Biotecnologia

Aula 2:
Obtenção e
isolamento de
micro-
organismos
Profª Natália Faria Romão
Bióloga / Mestre em genética e toxicologia
Doutoranda: Biotecnologia - UFAM
Coord. De Atividades: C. Biológicas, Biomedicina e Enfermagem
•As bactérias exigem determinadas
substâncias para que possam crescer e
multiplicar-se no meio de cultura.
•Para o seu metabolismo devem dispor
de fontes de carbono (proteínas e
açucares), fontes de nitrogênio
(peptonas) e fontes de energia.
•Algumas exigem também alguns sais
inorgânicos, de vitaminas e outros.
• Meios básicos de cultura:
– Meio sólido: contendo ágar (polissacarídeo
proveniente de algas), peptona e extrato de carne.
– Meio líquido: sem adição de ágar, constituído
basicamente de extrato de carne e peptona.
• Classificação dos meios de cultura quanto a
consistência:
– Meios líquidos: utilizado para crescimento de
microorganismos, em culturas puras.
– Meios sólidos em tubo: quanto a forma do ágar-
inclinado – objetiva o crescimento maciço de
microorganismos e a conservação dos mesmos.
– Meios sólidos em placas de petri: obtenção de
colônias isoladas, que possibilita o isolamento dos
possíveis microorganismos existentes em
microbiotas mistas.
 Meio sólido em tubo inclinado
Meio líquido

Meio sólido em placa

• Classificação dos meios de cultura quanto a
consistência:
– Meios semi-sólidos: utilizado geralmente para
verificar a mobilidade e observar a fermentação
de carboidratos por determinado microorganismo.
• Quanto à função:

– Meios simples: possuem componentes essenciais

para o crescimento de microorganismos pouco
exigentes. Ex.: Ágar padrão de contagem (PCA),
caldo simples (peptona).
• Quanto à função:

– Meios enriquecidos: adiciona-se aos meios

simples substancias de enriquecimento como
leveduras, sangue, soro, ovo, extrato de fígado,
extrato de soja... Ex.: águar-sangue.

Para isolamento de bactérias presente em

pequeno número, junto com outras que estão em
grande número.
• Quanto à função:

– Meios seletivos: favorecem o desenvolvimento de

determinados microorganismos, mas inibem a
proliferação de outros, devido a adição de
substâncias inibidoras, variação de nutrientes, pH,
temperatura, tensão superficial, pressão...
• Quanto à função:

– Substancias seletivas:
• Novobiocina: inibe bactérias proteus
• Sais biliares: em altas concentrações inibem
bactérias gram-positivas e esporuladas.
• Bacitracina: inibe estreptococos
• Azida sódica: inibe fungos
• Ácido tartárico: inibe bactérias diversas.
• Cristal violeta: inibe bactérias gram-positivas.
• Quanto à função:

– Meios seletivos-diferenciais: geralmente são

sólidos, utilizado para isolamento e identificação
presuntiva de bactérias. Ex.:
• Ágar MacConkey

• Ágar Luria Bertani

• Ágar Manitol
MÉTODOS PARA
QUANTIFICAR
DIRETAMENTE O
CRESCIMENTO
MICROBIANO
 Contagem em Placa

• Método mais utilizado na determinação do

tamanho de uma população bacteriana.

• Esse método considera que cada colônia é

originada do crescimento e da multiplicação
de uma bactéria.
 Contagem em Placa

• DILUIÇÃO SERIADA:
 Contagem em Placa

• MÉTODO DE ESPALHAMENTO EM SUPERFÍCIE:

– Auxílio da alça de drigalski
 Contagem em Placa

• MÉTODO DE PROFUNDIDADE OU “POUR

PLATE”:
Contagem em Placa
 Método do Número Mais Provável

• Faz uma estimativa da densidade média dos

microorganismos da amostra;
• Fácil execução, mas é laboriosa.
• A densidade é estimada por números de tubos
positivos e negativos;
• Apenas para a contagem de bactérias.
Método do Número Mais Provável
 Método do Número Mais Provável

• Leitura estatística:
 Isolamento de Micro-organismos

• O isolamento pode ser feito diretamente a partir

de uma amostra quando os micro-organismos
estão numa proporção adequada.
• Quando o microrganismo que se deseja isolar se
encontra em pequena quantidade, é realizado o
procedimento chamado enriquecimento que
significa elevar a quantidade do microrganismo
de interesse com relação ao restante da
população. A seguir se isola empregando o
método de isolamento por estrias ou por
diluição, para posterior identificação.
 Isolamento de Micro-organismos

• Procedimentos empregados no isolamento de

microrganismos:

– isolamento por estrias

– isolamento por diluição

 Isolamento de Micro-organismos

• MÉTODO ISOLAMENTO POR ESTRIAS

Consiste em espalhar uma
colônia, com o auxilio de uma alça
bacteriológica e fazer estrias em
três setores de modo que a
quantidade de material contido na
alça seja progressivamente
diminuido.
Para o sucesso da técnica:
•Realizar o maior numero de estrias
possível;
•Não voltar com as alças sobre as estrias;
•Utilizar pequena quantidade de material
para semear.
Isolamento de Micro-organismos
 Isolamento de Micro-organismos

• MÉTODO ISOLAMENTO POR DILUIÇÃO EM MEIO

SÓLIDO
– É usando tanto o método de inoculação em profundidade
como o método de inoculação em superfÍcie.

– Apenas é necessária a diluição da amostra.

– Para tanto pode-se preparar diluições decimais utilizando-

se água estéril ou outro diluente (ÁGUA PEPTONADA).
Preservação de Micro-organismos (culturas
puras)
• curto prazo
– repique contínuo

• médio prazo
– preservação em óleo mineral
– preservação em água
– congelamento a -20°C
– secagem em sílica, solo e papel de filtro

• longo-termo
– liofilização
– congelamento a -80°C
– criopreservação em nitrogênio líquido
Preservação de Micro-organismos (culturas
puras)
Repique contínuo
• princípio
– diminuição do metabolismo (meios mínimos; baixa
temperatura)

• fatores a serem considerados

– meio adequado para manter a cultura
– temperatura de estocagem: temperatura ambiente de
2-3 meses; geladeira (4 a 7 ºC) de 4-6 meses
Preservação de Micro-organismos (culturas
puras)
Repique contínuo
 Preservação de Micro-organismos (culturas
puras)
Repique contínuo
• vantagens
– baixo custo
– não requer equipamentos especializados
– o manuseio é simples

• desvantagens
– riscos de contaminação e possível perda da linhagem
– perda de características morfológicas, fisiológicas ou
patogenicidade
– seleção de células atípicas (variantes ou mutantes)
– supervisão especializada
– mão-de-obra
– espaço relativamente grande para a armazenamento
Preservação de Micro-organismos (culturas
puras)
Liofilização
• princípio
– remoção da água por sublimação

• fatores a serem considerados

– tipo de células
– idade da cultura
– concentração celular
– agentes crioprotetor
– condições de estocagem
– método de reidratação
Preservação de Micro-organismos (culturas
puras)
Liofilização

Maçarico Liofilizador

Maçarico
Cultura pura 3 mL 0,2 mL
Skim Milk na ampola
 Preservação de Micro-organismos (culturas
puras)
Liofilização
• vantagens
– vedação total da amostra
– longa viabilidade
– estabilidade elevada em muitas espécies
– produção em larga escala
– não requer armazenamento especial (somente ao abrigo da luz)
– fácil distribuição e transporte

• desvantagens
– muitas espécies não sobrevivem ao processo
– viabilidade ocasionalmente insatisfatória
– mão-de-obra especializada
– requer equipamentos sofisticado
Preservação de Micro-organismos (culturas
puras)
Congelamento em Ultrafreezer
• princípio
– indução da dormência do microrganismo
– armazenamento a - 80˚C

• fatores a serem considerados

– tipo de microrganismo
– idade da cultura
– concentração celular
– condições de estocagem
– método de descongelamento
Preservação de Micro-organismos (culturas
puras)
Congelamento em Ultrafreezer
Preservação de Micro-organismos (culturas
puras)
Congelamento em nitrogênio líquido
• princípio
– indução da dormência do microrganismo
– armazenamento a - 196˚C

• fatores a serem considerados

– tipo de microrganismo
– idade da cultura
– concentração celular
– condições de estocagem
– método de descongelamento
Preservação de Micro-organismos (culturas
puras)
Congelamento em nitrogênio líquido
Preservação de Micro-organismos (culturas
puras)
Congelamento em nitrogênio líquido
• vantagens
– condições estáveis por longos períodos
– vedação completa, evitando contaminação
– utilização para esporulados e não esporulados

• desvantagens
– viabilidade ocasionalmente insatisfatória
– requer equipamento sofisticado
– suprimento contínuo de N2
– boa infra-estrutura – caso de acidentes de
vazamento