CEPPA Ministério da Educação

Universidade Federal do Paraná

Setor de Tecnologia
Centro de Pesquisa e Processamento de Alimentos CEPPA

Métodos de detecção e
quantificação de Organismos
Geneticamente Modificados e seus
produtos.

Fábio de Oliveira Pedrosa

Métodos
baseados
no
DNA

Métodos
baseados
na
Proteína
 Aspectos Importantes da
Quantificação de OGM’s
• Amostragem e preparo da amostra
– Procedimento determina a “representatividade” do resultado.
– Tamanho da amostra, homogeneidade da amostra e limiar
de detecção.
– Requerimentos estatísticos devem ser satisfeitos.
– Tipo de material define o método analítico.
• Materiais não processados (ex. grãos)
• Ingredientes processados
• Alimentos processados
 Materiais de Referência
• Controles positivos e negativos appropriados.
– Base para validação do procedimento analítico
– Procedimento independente
• Efeitos da matriz e consistência similar para amostragem.
– Grãos,alimentos, etc…
– Estabilidade temporal, homogeneidade e conteúdo de OGM
• Métodos baseados no DNA:
requerem muitos controles positivos
• Métodos baseados em Proteínas
necessitam de um único padrão.

• Institute of Reference Materials and Measurement

– Geel, Belgica - Padrões Fluka.
– Por que não desenvolvermos Padrões brasileiros?
Ahmed, 2002
 Métodos de análise baseados na
detecção de Proteínas
• Os transgenes codificam para proteínas únicas e diferentes
daquelas da planta hospedeira (originalmente não transgênica).

• Técnicas de Immunoensaios usam anticorpos.

– Ideais para necessidades qualitativas e quantitativas
– Detectam proteínas especificas em substratos complexos

• A proteína alvo deve ser conhecida

• Interferências devido interações não-específicas com proteínas,
surfactantes (saponinas), fenólicos, ácidos graxos e fosfatases

Anticorpos policlonais
Sensíveis mas apresentam reconhecimento menos específico do antigeno.
Reação cruzada
Anticorpos monoclonais
Altamente específicos, reconhecimento do antígeno ligeiramente menos sensível.
 Métodos de análise baseados na
detecção de Proteínas

Western Blot = transferência de proteínas para membranas

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay):

1. Em placas de micropoços (Microwell Plate)

2. Imunocromatográfico em tiras (Lateral Flow Strip Assay)

3. Em Tubos recobertos com anticorpos

4. Imunomagnético
 Western Blot
• Teste qualitativo de alta específicidade
• Indica se a concentração da proteína OGM está acima ou
abaixo do limiar de concentração requerido
• Usado tipicamente para pesquisa
• Usa eletroforese desnaturante SDS-PAGE
– Solubiliza e remove agregados de proteínas
 Western Blot
Extrato celular é aplicado
em gel SDS PAGE

Submetido a eletroforese

As proteínas do gel são

transferidas para uma
membrana e reveladas
com anticorpos
específicos
toalha de papel

Membrana Gel
de transferência
toalha de papel
 Western Blot
• 1. Bloquear os sítios de ligação da membrana com leite desnatado

2. Lavar com ddH2O

3. Adicionar
anticorpos
4. lavar de novo
monoclonais

Anticorpos irão ligar à proteína específica

5. Adicionar segundo anticorpo (marcado) contra o primeiro anticorpo .

Revelar o anticorpo ligado para desenvolvimento de cor.

O aparecimento de cor
revela a presença da proteína
em estudo
ELISA Placa de micropoços
• Micropoços são revestidos com anticorpo

– Quantitativo, altamente sensível, econômico, de alta

produtividade, e ideal para análises laboratoriais.

• A proteína não pode estar desnaturada.

– Detecta 0.25% OGM em sementes & 1.4% em

alimento tostado (toasted meal)

– Tempo de análise: 90 min

– Necessita leitor óptico de placas para quantificar

 ELISA em Placa de micropoços
• Procedimento:
• 1. Fixar anticorpo monoclonal específico para a proteína OGM. Eliminar
excesso de anticorpo. Bloquear sitios de ligação com proteínas de leite.
• 2. Adicionar extrato total do material em análise. Remover excesso por lavagem.
Proteína OGM fica ligada ao anticorpo.
• 3.Adicionar segundo anticorpo específico para a proteina OGM
• 4. Adicionar anticorpo anti-anticorpo específico marcado com enzima
(HRPeroxidase ou fosfatase alcalina). Remover excesso do segundo anticorpo.
• 4. Revelar

poço
Intensidade da
Proteína OGM cor é
dependente da
concentração da
proteína GMO
proteína
bloqueadora
 Detecção Imunocromatográfica de OGM

Amostra
OGM proteína linha linha
teste controle

Anticorpo Segundo Anticorpo

específico anticorpo específico
marcado específico capturado
por anticorpo
(a) vista lateral do ELISA Resultado Resultado
negativo positivo
(b) vista vertical da tira
• Um variante do ELISA com dois anticorpos específicos à proteína expressa sendo
um imobilizado e outro livre, que é acoplado a um reagente de cor.
• Rápido, econômico, transferable & good for initial screening
 Protocolo de imunocromatografia para folhas

1 2

• Testes para
1. Corte disco de CryI(Ab) &
folha CP4 EPSPS
2. Adicionar a tubo, • Orgãos vegetais
e macerar & sementes.
3. Inserir uma flow
tira de teste
Protocolo de imunocromatografia para grãos

1. Contar ou pesar grãos equivalentes a 1000 grãos

2. Colocar no copo do liquidificado
3. Adicionar 1000 ml de água destilada
4. Liquidificar
5. Deixar decantar
6. Pipetar 0,5 ml para tubo plástico de 1,5 ml
7. Inserir tira imunocromatográfica
8. Incubar por 5 min à temperatura ambiente
9. Ler o resultado
1. Uma banda colorida = Negativo
2. Duas bandas coloridas = Positivo
 Experiência no CEPPA

Detecção imunocromatográfica - tiras

Kits reagentes da Strategic Diagnostics Inc. USA,
soja RR (GR Bulk Soybean test kit) = LOD 0,1%
milho (Bt1 Corn Grain test kit) = LOD 1%
farelo de soja tostado (RUR Toasted Meal test kit) =
LOD 0,9%

Limites de detecção encontrados:

Soja - limite de detecção: 0,1% de OGM (ou 1 semente
de soja transgênica RR em 1000) . Confiabilidade de
99% (3 sub-amostras)
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Ensaio Imunocromatográfico (Tiras)

Controle

Teste

Razão soja GM/soja 1 /1000 2 /1000 5 /1000 10 /1000 100 /1/900

% Soja GM 0,1 0,2 0,5 1 10

Kit de reagentes “GR Bulk Soybean test kit”

Soja RR
 ELISA Imunomagnético
• Particulas Magnéticas como superfícies de suporte sólido

• Revestidas com anticorpos de captura e colocadas em tubos.

– Separação usando um magneto exclui reagentes não ligados.
– Cinética e precisão superiores devido à uniformidade das
partículas.

VS.

Anticorpos Anticorpos livres para

mover em solução.
 Considerações sobre os ensaios ELISA
• Otimização e validação são importantes aspectos da padronização
das técnicas de detecção de OGM’s
• Devido a grande diversidade de tipos de alimentos otimização e
validação são imperativos.
• Fatores afetado a otimização são:
1. Parâmetros como:
• qualidade dos kits reagentes disponíveis comercialmente
• métodos para testar proteínas modificadas
• tempos de incubação, etc.
2. Limites de detecção (positivo/negativo) ou %
3. Rigor nos controles
4. Experiência do laboratório, problemas potenciais de
contaminação do ambiente e de pessoas.
 Considerações sobre os
ensaios ELISA
• Fatores afetando a Validação incluem:
1. Eficiência do método de extração da proteína OGM
2. Acurácia dos resultados
3. Precisão e habilidade do operador em distinguir
entre valores muito próximos
4. Sensibilidade , limite de detecção
5. Especificidade (anticorpo monoclonal)
6. Reproducibilidade
7. Consistência e confiabilidade de detecção
 Conclusões sobre os
ensaios ELISA
– ELISA é o método preferido para análise preliminar,
qualitativa, de um OGM particular em material não
processado, alimentos semi-processado e ingredientes
processados, desde que a proteína expressa não esteja
degradada e possa ser detectada.

Como ELISA tem menor poder de detecção que métodos

envolvendo DNA, (métodos de PCR), ele é menos sensível
para testar alimentos terminados contendo muitos
ingredientes, especialmente se o limite de detecção for
baixo.
Alguns OGMs não expressam níveis detectáveis de proteína
(NÃO É O CASO COM OS OGMs MAIS COMUNS)
 Métodos Baseados no DNA
• Se baseiam na complementariedade da duas
fitas do DNA, que hibridizam de maneira
sequência-específica. (A=T; CG)
• Reação em cadeia da DNA polimerase
• Requer DNA de alta qualidade

35S promoter EPSPS CP4 NOS terminator

CaMV Agrobacterium
Diagrama tumefaciens
representando a
sequência RoundupReady®
 Preparo da amostra de DNA
• Extração e purificação do DNA
– A extração e a purificação do DNA são
etapas importantes na obtenção de um DNA de
qualidade.
– O DNA obtido apresentar :
• Alto grau pureza A260/A280 nm superior a 1,8
• Massa molecular elevada (>>10000 pb)
• Baixo grau de dano do DNA é decorrente de:
– Calor, baixo pH (depurinação), nucleases (degradação
enzimática)
 Preparo da amostra de DNA
• Amostra para a extração do DNA
– A amostra laboratorial deve representar a amostra do
campo/alimento:
• material de partida: 1 - 2,5 kg de sementes de soja
• 100-350mg de amostra finamente moida para purificação.

DNA pode ainda ser afetado por contaminantes

presentes nos diferentes tipos de alimentos e que
nibem a detecção do rDNA por PCR, entre eles:
– Polisacarídeos, lipídeos, polifenois & reagentes
de extração do DNA
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Setor de Tecnologia
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Métodos de extração e purificação de DNA

- Inúmeros

Mais utilizados:
1. O método do CTAB (Brometo de cetiltrimetilamônio)
- Recomendado pelo Min. Agricultura.
2. O método Wizard da Promega usando resina
magnética.
3. O método proprietário PrepMan Ultra da Applied
Biosystems (Real time PCR).
 Requerimentos para
extração do DNA
• Quebrar as paredes celulares
– Gelo seco ou nitrogênio líquido
• Romper as membranas celulares
– Detergentes : CTAB or SDS
• Inativar nucleases
– EDTA quela Mg2+ inibindo nucleases.
• Separar polissacarídeos inibidores
• Separar constituintes celulares hidrofóbicos
– lipideos & polifenois com solvente orgânicos
• Separar o DNA precipitando e lavando-o
com alcool.
Determinar grau de pureza por espectrometria UV em 230,
260 e 280 nm.
Calcular a razão 260/280 nm…… superior a 1,8
 Princípios da reação em cadeia da
DNA polimerase (PCR)
• Permite amplificar o DNA alvo milhões de vezes.
• DNA polimerase faz cópias exatas do DNA alvo
• Utiliza oligonucleotideos iniciadores Cycles DNA molecules formed
1 -
(primers) complementares ao gene 2 1
3 2
de interesse 4 4
5 8
• Permite a Taq-polymerase gerar 6
7
16
32
sequências complementares à 8
9
64
128
região contida entre os pares 10
11
256
512
de primers. 12
13
1,024
2,048

• O número de sequências cresce 14

15
4,096
8,192
16 16,384
exponencialmente 17 32,768
18 65,536
Reação em cadeia da DNApolimerase (PCR)

Mistura de reação:

Tampão de PCR
dNTPs
Taq polimerase
Primers F (senso) e R (antisenso)
MgCl2
DNA (5 µl)

Volume Total (25 ou 50 µl/reação)

 Atividades da Taq polimerase
• Atividade de DNA polimerase Termoestável
• Atividade 5 nuclease associada à
polimerização
• Atividade 5 -3 nuclease. Não atrapalha PCR
convencional
dNTP

Polimerase 5’ nuclease
5’ 3’

3’ 5’
 Ciclagem térmica da PCR
• Perfil de ciclagem térmica Universal (PCR) (o.C)

1x 30-40x
95.0 95.0
4:00 0:15 72.0
60.0
0:30
1:00
22.0 desnatura desnatura anela os estensão
DNA DNA primers dos primers
 Mecanismo da reação em cadeia da
DNA polimerase (Ciclagem térmica)

primers F e R Gen alvo em dupla fita

Desnaturar fitas e anelar primers

5’
Estender Primers com a Taq Polimerase

Desnaturar, Aneal e Estender Primers

Produtos:
Amplicons

Amplificação exponencial = 2n n = número de ciclos

mostrar animação pcr.exe
 Ciclagem térmica : Plateau
• Amplificação é exponencial, mas o aumento
exponencial é limitado levando a um plateau.

• Causas do plateau?
Teórico – Inativação progressiva da Taq
polymerase,
Log DNA alvo

– Redução da eficiência da
etapa de desnaturação
Real – Redução da eficiência do
anelamento dos primers
devido a competição com o
produto (reanelamento do
produto)
Número do Ciclo – Taq polymerase se torna
limitante.
 Confirmação dos Fragmentos de
DNA amplificados por PCR
• Eletroforese em Gel de agarose – tamanho
– Verificar se o produto amplificado tem o tamanho
esperado.
• Artefatos de mesmo tamanho => falso positivos
• Ensaio “Southern Blot”
– Confiável mas demorado
• “Nested PCR” permite discriminação.
– 2o. par de primers dentro do amplicon
• Sequenciamento do amplicon
– Conveniente e demorado
Tipos de métodos de PCR para detecção de OGMs

1. Qualitativo
2. Semi-Quantitativo
3. Quantitativo
3.1 Competitivo
3.2 Tempo Real -
Sistemas de detecção/quantificação:
3.2.1 Sondas de transferência de energia fluorescente
por ressonância (FRET)
- Sistema TaqMan ( 5’ nuclease)
3.2.2 Sistema SybrGreen I (ligante de DNA dupla fita)
PCR Qualitativo

Usa dois pares de primers: F; senso ou 5’ 3’ e

R; antisenso ou 3’ 5’

Os fragmentos de DNA amplificados (amplicons) são

separados por eletroforese em gel de agarose e
visualizados por coloração com Brometo de Etídio.

HPLC e Eletroforese Capilar

Soja, trigo, canola, batata, arroz, milho, tomate, etc.

Componentes da Reação de PCR:

DNA dupla fita (template ou molde)

dNTP’s (dATP, dGTP, dCTP, TTP)
Par de oligonucleotídeos iniciadores (primers),
complementares às bordas externas do
gene/transgenes de interesse (alvo)
Mg2+
Taq polimerase
Legislação da Coordenação de Laboratório Vegetal – CLAV/DDIV/SDA/MAPA
NORMAS PARA CREDENCIAMENTO DE LABORATÓRIO PARA DETECÇÃO DE
MODIFICAÇÃO GENÉTICA EM PRODUTOS E SUBPRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL

DOU Nº163 - Seção 1, sexta-feira, 24 de agosto de 2001

INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001

Anexo II -

ISOLAMENTO DE DNA DE GRÃOS E FARINHAS

ISOLAMENTO DE DNA DE GRÃOS E FARINHAS (INSTRUÇÃO
NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001)

MÉTODO CTAB MODIFICADO PARA ANÁLISE DE AMOSTRAS DE

ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS.

PROCEDIMENTO:

1. Pesar 1 Kg de grãos;
2. Moer os grãos em moedor de café e colher duas sub-amostras
(200mg) de farinha em um tubo de microcentrífuga;
3. Acrescentar 750µL de tampão CTAB e 15µL de beta-Mercaptoetanol;
4. Agitar em um vortex durante 2 min;
5. Incubar a 65°C por 15 min;
6. Adicionar 520µL clorofórmio: álcool. isoamílico (24:1);
7. Agitar em um Vortex durante 1 min;
8. Centrifugar 13.000 rpm por 10 min.;

CONTINUA
9.Transferir o sobrenadante para um novo tubo e
acrescentar igual volume de isopropanol e 1/2v de
acetato de amônio 7,5M;
10. Centrifugar 13.000 rpm por 10 min;
11. Desprezar o sobrenadante e lavar o precipitado com
etanol 70%;
12. Centrifugar 13.000 rpm por 5 min.;
13. Desprezar o sobrenadante e secar o precipitado em
temperatura ambiente durante 15 min;
14. Solubilizar o precipitado em 50µL de água ultra-pura.
15. Determinar a concentração e qualidade do DNA em
espectrofotômetro;
16. Armazenar o DNA a -20°C.
Amplificação do DNA - Método qualitativo de PCR
(INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001)

Para cada sub-amostra, 4 tubos de reação de PCR são utilizados em uma reação
conforme a descrição abaixo:
Água 17,8 ul
Tampão de PCR 10X 2,5 ul
MgCl2 1,0 ul
desoxiribonucleotídeos (dNTPs) (10 mM) 0,5 ul
Primers
Tubo 1 Act F (20 uM) 1,0 ul e Act R (20 uM) 1,0 ul
Tubo 2 35S-1 (20 uM) 1,0 ul e 35S-2 (20 uM) 1,0 ul
Tubo 3 35S-3 (20 uM) 1,0 ul e 35S-4 (20 uM) 1,0 ul
Tubo 4 Nos-1 (20 uM) 1,0 ul e Nos-2 (20 uM) 1,0 ul
Taq DNA polimerase (5 U/ul) 0,2 ul
DNA (200 ng) 1,0 ul
Total 25,0 ul

O tubo 1 é um controle interno para verificar a qualidade do DNA vegetal.

Os tubos 2, 3 e 4 são para verificar a presença de transgênico, pois amplificam regiões
regulatórias comuns aos transgênicos em uso. Outros três controles são agregados durante a
PCR: DNA proveniente de grãos não transgênicos (controle negativo), ausência de DNA
(controle negativo para verificar contaminação durante a manipulação da amostra) e DNA
grãos contendo 0,1% de transgênicos (controle positivo).
Método dirigido para detectar
promotor 35S e terminador NOS

35S promoter EPSPS CP4 NOS terminator

CaMV Agrobacterium
Diagrama tumefaciens
representando a
sequência RoundupReady®
 (INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001)

Reação de amplificação em termociclador MJR PTC-100

Desnaturação inicial: 96°C 2 min

Desnaturação: 94°C 1 min
Anelamento: 62°C 45 seg
Extensão: 72°C 45 seg
Extensão final: 72°C 45 seg
Número de ciclos: 35
A interpretação dos resultados é efetuada através da verificação
da presença de fragmentos de DNA nas amostras, observada
após a eletroforese em gel de agarose 2% em tampão TBE,
com o mesmo tamanho do fragmento observado no controle
positivo e ausente nos controles negativos. Para uma amostra ser
considerada positiva, os três pares de primers que detectam
OGMs deverão resultar em amplificações semelhantes ao
controle positivo.
 PCR Quantitativo

Métodos :
1. PCR convencional (semi-quantitativo a
quantitativos)
2. Método de PCR Competitivo
3. PCR Quantitativo Tempo-Real
 PCR convencional

• Determina a percentagem de OGM no alimento

F 35S NOS
5’ Promoter Coding region Terminator 3’

• ex. determinar a concentração de soja GM (35S-

CP4 EPSPS) em grãos.
 PCR QUANTITATIVO CONVENCIONAL

As concentrações dos produtos presentes no ponto A (PONTO FINAL) determinados

por densitometria após eletroforese em gel de agarose e são grafados em função da
percentagem de OGMs presentes na amostra inicial.

O resultado demonstra que a proporcionalidade entre a concentração de DNA e os

produtos de PCR (faixa dinâmica) é limitada no PCR convencional.
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314
Exemplo de determinação
quantitativa da concentração
de OGM por PCR convencional

1. Padrão de peso molecular

2. 5% soja RR
3. 2% soja RR
4. 1% soja RR 16 1718 19 2021 22 23
5. 0,5% soja RR
6. 0,1% soja RR
7. Soja não-transgênica 13. Soja RR + controle externo
8. Soja não-transgênica 14. Soja RR + controle externo
9. Controle sem DNA
10. Amostra OGM
11. Amostra OGM
12 . 100% soja RR
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314
Exemplo de determinação
quantitativa da concentração
de OGM por PCR convencional

15. Padrão de peso molecular

16. Amostra + controle externo
17. soja RR + Controle interno(ubiq)
18. Amostra + Controle interno(ubiq) 15 16 17181920 21 22
19. Amostra + Controle interno(ubiq)
20. Soja não-transgênica +
Controle interno(ubiq)
Processamento posterior das bandas coradas

1. Determinar a intensidade das bandas por

densitometria
2. Utilizar os padrões normalizados contra a referência
interna para construir curva padrão
3. Determinar as concentrações das amostras
desconhecidas utilizando a curva padrão.

Duração 1-2 dias

 Ciclagem Térmica
PCR Semi-quantitativo “ traditional” ou
“Convencional”
• Amplificação Quantitativa de genes alvo
• Dificuldades:
– Grande esforço para estabelecer condições ótimas de
reação (concentrações de DNA alvo e primers)
– Difícil de reproduzir, mas não impossível!!!!
– Difícil desenhar um controle interno (escolher gene
conservado ubíquoto tipo pirofosfatase, lectina, zeina,
ubiquitina, etc.) mas não impossível!!!!
– Problemas de especificidade de primers
– Necessário realizar eletroforese dos produtos de
amplificação e todo processamento posterior
(densitometria, etc.)
– Difícil de conseguir alta produtividade
 PCR Quantitativo
• Normaliza um marcador de OGM (ex. 35S) a um gene de
referência específico da planta (ex. Lectina).
• Combina 2 reações de quantificação absoluta; mede a
concentração de DNA da amostra e permite
– Determinar o número de cópias/genoma de ambos os genes
(transgene e referência)
– Determinar = % de OGM’s na amostra.
• PCR Multiplex
– Ambos pares de primers na mesma reação
– Razão entre número de cópias do genoma GM/número de
cópias total do genoma
 Método de PCR Competitivo
• Co-amplificação da sequência alvo (transgene) e do
padrão interno (ex. lectina para soja; zeina para milho)
– Gene alvo específico de concentração desconhecida e molde
controle de concentração conhecida. (1%)
• Uso preferencial dos mesmos primers que amplificam
sequências de 2 tamanhos diferentes.

• Duplo QC-PCR usa 2 reações diferentes

– GM alvo e gene específico
• ex. gene da lectina (lel) em soja para RRS
– Concentração do gene competidor equivalente a 1% da soja
geneticamente modificada (+/-)
QC-PCR

Adapted from Hübner et al.,

 PCR EM TEMPO REAL
• Detecção em tempo Real dos produtos de
amplificação de DNA alvo (gene) pela reação
em cadeia da DNA polimerase.

• PCR em tempo Real (Real-Time PCR) usa

fluorescência o que permite a medida direta e a
quantificação dos produtos da reação
amplificação.

• Permite a quantificação precisa e reproduzível

dos ácidos nuclêicos.(DNA e RNA)
• Vantagens do PCR em Tempo Real

– Ampla faixa dinâmica de detecção (faixa de

sensibilidade)
– Química em tubos fechado
• Dispensa electroforese
• Dispensa processamento posterior dos produtos
de PCR (gel, coloração, hibridização,
densitometria, autoradiografia, etc.)
– Alta produtividade de análises
• Utiliza placas de micropoços (microwell plate) de 96
poços
 PCR em Tempo Real
Aplicações:
• Determinação de Transgênicos
(OGMs)
• Expressão gênica
• Quantificação de Cancer
• Detecção de dano do DNA
• Controle Qualidade
• Quantificação de Patógenos
• Entre outras.
Etapas do PCR em Tempo
Real
Detecção de curvas de PCR tempo Real

Preparo da Termo Detecção da Análise dos

amostra Ciclagem Fluorescência Dados

Único Instrumento

Análises Análises
Gerais de Aplicações
Específicas
Preparo da amostra
• Purificar DNA
– Purificado
• Vários métodos

– Kit PrepMan Ultra Applied

Biosystems DNA
dupla fita

35S promoter EPSPS CP4 NOS terminator

CaMV Agrobacterium tumefaciens
 Ciclagem Térmica
Detecção de curvas de PCR tempo Real

Preparo da Termo Detecção da Análise dos

amostra Ciclagem Fluorescência Dados

único instrumento

Análises Análises
Geral de Aplicações
Específicas
 Ciclagem Térmica

• 2 “Químicas”
– Ensaio Fluorogênico 5’ Nuclease, Sondas
Taqman
• Vantagem: a especificidade é garantida pela
sonda Taqman
– SYBR ligante de DNA dupla fita
Todos dsDNA produtos são detectados 
necessário realizar análise de dissociação
(Tm)
 Ensaio Fluorogênico 5’ Nuclease
• Sonda Fluorescente
Taqman
– Única para cada gen alvo
– Anela entre os 2 primers a 10°
C acima dos primers
• Aumenta a especificidade da
reação
• Aplicações:
– Quantificação de OGM’s
– Detecção de polimorfismo
– Quantificação de ácidos
nuclêicos por PCR Tempo Real
 Ciclagem Térmica
Taqman usa FRET

Fluorescent Resonant Energy Transfer

 Estrutura das sondas Taqman

R Reporter (FAM,VIC)
Q Quencher (Tamra)
Taq polimerase
(5’ Nuclease)

R Q R Q
Fluoresce
Sonda Clivada
(não fluoresce)
 Atividade 5 nuclease da Taq
polimerase
• Atividade associada à polimerização

dNTPs
polimerase 5’ nuclease
5’ 3’

3’ 5’
 Ensaio Fluorogênico 5’ Nuclease

Polimerização Taq Não fluoresce

primer
5’
R Q
3’ 5’

Não fluoresce
R
Deslocamento
5’
Q
3’ 5’
 Ensaio Fluorogênico 5’ Nuclease
Clivagem R
Fluoresce

Polimerização Fluoresce

Completada R Q
 SYBR corante para fita dupla de DNA

• SYBR® green 1 DYE

– SYBR fluoresce ao se
ligar ao DNA dupla fita
– Qualquer DNA dupla fita
 NON-specific
– Usado para ensaios de
identificação de genes
alvo (screening)
– Baixo custo

– Problema: dimeros dos

primers ou produtos de
PCR não-específicos
também fluorescem.
 SYBRGreen
Corante para fita dupla de DNA

Sequência alvo DNA

Desnaturação
 SYBRGreen
Corante para fita dupla de DNA

Polimerização

Polimerização Completa
 Ciclagem térmica
• Perfil de ciclagem térmica Universal (PCR) (o.C)

1x
1x 40x 72
95.0 95.0
15:00 0:15
60.0
1:00
50.0 Perfile de
Dissociação
2:00 entre 60 to 95C°
ativação da
0.5C°/cicle
Taq Gold SYBR GREEN
UNG
 Um único Instrumento
Detecção de curvas de PCR tempo Real

Preparo da Termo Detecção da Análise dos

amostra Ciclagem Fluorescência Dados

Único instrumento

Análises Análises
Gerais de Aplicações
Específicas
 Único Instrumento
• Mecanismos de detecção e instrumentos diferem
dependendo do fabricante.
• Instrumento mais vendido e usado.
– Applied Biosystems
• CEPPA

• Outros Fabricantes de Termocicladores Tempo

Real
– Biorad (similar ao AB)
– Westburg
ABI 7000/7700
 Detecção Fluorescente
Real time detection of PCR curves

Análises de
Preparo da Ciclagem Detecção
aplicações
amostra térmica Fluorescente
específicas

Único instrumento
 Detecção Fluorescente
Lâmpada

Excitation
Filter
Fold Mirror

CCD
Camera
Dichroic
Fresnel Lens Multi-
Mirror
Well Lenses Element
Lens

Filter Wheel
96-Well Plate
Peltier-based block thermal cycling system
 Análise dos Dados
Real time detection of PCR curves

Preparo da Ciclagem Detecção Análises dos

amostra térmica Fluorescente dados

In single instrument

Análise Análises
Geral Específicas
 Desenho Experimental
• Mistura de reação:
– Universal master mix (taqman or SYBR green)
• Tampão de PCR + dNTPs
• Amplitaq Gold polimerase
• UNG (evita contaminação, não necessário)
• ROX reporter = referência fluorescente interna
• Primers F (senso) e R (antisenso) do gene alvo
• Primers F (senso) e R (antisenso) do controle interno

– Sonda Taqman
– Volume Total (25 ou 50 µl/reação)
• Pipetar mistura para os micropoços (Amostra em
triplicata)
• Adicionar DNA (5 µl)
• Centrifugar a placa para eliminar bolhas de ar
 Desenho Experimental
Definir distribuição das amostras na placa
• Serão:
– 6 concentrações de amostras padrão =18 poços
– Controle positivo = 2 poços
– Controle negativo = 2 poços
– 37 Amostras desconhecidas (2X) = 74 poços
• Custo dos reagentes @ R$ 4000,00
 PCR terminado,
Análise dos Dados
• ABI prism coleta dados primários em 4 filtros
• A Fluorescência dos corantes é calculada usando
um algorítmo multicomponente.
• Reporteres são normalizados contra a referencia
interna o fluoróforo ROX
• Correções da linha de base
• Curva de dissociação (SYBR green 1)

• Resultados dependente da aplicação

– Quantificação da reação de PCR pelo Ciclo limiar (Cycle
Threshold)
– Medidas de Ponto Final
 Espectros brutos
Dados coletados no final de cada ciclo.

FAM/SYBR VIC/JOE TAMRA/NED ROX

A B C D
• Algoritmo calcula automaticamente a
contribuição de cada fluoróforo.
 Referência Fluorescente Rox
• ROX é uma referênca fluorescente passiva
presente no tampão. Sinais dos Reporteres são
normalizados contra ROX para eliminar variações
operacionais
• Níveis de Fluorescência são diferentes no meio e
laterais da placa
– Diferenças ópticas nos plásticos das placas
– Erros de pipetagem

FLUORESCENCIA
FLUORESCENCIA

Amostra1 Amostra2
FAM

ROX FAM

ROX
 Gráfico das Fluorescências da
Amplificação Normalizado
Sinal normalizado do reporter (FAM) contra ROX

Rn

Número do ciclo
Sinal do Reporter
Rn =
ROX
 Correção da linha de base
Sinal do reporter normalizado e linha de base corrigida

Rn
Linha de base
Cicle 3-14

Todos os dados Cycle number

começam no 0
Reporter signaln Reporter signal6-16
Rn =
ROXn ROX6-16
 Curva de dissociação
• Immediatamente depois do PCR, aumenar a Temperatura de
60 a 95 °C
• Produtos do DNA (amplicons) irão desnaturar.
• Fluorescência do SYBR green cairá durante a desnaturação

SYBR® fluorescência
Fluorescência

SYBR® dissocia
dos dsDNA

Temperatura
 Curva de Dissociação
• Primeira derivada
dos dados brutos
• Pico = Tm do
amplicon
• Segundo pico
observado na
temperatura menos
indica:
• Dimeros dos
primers
• Amplificação não
específica.
 PCR completado,
Análise dos Dados
• ABI prism coleta dados primários em 4 filtros
• A Fluorescencia dos corantes é calculada usando
um algorítmo multicomponente.
• Reporteres são normalizados contra a referência
interna o fluoróforo ROX
• Correções da linha de base
• Curva de dissociação (SYBR green 1)

• Resultados dependente da aplicação

– Quantificação da reação de PCR pelo Ciclo limiar
(Cycle Threshold)
– Medidas de Ponto Final
 Ciclo limiar (Cycle Threshold)
• Ciclo limiar Ct
– Número de ciclos de
amplificação
necessário para a exponential
fluorescência threshold
ultrapassar o limiar
(fluorescência mínima)
– O Liminar (Threshold) é
determinado na fase
exponencial: o meio da exponential
parte linear quando a threshold
fluorescência é grafada
logaritmicamente
–
Faixa Dinâmica e curva padrão
Amplificação de diluições
seriadas de amostra padrão

Curva padrão
mostrando unidades
8 logs da faixa
dinâmica linear
 Quantificação absoluta
• Resultados de amplificação do DNA de amostras de
concentrações conhecidas como curva padrão: Ct versus
concentração
• Calcular a concentração da amostra desconhecida com a curva
padrão.
• A inclinação da curva padrão dá informação sobre a eficiência
do PCR. 100% eficiência  inclinação (tg) = -3.33
• Correlação R da indicação da reproducibilidade da pipetagem e
deve ser ≥ 0.99

Inclinação= -3.33
R ≥ 0.99
 PCR em tempo real

A concentração dos produtos é determinada

continuamente por medidas de fluorescência.

Na reação de PCR em tempo real (RT-PCR) a amplificação é proporcional ao

número do ciclo durante a fase exponencial do PCR. Em contraste com o PCR
convencional existe uma relação linear entre a concentração dos produtos de
PCR e a concentração de DNA durante a fase exponencial do RT-PCR.
Determinar ponto de amostra conhecida que é o mesmo e referencia-lo a
fragmento GM desconhecido.
Resumo dos métodos de detecção de
produtos de OGMs
Parâmetro Baseados na Proteina
Western blot ELISA Imunocromatográfico
(tiras)
Facilidade de uso Dificil Moderada Simples
Necessita Sim Sim não
equipamento
special
Sensibilidade Alta Alta Alta
Duração 2 dias 30-90 min 10 min
Custo/amostra 150,00 5,00 2,00
(US$)
Fornece Não Sim Não
resultados
Quantitativos?
Apropriado para Não Sim Sim
teste de campo?
Empregado Pesquisa Laboratórios Teste em Campo
principalmente de análise
em: de rotina
CEPPA
Ahmed, 2002
 Resumo dos métodos de detecção de
produtos de OGMs
Parametro Baseados no DNA
Southern blot PCRQualitativo -PCR PCR em
Competitivo Tempo
Real
Facilidade de uso Dificil Dificil Dificil Dificil
Necessita Sim Sim Sim Sim
equipamento
special
Sensibilidade Moderada Muito Alta Alta Alta
Duração 6 horas 1,5 dias 2 dias 1 dia
Custo/amostra (US$) 150,00 250,00 350,00 450,00
Fornece resultados Não Não Sim sim
Quantitativos?
Apropriado para teste de Não Não Não Não
campo?
Empregado principalmente Pesquisa Laboratórios de Laboratórios de Laborat
em: análise análise órios de
de rotina de rotina análise
CEPPA de rotina
CEPPA
Ahmed, 2002
Outros métodos em desenvolvimento

1. Espectrometria de infra vermelho próximo (NIR)

2. Microarranjos de DNA - DNA chips
Agradecimentos

CEPPA:
Ariene Costa Prado Yoshiyasu
Fabiana Nicol Barbieri
Arion Zandoná Filhos

Mundo:
Darcy Pawlik
Farid E. Ahmed
B. Leyman