BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Bài 1 Xác định hàm lượng Nito tổng số bằng phương pháp
Kjeldahl

I. Nguyên tắc

*Giai đoạn Vô cơ hóa: Vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc và chất
xúc tác để chuyển N trong mẫu thành ion amoni NH4+

mẫu + H2SO4 đặc ->(300-400 độ C) CO2+ SO2 + (NH4)2SO4 +

H20

* Giai đoạn Cất đạm: Đẩy NH3 ra khỏi dung dịch bằng dinh dịch
NaOH, đồng thời cất và thu nó bằng một lượng dư axit boric

(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + H20 + 2NH3

2NH2OH + 4 H3BO3 = (NH4)2B407 + 7H20

*Giai đoạn chuẩn độ: Định phân lượng (NH4)2B4O7 tạo thành bằng
dung dịch H2SO4 từ đó tính được lượng N trong mẫu

(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H20 = (NH4)2SO4 + 4H3BO3

II. xử lí số liệu
5 ml dd vô cơ hóa
Kết quả phân tích:
Thể tích H2S04 dùng cho mẫu thí nghiệm = 7,4 ml
Thể tích H2SO4 dùng cho mẫu kiểm chứng = 0,25ml

* Thể H2SO4 dùng để định phân= Thể tích H2SO4 dùng cho mẫu thí
nghiệm - Thể tích H2SO4 dùng cho mẫu kiểm chứng = 7,4 - 0,25 =
7,15 (ml)
Ta có: * Thể H2SO4 dùng để định phân= Thể tích H2SO4 dùng cho
mẫu thí nghiệm - Thể tích H2SO4 dùng cho mẫu kiểm chứng = 7,4 -
0,25 = 7,15 (ml)

Ta có: 1 ml H2SO4 0,1N định phân tương ứng 1,4mg Nito trong mẫu
cất

=> 7,15 ml H2SO4 0,1N định phân tương ứng 7,15x1,4= 10,01 mg
Nito

vậy 5ml dung dịch cất đạm có 10,01 mg Nito => 100ml dụng dịch cất
đạm có 10,01x100/5=200,2 mg=0,2g

=> Hàm lượng Nito 0,2% (g/100ml)

* Biết N chiếm 16% trong Protein => Lượng protein kết tủa:
0,2x100/16=1,25g

5g mẫu có 1,25g protein => hàm lượng protein là: 1,25/5x 100%=
25% 1 ml H2SO4 0,1N định phân tương ứng 1,4mg Nito trong mẫu
cất

=> 7,15 ml H2SO4 0,1N định phân tương ứng 7,15x1,4= 10,01 mg
Nito

vậy 5ml dung dịch cất đạm có 10,01 mg Nito => 100ml dụng dịch cất
đạm có 10,01x100/5=200,2 mg=0,2g

=> Hàm lượng Nito 0,2% (g/100ml)

* Biết N chiếm 16% trong Protein => Lượng protein kết tủa:
0,2x100/16=1,25g

5g mẫu có 1,25g protein => hàm lượng protein là: 1,25/5x 100%=
25%
Trong quá trình cho dd vô cơ hóa, dd NaOH và nước vào bấu cất có
thể gây thất thoát một lượng nhỏ NH3 do trong lúc cho Nước vào và
đóng khóa NaOH đã tác dụng với NH4+ trong dd vô cơ hóa làm thoát
NH3 ra ngoài.

Vì vậy kết quả tính được sẽ thấp hơn so với lượng thực tế

Phương pháp Kjeldahl có thể ứng dụng để

+Xác định nito protein, nito phi protein, và hàm lượng protein trong
mẫu

. Khi xác định Nito trong thành phần của protein, người ta tách
protein ra khỏi các hợp chất chứa nito bằng phương pháp kết tủa, sau
đó đem đốt kết tủa protein thu được với H2SO4 đặc, rồi xác định nito
protein bằng phương pháp Kjeldahl

. nếu biết hàm lượng nito protein, nhân với hệ số 6,25 ta được hàm
lượng protein chưa trong mẫu nghiện cứu ( đối với sữa thì nhân hệ số
6,38 còn đối với ngũ cốc các loại đậu đỗ thì nhân với hệ số 5,7)

. lấy lượng nito tổng số trừ đi lượng nito protein ta được lượng nito
phi protein hoặc xác định trực tiếp bằng cách vô cơ hóa nước lọc sau
khi kết tủa protein

+Xác định ni tơ amoniac ( đạn thối)

Để giải phóng NH3 khỏi dung dịch, người ta dụng các kiềm yếu và ít
tan trong nước (MgO và CaO)

cất amonia ở nhiệt độ 35-40 độ C và dưới áp suất thấp khoảng 15-

20mmHg, sau đó thu nó bằng một lượng dư axit Boric. Định phân
nượng tetraborat amon tạo thành bằng dung dịch H2SO4
 BÀI 2: Xác Định Protein Bằng Phương Pháp Lowry
I- MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM.
Xác định nồng độ protein có trong mẫu bằng phương pháp Lowry.

II- NGUYÊN TẮC.

Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa protein và thuốc
thử folin. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein
trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dung dịch protein
nghiên cứu với thuốc thử folin, dựa theo đường chuẩn của protein tinh khiết với
thuốc thử này, có thể dễ dàng tính được hàm lượng protein của mẫu nghiên cứu.
Đây là phương pháp rất nhạy và chính xác, được dùng phổ biến
trong việc xác định protein. Phương pháp dùng đối với protein hòa tan.
Bao gồm 2 giai đoạn:
1. Phản ứng biure: Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide
(CO-NH-). Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide
trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím
đỏ hay đỏ. Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide.
2. Phản ứng với thuốc thử folin: Thuốc thử folin có chứa axit
phosphomolipdic và axit phos-phovolframic. Các chất này một mặt làm tăng độ
nhạy của phản ứng biure, một mặt khác phản ứng với gốc Tyr và Trp trong phân
tử protein. Các axitamin này tham gia trong quá trình tạo phức chất có màu
xanh da trời, hấp thụ cực đại bước sóng ở 750 nm.
PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM.
1. Hóa chất cần dùng.
- Thuốc thử folin:
Hòa tan 1000 gam natri wonframat ( Na 2WO4.H2O) và 25 gam
natri molybdat (Na2MoO4.2H2O) vào 800 ml nước cất. Thêm 50 ml axit
photphoric 80% ( H3PO4) và 100ml axit clohydric đậm đặc. đun sôi hỗn hợp
trong bình cầu đáy tròn dung tích 2000ml với ống sinh hàn ngược trong vòng 10
giờ. Có thể đun ngắt quãng, không cần phải đun liên tục, nhưng phải đun sôi đủ
10 giờ. Sau khi đun sôi xong, thêm vào hỗn hợp 105 gam litium sunfat, 50ml
nước cất và 5 giọt nước brom. Đun sôi 15 phút không có ống sinh hàn ngược để
loại trừ lượng brom dư. Dung dịch thuốc thử phảm có màu vàng, không được có
màu xanh. Nếu thuốc thử có màu xanh phải xử lý brom lần thứ hai. Sau khi làm
nguội dung dịch, thêm nước cất cho đến vạch mực trong bình định mức dung
tích 1 lít. Lọc qua ống Allin có chứa bông thủy tinh.
Xác định nồng độ thuốc thử bằng cách chuẩn độ dung dịch folin pha
loãng 10 lần với dung dịch NaOH 0,1 N với chất chỉ thị phenolphtalein ( dung
dịch gốc thường có nồng độ 1N).
 Bảo quản thuốc thử trong bình thủy tinh màu, nơi lạnh. Sau 2-3 tháng
dung dịch ngả màu xanh thì thêm vài vọt brom và lại đun sôi 15 phút, dung dịch
có màu vàng trở lại. Trước khi dùng, pha loãng thuốc thử bằng nước cất sao cho
nồng độ thuốc thử bằng 0,5N.
☞ Tại sao lại cho brom vào rồi lại khử Brom?
Do folin là chất oxi hóa, cho Brom vào để khử để luôn giữ folin ở trạng thái
oxi hóa, tuy nhiên brom dư phải bị khử đi để folin tránh pha loãng, tránh bị lẫn
với các thành phần khác và tránh sai số với phản ứng.
- Dung dịch A: dung dịch Na2CO3 2% pha trong NaOH 0,1N
- Dung dịch B: dung dịch CuSO4.5H2O ( 0,5% pha trong dung dịch natri xitrat
1% hoặc pha trong dung dịch kali-natri tartrat 1% ). Dung dịch pha trong natri
xitrat sẽ bền hơn pha trong kali-natri tartrat)
- Dung dịch C: hỗn hợp của hai dung dịch A và B pha theo tỷ lệ 50:1 trước khi
dùng.
2. Tiến hành.
2.1. Xây dựng đường chuẩn albumin cho phương pháp lowry.
Dung dịch gốc protein chuẩn: Albumin huyết thanh bò ( BSA-Bovine
Serum Albumin): 0,5mg/ml ( PTN pha sẵn).
☞Tại sao lại dùng Albumin huyết thanh bò?
Phương pháp chọn cần làm với protein tinh khiết ( 99,999%) vì nếu không
tinh khiết có thể trong đó còn có những chất có thể phản ứng được với Cu 2+ hay
phản ứng với những chất có trong phương pháp, do vậy có thể ảnh hưởng đến
kết quả thí nghiệm. Mà albumin lại nằm ở vị trí giữa trong nhóm protein sẽ dễ
xác định và nhận thấy hơn.
2.1.1. Tiến hành.
Chuẩn bị 1 dãy ống nghiệm sạch ( 6 ống):
Hòa lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau tạo hệ nồng độ
BSA (Ci)
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Dung dịch BSA gốc (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Trộn đều bằng vortex
Thực hiện phản ứng:
Ống nghiệm 7 8 9 10 11 12
Dung dịch BSA làm việc Ci 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
mg/ml ( ml)
Dung dịch C (ml) 3 3 3 3 3 3
Trộn đều để yên 10 phút
 Dung dịch Folin (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
Trộn đều bằng vortex, để yên 30 phút rồi đo độ hấp thị tại bước sóng 750nm
(OD 750nm) với mẫu đối snahs là mẫu trong ống nghiệm số 7.
Yêu cầu: tính toán, đo và điền vào bảng tiếp theo và vẽ đồ thị đường chuẩn, tính
R2.
Nồng độ BSA Ci (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
OD750nm 0 0,09 0,19 0,27 0,36 0,44

2.1.2. Xây dựng đường chuẩn.

0 0
0.1
0.2
0.09
0.19
Đường chuẩn albumine
0.3 0.5 0.27
0.4 0.36
0.45
0.5 0.44
f(x) = 0.882857142857143 x + 0.00428571428571428
0.4 R² = 0.998911963174138

0.35

0.3
OD 750 nm

Column B
0.25
Linear (Column B)
0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Nồng độ protein (mg/ml)

2.2. Phân tích mẫu.

2.2.1. Mẫu thí nghiệm: mẫu thực phẩm chứa protein được PTN chuẩn bị.
2.2.2. Chuẩn bị dịch protein phân tích:
- Dùng ống đong chuẩn bị 20ml NaOH 0,1N vào cốc dung tích 100ml.
- Cân chính xác 0,3 g mẫu.
- Chuyển mẫu vào cối, cho một ít dung dịch NaOH 0,1N từ cốc vào để làm ẩm.
☞ Tại sao lại dùng NaOH?
Lượng NaOH dùng đổ vào mẫu sút để phá vỡ cấu trúc màng tế bào để protein
chui ra bên ngoài. Do tế bào có màng lipit sẽ tác dụng với NaOH ( phản ứng xà
phòng hóa), do NaOH là dung dịch kiềm nhẹ nên làm protein phân ly tốt hơn,
khả năng hòa tan, khả năng đẩy tốt hơn.
- Nghiền nhuyễn mẫu
- Chuyển toàn bộ mẫu vào bình tam giác dung tích 100ml.
- Tráng sạch cối cháy bằng dung dịch NaOH 0,1N còn lại.
- Đặt bình mẫu vào nồi đun cách thủy để chiết protein trong 15 phút.
 ☞Tại sao lại đun cách thủy?
Đun cách thủy để nhiệt độ dung dịch không quá yêu cầu ( 70-80°C). Nếu
nhiệt độ cao sẽ làm giảm hiệu suất của phản ứng màu, hoặc gây biến tính.
- Lấy mẫu ra, làm nguội, trung hòa tới pH 7 bằng HCl 0,1N, dùng giấy pH làm
chỉ thị.
☞Tại sao lại dùng giấy chỉ thị pH mà không dùng phenolphtalein?
Dùng giây pH mà không dùng phenolphtalein ( màu hồng) vì phản ứng sau sẽ
có màu xanh làm ảnh hưởng đến việc xác định màu ở thí nghiệm. Nên phải
dùng chất chỉ thị mà không làm ảnh hưởng đến màu của dung dịch.
- Chuyển mẫu sang bình định mức 100ml, định mức bằng nước cất tới vạch. Trộn
đều. ( lắc đều khoảng 20 lần trước khi cho vào lọc để mẫu lấy ra chuẩn và nhiều
protein)
- Lọc trong, thu dịch lọc protein phân tích.

2.2.3. Làm phản ứng màu.

Chuẩn bị các ống nghiệm khô, sạch.
 Mẫu thí nghiệm: Lấy vào ống nghiệm:
0,3 ml dịch lọc protein ( dùng pipet)
3ml dung dịch C ( hỗn hợp dung dịch A:B = 50:1 mới pha)(dùng pipet)
Trộn đều. Để yên 10 phút.
Cho tiếp 0,3 ml dung dịch Folin. Trộn đều.
Để phản ứng 20 phút.
 Mẫu kiểm chứng ( làm song song với mẫu thí nghiệm): lấy vào ống nghiệm
khác:
0,3 ml H2O ( dùng pipet)
3ml dung dịch C,
Trộn đều. Để yên 10 phút.
Cho tiếp 0,3 ml dung dịch Folin. Trộn đều.
Để phản ứng 20 phút.
 Đo độ hấp thụ ánh sáng:
Đọc kỹ hướng dẫn sử dụng máy đo quang tại PTN.
Đo độ hấp thụ của dung dịch màu của các ống thí nghiệm ở 750nm, với
dung dịch đối sánh là mẫu kiểm chứng. Ghi kết quả.
Sử dụng đường chuẩn protein để xác định hàm lượng protein của dung dịch
nghiên cứu.

III- XỬ LÝ SỐ LIỆU.
- Lượng mẫu thực phẩm lấy được : 0,33 mg
- Kết quả đo OD : 0,143
Theo đường chuẩn albumine :
 y= 0,8829 x + 0,0043
Mà y = 0,143 => x = 0,157 (mg/ml)
 Trong 100ml dịch thì có 15,7 mg protein (= 0,0157 g)
 Hàm lượng protein có trong mẫu thí nghiệm là:
0,0157
% protein= 0 , 33 × 100% = 4,75%

BÀI 3:
XÁC ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ TỔNG SỐ
THEO PHƯƠNG PHÁP RODZEVICH.

I- MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM:

Bài thí nghiệm giúp ta xác định được lượng đường khử tổng có trong mẫu
bằng phương pháp Rodzevich.
Đường khử là monosacarit, mantoza, fructoza,… các đường còn chứa gốc
C=O
Phương pháp này không xác định được đường saccaroza do saccaroza
được cấu tạo bởi Glucoza-Fructoza nối mạch 1,2 nên không còn gốc C=O,
phương pháp này cũng không xác định được lượng tinh bột dù tinh bột vẫn còn
chứa gốc C=O nhưng do cấu trúc tinh bột rất cồng kềnh mà tinh bột có 1 đầu
khử rất nhỏ so với toàn bộ cấu trúc của nó.

II- NGUYÊN TẮC:

Phương pháp này đựa trên cơ sở trong môi trường kiềm của các đường khử
(glucoza, fructoza, mantoza…) có thể khử dễ dàng oxit đồng II thành oxit đồng
I (Cu2+ Cu1+ ) dưới dạng kết tủa màu đỏ và qua lượng CuSO 4 dư (không tham
gia phản ứng) tính được lượng đường khử.
Phản ứng nền:
Đường khử + Cu2+/OH-  -COOH + Cu1+
Phản ứng này xảy ra với đường có mạch thẳng, đối với đường có gốc
andehit sẽ phản ứng dễ hơn xeton, do vậy mà đối với đường có gốc andehit thì
chỉ cần là kiềm nhẹ, với xeton thì cần môi trường kiềm mạnh. Cũng nhờ vậy mà
có cách phân biệt chúng.
Cơ chế hoạt động của quá trình xảy ra theo các giai đoạn sau:
*Giai đoạn 1: phản ứng đường khử và đồng II:
 Khi trộn hai dung dịch felin I và felin II với nhau thì xảy ra phản ứng giữa
chúng.
Đầu tiên tạo thành kết tủa hidroxit đồng màu xanh da trời.
CuSO4 + 2NaOH = Cu(OH)2 + Na2SO4
 Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối secnhet tạo thành muối phức hòa tan có
dung dịch màu xanh thẫm.
O-CH-COONa
HO-CH-COONa /
Cu(OH)2 + |  Cu | + H2O
HO-CH-COOK \
O-CH-COOK

 Muối phức trên là một hợp chất không bền, vì thế các đường khử
có chứa nhóm andehit hoặc xeton dễ dàng khử Cu 2+ tạo thành kết tủa oxit đồng I
màu đỏ, bản thân đường bị oxi hóa khi cho dung dich đường tác dụng với dung
dich felin.
CHO O-CH-COONa COOH
| / | HO-CH-COONa
(CHOH)4 + 2Cu | + H2O  (CHOH)4+ Cu2O + |
| \ | HO-CH-
COONK
CH2OH O-CH-COOK CH2OH

*Giai đoạn 2: Xác định lượng đường thông qua lượng Cu2+ phản ứng
 xác định lượng Cu2+ phản ứng từ lượng Cu2+ dư.
Lượng CuSO4 dư (không tham gia phản ứng) cho tác dụng với KI trong
môi trường axit sunfuric sẽ giải phóng ra iod tự do.
2CuSO4 + 4KI + H2SO4 I2 + Cu2I2 + 2K2SO4
Chuẩn độ lượng iod tạo thành bằng tiosulfat natri chuẩn, qua đó tính được
lượng đường khử có trong dung dịch.
I2 + 2Na2S2O3 = Na2S4O6 + 2NaI
Cu phản ứng = Cu ban đầu ( mẫu kiểm chứng) - Cu2+dư ( mẫu thí nghiệm)
2+ 2+

(giả sử khi dịch đường trong H2O bẳng 0

CÁCH TIẾN HÀNH:
3.1. Hóa chất:
Felin I: 34,64g CuSO4.5H2O/500ml H2O
Felin II: (173g secnhet + 50g NaOH) trong 500ml H2O
KI: 30%
H2SO4 : 25%
Na2S2O3 : 0,1N
☞ Chú ý:
Trong felin II lại có thêm secnhet vì : muối secnhet có tác dụng giữ ion
2+
Cu trong môi trường kiềm không bị kết tủa dưới dạng Cu(OH) 2, mà giữ nó ở
 dạng muối phức. Muối phức này kém bền vì thế mà đường khử có thể tác dụng
được để thực hiện phản ứng khử Cu2+Cu1+.

3.2. Cách tiến hành:

Mẫu thí nghiệm : hoa quả (chuối ).
3.2.1. Chuẩn bị dịch đường phân tích:
-Nghiền mẫu theo 1 trong 2 cách:
* Cách 1:
+ Cân chính xác 5g mẫu cho vào cối nghiền nhỏ với một lượng nhỏ nước
cất.
+ Chuyển mẫu vào bình tam giác 100ml. tráng rửa cối, chày ( khoảng
30ml).
*Cách 2:
Cân chính xác 50g mẫu chuối, chuyển mẫu vào máy xay sinh tố, cho thêm
100ml nước cất, xay nhuyễn mẫu chuối. Mỗi nhóm cân lấy 15g mẫu chuối đã
xay chuyển vào bình định mức 100 qua phễu. Định mức đến vạch.

- Trung hòa mẫu đến pH=7 bằng NaOH 5% với chất chỉ thị
phenolphtalein.
- Chiết đường trong bình ổn nhiệt ở 70 – 80°C trong 15 phút.
- Làm nguội, kết tủa protein bằng axetat chì 10%.
- Loại chì dư bằng NaH2PO4 bão hòa.
- Chuyển hỗn dịch vào bình định mức 100ml, định mức tới 100ml bằng
nước cất.
- Lắc đều, lọc và thu dịch lọc: dịch đường phân tích.
☞Chú ý:
1. Tại sao lại phải trung hòa đến pH=7?
 Trong hoa quả thường có một lượng axit, nên dịch đã có pH <7, nếu cứ để
pH <7 thì sẽ xảy ra phản ứng thủy phân của đường, làm cho các đường không
phải đường khử sẽ bị thủy phân thành đường khử, từ đó sẽ dẫn đến sai số của
phương pháp.
2. Tại sao lại chiết ở nhiệt độ 70-80°C ?
 Đường tan tốt ở nhiệt độ này, nếu nhiệt độ thấp hoặc cao hơn thì hiệu suất
phản ứng sẽ kém. Nhiệt độ cao  dao động nhiệt lớn  phân tử khuếch tán tốt,
nhưng nếu ở nhiệt độ cao thì tinh bột ( có trong hoa quả) sẽ bị hồ hóa ( hấp thụ
nước, chương lên  khuếch tán kém  lọc sẽ khó hơn).
3. Tại sao lại phải kết tủa protein bằng axetat chì? Làm như thế nào?
 Vì trong phản ứng felin1,2 có Cu2+/ OH- nếu có protein sẽ làm xảy ra phản
ứng biure, làm lượng Cu(OH)2 khó xác định.
 Chọn axetat chì vì chì phản ứng mạnh với protein, mà tránh phải trung hòa pH
lại nếu loại bỏ protein bằng cách khác.
-Nhỏ từng giọt axetat chì vào nếu thấy xuất hiện kết tủa thì lắc đều bình, cho
đến khi không còn thấy kết tủa.
4. Tại sao lại cho axetat chì vào rồi lại lọc bỏ nó?
 Vì nếu Pb2+ còn dư sẽ tác dụng với I- tạo thành PbI2  làm khó xác định được
lượng I- phản ứng.

3.2.2. Xác định đường khử:

Mẫu kiểm chứng: Bình tam giác 1 ( bình 50 ml):
3ml nước cất.
1ml felin 1
1ml felin 2
Trộn đều
Đun sôi 2 phút tính từ lúc xuất hiện bọt khí đầu tiên.
Làm nguội
1ml H2SO4 25% ( bằng ống đong), trộn đều
1ml KI 30% ( bằng pipet), trộn đều
Để phản ứng 20 phút
Chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,1N đến hết màu Iốt ( màu trắng sữa)
Mẫu thí nghiệm: Bình tam giác 2 ( bình 50ml):
1ml felin 1
1ml felin 2
1ml dịch đường phân tích
2ml nước
Đun dôi 2 phút, tính từ lúc xuất hiện bọt khí đầu tiên.
Làm nguội
1ml H2SO4 25% ( bằng ống đong), trộn đều
1ml KI 30% ( bằng pipet), trộn đều
Để phản ứng 20 phút
Chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,1N đến hết màu Iốt ( màu trắng sữa)
☞Chú ý:
1. Tại sao lại chỉ đun sôi trong 2 phút?
Chỉ đun sôi trong 2 phút vì ở đây ta xác định lượng đường khử tổng số gồm
nhiều loại đường khử khác nhau có khối lượng phân tử, thành phần khác nhau
nên hệ số chuyển đổi khác nhau.
2. Sao lại cho H2SO4 vào trước?
 cho H2SO4 vào trước KI để tạo môi trường cho phản ứng CuSO4 + KI
Lưu ý: khi đun dung dịch:
 - Nếu dung dịch mất màu hoàn toàn chứng tỏ lượng dung dịch felin cho vào
không đủ để oxi hóa hoàn toàn lượng đường nên cần rút bớt dịch đường hoặc
pha loãng dịch đường.
- Nếu không có lớp Cu2O thì cần phải tăng lượng đường, giảm nước cất
( tăng giảm lượng đường và nước cất sao cho dịch đường + nước cất = 3ml)
III- XỬ LÝ SỐ LIỆU:

*Yêu cầu:
- Tính hàm lượng đường khử tổng số (%), biết rằng cứ 1ml Na 2S2O3 tương đương
với 3,3 mg đường khử có trong mẫu thử.

*Số liệu đo được:

- Lượng mẫu : 5,29g thu được 100ml dịch
- Lấy thí nghiệm 1 ml dịch đường
- Lượng định phân Na2S2O3 0,1N (kiểm chứng) = 3,0ml
- Lượng định phân Na2S2O3 0,1N (thí nghiệm ) = 1,8ml

*Xử lý số liệu:
- Lượng Na2S2O3 0,1N (cần tính) = Na2S2O3 0,1N(kiểm chứng) -Na2S2O3 0,1N(thí nghiệm)
= 3,0 – 1,8 = 1,2 ml
Ta có cứ 1ml Na2S2O3 0,1N  3,3mg đường khử
 1,2ml  3,96 mg đường khử trong 1ml dịch
đường
 Trong 100ml dịch sẽ có : 3,96 ×10-3×100 = 0,396 g đường khử.
 Hàm lượng đường khử tổng số có trong mẫu là :
0,396
% đường khử = 5 , 29 × 100% 7,5%
Vậy hàm lượng đường khử tổng số có trong 5,29g mẫu là 7,5%.
IV- CÂU HỎI ĐẶT RA:

1. Cách xử lý mẫu để thu dịch đường đem đi phân tích như thế nào?
☞ Tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu hạt, rau, quả…cách chuẩn bị dung dịch
nghiên cứu dùng định lượng có khác nhau đôi chú, nhưng nguyên tắc chung như
sau:
- Trường hợp nguyên liêu thí nghiệm không chứ quá nhiều tinh bột hoặc
inulin, có thể chiết đường từ mẫu nguyên liệu bằng nước:
+ 1-2 gam đối với mẫu thí nghiệm là hạt hay mẫu thí nghiệm thực vật khô như
cây, lá hoặc quả khô,vv…
+ 5-10 gam đối với mẫu thí nghiệm tươi ( như hoa quả tươi)
Và làm như bước trong thí nghiệm.
 - Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai
lang, sắn, khoai tây vv…ta chiết đường bằng rượu 70-80°, đun cách thủy hỗn
hợp trong bình có lắp ống sinh hàn không khí. Trong trường hợp này không cần
kết tủa protein bằng axetat chì vì lượng protein chuyển vào dung dịch không
nhiều.
- Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều axit hữu cơ như cà chua, dứa,
chanh, khế…cần chú ý là trong quá trình đun khi chiết, đường sacaroza có thể
bị thủy phân một phần. Do đó, khi cần xác định riêng đường khử và riêng
sacaroza, trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa axit bằng dung dịch
Na2CO3 bão hòa tới pH 6,4 – 7,0.

Chú ý:Chiết trong cồn là hiệu quả nhất vì ở pH=7: enzym vẫn còn hoạt
động , chiết ở cồn 80% etanol sẽ ức chế được hoạt động của enzym.
Câu hỏi bài cũ: Có thể bỏ Na2CO3 trong dung dịch A (trong thành phần
dung dịch C) được hay không?
☞ Na2CO3 trong dung dịch này được coi là dung dịch đệm, Na 2CO3 có tác
dụng giữ ion Cu2+ trong môi trường kiềm không bị kết tủa dưới dạng Cu(OH) 2,
mà giữ nó ở dạng muối kém bền, để protein có thể dễ dàng phản ứng

BÀI 4:
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SACCAROSE
(THEO PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN, XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ
THEO DNS

V- MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM:

Trong nhiều loại rau, củ quả, các vật phẩm thực phẩm có chứa một lượng
khá lớn sacaroza cùng với đường khử. Saccaroza không có tính khử nên không
thể trực tiếp xác định bằng các phương pháp xác định đường khử được. Để xác
định được lượng đường saccaroza bằng phuwog pháp này cần phải thủy phân
saccaroza thành các đường khử, sau đó xác định lượng đường khử bằng phương
pháp DNS.
VI- NGUYÊN TẮC:
Khi thủy phân dung dịch saccaroza bằng axit ta được hỗn hợp của hai
đường khử glucoza và fructoza. Định lượng đường khử tạo thành cho phép tính
được lượng saccaroza có trong mẫu thí nghiệm.
C12H22O11 + H2O H +¿ ¿ C6H12O6 + C6H12O6
→

Định phân đường khử bằng phương pháp DNS dựa trên cơ sở phản ứng tạo
màu giwuax đường khử với thuốc thử axit dinitr salicylic (DNS). Cường độ
 màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm
vi nhất định. Biết được mật độ quang của dung dịch đường khử nghiên cứu với
thuốc thử DNS, dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucoza tinh khuyết với thuốc
thử này, ta sẽ dễ dàng tính được hàm lượng đường khử, cũng như là hàm lượng
sacaroza trong mẫu.
C=O + DNS oxy hóa OH −¿→ ¿ -COOH + DNSkhử ( OD540nm)
VII- CÁCH TIẾN HÀNH:
3.1. Hóa chất:
- Dùng thủy phân saccaroza:
Dung dịch HCl 5%
Dung dịch NaOH 5% hoặc dung dịch Na2CO3 bão hòa
Metyl đỏ 0,02% (0,02g metyl đỏ trong 60ml rượu etylic và 40ml nước cất)
- Thuốc thử DNS:
Hỗn hợp: Nước cất 1416ml
3,5 axit Dinitrosalicylic 10,6 g
NaOH 19,8 g  tạo môi trường
Hòa tan trước ba chất trên sau thêm :
Muối K-Na tactra kép 306g  đảm bảo bền màu dung
dịch
Phenol( nóng chảy ở 50°C ) 7,6 ml  tăng độ nhạy của thuốc
thử
Na metabi sulfit ( Na2S2O5) 8,3g  chất khử để đảm bảo
không có phản ứng giữa O2 không khí và đường khử
Chuẩn 3ml thuốc thử DNS bằng HCl 0,1 N với chỉ thị phenolphtalein hết
5-6ml là được. Thêm NaOH nếu cần.
3.2. Cách tiến hành:
3.2.1. Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp DNS
1. dung dịch glucose gốc : 2mg/l
2. Tiến hành:
Chuẩn bị một dãy ống nghiệm sạch (6 ống).
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Dung dịch glucoso gốc 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
(ml)
Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Dung dịch DNS (ml) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Trộn đều, đun cách thủy 5 phút, làm lạnh nhanh trong nước lạnh
Đo độ hấp phụ tại bước sóng 540nm với mẫu trắng là mẫu trong ông nghiệm 1.
Yêu cầu: tính toán, đo và điền số liệu vào bảng tiếp theo và vẽ đồ thị đường chắn.
Nồng độ glucose Ci 0 0,12 0,24 0,36
(mg/ml)
OD540nm 0 0,211 0,426 0,648
C OD
0 0 OD
0.7 0.12 0.211
0.24 0.426
0.6 f(x) = 1.79916666666667 x − 0.00259999999999994
0.36 0.648
R² = 0.999868293901943
0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

3.2.2. Phân tích mẫu:

Mẫu thí nghiệm: nước ngọt chưa sacarose

1. Thủy phân saccaroso

Cho vào bình 0,4 ml mẫu ( dùng pipet), thêm 19ml nước cất ( dùng
ống đong) và 10ml HCl 5% ( dùng ống đong). Lắp sinh hàn khí và đun sôi cách
thủy 30 phút để thủy phân saccarose. Làm nguội và trung hòa mẫu bằng NaOH
5% với giấy chỉ thị pH. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức cỡ 100ml,
định mức bằng nước cất tới vạch mực. Lắc đều, được dịch đường khử sau thủy
phân.
2. Dịch đường khử trước thủy phân:
Dùng pipet cho 0,4 ml dịch mẫu nước ngọt vào bình định mức cỡ
100mk. Định mức bằng nước cất tới vạch mức. Lắc đều, được dịch đường khử
trước thủy phân.
3. Xác định đường khử theo phương pháp axit dinitro salicylic
( DNS)
Mẫu sau thủy phân: ống 1
0,5 ml dịch đường khử sau thủy phân( pha loãng nếu cần, dùng pipet)
1,5 ml DNS ( dùng pipet)
Đun sôi cách thủy 5 phút ( khi nồi cách thủy sôi mới cho mẫu vào)
Làm nguội nhanh.
Đo mật độ quang (λ = 540 nm) với mẫu trắng là nước cất.
Mẫu trước thủy phân: ống 2
0,5ml dịch đường khử trước thủy phân ( dùng pipet)
1,5 ml DNS
Đun sôi cách thủy 5 phút
Làm nguội nhanh
 Đo mật độ quang (λ = 540 nm) với mẫu trắng là nước cất.
Từ giá trị mật độ quang đo được cho mẫu trước và sau thủy phân, tra đồ
thị chuẩn giữa hàm lượng glucoso và mật độ quang suy ra hàm lượng đường
khử có trong dịch đường trước và sau thủy phân (mg/ml)
(cũng có thể đo độ hấp thụ của mẫu thí nghiệm, đối sánh với mẫu kiểm
chứng).

☞ Chú Ý:
- Dùng ống sinh hàn vì trong quá trình đun cách thủy, HCl bay hơi.
- Trung hòa mẫu vì phản ứng DNS – đường khử diễn ra trong môi
trường kiềm mới tạo ra phản ứng màu nên mẫu có axit cần phải được trung hòa.
- Không dùng phenolphtalein vì ảnh hưởng đến màu của phản ứng
dẫn đến sai số.
- Thủy phân bằng HCl chứ không bằng H2SO4 vì sẽ xảy ra phản ứng
oxi hóa nếu dùng H2SO4.
- Các mẫu đã được đun có thể để được một thời gian ( 20 phút) trước
khi đo. Các mẫu không đun sẽ bị phân hủy dần dần.
- Nếu dùng nước ngọt có ga cần phải bài khí, không được đun nóng
để đuổi CO2 vì saccarose bị thủy phân và hàm lượng sẽ giảm.
- Khi xác định saccarose trong các dịch chiết bằng nước có thể kết
quả sẽ bị sai khác bởi vì có một số polisacarit cao phân tử khác cũng chuyển
vào dịch chiết một phần hay hoàn toàn. Trong quá trình thủy phân những chất
này cũng tạo thành các monosacarit. Do đó, có thể chiết đường bằng rượu sao
cho nồng độ của rượu trong dung dịch đạt 75-80%.
- Nếu lượng đường nhiều thì phải pha loãng dung dịch đường để
nồng độ nằm trong vùng OD vì ở đây thì nồng độ mới tỷ lệ thuận với cường độ
màu. Chú ý không pha loãng dung dịch DNS hay thay vào phương trình vì lúc
này nồng độ không tỷ lệ với cường độ màu.
- Nếu lấy hai mẫu sau thủy phân và trước thủy phân khác nhau về tỷ
lệ ml thì cần phải lấy một mẫu H2O để kiểm chứng.
VIII- XỬ LÝ SỐ LIỆU:
Phương trình đường chuẩn:
Y = 0,7739x – 0,0061.
 Mẫu 1: OD = 0,700
 nồng độ đường glucozo  0,912 mg/ml
 số gam glucozo có trong 100 ml là 91,2 mg
 số gam saccacrozo có trong 0,4 ml mẫu là: 91,2 ×0,95 = 88,64mg
=0,08864 g
0,08864
 hàm lượng saccarozo trong mẫu là 0,4
×100 %=22 ,16 %
 Mẫu 2: OD = 0,708
  nồng độ đường glucoso  0,923 mg/ml
  số gam glucoso có trong 100 ml là 92,3 mg
  số gam saccacrozo có trong 0,4 ml mẫu là: 87,68 mg =0,08768 g
0,08768
  hàm lượng saccarozo trong mẫu là 0,4
× 100 %=21, 92 %

So Sánh thực nghiệm: mẫu sử dụng là nước giải khát C2.

Lấy 0,4 mg sau 2 lần kiểm nghiệm thu được kết quả lượng đường saccaroso là
21,92-22,16g / 100ml
Trên vỏ bao bì thực nghiệm ghi 7,1-14,7g / 100 ml
 CÂU HỎI ĐẶT RA:
1. Phương pháp này không đặc hiệu, nó đo tất cả các đường khử. Nếu
glucozo được dùng làm đường chuẩn thì xelobioza cho giá trị thấp hơn 15% còn
xyloza lại cho cao hơn 15%.
2. Tại sao lại phải thủy phân sacaroso?
Vì saccaroso không có tính chất khử , không có gốc C=O do là G-F 1,2
nên gốc C=O bị mất. Do vậy, cần phải thủy phân để tạo ra glucoso và fructozo
để áp dụng được phương pháp cho đường khử.
3. Liệu trong phản ứng có phản ứng ới frutose hay không?
Vì fructozo có hai gốc ở hai vị trí khác nhau. Vì CHO > C=O nên cần
một điều kiện đủ mạnh để có thể tác dụng.
4. Tại sao lại chỉ thủy phân được saccaroso?
Với mỗi loại đường có điều kiện thủy phân khác nhau, nên chỉ cần tạo
điều kiện phù hợp để chỉ thủy phân saccaroso.
5. Làm thế nào để có thể loại bỏ sai số ấy?
Chúng ta có thể sử dụng enzim đặc hiệu để thủy phân saccarozo, làm
giảm sai sô.
6. Có thể xác định lượng saccaroso bằng cách nào?
Chúng ta có thể áp dụng tất cả các phương pháp xác định đường khử để
xác định saccaroso, và áp dụng đúng như các bước trong bài, bằng cách thủy
phân saccaroso thành các đường khử rồi xác định đường khử theo các phương
pháp từ đó suy ra lượng saccaroso.
7. Phương pháp rovich có thể xác định được những thành phần gì?
Ngoài xác định được các loại đường khử như đã biết ta có thể xác định
được những chất có thể thủy phân ra đường khử rồi áp dụng phương pháp

BÀI 5:
PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ĐƯỜNG/ OLIGOSACCHARIT
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ BẢN MỎNG
I- MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM:
Xác định thành phần đường/ oligosaccharit có trong mẫu bằng phương
pháp sắc kí bản mỏng.
Biết cách thực hành với bản sắc kí.
II- NGUYÊN TẮC:
- Sắc kí là quá trình phân li, phân tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau
giữa pha tĩnh và pha động.
- Pha tĩnh là lớp silicagen ( SiO2.x H2O)
- Pha động: hệ dung môi ( n- propanol: nitromethan: H 2O= 7:1:2) ( dừng nước do
nước có độ phân cực cao nên có thể đủ khả năng làm tan hết các chất).
 - Khi chạy sắc kí một thời gian, chất có ái lực cao hơn với pha tĩnh sẽ bị giữ lại
trên pha tĩnh lâu hơn nên chuyển động chậm hơn, quãng đường dịch chuyển
cũng ngắn hơn.
- Phương pháp sắc kí bản mỏng thường dùng để phân tách các hợp chất phân cực,
có khả năng tạo liên kết cầu H
- Phương pháp này không đặc hiệu cho đường. Nó có thể xác dịnh được các hợp
chất hữu cơ khác nhưng cần một hệ dung môi khác.
- Ái lực của pha tĩnh có thể là liên kết cầu H, liên kết xiliagen, liên kết vật lí ( hấp
thụ trên bề mặt).
- Hệ số dịch chuyển Rf:
a
+ Rf = b trong đó : a là quãng đường dịch chuyển của chất cần phân
tích.
b là quãng đường dịch chuyển của dung môi.
+ Rf>> thì ái lực của chất phân tích với pha tĩnh càng nhỏ và ngược lại.
+ Trong 1 điều kiện xác định ở cùng một điều kiện, R f là một hằng số dặc trưng
cho chất cần phân tích ( thông thường là khi thực hiện trên cùng một bản sắc
kí).
- Buồng sắc kí phải thật kín khí và được bão hoà hơi dung môi.
- Hiện nay, sắc kí bản mỏng được sử dụng rộng rãi hơn sắc kí giấy do khả năng
phân tách cao, thời gian sắc kí nhanh hơn và các bản sắc kí được làm sẵn với
các chất hấp thụ với chiều dày mong muốn khác nhau.
III- CÁCH TIẾN HÀNH:
3.1. Hóa chất:
- Mẫu phân tích : chế phẩm đường chức năng H2.
- 3 mẫu đường để làm đường chuẩn:
1. glucoso

2. Rafinose : công thức

 3. Xylose:

- Hệ dung môi: hỗn hợp n- propanol: nitromethan: H2O= 7:1:2

- Bản sắc kí: Sắc kí bản mỏng, Meck,Silicagel 20*20cm
3.2. Cách tiến hành:
- Chuẩn bị bản sắc kí: cắt bản sắc kí theo kích thước ở dưới, lưu ý đi
găng tay để giữ bản sắc kí sạch.

2 cm
- Chấm mẫu:
+ đánh dấu vị trí và tên mẫu
Lưu ý: kẻ đường chấm mẫu bằng bút chì, không kẻ bằng bút bi vì mực
bút bi là cho, khi nhúng vào dung môi trong quá trình chạy sắc kí sẽ gây nhiễu.
+ Thực hiện:
 Lấy 10 l mẫu bằng ống mao quản thủy tinh hoặc đầu côn 10ul
 Chấm mẫu vào vị trí quy định, đường kính vết loang không vượt quá 5mm.
Lưu ý: chấm nhiều lần ( chờ khô mới chấm tiếp). Mỗi lần chấm 3 lần.
- Chạy sắc kí:
  Đặt bản sắc kí đã chấm mẫu vào bình sắc kí có chứa dung môi hữu cơ đã bão
hòa hơi dung môi, mép dưới bản sắc ksi được nhúng vào dung môi sao cho
không ngâm ngập mẫu trong dung môi, mặt chấm mẫu hướng xuống phía dưới.
 Quá trình chạy được kết thúc khi vệt chạy của dung môi cách mép trên của tờ
giấy sắc kí 1 cm
 Lấy bản sắc kí ra, đánh dấu vị trí của vệt dung môi
 Sấy khô bản sắc kí
Lưu ý:
 Đặt bản sắc kí vào bình sắc kí sao cho mép dưới bản sắc kí được nhúng vào
dung môi nhưng không ngâm ngập mẫu trong dung môi, tránh các mẫu bị lẫn
vào nhau gây nhiễu mẫu.
 Dung môi hữu cơ trong bình sắc kí phải được bão hòa hơi dung môi để tránh
bay hơi. Dung môi phải tinh khiết, không màu hoặc màu rất nhạt.
- Phát hiện mẫu:
 Phun đều dung dịch H2SO4 5% trong cồn tuyệt đối lên bản sắc kí ( hoặc nhúng
nhanh bản sắc kí vào khay đựng dung dịch hiện màu trên)
Phản ứng hiện màu : (C6H12O6)n H 2 SO→
4 , t ° 6n C + 6n H O
2

 Sấy khô bản sắc kí ở 110°C trong 5 phút 9 hoặc hơ bản mỏng trên bếp điện),
xuất hiện dần. Cẩn thận làm cháy bản sắc kí.
Lưu ý: H2SO4 pha trong cồn do cồn dễ bay hơi nên giảm thời gian của quá trình sấy).
IV- XỬ LÝ SỐ LIỆU:
Mẫu 1( glucoso) Mẫu 2 ( rafinose) Mẫu 3 Mẫu 4 ( H2)
(xyloso)
a (cm) 1,9 1,4 2,2 1,5 2,3
b (cm) 6 6 6 6 6
Rf  0,3167 0,2333 0,3667 0,25 0,3833

Vậy có thể thấy trong mẫu H2 có chứa xyloso và rafinose

Bản sắc khí sau khi hơ trên bếp

V- CÂU HỎI ĐẶT RA:
Câu hỏi 1: Nếu đường chấm bị dính nhau, loang không hiện rõ các
đường tròn tách biệt thì sẽ làm như thế nào?
☞ Nguyên nhân là do ái lực của chúng không khác nhau nhiều nên có
hiện tượng như vậy.
Biện pháp:
 Xoay bản sắc kí cho chạy lại.
 Thay đổi dung môi khác cho phù hợp
 Thay đổi bản sắc kí
Nếu điểm loang bắt đầu từ gốc có nghĩa do nồng độ lớn nên dung môi
không hết được cần phải pha loãng nồng độ.

BÀI 6:
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ GLUCOAMYLASE
(Xác định đường khử theo phương pháp DNS)
VI- MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM:
Xác định hoạt độ glucoamylase thông qua lượng đường khử
theo phương pháp DNS

VII- NGUYÊN TẮC:

- Glucoamylase là enzym phân cắt các liên kết glicozit α (1-4) , α(1-
6) bên trong phân tử tinh bột giải phóng glucoza. ( trong phản ứng này không có
saccaroso hay mantozo, lactoso vì cấu trúc phân tử không có trong thành phần
thủy phân của tinh bột)
- Phương trình: E + S → E + P
(C6H10O5)n + nH2O glucoamylase , →30 ° C , pH tốiưu nC6H12O6
- Phương pháp này dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bằng enzym
glucoamylase sau đó xác định lượng đường khử glucose bằng phương pháp
DNS. Đo quang ở 540nm, theo đường chuẩn xác định glucoso từ đó xác định
hoạt độ enzym.
- Đơn vị hoạt độ glucoamylase : một đơn vị hoạt độ glucoamylase
được định nghĩa là lượng enzym cần thiết trong thời gian 1 giờ ở 30°C tác dụng
lên tinh bột tan giải phóng được 1mg glucose. (Tinh bột tan là hồ tinh bột).
- Cách tiến hành gồm 3 giai đoạn :
+ giai đoạn phản ứng xúc tác enzym.
+ giai đoạn dừng phản ứng ( vô hiệu hóa enzym)
 Thực hiện ở giây thứ 59 của phút thứ 9 ( thực hiện vô hiệu hóa ở phút
thứ 10 do trong 10 phút đầu enzym có hoạt độ cao và càng về sau càng chậm
nên để xác định hoạt độ enzym cần xác định ở thời điểm enzym hoạt động
mạnh.
Nguyên tắc :
DNS có môi trường kiềm pH # 0
Enzym có độ pH tối ưu là 4,7 thì hoạt động tốt nhất do sự ảnh hưởng của
pH nên dẫn đến thay đổi trạng thái làm khả năng liên kết thay đổi, cấu trúc
không gian thay đổi.
Có thể thay thế bằng cách tăng nhiệt độ hoặc dùng kim loại nặng…những
yếu tố gây biến tính protein làm cấu trúc bậc cao của protein bị phá hủy dẫn
đến trang thái hoạt động bị phá vỡ
- Nguyên tắc làm mẫu kiểm chứng:
Để không cho phản ứng thủy phân với enzim diễn ra.
Để có thể xác định được lượng đường khử nằm ngoài phản ứng thủy
phân.
Do vậy nên cho DNS vào trước khi cho tinh bột để có thể vô hiệu hóa enzym,
rồi sau đó cho tinh bột.
VIII- CÁCH TIẾN HÀNH:
3.1. Hóa chất:
- Chế phẩm Distillase ( Dupont) do PTN cung cấp
- Dung dịch tinh bột 1%
- Thuốc thử DNS
3.2. Cách tiến hành:làm song song mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng:

Các bước ống nghiệm 1 (mẫu thí nghiệm) Ống nghiệm 2 (mẫu kiểm chứng)
tiến hành
Chuẩn bị - Chuẩn bị nồi cách thủy ở
30°C
- Đặt bình dung dịch tinh
bột và lọ/ ống chứa dung dịch
enzym trong bể ổn nhiệt 30°C
trong 10 phút
Bước 1: Phản ứng xúc tác của enzym
- 0,5ml dịch enzym phân
tích ( đã ở 30°C)
- 0,5ml dung dịch hồ tinh
bột 1% ( đã có ở 30°C)
- Trộn đều và để phản ứng
đúng 10 phút ở 30°C
 Bước 2: Vô hoạt enzym - 0,5ml dịch enzym phân tích
- Bổ sung 3ml DNS, trộn - 3ml DNS (trộn đều)
đều ( sau đó đặt ống nghiệm - 0,5ml dung dịch hồ tinh bột
vào giá trong nồi cách thủy) 1%. Trộn đều (sau đó đặt ống
nghiệm vào giá trong nồi cách
thủy.
Bước 3: Định lượng sản phẩm tạo thành: - Đun sôi cách thủy 5 phút 9
- Đun sôi cách thủy 5 phút khi nồi cách thủy sôi mới cho mẫu
9 khi nồi cách thủy sôi mới cho vào)
mẫu vào) - Làm nguội nhanh
- Làm nguội nhanh
Bước 4: Đo mật độ quang (λ= 540nm) đối sánh với mẫu kiểm chứng.

IX- XỬ LÝ SỐ LIỆU:
Chú ý:
- Sử dụng đường chuẩn glucose đã dựng ở bài 4 để tính toán hoạt độ
glucoamylase của chế phẩm ( U/ml chế phẩm thô).
- Mẫu enzym làm thí nghiệm có số liệu được công bố:
TYPICAL CHARACTERISTICS
Activity: 570 GAU/g (minimum)
Appearance: Clear brown liquid pH: 4.0 - 4.5
Specific gravity: 1.13 - 1.16 g/ml
Formulation: Food grade
UNIT DEFINITION :One Glucoamylase Unit (GAU) is the amount of enzyme
that will liberate one gram of reducing sugars calculated as glucose per hour
from soluble starch substrate under the conditions of the assay. A detailed assay
method is available upon request.
Định nghĩa: một đơn vị hoạt độ glucoamylase được định nghĩa là lượng enzym
cần thiết trong thời gian 1 giờ ở 30°C tác dụng lên tinh bột tan giải phóng được
1g glucose
Kết quả đo được qua 3 mẫu thí nghiệm :
Với 0,5 ml enzym và 0,5 ml hồ tinh bột.
Phương trình: y= 0,7739x – 0,0061
OD Nồng độ glucose (mg/ml)
0,755 0,983
0,732 0,954
0,996 1,295

X- MỘT SỐ LƯU Ý VỀ ENZYM VÀ CÂU HỎI ĐẶT RA:

5.1Một số lưu ý về enzym:
Enzim hay fecmen là những chất xúc tác sinh học có bản chất protein và
tính đặc hiệu 4 khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá học khác nhau. Mỗi một
enzim có khả năng xác tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định. Hoạt độ
xác tác của enzim càng mạnh thì lượng có chất bị chuyển hoá hoặc lượng sản
phẩm phản ứng tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Vì vậy, có thể
đánh giá hoạt độ xúc tác của enzym bằng cách xác định tốc độ chuyển hoá cơ
chất hoặc tốc độ tích luỹ sản phẩm phản ứng. Để đạt mục tiêu này có thể dùng
nhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp đo độ nhớt, phương pháp phân
cực kế, phương pháp áp kế, phương pháp phổ quang kế, phương pháp chuẩn độ
liên tục, phương pháp sắc ký và phương pháp hoá học.
Đối với chế phẩm enzim , ngoài việc xác định mức độ hoạt động của nó
cần phải đánh giá độ thuần khiết (độ sạch) của chế phẩm . Đại lượng đặc trưng
cho độ thuần khiết của chếphẩm enzim là hoạt độ riêng. Hoạt độ riêng được
biểu diễn bằng số đơn vị enzym trên 1mg Protein
Những điều cần lưu ý khi xác định hoạt độ enzym:
1 . Enzim là những protein có hoạt tính xúc tác nên không bền vững, rất
nhạy đối với tác động lý , hóa học . Vì vậy , cần tránh các yếu tố có thể gây biến
tính protein như nhiệt độ cao pH quá axit hoặc quá kiểm , muối kim loại nặng
vv . . Ngoài ra cần tránh tạo bọt trong hỗn hợp phản ứng vì một số enzym có thể
bị kìm hãm trên bề mặt phân chia .
Các điều kiện phản ứng ( pH , nhiệt độ ) phải ở trong giới hạn enzim có
thể tồn tại bền vững và giữ được cố định trong suốt thời gian phản ứng .
Thường người ta tiến hành phản ứng , trong dung dịch đệm với pH ổn định và
tối ưu đối với enzim đã cho và ở 30°C trong máy siêu ổn nhiệt
2 . Phản ứng enzim được tiến hành trong điều kiện dự cơ chứ . Sau khi
dừng phản ứng lượng có chất bị chuyển hoá không quá 20 % ( có thể khoảng 20
- 30 % ) để có thể bão hòa hết lượng enzym.
3.Thời gian xác định hoạt độ không quá lâu, thường là 10 phút ( từ 5-30
phút).Tốt nhất là xác định tốc độ ban đầu của phản ứng ( 30 - 60 giây) vì ở thời
gian tốc độ phản ứng khá ổn định , sau đó bắt đầu giảm. Trong một số trường
hợp hoạt độ enzym quá thấp có kéo dài thời gian phản ứng giữa enzym với cơ
chất đến 1 giờ hay lâu hơn.
4 . Khi xác định hoạt độ enzim phải làm mẫu kiểm chứng song song với
mẫu thí nghiệm . Trong mẫu kiểm chứng enzim đã bị làm vô hoạt trước khi cho
vào tiếp xúc với cơ chất.
5 . Khi chuẩn bị dung dịch cnzim để xác định hoạt độ thì tuỳ theo đặc
tính và mức độ thuần khiết của chế phẩm Enzim mà tiến hành chuẩn bị để có
được dung dịch enzim trong suốt.
 Nếu là các chế phẩm thô cần hoà tan enzim , loại bỏ sinh khối và tạp
chất rắn.
Đối với canh trường lông phải ly tâm ở nhiệt độ thấp hay lọc để nhận
được dung dịch trong suốt.
Đối với canh trường bỏ mặt phải nghiền nhỏ rồi chiết rút enzim bằng
nước hay dung dịch đệm có pH thích ứng với lượng dung môi gấp 10 - 20 lần
( thường là 10 lần) đối trọng . Sau đó đem lọc hoặc ly tâm để có được dung dịch
enzim trong suốt .
Nếu là các chế phẩm kỹ thuật hay thuần khiết phải hoà chế phẩm vào
nước hoặc dung dịch đệm thích ứng rồi dùng que thuỷ tinh trà cẩn thận với một
lượng nhỏ dung môi , sau đó thêm nước hoặc dung dịch đệm cho đến một thể
tích nhất định . Nếu dung dịch không suốt thì phải lọc hoặc ly tâm.
5.2Câu hỏi đặt ra:
Câu 1: nếu sử dụng phương pháp Rorvich thì thay DNS để vô hoạt enzym
như thế nào?
 Chúng ta thay DNS bằng 1ml felin 1, 1ml felin 2 và 2 ml H2O . Ở đây lấy
tác dụng của Cu(OH)2 và NaOH để vô hoạt hóa enzym nên sẽ cho felin 1, 2 vào
trước.

BÀI 7:
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PROTEASE
( Theo phương pháp Anson cải tiến)
XI- MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM:
Xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Anson cải tiến, xác định
được đường chuẩn Tyrosine, sử dụng đường chuẩn để tính hoạt độ protease.

XII- NGUYÊN TẮC:

Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân protein cazeinat natri ( cơ chất có
thể là cazein hoặc hemoglobin) bằng chế phẩm enzim có trong dung dịch
nghiên cứu rồi tiếp đó làm vô hoạt enzim và kết tủa protein chưa bị thủy phân
bằng axit tricloaxetic. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy
phân bằng phản ứng màu với thuốc thử folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của tyrozin
để tính lượng sản phẩm tương ứng do enzim xúc tác tạo nên.
Hoạt độ proteaza ( HĐP) đặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải
protein tới peptit và axit amin của các enzim và được biểu thị bằng số đơn vị
proteaza trong 1g chế phẩm. Hoạt độ riêng của chế phẩm biểu thị bằng số đơn
vị proteaza trên 1 mg protein của chế phẩm.
 Hoạt độ của các chế phẩm proteaza có nguồn gốc nấm mốc và vi khuẩn
được xác định tại các trị số pH sau:
pH = 2,5  0,2 đối với proteinaza axit
pH = 5,6  0,2 đối với proteinaza axit
pH = 7,2 0,2 đối với proteinaza trung tính
pH = 9,5  0,2 đối với proteinaza kiềm
Dựa vào định nghĩa hoạt độ ta sẽ có các bước làm và những hóa chất
cần sử dụng trong thí nghiệm.
Định nghĩa : 1 đơn vị hoạt độ protease là lượng enzim cần thiết trong
thời gian 1 phút ở 30°C chuyển hóa được casein thành một lượng sản phẩm
không bị kết tủa bởi axit tricloacetic ( TCA) tương đương với 1 mol tyrosine. (
trong sản phẩm của khoog chỉ có tyrosine nên ở đây chúng ta coi là tương
đương).
1 AU : casein lượng→enzim sản phẩm ( không kết tủa với TCA )  1 mol
Tyrosine.
 Nguyên tắc chung là:
1. Giai đoạn phản ứng với cơ chất: cơ chất là casein cho tác dụng với enzim
trộn và để phản ứng với enzim trong 10 phút ở 30°C.
2. Vô hoạt enzim: cho TCA vào để kết tủa đại phân tử, sau đó mang đi lọc
lấy phần sản phẩm không kết tủa với TCA.
3. Xác định sản phẩm theo định nghĩa: đem dịch lọc đi tạo phản ứng với
folin, đo mật độ quang rồi dựa vào đường chuẩn để tính.
Tyr ( sản phẩm) + Folin ( có kiềm nhẹ) = dung dịch màu xanh hấp thụ ánh
sáng cực đại 750nm ( folin có tính chấ khử các axit amin có vòng thơm).
 Tính nồng độ theo đường chuẩn:
- Tyrosine được đo ở bước sóng 270(3)
- Đường OD trong đường chuẩn là OD của sản phẩm phản ứng giữa
tyrosine với folin và sản phẩm này được đo ở bước song 750nm
( dung dịch phải có màu thì mới đo ở vùng tử ngoại)
 Nguyên tắc làm mẫu kiểm chứng là : kiểm lại xem cơ chất có thể
tự thủy phân ra sản phẩm không bị kết tủa bởi TCA hay trong lượng dung dịch
ấy có sản phẩm nào như vậy hay không khi enzim đã bị vô hoạt, và trong mẫu
kiểm chứng buộc phải có tất cả các chất trong mẫu thí nghiệm.
CÁCH TIẾN HÀNH:
3.1. Hóa chất:
- Dung dich casein 1% pha trong đệm pH 7 ( pH ở đây để cho cơ
chất có thể hoạt động mạnh nhất)
- Mẫu enzim cần phân tích : chế phẩm Alcalase của Novozyme,
enzyme papain từ nhựa đu đủ.
 - TCA 0,3 M
- Na2CO3 0,5 M
- Dung dịch folin

3.2. Cách tiến hành:

3.2.1. Xây dựng đường chuẩn Tyrosin:
Pha dung dịch Tyrosine gốc 0,5 mol/ml ( cân 0,905 mg tyrosine pha
trong 10ml nước cất )
Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Dung dịch tyrosine 0,5 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
mol/ml
Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Dung dịch Na2CO3 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
0,5M (ml)
Trộn đều, để 10 phút
Dung dịch folin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Trộn đều, để 30 phút, đo OD 750nm, đối sánh với nước cất

3.2.2. Phân tích mẫu:

Phản ứng enzym với cơ chất
( làm song song ống nghiệm với ống kiểm chứng)
Chuẩn bị: đặt lọ đựng dung dịch casein và ống đựng enzym cần xác định
hoạt độ vào trong bình ổn nhiệt 30°C trong 10 phút
Lấy các ống nghiệm khô, sạch:
Ống thí nghiệm Ống kiểm chứng
2ml Dung dich casein 1% pha 2ml Dung dich casein 1% pha
trong đệm pH 7 ( đã ở 30°C) trong đệm pH 7 ( đã ở 30°C)
2ml dịch enzym pha trong đệm 4ml TCA 0,3M
pH 7 ( đã ở 30°C) Trộn đều
Trộn đều, để phản ứng trong đúng 2ml dịch enzym pha trong đệm
10 phút ở 30°C pH 7 ( đã ở 30°C)
Dừng phản ứng enzym bằng 4ml Trộn đều và để yên hỗn hợp trong
TCA 0,3M 20 phút
Trộn đều và để yên hỗn hợp trong Lọc, thu được dịch lọc kiểm
20 phút chứng
Lọc, thu được dịch lọc thí nghiệm
 Xác định sản phẩm phản ứng enzym
(làm song song ống thí nghiệm và ống kiểm chứng)

Ống thí nghiệm Ống kiểm chứng

0,3ml dịch lọc thí nghiệm ( dùng pipet) 0,3ml dịch lọc kiểm chứng ( dùng
1,5ml Na2CO3 0,5M pipet)
Trộn đều, để 10 phút 1,5ml Na2CO3 0,5M
Thêm 0,3ml dung dịch folin. Trộn đều, để 10 phút
Trộn đều, để 30 phút. Thêm 0,3ml dung dịch folin.
Trộn đều, để 30 phút.
Đo OD750nm của dịch trong ống thí nghiệm, đối sánh với dịch kiểm chứng
Tra đồ thị chuẩn giữa hàm lượng tyrosine và mật độ quang.
Chú ý:
Đối với mỗi enzym bền trong khoảng pH nhất định do vậy tùy thuộc vào
từng enzym nghiên cứu mà ta chọn các dung dịch đệm cũng như khoảng pH
thích hợp để chiết rút enzym, đảm bảo không làm mất hoặc làm giảm hoạt tính
xúc tác của nó.
Trong một số trương hợp tùy thuộc vào dạng chế phẩm, chất lượng của
chế phẩm ( mức độ thuần khiết) enzym nghiên cứu mà phạm vi mật độ quang
đo được có thể có các trị số khác nhau.
Cùng một chế phẩm enzym nhưng pH của hỗn hợp phản ứng khác nhau
thì phạm vi mật độ quang đo được cũng có thể biến đổi. vì thế, khi tiến hành xác
dịnh hoạt độ proteaza của một chế phẩm mới phải xác định hoạt độ của nó 2-3
lần ở các chế độ pha loãng khác nhau tại cùng một trị số pH cho trước. Sau đó,
tìm xem tại các giá trị nào của mật độ quang thì thu được hoạt độ của chế phẩm
như nhau. Từ đó mới tiến hành xác định hoạt độ trong vùng mật độ quang vừa
tìm được.
XIII- XỬ LÝ SỐ LIỆU:
Phương trình: y= 1,0629x + 0,0016
Theo phương trình có: nồng độ tyrosine là x mol/ml.
 trong 8ml sẽ có 8x mol tyrosine được sinh ra trong 10 phút.
 trong 1 phút sẽ có 0,8x mol tyrosine.
1 đơn vị hoạt độ chuyển hóa được tương đương 1mol.
 có 0,8x đơn vị hoạt độ trong 2ml dịch enzym.
 có 0,4x× f AU/ml trong dịch enzym.( f=4000 lần)
Bảng xử lí số liệu:
Lần đo OD750nm Nồng độ tyrosine Hoạt độ proteaza
(x mol/ml) (0,4xf AU/ml)
 1 0,271 0,253 404
2 0,209 0,195 312

BÀI 8:
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN C
(Phương pháp chuẩn dộ bằng 2,6 diclophenolindophenol-2,6
DCIP)
XIV- MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM:
Xác định lượng vitamin C có trong mẫu (hoa quả), tính được hàm lượng
của vitamin C trong mẫu mg%.

XV- NGUYÊN TẮC:

2.1. Nguyên tắc chuẩn độ:
Axit ascocbic ( vitamin C) là một hợp chất chưa no có hai nhóm enol và
2 nhóm hydroxit, hòa tan trong nước và tồn tại dưới dạng oxi hóa và dạng khử.

Axit ascocbic bị phá hủy rất nhanh dưới tác dụng của các chất oxy hóa
và bền trong môi trường axit. Do vậ, người ta thường chiết axit ascocbic trong
mẫu bằng các dung dịch axit như axetic 5%, axit metaphotphoric 2%...
Phương pháp dựa trên nguyên tắc là axit ascocbic có khả năng oxi hóa
khử thuận nghịch chất chỉ thị đặc trưng màu xanh là 2,6 diclophenolindophenol
( DCIP). Dựa vào lượng chất chỉ thị tiêu tốn ta tính được lượng axit ascocbic có
trong mẫu thí nghiệm. Sơ đồ phản ứng giữa axit ascocbic với chất chỉ thị DCIP
như sau:
Vitamin C + 2,6 DCIP  DHAA + 2,6 DCIP
(Khử) ( oxi hóa) (oxi hóa) (Khử)
Quá trình đổi màu:
Màu xanh (môi trường kiềm) màu hồng ( môi trường axit)  không màu
 Phản ứng là phản ứng thuận nghịch, chiều thuận xảy ra ở điều kiện
thường và rất dễ dàng xảy ra, nhưng chiều nghịch lại khó xảy ra và cần có chất
xúc tác.

* Đặc điểm chất chỉ thị:

- Chất chỉ thị này là một hợp chất có khả năng đổi màu kép, một mặt,
khi pH của môi trương thay đổi từ kiềm qua axit thì màu của chất chỉ thị chuyển
từ xanh sang hồng, mặt khác dạng oxy hóa của DCIP có màu, còn dạng khử
không màu (DCIP có màu xanh tỏng môi trường kiềm và môi trường axit yếu,
có màu tím trong khoảng pH từ 4 đến 5 và có màu hồng ở môi trường có pH < 4
).
- DCIP bền trong môi trường trung tính và kém bền ở môi trường axit
nên màu hồng khi DCIP dư chỉ tồn tại trong vòng khoảng 1 phút.

2.2. Nguyên tắc xác định hệ số f:

- Do DCIP kém bền, thay đổi nồng độ tùy thuộc vào nhiệt độ nên nồng
độ của nó cũng thay đổi. Chính vì vậy, nên phải xác định hệ số f.
- Vitamin C + KIO3/H+ + hồ tinh bột  xuất hiện màu xanh
+ Phương trình phản ứng :
KIO3 + 6HCl + 5KI  3I2 + 6KCl + 3H2O
+ Vitamin C trong trường hợp này ở dạng khử ( axit ascocbic), khi cho
I2 vào thì axit ascocbic bị oxi hóa và chuyển sang dạng dehydroascorbic còn I 0
bị khử thành I- nên dung dịch mất màu.
Khi cho dư I2 thì lúc này dung dịch xuất hiện màu xanh (với chất chỉ thị
là hồ tinh bột).
Phương trình phản ứng:
 Chuẩn độ cho đến khi xuất hiện màu xanh : lúc này ta tính được lượng
I2, từ đó xác định được nồng độ Vitamin C, cuối cùng suy ra được nồng độ
DCIP.
CN( DCIP)× VDCIP = CN( vitamin C)× Vvitamin C =CN( KIO3)× VKIO3
CN( DCIP) = ?
? Tại sao không dùng trực tiếp KIO3 chuẩn độ vitamin C?
☞ vì KIO3 là chất oxi hóa mạnh nên có thể oxi hóa được nhiều chất, mà
trong mẫu thí nghiệm có thể có những chất có thể tác dụng được với KIO 3 (axit
amin, protein, saccarose…) nên có thể dẫn đến sai số khi sử dụng chất này.
Khi tìm hệ sô f chúng ta sử dụng vitamin C tinh khiết nên có thể
tránh được sai số kia.
XVI- CÁCH TIẾN HÀNH:
3.1. Hóa chất:
- HCl 1% hay CH3COOH 5%
- axit metaphotphoric 2%
- Dung dịch bão hòa oxalat amon
- KI tinh thể
- H2SO4 2%
- Axit ascocbic ( vitamin C) tinh khiết ( bảo quản kín trong lọ màu tối)
- Dung dịch hồ tinh bột 1%
- Dung dịch thuốc chỉ thị DCIP 0,001N

3.2. Cách tiến hành:

* Lưu ý đối với một số mẫu thí nghiệm:
Cân lấy vào cối sứ lượng mẫu thí nghiệm thế nào để trong 5ml dịch
chiết dùng định phân chứa từ 0,15 đến 0,2 mg sinh tố C.
1. Các nguyên liệu giàu vitamin C như ớt, khoai tây, chanh…cân 3-
5g.
2. Các nguyên liệu thực vật tươi khác nhau nhưu rau quả…10-50g.
3. Các sản phẩm đóng họp 5-10g…
Tùy theo hàm lượng vitamin C trong từng loại nguyên liệu mà lấy lượng
mẫu cân cho thích hợp).
Khi thí nghiệm với các phẩm vật có nguồn gốc động vật thì dùng axit
tricloaxetic 20% sao cho nồng độ của nó đạt 5% trong dung dịch ( 25ml).
3.2.1. Mẫu thí nghiệm : các loại rau, hoa quả, mẫu vitamin.

3.2.2. Chuẩn bị dịch chiết vitamin C phân tích theo 1 trong 2 cách:
1. Cách 1: Cân chính xác 10g mẫu, cho vào cối, nghiền ngập trong axit
metaphosphoric 5%. Chuyển mẫu vào bình định mức cỡ 100ml. Định mức tới
vạch bằng axit HCl 1%. Lắc đều, lọc và thi dịch lọc vitamin C phân tích.
2. Cách 2: Cân chính xác 50-100g mẫu, cho vào cối máy xay sinh tố, cho tiếp 100-
200ml HCl 1%, nghiền mẫu, mỗi nhóm lấy 20g dịch vừa nghiền mẫu, chuyển
vào bình định mức 100ml, định mức bằng HCl 1% đến vạch. Lắc đều, lọc và
thu dịch lọc vitamin C phân tích.
3. (Lượng mẫu được lấy sao cho nồng độ vitamin C nằm trong khoảng 0,5mg/ml).
3.2.3. Chuẩn độ
Mẫu thí nghiệm: Bình tam giác 1 ( cỡ 50ml):
5ml dịch lọc vitamin C phân tích ( dùng pipet)
2,5 ml oxalatamon bão hòa ( dùng pipet)
Chuẩn bằng 2,6 DCIP ( phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1
phút, được a ml.
Mẫu kiểm chứng: bình tam giác 2 ( cỡ 50ml)
5ml HCl 1% ( dùng pipet)
2,5ml oxalatamon bão hòa ( dùng pipet)
Chuẩn bằng 2,6 DCIP ( phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1
phút, được b ml.

3.2.4. Xác định hệ số f

Bình tam giác 3 ( cỡ 50ml)
2ml dịch vitamin C tinh khiết pha trong axit metaphosphoric 5% (dùng
pipet)
2,5ml oxalatamon bão hòa.
Chuẩn bằng 2,6 DCIP ( phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1
phút, được a1 ml.
Bình tam giác 4 ( cỡ 50ml)
5ml dịch vitamin C tinh khiết.
Vài hạt tinh thể KI.
5 giọt hồ tinh bột.
Chuẩn bằng KIO3 0,001N cho đến khi dung dịch xuất hiện màu xanh, được b 1
ml.
3.3. Chú ý:
1. Vitamin C là chất khử mạnh, dễ bị oxi hóa nên phải duy trì trạng
thái khử của nó:
 + Chiết trong môi trường axit.
+ Nghiền nhanh, ngập trong axit để tránh vitamin C tác dụng với oxi
trong không khí.
+ Tránh dùng các dụng cụ bằng sắt, đồng vì Fe, Cu là cofactor của
nhiều enzym oxi hóa khử trong cơ thể sống, nên nếu dùng dụng cụ bằng Fe, Cu
thì sẽ kích hoạt các enzym oxi hóa khử làm khử vitamin C và dẫn đến sai số.
2. Với những dung dịch có sẵn màu hồng phải tẩy màu (bằng than
hoạt tính, hoặc bằng axit metaphosphoric , axit oxalic..)
3. Dung dịch đục phải lọc hoặc li tâm, sắc kí.
4. Axit metaphosphoric 5% còn có tác dụng liên kết với Fe 2+, Cu2+ để
phá hủy enzym phá hủy vitamin C, không những vậy nó còn lọa bỏ protein giúp
lọc dễ dàng.
5. Dung dịch oxalatamon có tác dụng bền màu của dung dịch, cũng
như nó giống như axit oxalic để tẩy màu.
6. Có thể dùng axit oxalat 1% để tráng cối và thêm đến vạch mức,
hoặc dùng axetat chì 5% (5ml) để kết tủa protein, loại trừ chất khử và sắc tố.
7. Khi xác định vitamin C trong một phẩm vật nào đó phải tiến hành
phân tích ít nhất là 2 mẫu thí nghiệm, dối với mỗi mẫu 2 lần xác định, kết quả
định phân 2 lần không sai lệch quá 0,03ml DCIP 0,001N.
8. Phải dùng microburet để dịnh phân.
9. Thời gian định phân kéo dài không quá 2 phút và lượng DCIP dùng
để định phân nên ở trong khoảng 1-2ml ( không quá 2ml hoặc ít hơn 1 ml).
XỬ LÝ SỐ LIỆU:
4.1. Yêu cầu:
- Tính hệ số f hoặc xác định nồng độ 2,6 DCIP dùng trong phân tích. Hệ số f
được tính : f =b1/a1
- Tính hàm lượng vitamin C trong mẫu thí nghiệm theo mg%
Biết: 1ml 2,6 DCIP 0,001N tương ứng với 0,088mg vitain C; 1ml KIO3
0,001N tương ứng với 0,088mg vitamin C.
4.2. Báo cáo kết quả thí nghiệm:
Mẫu thí nghiệm : ớt chuông.
Cân ban đầu cho vào cối xay gồm 104,63g HCl và 29,1 g ớt.
Cho vào cối xay, sau đó lấy 20g đi định mức.
4.2.1. Kết quả thu được:
*Kết quả chuẩn độ:
Mẫu thí nghiệm 1: 3,5ml 2,6 DCIP
Mẫu thí nghiệm 2: 3,45ml 2,6 DCIP
Mẫu kiểm chứng : 0,1 ml 2,6 DCIP
* Kết quả xác định f:
 a1= 4
b1= 3,8
4.2.2. Xử lí số liệu:
b1 3 ,8
f = a 1 = 4 = 0,95
Ta có:
- 1ml 2,6 DCIP 0,001N tương ứng với 0,088mg vitain C; 1ml KIO3 0,001N tương
ứng với 0,088mg vitamin C.
- Số ml 2,6 DCIP cần dùng : Vmẫu thí nghiệm - Vmẫu kiểm chứng = V
 số mg vitamin C có trong 5ml mẫu thí nghiệm là: V×f× 0,088= m (mg)
m×100
 số mg vitamin C có trong 100ml (tương ứng với 20g dịch) là : 5
= 20× m (mg)
- Trong 20g dịch có 20m (mg) vitamin C
 Trong 133,73 g dịch ( 104,63g HCl + 29,1g mẫu) sẽ có:
133 ,73 ×20 m
= 133,73m (mg) vitamin C
20
- Trong 29,1g mẫu có 133,73m (mg) vitamin C
100× 133 ,73 m
 Trong 100g mẫu sẽ có: 29 ,1 (mg) vitaminC. ( hàm lượng
mg%)
Từ đó, có bảng số liệu:
Mẫu TN V=Vmẫu thí nghiệm - Vmẫu kiểm chứng m=V×f× 0,088 Hàm lượng mg%
1 3,4 ml 0,2842 130,62 mg
2 3,35 ml 0,2801 128,7 mg
Vtb= 3,375 mtb= 0,2822 129,7 mg
4.2.3. So sánh thực nghiệm và nhận xét:
Bảng thành phần dinh dưỡng của ớt chuông được công bố:

Nhận xét:
- Số liệu thí nghiệm là 129,7 mg , số liệu được công bố là 127,7 mg.
- 2 số liệu này có thể coi xấp xỉ bằng nhau, cho thấy cách đo này là chính
xác và sai số có này xảy ra là do thao tác thực hiện khi cân lấy dịch mẫu (lượng
ở đáy cối xay có thê nhiều hơn ở phía trên, nên nếu không khuấy đều thì có sự
sai lệch trong cùng 1 mẫu), thao tác khi thực hiện chuẩn độ, sự thay đổi của
nồng độ 2,6 DCIP,…
 BÀI 9-11
PHẦN 1:
Xác định chỉ số axit của dầu thực vật
XVII-MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM:
Xác định được chỉ số axit của dầu thực vật, từ đó nêu lên được ý nghĩa,
sự thay đổi, của chỉ số axit đối với một sản phẩm.

XVIII- NGUYÊN TẮC:

2.1. Xác định chỉ số axit:
Chỉ số axit là số mg KOH cần để trung hòa các axit béo tự do có trong
1g chất béo.
2.2. Nguyên tắc:
Trung hòa chất béo bằng dung dịch KOH chuẩn độ, khi đó giữa KOH và
các axit béo tự do có trong chất béo xảy ra phản ứng.
RCOOH + KOH  RCOOK + H2O
Dựa vào lượng KOH dùng để trung hòa các axit, tính chỉ số axit.
CÁCH TIẾN HÀNH:
3.1. Hóa chất:
Ete etylic
Rượu etylic 96%
KOH 0,1N trong rượu
Dung dịch phenolphtalein 1% trong rượu.
3.2. Cách tiến hành:
Chuẩn bị bình cầu, bình nón sạch, khô, dung tích 250ml.
Mẫu Thí nghiệm
Cân chính xác 2-3g chất béo (cân bằng cân phân tích).
30-50ml hỗn hợp ete- rượu 96% ( 1:1) để hòa tan chất béo.
Lắc cẩn thận, có thể đun cách thủy nếu chất béo chưa tan hết.
Lắc đều. Làm nguội.
Định phân bằng hỗn hợp KOH 0,1N trong rượu với chất chỉ thị là
phenolphtalein (5 giọt dung dịch 1% trong rượu).
Chuẩn đến khi xuất hiện màu hồng tươi.
Mẫu kiểm chứng
2-3 ml nước cất.
30-50ml hỗn hợp ete- rượu 96% ( 1:1).
Lắc cẩn thận, có thể đun cách thủy nếu mẫu thí nghiệm đun.
Lắc đều. Làm nguội.
 Định phân bằng hỗn hợp KOH 0,1N trong rượu với chất chỉ thị là
phenolphtalein (5 giọt dung dịch 1% trong rượu).
Chuẩn đến khi xuất hiện màu hồng tươi.

Chú ý:
- KOH 0,1N trong rượu được sử dụng để tránh những sai sót có thể
xảy ra do sự thủy phân của xà phòng, trong trường hợp hỗn hợp chứa quá nhiều
nước từ 20% trở lên.
- Trường hợp chất béo có màu sẫm thì dùng chỉ thị timolphtalein
(1ml dung dịch 1% trong rượu) định phân cho đến màu xanh, hoặc dùng ankali
xanh 6B (1ml dung dịch 1% trong rượu).
- Nồng độ kiềm sử dụng ở đây thấp hơn trong thí nghiệm xà phòng
để tránh sự thủy phân.
- Mẫu kiểm chứng để xem khi dung dịch mẫu không chứa chất béo
có chất nào trong mẫu có chất nào tác dụng với KOH 0,1N không.XỬ LÝ SỐ
LIỆU:
Khối lượng dầu thực vật lấy được : m= 3g
Mẫu thí nghiệm chuẩn được= 0,1 ml
Mấu kiểm chứng là 0
5,611 ( 0 ,1−0 ) ×1
C= ≈ 0,187
3

PHẦN 2:
Xác định chỉ số xà phòng của dầu thực vật
I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM:
Xác định được chỉ số xà phòng của dầu thực vật, từ đó nêu lên được ý
nghĩa, sự thay đổi, của chỉ số xà phòng đối với một sản phẩm.

II. NGUYÊN TẮC:

2.1. Xác định chỉ số xà phòng hóa:
Chỉ số xà phòng hóa là lượng mg KOH cần để trung hòa các axit béo tự
do cũng như liên kết có trong 1g chất béo. Nói cách khác là lượng mg KOH ần
để xà phòng hóa các glixerit cũng như để trung hòa axit béo tự do có trong 1g
chất béo.
(là số mg KOH dùng để dịnh phân axit béo tự do và axit béo trong
glixerit (bằng cách thủy phân chất béo), nói cách khác là số mg KOH dùng để
định phân axit béo có trong cấu trúc chất béo trong 1g chất béo.)
2.2. Nguyên tắc:
 Đun sôi chất béo với một lượng dư dung dịch KOH chuẩn độ thì chất
béo bị thủy phân.

Các axit béo được giải phóng ra sẽ phản ứng với KOH
RCOOH + KOH  RCOOK + H2O
Các chất béo tự do cũng phản ứng với KOH sơ đồ trên.
Lượng kiềm dư, không tham gia phản ứng với các axit béo được định
phân bằng HCl chuẩn. Dựa vào lượng kiềm tiêu tốn để trung hòa các loại axit
béo trong chất béo, tính được chỉ số xà phòng.

CÁCH TIẾN HÀNH:

3.1. Hóa chất:
Dung dịch KOH 0,5N trong rượu: 30g KOH tinh khiết hào ta trong 1 lít
rượu etylic tinh khiết đun nóng có lắp ống sinh hàn thu hồi, dung dịch để yên
một đêm, sau đó lọc và bảo quản trong bình đựng màu nâu.
(Tránh ánh sáng, do nó rất nhạy cảm với ánh sáng, dễ oxi hóa, phân hủy,
không ổn định).
Dung dịch HCl 0,5N.
Dung dịch phenolphtalein 1% trong rượu hoặc timolphtalein 1%.
3.2. Cách tiến hành:
Mẫu thí nghiệm:
Lấy 2-3g chất béo vào bình 250ml.
Cho 20ml KOH 0,5N trong rượu ( dùng pipet hoặc buret).
Đậy bình bằng ống sinh hàn khí và đun sôi cách thủy hỗn hợp trong
1giờ.
Làm nguội hỗn hợp, thêm 5 giọt phenolphtalein hoặc timolphtalein 1%
trong rượu và định phân bằng dung dịch HCl 0,5N.
Chuẩn đến khi dung dịch mất màu hồng.
Mẫu kiểm chứng:
Lấy 2-3ml nước cất vào bình 250ml.
Cho 20ml KOH 0,5N trong rượu ( dùng pipet hoặc buret).
Đậy bình bằng ống sinh hàn khí và đun sôi cách thủy hỗn hợp trong 1
giờ.
Làm nguội hỗn hợp, thêm 5 giọt phenolphtalein hoặc timolphtalein 1%
trong rượu và định phân bằng dung dịch HCl 0,5N.
 Chuẩn đến khi dung dịch mất màu hồng.
Chú ý:
- Nếu xà phòng khó tan có thể thêm khoảng 20ml một trong các
dung môi có nhiệt độ sôi cao như toluen, rượu propilic, butylic hoặc amilic.
- Song song làm thí nghiệm kiểm chứng, thay chất béo bằng một
lượng nước cất tương ứng (cần làm thí nghiệm kiểm chứng vì nồng độ của kiềm
có thể bị biến đổi). Mẫu kiểm chứng có thể làm bằng dung môi để có độ chính
xác nhất định.
-
XỬ LÝ SỐ LIỆU:
Số gam dầu thực vật lấy được là 2,07 g
Ban đầu cho 30ml KOH
Sau khi thủy phân cho thêm 1,25ml KOH
Sau khi định phân thu được kết quả là tiêu tốn hết 26ml HCl
Tuy nhiên mẫu kiểm chứng lấy 20ml KOH và định phân ra được là: 15,2ml
Ta có :
Số ml dung dịch KOH đã phản ứng trong mẫu thí nghiệm là 31,25-26,2=
5,25ml
Số ml dung dịch KOH đã phản ứng trong mẫu kiểm chứng là 20-15,2= 4,8ml
Trong 1ml KOH 0,5N có 28mg KOH
 chỉ số xà phòng là:
(5 , 25−4 , 8)× 28
Xp = ≈ 6,087
2 , 07
Sai số có thể do tỷ lệ giữa 2 mẫu thí nghiệm và kiểm chứng khác nhau, cũng
như thao tác làm thí nghiệm.

PHẦN 3:
Xác định chỉ số peroxit của dầu thực vật
I- MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM:
Xác định được chỉ số peroxit của dầu thực vật, từ đó nêu lên được ý
nghĩa, sự thay đổi, của chỉ số peroxit đối với một sản phẩm.
II- NGUYÊN TẮC:
2.1. Xác định chỉ số peroxit
Chỉ số peroxit là số gam iot có thể phản ứng với hydro hoạt động của
các peroxit chứa trong 100g chất béo, nói cách khác, chỉ số peroxit là số gam iot
được giải phóng ra khi cho dung dịch KI tác dụng với 100g chất béo nhờ tác
dụng của các peroxit (sản phẩn của sự ôi hóa chất béo) có trong chất béo.
2.2. Nguyên tắc:
 Xác định chỉ số peroxit dựa trên nguyên tắc: các peroxit của chất béo
(tạo thành trong quá trình ôi hóa của chất béo) trong môi trường axit có khả
năng phản ứng với KI thải ra I2 theo phản ứng:

Iot được tạo thành định phân bằng dung dịch tiosunfat:
2Na2S2O3 + I2 2NaI + Na2S4O6
Dựa vào lượng tiosunfat tiêu tốn khi định phân iot tính chỉ số peroxit.
CÁCH TIẾN HÀNH:
3.1. Hóa chất:
- Axit axetic loãng.
- Tinh thể KI.
- Dung dịch Na2S2O3 0,01N ( pha trước khi dùng từ dung dịch Na 2S2O3
0,1N bằng nước cất đun sôi để nguội không có chứa CO2).
- Dung dịch hồ tinh bột 1%.

3.2. Cách tiến hành:

Mẫu thí nghiệm:
- Lấy 3-5g chất béo.
- 5-10ml clorofocm.
- 10-20ml CH3COOH băng ( hỗn hợp axit axetic băng và clorofocm
2:1).
- 1 ít tinh thể KI. ( bằng hạt đỗ)
- Lắc hỗn hợp thật cẩn thận trong 5-10 phút.
- Thêm vào hỗn hợp 25ml nước cất.
- Định phân iot tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N với chất chỉ
thị hồ tinh bột ( 0,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%).
Chuẩn độ cho đến khi mất màu xanh (nâu tím).
Mẫu kiểm chứng:
- Lấy 3-5ml nước cất.
- 5-10ml clorofocm.
- 10-20ml CH3COOH băng ( hỗn hợp axit axetic băng và clorofocm
2:1).
- 1 ít tinh thể KI.
- Lắc hỗn hợp thật cẩn thận trong 5-10 phút.
- Thêm vào hỗn hợp 25ml nước cất.
- Định phân iot tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N với chất chỉ
thị hồ tinh bột ( 0,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%).
 Chuẩn độ cho đến khi mất màu xanh (nâu tím).

Chú ý:
- Phải cho clorofocm vì khi chiết chất béo, tập trung chất béo ở 1
chỗ làm cho I2 nằm ngoài lớp clorofocm dẫn đến không tác dụng với chất béo
làm I2 dễ tác dụng với thuốc thử.
- Lắc hỗn hợp thật cẩn thận để cho I2 phân bố ở nước để dễ tác dụng
với thuốc thử.
- XỬ LÝ SỐ LIỆU:
Khối lượng mẫu dầu thực vật lấy được là 3,17g
Mẫu thí nghiệm đo được là 1,38ml
Mẫu kiểm chứng là 0
Chỉ số peroxit là
0,001269 ×100 ×(1, 38−0)
P= ≈ 0,055
3 , 17
Sai số ở đây có thể là do lượng tinh thể KI lấy trong 2 mẫu khác nhau cũng như
thao tác làm thí nghiệm.

PHẦN 4:
CÂU HỎI ĐẶT RA
Câu 1: định nghĩa, ý nghĩa của việc xác định chỉ số axit:
☞ trả lời:
- Định nghĩa: Chỉ số axit là số mg KOH cần để trung hòa các axit béo
tự do có trong 1g chất béo.
- Xác định chỉ số axit, từ đó biết được giá trị của chỉ số axit, giá trị
ấy cho biết độ tươi của sản phẩm xác định, chỉ số axit không nói lên sản phẩm
cũ hay mới vì có nhiều yếu tố môi trường ảnh hưởng đến chất lượng
Câu 2: Tại sao phải xác định chỉ số axit, giá trị của chỉ số axit, chỉ số axit phản
ánh độ tươi của sản phẩm như thế nào?
☞ Trả lời:
- Xác định chỉ số axit xem độ tươi của sản phẩm, xem sản phẩm có được
bảo quản đúng cách hay không.
- Nếu sản phẩm có nhiều axit béo tự do, có glixerit bị phân hủy do các
yếu tố bên ngoài, vì enzym có trong vi sinh vật dẫn đến xảy ra quá trình thủy
phân. Thì chỉ số axit càng cao.
Câu 3: chỉ số axit khác 0 hoặc càng lớn thì nói lên điều gì?
☞ chỉ số axit khác 0 hoặc càng lớn thì cho thấy:
 - Bảo quản sản phẩm đã đúng cách hay chưa.
- Chỉ số axit thường nằm trong khoảng từ 0-6 nhưng thro quy định
quốc tế thì chỉ số axit phải bằng 0.
Câu 4: Chỉ số axit sẽ thay đổi như thế nào?
☞ Chỉ số axit ngày càng tăng, do trong môi trường có nhưng vi sinh vật
mang enzym thủy phân chất béo dẫn đến lượng axit béo tự do ngày càng nhiều
làm chỉ số axit ngày càng tăng.

Câu 5: Định nghĩa, ý nghĩa của việc xác định chỉ số xà phòng?
☞ - chỉ số xà phòng là số mg KOH dùng để định phân axit béo có
trong cấu trúc chất béo trong 1g chất béo.
- Ý nghĩa của việc xác định chỉ số xà phòng: cho biết trong chất béo
có những thành phần axit béo nào ( thông qua khối lượng trung bình của axit
béo).
Câu 6: Chỉ số xà phòng thay đổi như thế nào?
☞ Chỉ số xà phòng về lí thuyết thì sẽ không thay đổi, tuy nhiên, trong
thực tế chất béo có thể bị ôi hóa nên chỉ số này sẽ bị giảm đi.
Câu 7: Chỉ số peroxit là gì, tại sao lại xác định, ý nghĩa của nó?
☞ - Định nghĩa: chỉ số peroxit là số gam iot được giải phóng ra khi cho
dung dịch KI tác dụng với 100g chất béo nhờ tác dụng của các peroxit (sản phẩn
của sự ôi hóa chất béo) có trong chất béo.
- Xác định chỉ số peroxit cho biết được sự ôi hóa của sản phẩm đang
xác định.
Câu 8: Chỉ só peroxit biến đổi như thế nào?
☞ Chỉ số peroxit phụ thuộc vào sự ôi hóa của sản phẩm nên chất béo bị
ôi hóa thì quá trình ôi hóa cũng như chỉ số peroxit cũng ngày càng cao.
Quá trình ôi hóa phụ thuộc vào oxi có xuất hiện và nhiệt độ bảo quản
sản phẩm,...

Câu 9: Mối quan hệ giữa chỉ số peroxit với chỉ số axit như thế nào?
☞ chỉ số peroxit và chỉ số axit có mối quan hệ với nhau, nếu chỉ số axit
tăng thì chỉ số peroxit cũng tăng. ( lượng axit béo tự do tăng cũng cho thấy sự ôi
hóa của sản phẩm tăng).