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Manual Tercera Edición-Primera Parte
Manual Tercera Edición-Primera Parte
11
Práctica
Bioseguridad en el laboratorio
de Inmunología
Liliana Manuela Valdés Vázquez
Objetivo general
Reconocer los conceptos básicos de bioseguridad mediante la aplicación de las
prácticas microbiológicas estándar en el desarrollo de cada una de las prácticas de
este manual, para la protección personal, del equipo, las instalaciones y el medio
Introducción
La bioseguridad es un componente de la seguridad ambiental y su pilar es la eva-
luación del riesgo. Se puede definir como:
El conjunto de lineamientos, medidas y acciones de prevención, control,
mitigación y erradicación de impactos y repercusiones adversas a la sa-
lud y al ambiente. Todos ellos asociados a factores biológicos, derivados
de actividades y/o productos de la biotecnología, docencia, investigación,
12 Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología
5.
6. El manejo de bioterios, residuos peligrosos, sustancias químicas
7. Señalización y código de colores
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
Principios de la bioseguridad
La universalidad y la contención son dos principios básicos de la bioseguridad. El
primero se refiere a que todas las personas que trabajan en un laboratorio sigan
las precauciones incluidas en los niveles de bioseguridad, sin importar su estrato
social, religión, edad, salud etc. El segundo principio describe los métodos seguros
para trabajar en un laboratorio. Se dividen en dos tipos:
Cuadro 1.
Prácticas microbiológicas estándar
❙❙ Limitar el acceso al laboratorio a personal autorizado.
❙❙ Lavarse las manos antes y después de manipular materiales viables, al quitarse los
guantes y antes de salir del laboratorio.
❙❙ Prohibir pipetear con la boca, comer, fumar, manipular lentes de contacto, ma-
quillarse o almacenar alimentos dentro del laboratorio, llevarse objetos a la boca.
❙❙ Minimizar la creación de salpicaduras o aerosoles.
❙❙ Descontaminar las superficies de trabajo por lo menos una vez al día.
❙❙ Manejar adecuadamente los residuos peligrosos.
❙❙ Poner señales en el laboratorio, con la advertencia de riesgo biológico en la entra-
da de este.
❙❙ Transportar las muestras en el laboratorio en condiciones de seguridad.
❙❙ Contar con un plan de contingencias y procedimientos de emergencia.
❙❙ Programar un control de plagas (roedores e insectos).
Clasificación
infeccioso
Tipo de residuo
Cuadro 2
biológico-infecciosos
Identificación y envasado de los residuos peligrosos
Envasado
Práctica 1 Bioseguridad en el laboratorio
Niveles de bioseguridad
El Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados
Unidos especifica cuatro niveles de bioseguridad para el manejo de agentes bioló-
gicos, que se conocen como niveles de bioseguridad del 1 al 4. La clasificación de
cada laboratorio identifica el riesgo biológico que representa para la salud del per-
sonal y su impacto en el medio ambiente: laboratorio básico niveles 1 y 2, laborato-
rio de contención nivel 3 y laboratorio de contención máxima nivel 4. El laboratorio
de prácticas de inmunología y virología tiene un nivel de seguridad 1.
Para cada nivel de seguridad biológica se presentan cuatro elementos de re-
glamentación, dos de ellos se refieren a la infraestructura del laboratorio y los dos
restantes describen las buenas prácticas dentro del mismo. En todos los niveles
aplican las reglas básicas de laboratorio (prácticas microbiológicas estándar). Para
más información, ver el Anexo II al final de este manual.
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología
Normas de bioseguridad
Como en todas las actividades de riesgo, se necesita una correcta aplicación de
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
Materiales
Tubos de ensayo 13 × 100
Desarrollo de la práctica
Revisar los materiales del laboratorio para mostrarles su utilidad en el laboratorio.
Literatura de consulta
1. Castellanos, B. C. López, M. L. Rosales, L. R. Ladrón de Guevara, O. V. Osorio,
A. Garduño, S. G. Bioseguridad para los laboratorios biomédicos. Lineamientos,
prevención y protección. DF, México: UNAM, 1999.
2. Categorization of biological agents according to hazard and categories of
containment. 4th ed. London, United Kingdom. HSE Books, 1995. ISBN
0717610381.
3. Gallardo, R. R. Manual de bioseguridad para laboratorios de biológicos. DF,
México: Secretaría de Salud, 1994.
4. Semarnat. NOM-052-SEMARNAT-2005. Que establece las características, el
procedimiento de identificación, clasificación y los listados de los residuos peligro-
sos. DF, México: Segob, 2005.
5. Semarnat. NOM-087-SEMARNAT-2002. Requisitos para la separación, envasa-
do, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los
residuos peligrosos biológico-infecciosos que se generan en establecimientos que
presenten atención médica. DF, México: Segob, 2002.
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología
Práctica
Diluciones
Laura Cobos Marín
Myrna Vicencio Mallén
Objetivo general
Conocer el concepto de dilución, la nomenclatura y sus formas de interpretación,
mediante la realización de distintos ejercicios teórico-prácticos para identificar sus
aplicaciones en las ciencias químico-biológicas.
Introducción
Diluir es la acción de disminuir la concentración de una sustancia (soluto) en otra
(solvente), a ésta en inmunología se le llama diluyente. Cuando el soluto se disuel-
ve en el diluyente, a la mezcla se le denomina solución, por ejemplo, cuando agre-
gamos cloruro de sodio (soluto) en agua (diluyente); por el contrario, si el soluto
no se disuelve en el diluyente, entonces se obtiene una suspensión, por ejemplo, al
agregar glóbulos rojos (soluto) en solución salina (diluyente).
En una solución, el soluto y el diluyente pueden ser un sólido, un líquido o un
gas; sin embargo, en inmunología el diluyente normalmente está en estado líquido
como el alcohol, y el soluto, en estado sólido como la glucosa. Las diluciones sue-
len expresarse en proporciones, así una dilución 1/4 nos indica las partes de soluto
y las partes totales que tiene una dilución, en donde:
20 Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología
(soluto + diluyente)
Por lo tanto, una dilución ¼ contiene una parte de soluto, tres de diluente, y la
suma es el total: cuatro; de la misma manera una dilución 1/7 contiene una parte
de soluto, seis partes de diluyente, que suman siete partes en total.
Las diluciones pueden ser:
Diluciones únicas
Se denominan únicas cuando solamente se requiere esa dilución. Para realizar una
dilución única se necesita:
1.
2. Calcular el volumen de soluto y de diluyente necesarios
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
Diluciones seriadas
Las diluciones seriadas son la disminución de un soluto en un diluyente en forma
gradual y sistemática, para lograr reducir su concentración en una secuencia orde-
nada y con ello cuantificar su actividad biológica. Por ejemplo, para saber cuántos
anticuerpos hay en el suero de un animal (título del suero), podemos ir disminu-
yendo su concentración a la mitad, y a la mitad, y así sucesivamente hasta llegar a
un punto en el que ya no detectemos estos anticuerpos. Arbitrariamente podemos
decir que la dilución del último tubo en el que todavía encuentro anticuerpos
corresponde al título del suero y se expresa como el inverso de esa dilución. Por
ejemplo, si en una prueba serológica se hicieron diluciones dobles seriadas, co-
menzando por la dilución 1/5 y se observa una reacción positiva en los primeros
Práctica 2 Diluciones 21
cinco pozos (dilución 1/80), y en el sexto, ya no, el título del suero se expresa como
el inverso de 1/80, es decir 80/1 = 80.
Existen diferentes diluciones seriadas, las más utilizadas en inmunología y vi-
rología son las diluciones dobles seriadas, triples seriadas, quíntuples seriadas y
décuples seriadas. Se llaman dobles cuando lo que se está haciendo es diluir a la
mitad, triples diluyendo a una tercera parte, quíntuples cuando se está diluyendo
a la quinta parte o décuples cuando se está diluyendo a la décima parte la concen-
tración del soluto.
Todas las diluciones seriadas comienzan con una dilución inicial, misma que
se obtiene exactamente igual que si fuera una dilución única. Se puede hacer una
dilución seriada a partir de una dilución inicial cualquiera, lo importante es tener
en mente que la concentración inicial se va a ir disminuyendo a la mitad, o a la
décima parte, etcétera.
a. En el primer tubo se hace una dilución única: para saber cuántos mililitros co-
rresponden al soluto, divido el volumen inicial entre cinco (1 mL/5 = 0.2 mL)
y el resto es de diluyente (1 mL - 0.2 mL = 0.8 mL).
b. Como la dilución es doble, en el siguiente tubo disminuiré la concentración a
la mitad, por lo que transfiero, del tubo uno al dos, la mitad del volumen ini-
cial: 1 mL/2 = 0.5 mL (volumen de transferencia), esta cantidad la recibo en
la otra mitad del volumen: 1 mL - 0.5 mL = 0.5 mL de diluyente (volumen de
recepción), para complementar el volumen inicial (1 mL). Como se indicó an-
teriormente, en una dilución seriada se repiten los pasos sistemáticamente de
un tubo a otro, así transferiré del tubo dos al tres el volumen de transferencia
(0.5 mL) y lo recibo en el volumen de recepción (0.5 mL), esto se repite tantas
veces como tubos sean necesarios.
22 Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología
c. Del último tubo se desecha el volumen de transferencia, (en este caso 0.5 mL)
para que todos los tubos queden con el mismo volumen; para este ejemplo,
0.5 mL.
desechar
1 2 3 4
1mL 1mL 1mL 1mL
DILUENTE
0.25mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL
soluto soluto soluto soluto
+ + + +
0.75mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL
diluente diluente diluente diluente
0.75mL
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología
Vol. de recepción
0.5mL
Vol. de recepción
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
Las diluciones que quedan en cada tubo al terminar la dilución seriada corres-
ponden a:
NOTA. Esto también puede expresarse en forma matemática como 1/5/2, que se-
ría igual a 1/5 ÷ 2/1. Por ley del sándwich, se multiplican los extremos y el resultado
es el numerador, y la multiplicación de los números centrales es el denominador:
Práctica 2 Diluciones 23
1 2 3 4
Como se ve, el volumen final en todos los tubos corresponde a la mitad del
volumen inicial (0.5 mL). Si quisiéramos que los tubos quedaran con 1 mL de vo-
lumen final, tendríamos que iniciar la dilución con el doble del volumen (2 mL).
Para hacer una dilución doble seriada, iniciando con una dilución 1/8 en un
volumen inicial de 4 mL en cinco tubos de ensayo, se necesita:
N.º Tubo 1 2 3 4 5
N.º Tubo 1 2 3 4 5
Volumen final 2 mL
Factor de dilución 2 2 2 2
× 1/ 2 × 1/ 2 × 1/ 2 × 1/ 2
Operación
o o o o
matemática
÷2 ÷2 ÷2 ÷2
Supongamos que queremos realizar una dilución décuple seriada en cinco tu-
bos partiendo de una dilución inicial 1/8 en un volumen de 4 mL; los cálculos
serían:
a. En el primer tubo se hace una dilución única: para saber cuántos mililitros co-
rresponden al soluto, divido el volumen inicial entre ocho (4 mL/8 = 0.5 mL)
y el resto es de diluyente (4 mL - 0.5 mL = 3.5 mL).
b. Como la dilución es décuple, quiere decir que en el siguiente tubo debo dis-
minuir la concentración a la décima parte, por lo que transfiero del tubo uno
al dos, la décima parte del volumen inicial: 4 mL/10 = 0.4 mL (volumen de
transferencia); esta cantidad la recibo en las nueve décimas partes restantes:
4 mL - 0.4 mL = 3.6 mL de diluyente (volumen de recepción), para com-
plementar el volumen inicial (4 mL). Como se indicó anteriormente, en una
dilución seriada se repiten los pasos sistemáticamente de un tubo a otro, así
transferiré del tubo dos al tres el volumen de transferencia (0.4 mL) y lo recibo
en el volumen de recepción (3.6 mL), esto se repite tantas veces como tubos
sean necesarios.
SOLUTO
Vol. de Vol. de Vol. de Vol. de Vol. de
0.5mL
transferencia transferencia transferencia transferencia transferencia
0.4mL 0.4mL 0.4mL 0.4mL 0.4mL
desechar
DILUENTE
1 2 3 4 5
4mL 4mL 4mL 4mL 4mL
0.4mL 0.4mL 0.4mL 0.4mL 0.4mL
soluto soluto soluto soluto soluto
+ + + + +
3.6mL 3.6mL 3.6mL 3.6mL 3.6mL
diluente diluente diluente diluente diluente
3.5mL
Vol. de recepción
3.6mL
Vol. de recepción
3.6mL
Vol. de recepción
Vol. de recepción
3.6mL
3.6mL
Para hacer una dilución décuple seriada iniciando con una dilución ½ en un
volumen inicial de 5 mL en cuatro tubos se necesita:
N.º Tubo 1 2 3 4
Factor de dilución 10 10 10
4 × 2 = 8 o 4/1 = 4
8/1 = 8 mL 4 × 2 = 8 mL
Por lo tanto, el volumen inicial es de 8 mL.
Práctica 2 Diluciones 27
Si quisiéramos diluir 1/5 con el mismo volumen final, los cálculos se harían
de la siguiente forma: 4 mL (volumen de recepción o volumen final) serían cuatro
partes de la dilución, mientras que la otra parte sería el volumen de transferencia.
La suma de ambas partes (cinco partes) nos daría el volumen inicial. La regla de
tres quedaría de la siguiente forma:
4 : 4 :: X : 5
o
4 mL 4 partes (volumen final)
X 5 partes (volumen inicial)
Diluciones en pasos
Cuando se requiere hacer una dilución alta, no siempre es factible o conveniente
hacerla directamente, por lo que es necesario empezar con una dilución más con-
centrada que la que necesitamos, y a partir de ésta, realizar una o más diluciones
hasta llegar a la dilución que queremos obtener. Si queremos preparar una dilución
1/3 500, podemos partir de una más sencilla, por ejemplo, 1/100. Lo que necesi-
tamos es calcular la dilución restante o intermedia, esto se obtiene dividiendo la
dilución final (1/3 500) entre la dilución inicial (1/100): 3 500/100 = 35
El 35 representa la segunda dilución requerida (dilución intermedia), es de-
cir, necesitamos diluir 35 veces la dilución inicial (1/100) para obtener la dilu-
ción requerida (1/3 500). Dicho de otra forma, para hacer la dilución 1/3 500
diluimos 1/100 y a partir de ésta, una dilución 1/35 en el volumen requerido. Es
importante mencionar que el soluto necesario para la dilución 1/35 se toma de
la dilución 1/100.
28 Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología
SOLUTO
DILUENTE
1 2
tante es:
Una forma de hacer los cálculos para la dilución en pasos podría ser:
Dilución inicial 1/100 en un volumen de 1 mL:
Soluto: 1 mL/100 = 0.01 mL
Diluyente: 1 mL - 0.01 mL = 0.99 mL
Segunda dilución (intermedia) 1/35 en un volumen de 7 mL:
Soluto: 7/35 = 0.2 mL
Diluente: 7 - 0.2 = 6.8 mL
SOLUTO Vol. de
transferencia
0.2mL
0.01mL
1 1mL 2 7mL
0.01mL 0.2mL
DILUENTE soluto soluto
+ +
0.99mL 6.8mL
diluente diluente
0.99mL Vol. de
recepción
6.8mL
N.º Tubo 1 2
Diluciones porcentuales
Como se indicó al inicio de la práctica, una dilución puede expresarse en forma
porcentual. La expresión “tanto por ciento”, por ejemplo, 8 %, quiere decir que de
cada 100 partes, ocho corresponden al soluto y el resto (92) al diluyente. Para pre-
parar una solución porcentual necesito saber:
3 100
X 40
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
Para esta solución necesito poner 0.255 g de NaCl (soluto); en este caso no
restamos los gramos de NaCl al volumen total, por lo que uso una probeta para afo-
rar al volumen deseado; es decir, agregar diluyente cuanto baste para (cbp) 30 mL.
Práctica 2 Diluciones 31
Preguntas
Ejercicios
a. Esquematice las diluciones que realizó durante la práctica junto con los cál-
culos de cada una de ellas.
b. Al finalizar la práctica se dejará una serie de ejercicios para desarrollar en casa
en los que se resolverá los siguientes puntos:
Literatura de consulta
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
Práctica
Manejo de animales de
experimentación
Laura Cobos Marín
Pablo Hernández Peralta
Objetivo general
Conocer la clasificación y uso ético de los animales de experimentación, así como
el manejo de algunos de ellos, mediante su correcta sujeción para inoculación y
sangrado.
Introducción
En la investigación y la docencia de todas las ciencias biomédicas es común expe-
rimentar con diferentes especies animales. Los más usados en los laboratorios son
ratones, ratas, jerbos, hámsters, cuyos, conejos y pollos. Sin embargo, cualquier es-
pecie animal se considera como un animal de laboratorio; aún cuando se emplean
grandes especies domésticas (caballos, cerdos, bovinos, etc.) para estudiar sus ca-
racterísticas anatomofisiológicas, sus necesidades nutricionales o su respuesta a
las diversas enfermedades o fármacos.
El término “animales de laboratorio” se ha usado en forma tradicional por la
relación que existe entre el laboratorio y los animales que se utilizan en él, durante
una investigación; sin embargo, sería más apropiado utilizar el término “animales
para experimentación” ya que hay ciertas especies animales difíciles de mante-
ner en condiciones adecuadas dentro de un laboratorio. Es muy importante tener
34 Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología
]] Producción de antisueros
]] Obtención de complemento
]] Obtención de glóbulos rojos
]] Propagación de antígenos
]] Diagnóstico de enfermedades infecciosas
Pruebas de seroneutralización
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología
]]
]] Pruebas de viabilidad, potencia e inocuidad en vacunas y otros productos
biológicos
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
a. Animales convencionales. Son animales que se han criado bajo requisitos mí-
nimos de higiene, pueden sufrir o no de parasitosis, no existen evaluaciones
microbiológicas, no se tiene ningún cuidado especial en cuanto a su origen
genético, deficiencias metabólicas, etc. Este tipo de animales generalmente
son criados bajo condiciones de “cuartos abiertos” (sin barreras).
b. Animales condicionados. Aquellos que se han criado bajo condiciones riguro-
sas de higiene, llevan un control de desparasitación y se les proporciona una
dieta balanceada de acuerdo a las necesidades de la especie y de su estado
fisiológico. Al igual que en los convencionales, no se tiene ningún cuidado en
cuanto a su selección u origen genético.
c. Animales altamente condicionados. Aquellos en los que hay un estricto con-
trol genético, medioambiental y nutricional; dentro de este grupo podemos
encontrar los siguientes:
1. Libres de patógenos específicos (SPF del inglés specific pathogen free).
Estos animales poseen una microflora considerada como “normal” para la
especie, pero se garantiza la ausencia de agentes específicos que puedan
intervenir en el proceso de experimentación. El uso de embriones de pollo
SPF es muy común en la elaboración de diversas vacunas.
Práctica 3 Manejo de animales de experimentación 35
1. Gallina doméstica
a. Sujeción de la gallina para su traslado. El operador coloca la palma de la mano
en la quilla con los dedos dirigidos hacia la cloaca (Figura 1). El dedo medio
se sitúa entre las piernas, sujetando las patas, una entre el dedo índice y el
medio, la otra entre el anular y el medio, las alas deberán sujetarse, una con
el pulgar y otra con el meñique, ayudándose con la otra mano (Figuras 2 y 3).
b. Sujeción de la gallina en decúbito lateral. Esta técnica inmoviliza a la gallina y
permite tener acceso a los músculos pectorales para la inoculación intramus-
cular (IM), al pliegue del ala para la inoculación subcutánea (SC), a la vena
36 Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología
1
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
2. Conejo
a) Sujeción del conejo para su traslado. Se toma la piel laxa del dorso con una
mano, mientras la otra mano soporta el peso del animal a manera de sopor-
te en la región sacra (Figura 8). NOTA. NUNCA CARGUE A UN CONEJO
SUJETÁNDOLO DE LAS OREJAS.
8
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología
Procedimiento. Una vez colocado sobre la superficie de trabajo, con una mano,
sujete el dorso del conejo a la altura del tórax haciendo ligera presión contra la
superficie de trabajo (Figura 9), con la otra mano haga presión sobre la cadera, así
se presionan ambos fémures en dirección caudal, y con ello, el conejo estirará los
miembros pélvicos totalmente (Figura 10).
9
Práctica 3 Manejo de animales de experimentación 39
10
11 12 13
14
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología
15
Práctica 3 Manejo de animales de experimentación 41
16
c) Sujeción del cuyo en decúbito dorsal. Con esta técnica de sujeción acce-
demos a la cavidad torácica del animal para el sangrado intracardiaco o
bien a la cavidad abdominal para la inoculación IP (estas actividades no se
realizan en esta práctica).
17 18 19
4. Ratón
a) Sujeción del ratón para su traslado. Se toma al animal por la cola y se co-
loca sobre una superficie rugosa (Figuras 20-21).
20
21
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b) Sujeción del ratón para inoculación o toma de muestras. Se toma con los
dedos pulgar e índice la punta de la cola del ratón (Figura 22); a continua-
ción se detiene con los dedos anular y meñique el resto de la cola lo más
cercano a la base (Figura 23). Esta acción permite utilizar los dedos pulgar e
índice para pellizcar la piel laxa del dorso y cuello (Figura 24), de esta forma
se asegura que el animal no pueda mover la cabeza (Figuras 25-26).
22
26
25
24
23
]] 1 a 2 conejos
]] 1 a 2 cuyos
]] 1 a 2 gallinas
]] 1 frasco con torundas en alcohol
]] 1 ratón
Desarrollo de la práctica
1.
Preguntas
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Literatura de consulta
1. Benjamín, M. M. Manual de patología clínica, Limusa, México, pp. 9-20, 1985.
2. Goldsby, R. A. Kindt, T. J. Osborne, B. A. Kuby, J. Immunology. 5th ed. New York,
United States: W. H. Freeman And Co. 2003.
3. NOM-062-ZOO-1999. Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y
uso de los animales de laboratorio. DF, México: Segob, 1999.
4. Olguín, F. R. Los animales de laboratorio, importancia, cuidados y manejo.
Material de consulta. DF, México: UNAM, 1982.
5. Coates, M. E. The germ free animal in research. US: Academic Press, 1968.
6. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. Washington DC: National
Research Council, 2011.
4
45
Práctica
Vías de inoculación y sangrado
en animales de experimentación
Laura Cobos Marín
Pablo Hernández Peralta
Objetivo general
Identificar las regiones anatómicas adecuadas para la inoculación y el sangrado
en el conejo, el cuyo y la gallina doméstica, así como la inoculación en el ratón,
mediante la aplicación de solución salina fisiológica y la obtención de muestras
Introducción
Vías de inoculación
En la investigación y el diagnóstico que se lleva a cabo en el Laboratorio de inmu-
nología es necesario inocular diferentes sustancias en los animales en experimen-
tación; es importante mencionar que la Norma Oficial Mexicana indica que:
46 Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología
[…] cualquier procedimiento que cause mayor dolor o molestia en los ani-
males, que la producida por inyección o marcaje en orejas, requerirá el uso
de tranquilizantes, analgésicos o anestésicos. Si es necesario efectuar un
procedimiento doloroso sin el uso de anestesia, analgésicos, o tranquilizan-
tes, porque su uso afectaría los resultados del experimento, éste debe ser
aprobado previamente (NOM-062-ZOO-1999).
Gallina doméstica
Inoculación intramuscular
1.
2. Con una torunda con alcohol, desinfectar una región del músculo pectoral
donde no se observen vasos sanguíneos.
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
Inoculación subcutánea
Conejo
El manejo del conejo requiere de la sujeción por dos personas, una en la sujeción,
y otra, en la inoculación o toma de muestras.
Inoculación subcutánea
Inoculación intramuscular
1. La persona que vaya a inocular desinfecta el área a inocular con una torunda
con alcohol (Figura 4).
2. Coloca la punta de la aguja en la cara lateral del muslo, con el bisel hacia arriba
y a 30 grados de inclinación respecto de la piel.
3. Introducir la aguja en la masa muscular y depositar el material de inoculación
lentamente (Figura 5).
4. Extraer la aguja.
5. Presionar con una torunda el sitio de inoculación.
4
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
Cuyo
Inoculación intramuscular
6 7
Inoculación subcutánea
8 9
Ratón
Inoculación intramuscular
Inoculación subcutánea
Inoculación intraperitoneal
12 13
52 Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología
14
Cuadro 1
Principales vías de inoculación de algunos animales de laboratorio
Especie Inoculación
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología
Oftálmica
SC. Pliegue del ala
Ave
IM. Músculos pectorales y de los muslos
IV. Vena radial
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Cuadro 2
Calibres recomendados para la inoculación de algunos animales
Intravenosa 27
Subcutánea 27
Ratón
Intramuscular 27
Intraperitoneal 27
Intramuscular 21 – 22
Cuyo
Subcutánea 21 – 22
Práctica 4 Vías de inoculación y sangrado en animales de experimentación 53
Intravenosa 27
Conejo Subcutánea 20 – 22
Intramuscular 20 – 22
Intravenosa 22
Gallina Intramuscular 20 – 22
Subcutánea 20 – 22
Vías de sangrado
En la práctica de la inmunología es común la obtención de muestras sanguíneas,
ya sea para obtener plasma, suero o células. En un animal, el volumen total de
sangre corresponde aproximadamente al 10 % de su peso corporal; normalmente
se considera que se puede obtener hasta un 10 % del volumen sanguíneo sin poner
en riesgo su vida.
plasma
Cuadro 3
Efectos y proporciones de los anticoagulantes frecuentemente usados en
la toma de muestras
glucosa
EDTA (ácido etilén
Secuestra calcio 1:9
diaminotetracético)
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
Interfiere en la conversión de
Heparina 1%
protrombina en trombina
Impide la disponibilidad de
Citratos 3.8-4 %
calcio
4. Este paso se repite al menos dos veces más, hasta que el sobrenadante sea to-
talmente transparente.
2 mL de glóbulos rojos son para 100 mL, ¿cuántos mililitros de glóbulos rojos
]] Obtención de suero. Para obtener el suero del animal, la muestra se toma sin
anticoagulante, el líquido que se desprende después de formado el coágulo se
denomina suero y contiene los mismos elementos que el plasma sin fibrinóge-
no (pues este se activó en la formación del coágulo). Las muestras de suero se
emplean para la titulación de anticuerpos mediante el uso de diversas pruebas
serológicas. Algunos de los aspectos importantes para la obtención de suero
son:
sis, cambiará de un rojo translúcido hasta un rojo intenso semejante al del vino
tinto. En el laboratorio, se evalúa el grado de hemólisis, si es alto, la muestra
se rechaza, por lo que es necesario realizar un nuevo muestreo, lo que implica
gasto de tiempo, dinero y esfuerzo.
Si la muestra tardará más de tres días en llegar al laboratorio, es reco-
mendable quitarle el coágulo y dejar que sedimenten los glóbulos rojos que
quedaron en la muestra. Auxíliese de una jeringa con aguja, tome el suero
sin sedimento, páselo a otro tubo lo más limpio posible y colóquele un tapón
(puede ser otro tubo: un Vacutainer). Bajo estas condiciones, el suero puede
congelarse y enviarse al laboratorio. Entre un suero y otro es importante en-
juagar la jeringa y la aguja con agua limpia (hervida de preferencia) para evitar
mezclar los sueros. NOTA. Una muestra de suero con coágulo se hemolizará
si se congela.
Vías de sangrado
Cualquier procedimiento que cause mayor dolor o molestia en los animales, que
la producida por inyección o marcaje en orejas, requerirá el uso de tranquilizantes,
analgésicos o anestésicos. Si es necesario efectuar un procedimiento doloroso sin
el uso de anestesia, analgésicos, o tranquilizantes, porque su uso afectaría los re-
sultados del experimento, debe ser aprobado previamente (NOM). A continuación
se describen las técnicas de toma de muestra sanguínea:
Práctica 4 Vías de inoculación y sangrado en animales de experimentación 57
Gallina doméstica
Vena radial:
15
16
Conejo
Vena central de la oreja:
17
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
18
Para una punción cardiaca (no se realiza en esta práctica), si se necesita cam-
biar la dirección de la aguja, se sacará y de nuevo se introducirá buscando la di-
rección correcta. NUNCA SE DEBE MOVER LA AGUJA DENTRO DE LA
CAVIDAD TORÁCICA, PUES SE CORRE EL RIESGO DE DESGARRAR EL
TEJIDO CARDIACO Y/O PULMONAR OCASIONANDO LA MUERTE DEL
ANIMAL.
Práctica 4 Vías de inoculación y sangrado en animales de experimentación 59
Cuadro 4
Vías de sangrado empleadas en esta práctica
Especie Sangrado
]] 1 ratón
]] 1 jeringa de insulina
]] 1 pipeta de transferencia de plástico
]] 1 tubo de ensayo 13 × 100
60 Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología
Desarrollo de la práctica
Preguntas
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología
1. Mencione las regiones anatómicas en las que se puede inocular vía intramus-
cular a las especies animales manejadas en la práctica.
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
Literatura de consulta
1. Benjamín, M. M. Manual de patología clínica, Limusa, México, pp. 9-20, 1985
2. Kuby, J. Immunology. 4th ed, New York, USA. Freeman and Company, 2000.
3. NOM-062-ZOO-1999. Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y
uso de los animales de laboratorio. DF, México. Segob, 1999.
4. Olguín, F. R. Los animales de laboratorio: importancia, cuidados y manejo.
Material de consulta. DF, México: UNAM, 1982.
5. Guide for the care and use of laboratory animals. United States of America.
Washington DC. National Research Council. National Academy Press. 2009.
5
61
Práctica
Mecanismos moleculares
de inmunidad innata en el suero
Alfredo Castañeda Ramírez
Alejandro Benítez Guzmán
Objetivo general
Evidenciar la actividad microbicida del suero, mediante la incubación de un cultivo
de Salmonella gallinarum con suero inactivado por calor y sin tratar, para comparar
el crecimiento de la bacteria en ambas condiciones y asociarlo con la presencia de
Introducción
Los mecanismos de defensa que intervienen inicialmente, cuando un agente pa-
tógeno (bacterias, virus, hongos y parásitos) entra en contacto con el hospedador,
son los que pertenecen a la inmunidad innata. Como características principales
de la inmunidad innata se encuentran: el no presentar memoria, el individuo la
posee desde su nacimiento y se considera la primera barrera de defensa contra
agentes extraños al organismo. Los mecanismos innatos se pueden dividir en tres
categorías:
Cuadro 1.
Principales sustancias bactericidas localizadas en fluidos y tejidos del
organismo
Principal origen
Grupo Nombre Acción Cofactor
y/o localización
Gram+,
menos eficaz
Suero y en Gram−.
leucocitos Previene
Enzima Lisozima pH ácido
Secreciones fijación de
(saliva, lágrimas) virus a los
receptores
celulares.
Contra
Beta lisina
Suero Gram+
Defensinas
Neutrófilos y Gram-
Péptidos Protegrinas
Macrófagos Hongos
antimicrobianos Histatinas
Leche
Mecanismos de Lactoperoxidasa Neutrófilos Bacterias,
descomposición Mieloperoxidasa Macrófagos virus
del peróxido Xantinooxidasa Suero, saliva y parásitos
Tiocianato y leche
]] 1 gradilla
]] 1 vial con un cultivo de Salmonella gallinarum de 18 a 24 horas
]] 3 tubos de ensayo estériles de 12 × 75 con tapón de algodón
]] 3 pipetas serológicas de 1 mL, 1/100, estériles
]] 1 pipeta serológica de 5 o 10 mL, 1/10 estéril
]] 3 cajas de Petri de 60 mm con agar triptosa envasadas estérilmente.
]] 1 frasco con 20 mL de solución salina fisiológica (SSF), estéril
]] 1 frasco con capacidad de 10 mL, vacío y estéril
]] 1 frasco con capacidad de 5 mL, vacío y estéril
]] 1 frasco con suero normal (SN)
]] 1 frasco con suero calentado (a 56 °C/30 min) (SC)
]] 1 tira de cinta adhesiva
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología
Desarrollo de la práctica
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
2. Rotular los dos frascos estériles y los tubos de ensayo estériles de la siguiente
forma:
Recipientes Rótulo
3. Con una pipeta estéril de 5 o 10 mL, añadir 9.9 mL de SSF estéril al frasco
rotulado 1/100, y 4.9 mL al frasco rotulado 1/5000.
Práctica 5 Mecanismos moleculares de inmunidad innata en el suero 65
4. Con una pipeta de 1 mL estéril, añadir 0.25 mL de SSF estéril al tubo de en-
sayo rotulado como control.
5. Con la misma pipeta añadir 0.1 mL de cultivo de S. gallinarum (cultivo de
18 horas), previamente homogeneizado, al frasco de 10 mL. Homogeneizar
perfectamente y transferir 0.1 mL de esta dilución (1/100) al frasco de 5 mL,
rotulado 1/5000. (Figura 1).
Resultados
Los resultados esperados para cada caja de Petri son:
Preguntas
Literatura de consulta
1. Bach, J. F. Inmunología, Limusa, D.F México, p. 371-373, 1985.
2. Cooper, N. R. El sistema del complemento. En: Stites, D. P., Stobo, J. D.,
Fudenberg, H. H. y Wells, J. V. Inmunología Básica y Clínica. Manual Moderno,
D.F, México, 5a. edición, p. 119, 1985.
3. Herbert, W. J. Inmunología Veterinaria. Acribia, Zaragoza, España Capítulo 3,
1972.
4. Werb, Z. and Goldstein, I. M. Células fagocíticas: Funciones quimiotácticas y
efectoras de los macrófagos y los granulocitos. En: Stites, D. P., Stobo, J. D.,
Fudenberg, H. H. y Wel15, J. V. Inmunología Básica y Clínica. Manual Moderno,
D.F, México, 5a.edición p.103, 1985.
5. Wood, W. B. and Davis, B. D. Host-Parasite relations in bacterial infections. In:
Davis, B. D., Dulbecco, R., Eisen, H. N. and Ginsberg, H. S. Microbiology. Harper
and Row Publishers, U.S.A., 3th. edition, chapter 24. 1980.
6. Hancock, R. E. W. and Diamond, Gill. The role of cationic antimicrobial peptides
in innate host defenses. Canada, Trends Microbiol 8(9): 402-410, 2000.
7. Tizard, I. Inmunología Veterinaria. 6ª ed, Texas, USA, Interamericana, 2001.
8. Ricklin, D. Hajishengallis, G. Kun, Yangi, K. Lambris, J. D. Complement: a key
system for immune surveillance and homeostasis. Philadelphia, USA, Nature im-
munology 11(9) 2010
Práctica 5 Mecanismos moleculares de inmunidad innata en el suero 67
Práctica
Prueba de la tuberculina
Alfredo Castañeda Ramírez
Alejandro Benítez Guzmán
Objetivo general
Realizar la prueba cervical doble comparativa mediante la inoculación intradérmi-
ca de derivado proteico purificado (PPD)* en vacas y analizar casos hipotéticos,
para conocer el procedimiento y la interpretación oficial empleados en el diagnós-
Introducción
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica causada por bacterias ácido
(alcohol resistentes del género Mycobacterium. Mycobacterium bovis es la causa
principal de la tuberculosis en el ganado bovino, sin embargo, el humano, las cabras
y los cerdos también son susceptibles a esta especie. La principal vía de transmi-
sión entre animales es la aerógena, aunque la infección al hombre se da principal-
mente por vía oral, a través de la leche, así como cualquier producto lácteo crudo
o mal pasteurizado. Esta enfermedad, ocasiona grandes pérdidas económicas en la
industria pecuaria, ya que la capacidad productiva de los animales disminuye en
70 Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología
a. PPD bovino: es elaborado con Mycobacterium bovis cepa AN5, para la prueba
caudal, cervical comparativa y cervical simple.
b. PPD aviar: es elaborado con Mycobacterium avium cepa D4, para la prueba
cervical comparativa. La tuberculina de PPD aviar contiene como colorante el
rojo de Ponceau, para distinguirla de la de PPD bovino que no lleva colorante.
Práctica 12 Prueba de la tuberculina 71
Prueba cervical comparativa. En esta prueba se utilizan los dos tipos de tuber-
culina, el PPD bovino y el PPD aviar. El PPD aviar se utiliza para diferenciar la
reacción por una infección con M. bovis e infecciones por M. avium, M. paratuber-
culosis (incluyendo vacunación), Nocardia farcinicus (muermo bovino), así como
por micobacterias atípicas (fotocromógenas, ectocromógenas, no cromógenas y de
crecimiento rápido) que llegan a ser habitantes habituales del suelo y que, por su
parentesco, llegan a producir reacciones inespecíficas. En la prueba doble compa-
rativa, se inyectan simultáneamente las tuberculinas aviar y bovina en dos lugares
del mismo lado del cuello, y se realiza la lectura 72 horas (± 6 horas) después. Se
inocula comúnmente en la tabla del cuello, porque se ha observado que, en esta
parte, la piel es más sensible que la del pliegue ano-caudal.
tencia de M.bovis; o bien para examinar ganado que estuvo expuesto directa o in-
directamente con hatos infectados con M. bovis. Las reacciones a las pruebas de
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
1. Por el contacto de los animales con bacterias relacionadas con M. bovis como
M. avium, M. paratuberculosis, bacterias del género Nocardia, así como otras
micobacterias atípicas.
2. En animales recientemente tuberculinizados.
3. Animales que hayan adquirido inmunidad natural activa contra la tuberculosis.
Desarrollo de la práctica
La prueba se realiza en el tercio medio de la tabla del cuello, a diez centímetros
por debajo de la cruz, se rasura en dos áreas, cada una de ocho centímetros de diá-
metro, aproximadamente, y trece centímetros hacia la porción ventral (Figura 1).
74 Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología
Interpretación
Una vez obtenidas las mediciones del grosor de la piel en la lectura inicial, y a las
72 horas postinoculación, se hará lo siguiente:
Lectura inicial 4 mm 4 mm
Diferencia 6 mm 3 mm
Resultados
Con las lecturas realizadas durante la práctica, interprete la prueba y explique cuál
es el procedimiento a seguir con ese animal en caso de que perteneciera a un hato
afectado por tuberculosis.
Preguntas
1. ¿Cuáles son las pruebas in vivo e in vitro que se pueden llevar a cabo para el
diagnóstico de tuberculosis?
2. ¿Cuántos tipos de tuberculina se conocen?
3. Explique las ventajas que tiene llevar a cabo la prueba de tuberculina doble
comparativa con respecto a las demás pruebas.
4. ¿Cuál es la vía de inoculación utilizada en la prueba doble comparativa?
5. ¿Cuánto tiempo se necesita esperar después de inocular para observar una re-
acción positiva a la tuberculina?
6. De cada una de las reacciones falsas positivas y falsas negativas listadas en la
práctica, explique los mecanismos por los que se presentan.
Literatura de consulta
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología
Sangre
La sangre y sus componentes sólo en su forma líquida, así como los derivados no
comerciales, incluyendo las células progenitoras, hematopoyéticas y las fracciones
celulares o acelulares de la sangre resultante (hemoderivados).
Patológicos
Los tejidos, órganos o partes que se extirpan o remueven durante las necropsias,
la cirugía o algún otro tipo de intervención quirúrgica, que no se encuentren en
formol. Así como, las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico,
citológico e histológico, y los cadáveres y partes de animales que fueron inoculados
con agentes enteropatógenos en centros de investigación y bioterios.
No anatómicos
Los recipientes desechables que contengan sangre líquida. Los materiales de cu-
ración, empapados, saturados, que gotean sangre o cualquiera de los siguientes
fluidos corporales: líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido pleural, líquido ce-
falorraquídeo o líquido peritoneal; los materiales absorbentes utilizados en las jau-
las de animales que hayan sido expuestos a agentes enteropatógenos.
Punzocortantes
Los utensilios que han estado en contacto con humanos o animales, o sus mues-
tras biológicas durante el diagnóstico y tratamiento, únicamente: tubos capilares,
navajas, lancetas, agujas de jeringas desechables, agujas hipodérmicas, de sutura,
de acupuntura y para tatuaje, bisturís y estiletes de catéter, excepto todo material
de vidrio roto utilizado en el laboratorio, el cual deberá desinfectarse o esterilizarse
antes de ser dispuesto como residuo municipal.
Anexo I Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI’S) 79
Los generadores deben cumplir con las siguientes fases de manejo: identifi-
cación, envasado, almacenamiento, recolección y transporte interno, tratamiento y
disposición final, según sea el caso.
Identificación y envasado
En las áreas de generación, (laboratorios de docencia o investigación), se deberán
separar y envasar todos los RPBI, de acuerdo con sus características físicas y bio-
lógicas infecciosas, conforme al Cuadro 2 que se presenta a continuación. Los re-
siduos peligrosos biológico-infecciosos no deberán mezclarse con ningún otro tipo
de residuos municipales o peligrosos.
Las bolsas se llenarán al 80 % de su capacidad y se cerrarán antes de ser
transportadas al sitio de almacenamiento temporal: no podrán ser abiertas o vacia-
das. Los recipientes para los residuos peligrosos punzocortantes se llenarán hasta
el 80 % de su capacidad y se asegurarán los dispositivos de cierre: no se deberán
abrir o vaciar.
Cultivos y cepas
Polietileno traslúcido, calibre
de agentes Sólidos
300 mm, contenido de metales
infecciosos
Bolsa roja pesados de no más de una parte
por millón (ppm) y libres de cloro,
Residuos no
Sólidos marcadas con el símbolo universal de
anatómicos
riesgo biológico y la leyenda Residuos
Peligrosos Biológico-Infecciosos.
Deberán cumplir los valores mínimos
Bolsa de los parámetros indicados en la
Patológicos Sólidos
amarilla Tabla 3 de la NOM-087.
Almacenamiento
Los residuos peligrosos biológico-infecciosos envasados deberán almacenarse en
contenedores metálicos o de plástico con tapa y se rotulan con el símbolo univer-
sal de riesgo biológico, con la leyenda “Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos”.
Estos contenedores deben desinfectarse y lavarse después de cada ciclo de reco-
lección. En el caso de residuos patológicos, deberán almacenarse a 4 °C.
Tratamiento
Los residuos peligrosos biológico-infecciosos deben ser tratados por métodos físi-
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)
Disposición final
Los residuos peligrosos biológico-infecciosos tratados e irreconocibles se dis-
pondrán como residuos no peligrosos en sitios autorizados por las autoridades
competentes.
a. Residuos peligrosos radiactivos: de acuerdo con la NOM 004 NUCL de
la Secretaría de Energía, se definen como cualquier material que contenga o
esté contaminado con radionúclidos a concentraciones a las señaladas en esta
normatividad y para el cual no se prevé uso alguno. Se clasifican en nivel bajo,
medio y alto. Las fases de manejo incluyen el envasado, transporte, almacena-
miento temporal y disposición final.
b. Manejo de sustancias químicas: en los laboratorios microbiológicos, también
se manejan sustancias químicas que son potencialmente peligrosas, que consti-
tuyan un riesgo si no son identificadas y manejadas correctamente. Las NOM’s
018 y 114 de la STPS establecen los requisitos mínimos para la identificación
y comunicación de peligros y riesgos por sustancias químicas peligrosas con
respecto a sus características físicas, químicas, de toxicidad, concentración y
tiempo de exposición, que afecten la salud del personal que las maneja o que
dañe los centros de trabajo. Se debe contar con la hoja de seguridad de cada
Anexo I Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI’S) 81