Manual Tercera Edición-Primera Parte - 220914 - 092305

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Práctica
Bioseguridad en el laboratorio
de Inmunología
Liliana Manuela Valdés Vázquez
Objetivo general
Reconocer los conceptos básicos de bioseguridad mediante la aplicación de las
prácticas microbiológicas estándar en el desarrollo de cada una de las prácticas de
este manual, para la protección personal, del equipo, las instalaciones y el medio
El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología

ambiente.
de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)

Objetivos particulares
1. Identificar los posibles riesgos dentro del laboratorio de inmunología mediante
la revisión de los objetivos de las prácticas para discernir qué medidas de bio-
seguridad se deberán aplicar en cada una ellas, así como en otros ambientes
laborales de la profesión veterinaria como un consultorio médico y explotacio-
nes pecuarias.
2. Conocer y aplicar los principios básicos de bioseguridad dentro del laboratorio
de inmunología mediante el uso de equipo de protección personal, la desinfec-
ción del área de trabajo y el manejo de residuos peligrosos para evitar riesgos y
trabajar de forma segura en el laboratorio.
3. Desarrollar la habilidad del uso correcto de la perilla de seguridad mediante
ejercicios prácticos para el adecuado pipeteo durante el trabajo en el laboratorio.
Introducción
La bioseguridad es un componente de la seguridad ambiental y su pilar es la eva-
luación del riesgo. Se puede definir como:
El conjunto de lineamientos, medidas y acciones de prevención, control,
mitigación y erradicación de impactos y repercusiones adversas a la sa-
lud y al ambiente. Todos ellos asociados a factores biológicos, derivados
de actividades y/o productos de la biotecnología, docencia, investigación,
12 Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología
diagnóstico, servicios hospitalarios (medicina humana y veterinaria), in-

dustria farmacéutica, producción de biológicos, así como de explotaciones
pecuarias. Lo anterior, con la finalidad de proteger de agentes que son
potencialmente nocivos, tanto la salud humana y animal, como el medio
ambiente (Gallardo, 1994; Santos and Cruz-Gavilán, 2002; CDC, 1999;
OMS, 2005).
La bioseguridad en el laboratorio se entiende como una metodología que brin-
da la oportunidad de lograr actitudes y conductas que disminuyan el riesgo del
personal para adquirir infecciones en el medio laboral. El tema de la bioseguridad
en los laboratorios es muy extenso y comprende una gran variedad de aspectos:
1. Los niveles de bioseguridad

2. La clasificación de agentes por grupo de riesgo
3. Los equipos de protección personal (barreras primarias)
4. Las instalaciones (barreras secundarias)
La capacitación del personal
5.
6. El manejo de bioterios, residuos peligrosos, sustancias químicas
7. Señalización y código de colores
8. Desinfección y planes de contingencia
Todo lo anterior con el objetivo de proteger al personal y al medio ambiente, cuidar

el equipo, los materiales y las instalaciones.
Principios de la bioseguridad
La universalidad y la contención son dos principios básicos de la bioseguridad. El
primero se refiere a que todas las personas que trabajan en un laboratorio sigan
las precauciones incluidas en los niveles de bioseguridad, sin importar su estrato
social, religión, edad, salud etc. El segundo principio describe los métodos seguros
para trabajar en un laboratorio. Se dividen en dos tipos:
1. Contención primaria: es la protección del personal y del medio ambiente

inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos. La contención
primaria incluye:
a) Prácticas y técnicas de laboratorio. El elemento más importante de la con-
tención es el cumplimiento estricto de las prácticas y técnicas microbioló-
gicas estándar (Cuadro 1)
Práctica 1  Bioseguridad en el laboratorio 13
Cuadro 1.
Prácticas microbiológicas estándar
❙❙ Limitar el acceso al laboratorio a personal autorizado.
❙❙ Lavarse las manos antes y después de manipular materiales viables, al quitarse los
guantes y antes de salir del laboratorio.
❙❙ Prohibir pipetear con la boca, comer, fumar, manipular lentes de contacto, ma-
quillarse o almacenar alimentos dentro del laboratorio, llevarse objetos a la boca.
❙❙ Minimizar la creación de salpicaduras o aerosoles.
❙❙ Descontaminar las superficies de trabajo por lo menos una vez al día.
❙❙ Manejar adecuadamente los residuos peligrosos.
❙❙ Poner señales en el laboratorio, con la advertencia de riesgo biológico en la entra-
da de este.
❙❙ Transportar las muestras en el laboratorio en condiciones de seguridad.
❙❙ Contar con un plan de contingencias y procedimientos de emergencia.
❙❙ Programar un control de plagas (roedores e insectos).

b) Equipos de seguridad (barreras primarias)
❙❙ Gabinetes de seguridad biológica (GSB) y mecheros, que se utilizan para

proporcionar contención de salpicaduras o aerosoles infecciosos genera-
dos por diversos procedimientos microbiológicos.
❙❙ Elementos de protección personal respecto a la región anatómica expuesta:
cabeza (cofia), ojos y cara (anteojos de protección, gafas de protección, ca-
reta facial), aparato respiratorio (respirador contra partículas, gases y pol-
vos; respirador desechable, cubrebocas), extremidades superiores (guantes
para sustancias químicas, para altas y bajas temperaturas, para manipula-
ción de biológicos), tronco (bata, overol, mandil para sustancias químicas,
para altas temperaturas), extremidades inferiores (calzado de seguridad,
calzado contra sustancias químicas, botas impermeables)
2. Contención secundaria: se refiere a la protección del medio ambiente ex-

terno al laboratorio de la exposición a materiales infecciosos. Se logra a través
de una combinación del diseño de las instalaciones y prácticas operativas. La
seguridad física de los laboratorios se incrementa de forma concéntrica hacia
el núcleo central, el área de mayor riesgo. Es decir, las cepas de los agentes bio-
lógicos estarán protegidas de tal forma que para llegar a ellas se pase por varias
medidas de seguridad como lectores de huella digital, de iris, entre otros.
Señalización y código de colores

La señalización y el código de colores son también elementos que componen la
bioseguridad de un laboratorio, es la forma de comunicación para evidenciar algún
peligro. Es fundamental conocer las características de los colores, señales y figuras
de seguridad, así como la identificación de riesgos por fluidos conducidos por tube-
rías. La señalización indica peligro, proporciona información o bien prohíbe o ad-
vierte una acción a seguir. En la NOM026 de la Secretaría del Trabajo y Previsión
Social (STPS), se muestra el código de colores de seguridad, las formas geométri-
cas, los colores de seguridad para tuberías, las leyendas para fluidos peligrosos, así
como los tipos de señales, cuyo objetivo es atraer la atención del personal al que
está destinado ese mensaje y ser claras para facilitar su interpretación. Para mayor
información, ver el anexo al final de este manual.
Manejo de residuos peligrosos

En los laboratorios se producen residuos peligrosos diversos, que se deben ma-
nejar de acuerdo con los procedimientos establecidos en la legislación ambiental

vigente. Los residuos peligrosos son los materiales generados en los procesos pro-
ductivos que no se reutilizan; se encuentran en cualquier estado físico que, por

sus características corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas, inflamables o biológi-
co-infecciosas (CRETIB) representen un peligro para el equilibrio ecológico y el
ambiente.
La Ley general para la prevención y gestión integral de los residuos (2003, refor-
mada 2018) define al generador como la “persona física o moral que produce resi-
duos a través del desarrollo de procesos productivos o de consumo”. Asimismo, el
generador es el responsable directo del manejo adecuado de estos residuos.
1. Residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI’s). De acuerdo con

la NOM087 de la Secretaría del Medio Ambiente y Recursos Naturales
(Semarnat), se clasifican en sangre, cultivos y cepas, no anatómicos, punzo-
cortantes y patológicos. Su manejo incluye la identificación, envasado, aco-
pio, transporte al área de almacenamiento, tratamiento y disposición final
(Cuadro 2). Para más información, ver el Anexo I al final de este manual.
2. Residuos peligrosos químicos. La NOM-052 de la Semarnat, los define

como “sustancias en cualquier estado físico, que por sus características corro-
sivas, reactivas, explosivas, inflamables y tóxicas ambientales (Código CRIT)
representen un riesgo para el equilibrio ecológico, el ambiente y la salud de
la población en general.” No se deben verter al drenaje, sino llevarse a confi-
namiento autorizado o tratarse para su eliminación segura de acuerdo con las
siguientes propiedades: caracterización, neutralización, almacenamiento tem-
poral, eliminación y disposición final.
Sangre y
líquidos
Vidrio contaminado con un biológico Objetos
contaminados Patológicos No anatómicos Cultivos y cepas
infeccioso punzocortantes
con un biológico
Clasificación
infeccioso
Tipo de residuo
Cuadro 2
biológico-infecciosos
Identificación y envasado de los residuos peligrosos
Envasado
Práctica 1  Bioseguridad en el laboratorio

15
Niveles de bioseguridad
El Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados
Unidos especifica cuatro niveles de bioseguridad para el manejo de agentes bioló-
gicos, que se conocen como niveles de bioseguridad del 1 al 4. La clasificación de
cada laboratorio identifica el riesgo biológico que representa para la salud del per-
sonal y su impacto en el medio ambiente: laboratorio básico niveles 1 y 2, laborato-
rio de contención nivel 3 y laboratorio de contención máxima nivel 4. El laboratorio
de prácticas de inmunología y virología tiene un nivel de seguridad 1.
Para cada nivel de seguridad biológica se presentan cuatro elementos de re-
glamentación, dos de ellos se refieren a la infraestructura del laboratorio y los dos
restantes describen las buenas prácticas dentro del mismo. En todos los niveles
aplican las reglas básicas de laboratorio (prácticas microbiológicas estándar). Para
más información, ver el Anexo II al final de este manual.
Normas de bioseguridad
Como en todas las actividades de riesgo, se necesita una correcta aplicación de
normas de seguridad (prácticas microbiológicas estándar). Algunas de estas nor-

mas se incluyen en el Reglamento del laboratorio de virología e inmunología.
I. Actividades y desarrollo de la práctica

1. En el siguiente cuadro, se listan algunas prácticas incluidas en este manual.
Revise los materiales y métodos, con base en ello y el análisis de riesgo, escriba
en el espacio vacío el equipo de protección personal mínimo que se requiere
para el desarrollo adecuado de las actividades en el laboratorio.
Práctica Equipo de protección personal
Vías de inoculación y sangrado de animales

de laboratorio
Mecanismos moleculares de inmunidad
innata en el suero
Aglutinación directa I: diagnóstico de
salmonelosis aviar y pruebas cruzadas
Aglutinación directa II: diagnóstico
serológico de brucelosis
Prueba de tuberculina
Práctica 1  Bioseguridad en el laboratorio 17
2. Mediante una dinámica de grupo, discutir la aplicación de las medidas de

bioseguridad en actividades de la medicina veterinaria (consultorio médico o
explotación pecuaria).
Elementos Consultorio médico Explotación pecuaria
Equipo de protección personal

Manejo de residuos peligrosos
Medicina preventiva
Manejo de medicamentos controlados
Desinfección y esterilización
Otros
Materiales
Tubos de ensayo 13 × 100

]]
]] Pipetas serológicas 1 mL 1/100
]] Perilla de seguridad/ propipeta

]] Paquete de pipetas de plástico terminales y no terminales
]] Frasco con colorante vegetal
]] Frasco con agua corriente
]] Tubos de tapón de algodón
]] Marcador de tinta indeleble
]] Pipetas volumétricas
]] Micropipetas automáticas
]] Caja con puntas para micropipetas automáticas
]] Cajas de Petri de vidrio
]] Cajas de Petri de plástico
]] Microplacas de fondo en “U”
]] Microplacas de fondo plano
Desarrollo de la práctica
Revisar los materiales del laboratorio para mostrarles su utilidad en el laboratorio.
1. Utilizar la perilla de seguridad y hacer ejercicios prácticos.

2. Ejercitarse en el manejo de los tubos, las pipetas, las gradillas, las cajas de
Petri, las microplacas y las micropipetas.
Literatura de consulta
1. Castellanos, B. C. López, M. L. Rosales, L. R. Ladrón de Guevara, O. V. Osorio,
A. Garduño, S. G. Bioseguridad para los laboratorios biomédicos. Lineamientos,
prevención y protección. DF, México: UNAM, 1999.
2. Categorization of biological agents according to hazard and categories of
containment. 4th ed. London, United Kingdom. HSE Books, 1995. ISBN
0717610381.
3. Gallardo, R. R. Manual de bioseguridad para laboratorios de biológicos. DF,
México: Secretaría de Salud, 1994.
4. Semarnat. NOM-052-SEMARNAT-2005. Que establece las características, el
procedimiento de identificación, clasificación y los listados de los residuos peligro-
sos. DF, México: Segob, 2005.
5. Semarnat. NOM-087-SEMARNAT-2002. Requisitos para la separación, envasa-
do, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los
residuos peligrosos biológico-infecciosos que se generan en establecimientos que
presenten atención médica. DF, México: Segob, 2002.
6. Santos, E. Cruz-Gavilán, I. Manual de procedimientos de bioseguridad en los

laboratorios de la UNAM. 2a ed. DF, México: DGIRE, 2002.
7. Natalia, M. Cediel, B.I. Luis, C. Villamil, J. II. Riesgo biológico ocupacional en

la medicina veterinaria, área de intervención prioritaria. Revista de Salud Pública,
2004;6(1):28-43.
8. Morley, P. Biosecurity of veterinary practices. Veterinary clinics of North American,
food animal practice, 2002;18:1-19.
9. Bascom, R. Occupational health and safety program in a research animal facility. 4th
ed. National symposium on biosafety. Proceedings of the 4th national symposium on
biosafety. Santa Barbara California. USA. CDC, 1996.
10. Organización Mundial de la Salud. Laboratory biosafety manual. 3rd ed.
Ginebra: 2005.
11. Centro de Control y Prevención de Enfermedades (CDC/NIH). Biosafety in
microbiological and biomedical laboratories. 4th ed. USA. National Institutes of
Health. 1999.
2
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Práctica
Diluciones
Laura Cobos Marín
Myrna Vicencio Mallén
Objetivo general
Conocer el concepto de dilución, la nomenclatura y sus formas de interpretación,
mediante la realización de distintos ejercicios teórico-prácticos para identificar sus
aplicaciones en las ciencias químico-biológicas.

Objetivo particular
Distinguir las diluciones únicas, seriadas, en pasos y porcentuales, así como sus
formas de expresión mediante la realización de operaciones matemáticas, la medi-
ción de volúmenes, y la observación de los resultados obtenidos para fundamentar
sus distintas aplicaciones en las ciencias químico-biológicas.
Introducción
Diluir es la acción de disminuir la concentración de una sustancia (soluto) en otra
(solvente), a ésta en inmunología se le llama diluyente. Cuando el soluto se disuel-
ve en el diluyente, a la mezcla se le denomina solución, por ejemplo, cuando agre-
gamos cloruro de sodio (soluto) en agua (diluyente); por el contrario, si el soluto
no se disuelve en el diluyente, entonces se obtiene una suspensión, por ejemplo, al
agregar glóbulos rojos (soluto) en solución salina (diluyente).
En una solución, el soluto y el diluyente pueden ser un sólido, un líquido o un
gas; sin embargo, en inmunología el diluyente normalmente está en estado líquido
como el alcohol, y el soluto, en estado sólido como la glucosa. Las diluciones sue-
len expresarse en proporciones, así una dilución 1/4 nos indica las partes de soluto
y las partes totales que tiene una dilución, en donde:
1 Corresponde a las partes de soluto
4 Corresponde a las partes totales
(soluto + diluyente)
Por lo tanto, una dilución ¼ contiene una parte de soluto, tres de diluente, y la
suma es el total: cuatro; de la misma manera una dilución 1/7 contiene una parte
de soluto, seis partes de diluyente, que suman siete partes en total.
Las diluciones pueden ser:
Diluciones únicas
Se denominan únicas cuando solamente se requiere esa dilución. Para realizar una
dilución única se necesita:
Saber la dilución y el volumen requeridos

1.
2. Calcular el volumen de soluto y de diluyente necesarios
Para preparar una dilución ¼ en dos mililitros, sabemos que se requiere

una parte de soluto y tres partes de diluyente; como el volumen es 2 mL, en-
tonces para calcular el volumen de soluto se tiene que dividir 2 mL (volumen
requerido)/4 = 0.5 mL, lo que falte para los 2 mL corresponde al diluyente:
2 mL - 0.5 mL = 1.5 mL.
Si se necesita preparar una dilución 1/10 en 5 mL, el soluto equivale a la dé-
cima parte de 5 mL: 5 mL/10 = 0.5 mL, y las nueve partes restantes corresponden
al diluyente: 5 mL - 0.5 mL = 4.5 mL; sumando el soluto y el diluyente obtenemos
5 mL que corresponde a las partes totales (10).
Diluciones seriadas
Las diluciones seriadas son la disminución de un soluto en un diluyente en forma
gradual y sistemática, para lograr reducir su concentración en una secuencia orde-
nada y con ello cuantificar su actividad biológica. Por ejemplo, para saber cuántos
anticuerpos hay en el suero de un animal (título del suero), podemos ir disminu-
yendo su concentración a la mitad, y a la mitad, y así sucesivamente hasta llegar a
un punto en el que ya no detectemos estos anticuerpos. Arbitrariamente podemos
decir que la dilución del último tubo en el que todavía encuentro anticuerpos
corresponde al título del suero y se expresa como el inverso de esa dilución. Por
ejemplo, si en una prueba serológica se hicieron diluciones dobles seriadas, co-
menzando por la dilución 1/5 y se observa una reacción positiva en los primeros
Práctica 2  Diluciones 21
cinco pozos (dilución 1/80), y en el sexto, ya no, el título del suero se expresa como
el inverso de 1/80, es decir 80/1 = 80.
Existen diferentes diluciones seriadas, las más utilizadas en inmunología y vi-
rología son las diluciones dobles seriadas, triples seriadas, quíntuples seriadas y
décuples seriadas. Se llaman dobles cuando lo que se está haciendo es diluir a la
mitad, triples diluyendo a una tercera parte, quíntuples cuando se está diluyendo
a la quinta parte o décuples cuando se está diluyendo a la décima parte la concen-
tración del soluto.
Todas las diluciones seriadas comienzan con una dilución inicial, misma que
se obtiene exactamente igual que si fuera una dilución única. Se puede hacer una
dilución seriada a partir de una dilución inicial cualquiera, lo importante es tener
en mente que la concentración inicial se va a ir disminuyendo a la mitad, o a la
décima parte, etcétera.

Diluciones dobles seriadas
Para realizar una dilución doble se requiere saber:

1. La dilución inicial (que no necesariamente es ½, puede ser cualquier otra)
2. El volumen inicial
3. El número de tubos de ensayo requerido para las diluciones
4. El factor de dilución (en este caso es ½)
Por ejemplo, para cuantificar los anticuerpos de un suero contra H. somnus, se

hace una dilución doble seriada iniciando con una dilución 1/5 en un volumen de
1 mL, en cuatro tubos; los cálculos serían:
a. En el primer tubo se hace una dilución única: para saber cuántos mililitros co-
rresponden al soluto, divido el volumen inicial entre cinco (1 mL/5 = 0.2 mL)
y el resto es de diluyente (1 mL - 0.2 mL = 0.8 mL).
b. Como la dilución es doble, en el siguiente tubo disminuiré la concentración a
la mitad, por lo que transfiero, del tubo uno al dos, la mitad del volumen ini-
cial: 1 mL/2 = 0.5 mL (volumen de transferencia), esta cantidad la recibo en
la otra mitad del volumen: 1 mL - 0.5 mL = 0.5 mL de diluyente (volumen de
recepción), para complementar el volumen inicial (1 mL). Como se indicó an-
teriormente, en una dilución seriada se repiten los pasos sistemáticamente de
un tubo a otro, así transferiré del tubo dos al tres el volumen de transferencia
(0.5 mL) y lo recibo en el volumen de recepción (0.5 mL), esto se repite tantas
veces como tubos sean necesarios.
c. Del último tubo se desecha el volumen de transferencia, (en este caso 0.5 mL)
para que todos los tubos queden con el mismo volumen; para este ejemplo,
0.5 mL.
A continuación se muestra un esquema de cómo se realiza la dilución seriada

de nuestro ejemplo:
SOLUTO Vol. de Vol. de Vol. de Vol. de

transferencia transferencia transferencia transferencia
0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL
0.25mL
desechar
1 2 3 4
1mL 1mL 1mL 1mL
DILUENTE
0.25mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL
soluto soluto soluto soluto
+ + + +
0.75mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL
diluente diluente diluente diluente
0.75mL
Vol. de recepción
0.5mL
Vol. de recepción
0.5mL Vol. de recepción

0.5mL
Las diluciones que quedan en cada tubo al terminar la dilución seriada corres-
ponden a:
NOTA. Esto también puede expresarse en forma matemática como 1/5/2, que se-
ría igual a 1/5 ÷ 2/1. Por ley del sándwich, se multiplican los extremos y el resultado
es el numerador, y la multiplicación de los números centrales es el denominador:
1 2 3 4
0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL

volumen volumen volumen volumen
final final final final
Dilución inical X 1/2 X 1/2 X 1/2

1/5 dilución 1/10 dilución 1/20 dilución 1/40
doble doble doble
seriada seriada seriada
Como se ve, el volumen final en todos los tubos corresponde a la mitad del
volumen inicial (0.5 mL). Si quisiéramos que los tubos quedaran con 1 mL de vo-
lumen final, tendríamos que iniciar la dilución con el doble del volumen (2 mL).
Para hacer una dilución doble seriada, iniciando con una dilución 1/8 en un
volumen inicial de 4 mL en cinco tubos de ensayo, se necesita:
Dilución inicial (tubo 1):

Cantidad de soluto: 4 mL (volumen inicial)/8 (dilución inicial 1/8) = 0.5 mL
Cantidad de diluente: 4 mL - 0.5 mL (soluto) = 3.5 mL

Dilución seriada (tubos 2 a 5):
Volumen de transferencia: 4 mL (volumen inicial)/2 (dilución doble seriada) = 2 mL
Volumen de recepción: 4 mL (volumen inicial) - 2mL (volumen de
transferencia) = 2 mL
Factor de dilución: se refiere a cuánto se va a diluir en cada tubo. En este ejem-
plo, como es una dilución doble seriada, se expresa: X2
Dilución final obtenida en cada tubo:

Tubo 1 = 1/8
Tubo 2 = 1/16 = (1/8)(1/2)
Tubo 3 = 1/32 = (1/16)(1/2)
Tubo 4 = 1/64 = (1/32)(1/2)
Tubo 5 = 1/128 = (1/64)(1/2)
Los datos obtenidos se pueden resumir en el siguiente cuadro:
N.º Tubo 1 2 3 4 5
Dilución obtenida 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128

Vol. de soluto 0.5 mL
Vol. de diluyente 3.5 mL 2 mL
Volumen de
2 mL
transferencia
N.º Tubo 1 2 3 4 5
Volumen final 2 mL
Factor de dilución 2 2 2 2
× 1/ 2 × 1/ 2 × 1/ 2 × 1/ 2
Operación
o o o o
matemática
÷2 ÷2 ÷2 ÷2
Diluciones décuples seriadas

En las diluciones décuples seriadas (1/10) se transfiere una décima parte del vo-
lumen del tubo que estamos trabajando y se recibe en nueve partes de diluyente.
Estas diluciones suelen expresarse en forma logarítmica (10-1). Al igual que en las
diluciones dobles, para hacer una dilución décuple se necesita:
1. La dilución inicial (que no necesariamente es 1/10, puede ser cualquier otra)

2. El volumen inicial
3. El número de tubos de ensayo requerido para las diluciones
Supongamos que queremos realizar una dilución décuple seriada en cinco tu-
bos partiendo de una dilución inicial 1/8 en un volumen de 4 mL; los cálculos
serían:
a. En el primer tubo se hace una dilución única: para saber cuántos mililitros co-
rresponden al soluto, divido el volumen inicial entre ocho (4 mL/8 = 0.5 mL)
y el resto es de diluyente (4 mL - 0.5 mL = 3.5 mL).
b. Como la dilución es décuple, quiere decir que en el siguiente tubo debo dis-
minuir la concentración a la décima parte, por lo que transfiero del tubo uno
al dos, la décima parte del volumen inicial: 4 mL/10 = 0.4 mL (volumen de
transferencia); esta cantidad la recibo en las nueve décimas partes restantes:
4 mL - 0.4 mL = 3.6 mL de diluyente (volumen de recepción), para com-
plementar el volumen inicial (4 mL). Como se indicó anteriormente, en una
dilución seriada se repiten los pasos sistemáticamente de un tubo a otro, así
transferiré del tubo dos al tres el volumen de transferencia (0.4 mL) y lo recibo
en el volumen de recepción (3.6 mL), esto se repite tantas veces como tubos
sean necesarios.
A continuación se muestra un esquema de cómo se realiza la dilución seriada

de nuestro ejemplo:
SOLUTO
Vol. de Vol. de Vol. de Vol. de Vol. de
0.5mL
transferencia transferencia transferencia transferencia transferencia
0.4mL 0.4mL 0.4mL 0.4mL 0.4mL
desechar
DILUENTE
1 2 3 4 5
4mL 4mL 4mL 4mL 4mL
0.4mL 0.4mL 0.4mL 0.4mL 0.4mL
soluto soluto soluto soluto soluto
+ + + + +
3.6mL 3.6mL 3.6mL 3.6mL 3.6mL
diluente diluente diluente diluente diluente
3.5mL
Vol. de recepción
3.6mL
Vol. de recepción
3.6mL
Vol. de recepción
Vol. de recepción
3.6mL
3.6mL

Las diluciones que quedan en cada tubo al terminar la dilución seriada corres-
ponden a:

1 2 3 4 5
3.6mL 3.6mL 3.6mL 3.6mL 3.6mL

volumen volumen volumen volumen volumen
final final final final final
Dilución inical X 1/10 X 1/10 X 1/10 X 1/10

dilución dilución dilución
1/8 1/80 dilución 1/800 1/8000 décuple
1/80000
décuple décuple décuple
seriada seriada seriada seriada
Para hacer una dilución décuple seriada iniciando con una dilución ½ en un
volumen inicial de 5 mL en cuatro tubos se necesita:
Dilución inicial (tubo1):

Cantidad de soluto: 5 mL (volumen inicial)/2 (dilución inicial 1/2) = 2.5 mL
Cantidad de diluyente: 5 mL - 2.5 mL (soluto) = 2.5 mL
Dilución seriada (tubos 2 a 4):

Volumen de transferencia: 5 mL (volumen inicial) /10 (dilución décuple se-
riada) = 0.5 mL
Volumen de recepción: 5 mL (volumen inicial) - 0.5 mL (volumen de
transferencia) = 4.5 mL
Dilución final en cada tubo:

Tubo 1 = 1/2
Tubo 2 = 1/20 = (1/2)(1/10)
Tubo 3 = 1/200 = (1/20)(1/10)
Tubo 4 = 1/2000 = (1/200)(1/10)
N.º Tubo 1 2 3 4
Dilución obtenida ½ 1/20 1/200 1/2000
Vol. de diluente 2.5 mL

Vol. de transferencia 0.5 mL
Vol. final 4.5 mL

Factor de dilución 10 10 10
× 1/10 × 1/10 × 1/10

Operación matemática o o o
÷10 ÷10 ÷10
Ahora bien, en ocasiones es necesario obtener un volumen final determinado,

por lo tanto, calcularemos el volumen inicial requerido por regla de tres. Por ejem-
plo, para hacer una dilución doble seriada con un volumen final de 4 mL, sabemos
que una parte de la dilución (volumen de recepción o volumen final) corresponde
a 4 mL, mientras que la otra parte corresponde al volumen de transferencia. La
suma del volumen de transferencia con el de recepción daría las dos partes totales
o el volumen inicial.
Por lo que se plantea la siguiente regla de tres:
4 : 1 :: X : 2
o
4 mL 1 parte (volumen final)
X 2 partes (volumen inicial)
4 × 2 = 8 o 4/1 = 4
8/1 = 8 mL 4 × 2 = 8 mL
Por lo tanto, el volumen inicial es de 8 mL.
Para comprobar el resultado:

Divido 8/2 = 4 mL del volumen de transferencia.
8-4 = 4 mL del volumen de recepción o volumen final.
Si quisiéramos diluir 1/5 con el mismo volumen final, los cálculos se harían
de la siguiente forma: 4 mL (volumen de recepción o volumen final) serían cuatro
partes de la dilución, mientras que la otra parte sería el volumen de transferencia.
La suma de ambas partes (cinco partes) nos daría el volumen inicial. La regla de
tres quedaría de la siguiente forma:
4 : 4 :: X : 5
o
4 mL 4 partes (volumen final)
X 5 partes (volumen inicial)

4 × 5 = 20 o 4/4 = 1 mL
20/4 = 5 mL (volumen inicial) 1 × 5 = 5 mL (volumen inicial)

Si divido 5/5 = 1 mL de volumen de transferencia.
5 – 1 = 4 mL de volumen de recepción o volumen final.
Diluciones en pasos
Cuando se requiere hacer una dilución alta, no siempre es factible o conveniente
hacerla directamente, por lo que es necesario empezar con una dilución más con-
centrada que la que necesitamos, y a partir de ésta, realizar una o más diluciones
hasta llegar a la dilución que queremos obtener. Si queremos preparar una dilución
1/3 500, podemos partir de una más sencilla, por ejemplo, 1/100. Lo que necesi-
tamos es calcular la dilución restante o intermedia, esto se obtiene dividiendo la
dilución final (1/3 500) entre la dilución inicial (1/100): 3 500/100 = 35
El 35 representa la segunda dilución requerida (dilución intermedia), es de-
cir, necesitamos diluir 35 veces la dilución inicial (1/100) para obtener la dilu-
ción requerida (1/3 500). Dicho de otra forma, para hacer la dilución 1/3 500
diluimos 1/100 y a partir de ésta, una dilución 1/35 en el volumen requerido. Es
importante mencionar que el soluto necesario para la dilución 1/35 se toma de
la dilución 1/100.
SOLUTO
DILUENTE
1 2
Dilución inical X 1/35 Dilución final

dilución
1/100 intremedia 1/3500
El volumen de la dilución inicial se obtiene arbitrariamente, lo único impor-

tante es:
]] Utilizar el menor volumen de soluto (sobre todo si es un reactivo caro o hay

poca disponibilidad del mismo).
]] Tener el volumen suficiente para cubrir el volumen de la segunda dilución
(dilución intermedia).
Una forma de hacer los cálculos para la dilución en pasos podría ser:
Dilución inicial 1/100 en un volumen de 1 mL:
Soluto: 1 mL/100 = 0.01 mL
Diluyente: 1 mL - 0.01 mL = 0.99 mL
Segunda dilución (intermedia) 1/35 en un volumen de 7 mL:
Soluto: 7/35 = 0.2 mL
Diluente: 7 - 0.2 = 6.8 mL
La dilución se realizaría de la siguiente forma:

SOLUTO Vol. de
transferencia
0.2mL
0.01mL
1 1mL 2 7mL
0.01mL 0.2mL
DILUENTE soluto soluto
+ +
0.99mL 6.8mL
diluente diluente
0.99mL Vol. de
recepción
6.8mL

N.º Tubo 1 2
Dilución obtenida 1/100 1/3 500

(1/100)(1/35)

Vol. de diluyente 0.99 mL 6.8 mL
Vol. de transferencia 0.2 mL 0.2 mL
Vol. final 7 mL
Factor de dilución 35
× 1/35
Operación matemática o
÷ 35
Diluciones porcentuales
Como se indicó al inicio de la práctica, una dilución puede expresarse en forma
porcentual. La expresión “tanto por ciento”, por ejemplo, 8 %, quiere decir que de
cada 100 partes, ocho corresponden al soluto y el resto (92) al diluyente. Para pre-
parar una solución porcentual necesito saber:
1. ¿A qué concentración la quiero?

2. ¿Qué cantidad o volumen necesito preparar?
Si deseo preparar 40 mL de una suspensión de glóbulos rojos al 3 %, quiere de-

cir que cada 100 mL de esta suspensión tendrá 3 mL de glóbulos rojos. Si requiero
un volumen de 40 mL, entonces hago una regla de tres:
Tres mililitros de glóbulos rojos son para 100 mL, ¿cuántos mililitros de glóbu-
los rojos (X) son para 40 mL?, entonces: 3:100 :: X:40
o
Mililitros de glóbulos rojos Mililitros totales
3 100
X 40
(3)(40) = 120 o 3/100 = 0.03

120/100 = 1.2 mL (0.03)(40) = 1.2 mL
Necesito 1.2 mL del paquete de glóbulos rojos (soluto) y 38.8 mL de solución

salina como diluyente (40 mL - 1.2 mL = 38.8 mL).
Si deseo preparar una solución salina al 0.85 %, quiere decir que cada 100 mL
de esta solución tendrán 0.85 g de NaCl. Si requiero un volumen de 30 mL, en-
tonces hago una regla de tres:
0.85 g son para 100 mL, ¿cuántos gramos (X) son para 30 mL? 0.85:100 ::
X:30 o
Gramos de NaCl Mililitros totales

0.85 100
X 30
(30)(0.85) = 25.5 o 0.85/100 = 0.0085

25.5/100 = 0.255 g (0.0085)(30) = 0.255 g
Para esta solución necesito poner 0.255 g de NaCl (soluto); en este caso no
restamos los gramos de NaCl al volumen total, por lo que uso una probeta para afo-
rar al volumen deseado; es decir, agregar diluyente cuanto baste para (cbp) 30 mL.
Material por sección

]] 1 pipeta automática con capacidad de 50 a 200 µl
]] 1 pipeta automática con capacidad de 1000 µl
]] 1 pipeta automática de 8 o 12 canales con capacidad de 50 µl
]] Puntas para pipeta automática con capacidad de 200 µl y 1000 µl
Material por alumno

]] 1 gradilla
]] Tubos de ensayo
]] Paquete con pipetas de plástico terminales y no terminales, de diferentes vo-
lúmenes y graduaciones
]] 1 perilla de seguridad (propipeta)
]] Microplacas de fondo en “U”
]] 1 frasco con agua (diluyente)
2 pipetas de 1 mL

]]
]] Frasco con una solución de colorante vegetal (soluto)

1. Hacer los cálculos matemáticos necesarios para realizar diferentes diluciones

únicas, seriadas y en pasos.
2. Indicar el manejo y la forma adecuados de medir con las pipetas serológicas, a
diferencia de las pipetas automáticas.
3. Practicar diferentes diluciones con el colorante vegetal, utilizando pipetas se-
rológicas, tubos de ensayo, micropipetas y placas de fondo en “U”.
4. Discutir los resultados obtenidos.
Preguntas
1. Defina los términos soluto y diluyente

2. Defina qué es una dilución
3. Explique cuál es la finalidad de diluir el suero de un animal
4. ¿Qué finalidad tienen las diluciones seriadas?
5. ¿Cuándo utilizamos las diluciones en pasos?
Ejercicios
a. Esquematice las diluciones que realizó durante la práctica junto con los cál-
culos de cada una de ellas.
b. Al finalizar la práctica se dejará una serie de ejercicios para desarrollar en casa
en los que se resolverá los siguientes puntos:
1. Para cada una de las diluciones iniciales, calcular la cantidad de soluto y

diluyente necesarios.
2. Para cada una de las diluciones (dobles, quíntuples, décuples, etc.) seria-
das calcule:
a) Cantidad de soluto y diluyente de la dilución inicial
b) Volumen de recepción
c) Volumen de transferencia
d) Dilución correspondiente en cada tubo
1. Baldor, A. Aritmética. Teórico-práctica. Cultural centroamericana, S. A. Guatemala,

impreso en España, 1974.
2. Granero, C. R. García, G. A. Serrate, F. C. Técnicas básicas de microbiología y
bioquímica. Editorial Sintesis, Madrid España. ISBN: 978-84-9077-477-9.
3
33
Práctica
Manejo de animales de
experimentación
Laura Cobos Marín
Pablo Hernández Peralta
Objetivo general
Conocer la clasificación y uso ético de los animales de experimentación, así como
el manejo de algunos de ellos, mediante su correcta sujeción para inoculación y
sangrado.

1. Conocer la clasificación de los animales de experimentación (nomenclatura in-

ternacional) para el uso apropiado en la investigación, docencia y diagnóstico.
2. Manipular al conejo, ratón, cuyo y gallina doméstica mediante la adecuada
sujeción para identificar las regiones anatómicas útiles en la inoculación y san-
grado de estas especies domésticas.
Introducción
En la investigación y la docencia de todas las ciencias biomédicas es común expe-
rimentar con diferentes especies animales. Los más usados en los laboratorios son
ratones, ratas, jerbos, hámsters, cuyos, conejos y pollos. Sin embargo, cualquier es-
pecie animal se considera como un animal de laboratorio; aún cuando se emplean
grandes especies domésticas (caballos, cerdos, bovinos, etc.) para estudiar sus ca-
racterísticas anatomofisiológicas, sus necesidades nutricionales o su respuesta a
las diversas enfermedades o fármacos.
El término “animales de laboratorio” se ha usado en forma tradicional por la
relación que existe entre el laboratorio y los animales que se utilizan en él, durante
una investigación; sin embargo, sería más apropiado utilizar el término “animales
para experimentación” ya que hay ciertas especies animales difíciles de mante-
ner en condiciones adecuadas dentro de un laboratorio. Es muy importante tener
siempre en mente que es obligación del investigador, el cuidado de los animales

para experimentación. La NOM-062-ZOO-1999 dice que el investigador debe re-
ducir al mínimo el dolor y la incomodidad así como evitar el uso innecesario de
ellos.
Los animales de experimentación se utilizan como sustituto del hombre o de
otras especies animales cuando por razones prácticas, económicas o morales, las
investigaciones no se llevan a cabo directamente en el animal que queremos estu-
diar. A continuación se listan algunos de los usos que se les da a los animales para
experimentación en el laboratorio de inmunología:
]] Producción de antisueros
]] Obtención de complemento
]] Obtención de glóbulos rojos
]] Propagación de antígenos
]] Diagnóstico de enfermedades infecciosas
Pruebas de seroneutralización
]]
]] Pruebas de viabilidad, potencia e inocuidad en vacunas y otros productos
biológicos
]] Pruebas de actividad de fármacos
Los animales de experimentación, se clasifican de la siguiente forma:
a. Animales convencionales. Son animales que se han criado bajo requisitos mí-
nimos de higiene, pueden sufrir o no de parasitosis, no existen evaluaciones
microbiológicas, no se tiene ningún cuidado especial en cuanto a su origen
genético, deficiencias metabólicas, etc. Este tipo de animales generalmente
son criados bajo condiciones de “cuartos abiertos” (sin barreras).
b. Animales condicionados. Aquellos que se han criado bajo condiciones riguro-
sas de higiene, llevan un control de desparasitación y se les proporciona una
dieta balanceada de acuerdo a las necesidades de la especie y de su estado
fisiológico. Al igual que en los convencionales, no se tiene ningún cuidado en
cuanto a su selección u origen genético.
c. Animales altamente condicionados. Aquellos en los que hay un estricto con-
trol genético, medioambiental y nutricional; dentro de este grupo podemos
encontrar los siguientes:
1. Libres de patógenos específicos (SPF del inglés specific pathogen free).
Estos animales poseen una microflora considerada como “normal” para la
especie, pero se garantiza la ausencia de agentes específicos que puedan
intervenir en el proceso de experimentación. El uso de embriones de pollo
SPF es muy común en la elaboración de diversas vacunas.
Práctica 3  Manejo de animales de experimentación 35
2. Animales axénicos o libres de gérmenes (a = sin, xenos = extraño). Animales

obtenidos por cesárea en un ambiente estéril, en ellos no se detecta nin-
gún microorganismo o virus.
3. Animales gnotobióticos (gnotos = conocido, bios = vida). Son animales,
previamente axénicos, a los que se les han inoculado uno o más microor-
ganismos o virus conocidos.
4. Animales singénicos o de líneas puras consanguíneas. Resultan de la cruza
endogámica (entre hermano y hermana, o entre madre e hijos o padre e
hijos) de por lo menos 20 generaciones. Son genéticamente homogéneos
en más de un 98 % y por ello resultan muy útiles en investigación, pues
prácticamente no existen variaciones en la respuesta entre un individuo y
otro. Los animales singénicos más utilizados son los ratones, sin embargo,
también existen cuyos, hámsters, conejos y aves.
5. Animales transgénicos. Son animales a los que por manipulación genética
in ovo se les integra algún gen nuevo en su cromosoma; después del naci-
miento, aquellos que expresan el gen son cruzados entre sí, para que sus

crías continúen expresando el nuevo gen. Estos animales son muy útiles
en inmunología para estudiar la función de alguna molécula en particular.

6. Animales “Knock-out”. Quienes al contrario de los transgénicos, se les ha
eliminado un determinado gen; también son muy utilizados en inmunolo-
gía para estudiar la función de distintas moléculas.
Técnicas de manejo y sujeción de los animales de

experimentación
Son una serie de acciones que permiten al operador acceder a diversas regiones
anatómicas del animal, realizar correctamente esas acciones, esto asegura la con-
servación de la integridad del operador y del animal de experimentación, pues la
diversidad anatómica y etológica de cada uno requiere diferente metodología.
1. Gallina doméstica
a. Sujeción de la gallina para su traslado. El operador coloca la palma de la mano
en la quilla con los dedos dirigidos hacia la cloaca (Figura 1). El dedo medio
se sitúa entre las piernas, sujetando las patas, una entre el dedo índice y el
medio, la otra entre el anular y el medio, las alas deberán sujetarse, una con
el pulgar y otra con el meñique, ayudándose con la otra mano (Figuras 2 y 3).
b. Sujeción de la gallina en decúbito lateral. Esta técnica inmoviliza a la gallina y
permite tener acceso a los músculos pectorales para la inoculación intramus-
cular (IM), al pliegue del ala para la inoculación subcutánea (SC), a la vena
radial para la toma de muestra sanguínea o para la inoculación intravenosa

(IV), así como para el sitio de punción cardiaca (técnica no realizada en esta
práctica).
Procedimiento. Una vez con la gallina de pie sobre la superficie de trabajo se

sujetan ambas patas con una mano (Figura 4), con esta misma, se sujeta el ala
que quedará en contacto con la superficie de trabajo (Figura 5), con la mano
que queda disponible se sujeta la otra ala (Figura 6). Posteriormente, se coloca
el ave en decúbito lateral (Figura 7).
1
Figuras 1-3. Sujeción para el traslado de la gallina doméstica.

7
6
5
4
Figuras 4-7. Sujeción de la gallina doméstica en decúbito lateral.

Práctica 3  Manejo de animales de experimentación

37
2. Conejo
a) Sujeción del conejo para su traslado. Se toma la piel laxa del dorso con una
mano, mientras la otra mano soporta el peso del animal a manera de sopor-
te en la región sacra (Figura 8). NOTA. NUNCA CARGUE A UN CONEJO
SUJETÁNDOLO DE LAS OREJAS.
8
Figura 8. Sujeción del conejo para su traslado.

b) Sujeción del conejo en decúbito ventral. Esta técnica de sujeción inmoviliza al

conejo y permite tener acceso a la piel laxa del dorso para inoculaciones SC, a
las caras laterales de los miembros pélvicos para inoculaciones IM, y a las ve-
nas marginales y centrales de las orejas, para la toma de muestras sanguíneas
e inoculaciones IV.
Procedimiento. Una vez colocado sobre la superficie de trabajo, con una mano,
sujete el dorso del conejo a la altura del tórax haciendo ligera presión contra la
superficie de trabajo (Figura 9), con la otra mano haga presión sobre la cadera, así
se presionan ambos fémures en dirección caudal, y con ello, el conejo estirará los
miembros pélvicos totalmente (Figura 10).
9
10
Figura 9-10. Sujeción en decúbito ventral del conejo.
c) Sujeción del conejo en decúbito dorsal. Esta técnica de sujeción nos

permite acceder a la cavidad torácica para el sangrado intracardiaco, así
como a la cavidad abdominal para la inoculación IP (no se realizan en esta
práctica).

Procedimiento. Una vez colocado sobre la superficie de trabajo, el operador

sitúa el antebrazo derecho a lo largo del dorso del conejo ejerciendo una ligera
presión, entonces coloca la mano a la altura de la cabeza (Figura 11), sin inte-
rrumpir la presión del antebrazo, coloca el dedo medio de la mano entre las
orejas y sujeta la mano derecha del conejo con los dedos índice y pulgar, y la
izquierda con el anular y el meñique (Figura 12). Después, pasa la palma de la
mano izquierda por la parte ventral del animal, desde el esternón hasta la pel-
vis. A continuación se gira al animal, tomando como eje el antebrazo derecho
del operador, hasta que el conejo quede en decúbito dorsal, sobre el antebrazo
(Figura 13).
11 12 13
Figuras 11-13. Sujeción del conejo en decúbito dorsal.

3. Cuyo (cuye, cobayo, conejillo de Indias o cerdo de Guinea)

a) Sujeción del cuyo para su traslado. Se toma el tórax del animal envolvién-
dolo con una mano (Figura 14).
14
Figura 14. Sujeción del cuyo para su traslado.

b) Sujeción del cuyo en decúbito ventral. Esta técnica de sujeción inmoviliza

al cuyo y deja libre la piel laxa del dorso para inoculación SC, y las caras
laterales de los miembros pélvicos para inoculaciones IM.
Procedimiento. Una vez colocado sobre la superficie de trabajo, con una

mano se sujeta el tórax del cuyo haciendo ligera presión contra la superficie de
trabajo (Figura 15), con la otra mano, se presiona sobre la cadera y los fémures
en dirección caudal para lograr que se estiren totalmente los miembros pélvi-
cos. (Figura 16).
15
16
Figuras 15-16. Sujeción del cuyo en decúbito ventral.
c) Sujeción del cuyo en decúbito dorsal. Con esta técnica de sujeción acce-
demos a la cavidad torácica del animal para el sangrado intracardiaco o
bien a la cavidad abdominal para la inoculación IP (estas actividades no se
realizan en esta práctica).

Procedimiento. Una vez que el cuyo está sobre la superficie de trabajo, se

coloca la mano derecha a la altura del tórax y la cabeza (Figura 17), después se
pone el dedo medio entre los ojos del cuyo y se sujeta el miembro torácico de-
recho a la altura del húmero entre el dedo anular y el meñique, a continuación
se coloca el miembro torácico izquierdo a la altura del húmero entre los dedos
índice y pulgar (Figura 18) entonces, se rota al cuyo para que quede en decúbito
dorsal sobre la palma de la mano, mientras que con la mano izquierda se sujeta
la pelvis para mantener extendidos los miembros pélvicos (Figura 19).
17 18 19
Figuras 17-19. Sujeción en decúbito dorsal del cuyo.

4. Ratón
a) Sujeción del ratón para su traslado. Se toma al animal por la cola y se co-
loca sobre una superficie rugosa (Figuras 20-21).
20
21
Figuras 20‒21. Sujeción del ratón para su traslado.
b) Sujeción del ratón para inoculación o toma de muestras. Se toma con los
dedos pulgar e índice la punta de la cola del ratón (Figura 22); a continua-
ción se detiene con los dedos anular y meñique el resto de la cola lo más
cercano a la base (Figura 23). Esta acción permite utilizar los dedos pulgar e
índice para pellizcar la piel laxa del dorso y cuello (Figura 24), de esta forma
se asegura que el animal no pueda mover la cabeza (Figuras 25-26).
22
26
25
24
23
Figuras 22-26. Sujeción del ratón para la inoculación y toma de muestras.

Práctica 3  Manejo de animales de experimentación

43
]] 1 a 2 conejos
]] 1 a 2 cuyos
]] 1 a 2 gallinas
]] 1 frasco con torundas en alcohol
Material por alumno
]] 1 ratón
Manejar correctamente al conejo, ratón, cuyo y gallina.

1.
Preguntas
1. ¿Cuál es la utilidad de los animales de laboratorio en inmunología?

2. Mencione las diferencias entre un animal condicionado y un animal altamente
condicionado.
3. Mencione las diferencias entre un animal axénico, un gnotobiótico y uno SPF.
4. Mencione las diferencias entre un animal “Knock- out” y un transgénico.
1. Benjamín, M. M. Manual de patología clínica, Limusa, México, pp. 9-20, 1985.
2. Goldsby, R. A. Kindt, T. J. Osborne, B. A. Kuby, J. Immunology. 5th ed. New York,
United States: W. H. Freeman And Co. 2003.
3. NOM-062-ZOO-1999. Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y
uso de los animales de laboratorio. DF, México: Segob, 1999.
4. Olguín, F. R. Los animales de laboratorio, importancia, cuidados y manejo.
Material de consulta. DF, México: UNAM, 1982.
5. Coates, M. E. The germ free animal in research. US: Academic Press, 1968.
6. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. Washington DC: National
Research Council, 2011.
4
45
Práctica
Vías de inoculación y sangrado
en animales de experimentación
Laura Cobos Marín
Pablo Hernández Peralta
Objetivo general
Identificar las regiones anatómicas adecuadas para la inoculación y el sangrado
en el conejo, el cuyo y la gallina doméstica, así como la inoculación en el ratón,
mediante la aplicación de solución salina fisiológica y la obtención de muestras

sanguíneas para conocer su uso en la investigación y el diagnóstico.

1. Realizar inoculaciones intramusculares y subcutáneas en el ratón, el conejo,

el cuyo y la gallina doméstica, mediante la aplicación de solución salina fi-
siológica para ejemplificar su uso en vacunación, terapéutica, investigación y
diagnóstico.
2. Identificar las vías de sangrado de conejos, ratones y gallinas domésticas, me-
diante la obtención de muestras sanguíneas de acuerdo a las metodologías des-
critas para establecer sus usos en la investigación y el diagnóstico.
3. Identificar los el plasma, la capa leucoplaquetaria, los glóbulos rojos, el suero
y el coágulo sanguíneo, que conforman las muestras de sangre obtenidas con
y sin anticoagulante mediante la observación de las muestras centrifugadas
para discernir sus usos en las pruebas de laboratorio en la investigación y el
diagnóstico.
Introducción
Vías de inoculación
En la investigación y el diagnóstico que se lleva a cabo en el Laboratorio de inmu-
nología es necesario inocular diferentes sustancias en los animales en experimen-
tación; es importante mencionar que la Norma Oficial Mexicana indica que:
[…] cualquier procedimiento que cause mayor dolor o molestia en los ani-
males, que la producida por inyección o marcaje en orejas, requerirá el uso
de tranquilizantes, analgésicos o anestésicos. Si es necesario efectuar un
procedimiento doloroso sin el uso de anestesia, analgésicos, o tranquilizan-
tes, porque su uso afectaría los resultados del experimento, éste debe ser
aprobado previamente (NOM-062-ZOO-1999).
A continuación se describen las vías de inoculación más empleadas en

inmunología:
Gallina doméstica
Inoculación intramuscular
Sujetar a la gallina en decúbito lateral.

1.
2. Con una torunda con alcohol, desinfectar una región del músculo pectoral
donde no se observen vasos sanguíneos.
3. Colocar la punta de la aguja, con el bisel hacia arriba e inyectar a 30 grados de

inclinación respecto a la piel.
4. Introducir la jeringa con un movimiento firme hasta alcanzar la masa muscular.
5. Depositar el inóculo lentamente y retirar la jeringa.
6. Presionar con una torunda el sitio de inoculación.
Figura 1. Gallina en decúbito lateral preparada para la inoculación intramuscular.
Inoculación subcutánea
1. Sujetar a la gallina en decúbito lateral.

2. Desinfectar la zona del pliegue del ala con una torunda con alcohol.
Práctica 4  Vías de inoculación y sangrado en animales de experimentación 47
3. Introducir la aguja por debajo de la piel y depositar el inóculo. No debe formar-

se pápula en el sitio de inoculación.
4. Retirar la aguja y dar un suave masaje.
Conejo
El manejo del conejo requiere de la sujeción por dos personas, una en la sujeción,
y otra, en la inoculación o toma de muestras.
1. Colocar al conejo en decúbito ventral.

2. Elegir la(s) zona(s) de inoculación y limpiar con una torunda con alcohol
(Figura 2).
3. Levantar ligeramente la piel del dorso del conejo e introducir aproximadamen-
te una tercera parte de la aguja, teniendo cuidado de que el bisel de la misma

esté hacia arriba (Figura 3).
4. Depositar el inóculo y retirar la aguja.

5. Dar un ligero masaje en el sitio de inoculación, no debe formarse pápula.
Figuras 2 y 3. Inoculación subcutánea del conejo.

1. La persona que vaya a inocular desinfecta el área a inocular con una torunda
con alcohol (Figura 4).
2. Coloca la punta de la aguja en la cara lateral del muslo, con el bisel hacia arriba
y a 30 grados de inclinación respecto de la piel.
3. Introducir la aguja en la masa muscular y depositar el material de inoculación
lentamente (Figura 5).
4. Extraer la aguja.
4
Figuras 4 y 5. Inoculación intramuscular del conejo.
Cuyo
1. Sujetar al cuyo en decúbito ventral.

2. Desinfectar con alcohol la cara lateral de uno de los miembros posteriores
(Figura 6).
3. Colocar la punta de la aguja en el sitio de inoculación con el bisel hacia arriba

y dando a 30 grados de inclinación respecto de la piel.
4. Introducir la jeringa con un movimiento firme hasta alcanzar la masa muscular
(Figura 7).
6 7

Figuras 6 y 7. Inoculación intramuscular del cuye.
1. Sujetar al cuyo en decúbito ventral.

2. Desinfectar la zona con una torunda con alcohol (Figura 8).
3. Introducir la aguja por debajo de la piel laxa del dorso y depositar el inóculo
(Figura 9).
4. Retirar la aguja y dar un pequeño masaje en la zona.
8 9
Figuras 8 y 9. Inoculación subcutánea del cuyo.

Ratón
1. Sujetar al ratón mediante la técnica de sujeción para inoculaciones y toma de

muestras.
2. Desinfectar con alcohol uno de los miembros posteriores.
3. Colocar la punta en el sitio de inoculación, con el bisel hacia arriba (Figura 10).
4. Introducir la jeringa con un movimiento firme hasta la inserción en la masa
muscular.
Figura 10. Inoculación intramuscular en el ratón.

muestras.
2. Desinfectar la zona con una torunda con alcohol.
3. Introducir la aguja por debajo de la piel del dorso que quedó entre los dedos
del manipulador, y depositar el inóculo (Figura 11).
4. Retirar la aguja y presionar con una torunda el sitio de inoculación.
Figura 11. Inoculación subcutánea del ratón.
Inoculación intraperitoneal


muestras, y posteriormente, se coloca en forma inclinada, con la cabeza hacia
abajo, para que desciendan las vísceras del abdomen por gravedad.
2. Desinfectar la zona abdominal con una torunda con alcohol (Figura 12).
3. Colocar la punta de la aguja con el bisel hacia arriba a 30 grados de inclinación
con respecto a la piel del abdomen.
4. Introducir la punta de la aguja en el abdomen (Figura 13 y14).
5. Depositar el inóculo.
6. Extraer la aguja y presionar con una torunda con alcohol el sitio de inoculación.
12 13
14
Figuras 12, 13 y 14. Inoculación intraperitoneal en el ratón.
Cuadro 1
Principales vías de inoculación de algunos animales de laboratorio
Especie Inoculación
Oftálmica
SC. Pliegue del ala
Ave
IM. Músculos pectorales y de los muslos
IV. Vena radial
SC. Piel laxa del dorso

Conejo IM. Músculos de los miembros posteriores
IV. Vena marginal o central de la oreja
Cuyo IM. Músculos de los miembros posteriores.
IV. Vena femoral, safena y yugular*
IM. Músculos de los miembros posteriores
Ratón
IP. Parte media inferior del abdomen
IV. Vena caudal
*Previa anestesia o sedación.(Benjamín, 1985; NOM).

SC. = subcutáneo, IM. = intramuscular, IP. = intraperitoneal, IV. = intravenoso
Cuadro 2
Calibres recomendados para la inoculación de algunos animales
Animal Vías de inoculación Calibre de la aguja
Intravenosa 27
Subcutánea 27
Ratón
Intramuscular 27
Intraperitoneal 27
Intramuscular 21 – 22
Cuyo
Subcutánea 21 – 22
Animal Vías de inoculación Calibre de la aguja
Intravenosa 27
Conejo Subcutánea 20 – 22
Intramuscular 20 – 22
Intravenosa 22
Gallina Intramuscular 20 – 22
Subcutánea 20 – 22
Vías de sangrado
En la práctica de la inmunología es común la obtención de muestras sanguíneas,
ya sea para obtener plasma, suero o células. En un animal, el volumen total de
sangre corresponde aproximadamente al 10 % de su peso corporal; normalmente
se considera que se puede obtener hasta un 10 % del volumen sanguíneo sin poner
en riesgo su vida.
Obtención de sangre completa. Si se desean obtener eritrocitos o leucoci-

]]
tos, la muestra se toma con anticoagulante para evitar la formación de un coá-
gulo; a una muestra sanguínea tomada con anticoagulante normalmente se les

denomina “sangre completa” y está constituida por los siguientes elementos:
a) Plasma (líquido transparente o amarillento): el plasma está formado en un
90 % de agua y un 10 % de sales, vitaminas, minerales, hormonas, lípidos,
carbohidratos y proteínas, éstas últimas corresponden a fibrinógeno, albú-
mina y α, β y γ globulinas.
b) Elementos figurados: estos son las plaquetas, los glóbulos blancos o leuco-
citos y los glóbulos rojos o eritrocitos.
Si se centrifuga una muestra de sangre completa los elementos que la forman

se separan de la siguiente manera:
plasma
capa leucoplaquetaria (glóbulos blancos y plaquetas)

glóbulos rojos
Las muestras de sangre completa generalmente se usan para la elaboración

de suspensiones de eritrocitos, que se emplean en pruebas como la de fijación del
complemento, la de hemoaglutinación o la de inhibición de la hemoaglutinación.
La sangre completa también se usa para hacer pruebas con cultivos de leucocitos;
estos se emplean en ensayos de activación, proliferación o citotoxicidad —pruebas
empleadas en la evaluación de la respuesta inmune celular—. Los anticoagulantes
más empleados se muestran en el siguiente cuadro:
Cuadro 3
Efectos y proporciones de los anticoagulantes frecuentemente usados en
la toma de muestras
Anticoagulante Efecto Proporción para su uso
Forman sales con el

calcio, además sirve como 1:1
Alsever (citratos) conservador pues contiene (volumen a volumen)
glucosa
EDTA (ácido etilén
Secuestra calcio 1:9
diaminotetracético)
Interfiere en la conversión de
Heparina 1%
protrombina en trombina
Impide la disponibilidad de
Citratos 3.8-4 %
calcio
Los eritrocitos que se emplean en las distintas pruebas de laboratorio deben

de lavarse para eliminar el anticoagulante, los leucocitos y el plasma. El proceso
de lavado de glóbulos rojos se lleva a cabo siguiendo los pasos que a continuación
se describen:
1. La sangre obtenida se mezcla perfectamente y con suavidad con el anticoagu-

lante. Posteriormente se centrifuga a 300 g por diez minutos, o a 1000 g du-
rante cinco minutos. Ver anexo 2.
2. Una vez separada la muestra, se elimina el sobrenadante —el líquido amari-
llento formado por plasma y anticoagulante—. En el fondo del tubo, se en-
contrará el paquete de glóbulos rojos y la capa flogística. En algunas pruebas,
como en la de fijación de complemento, es necesario eliminar la capa flogística
por lo que deberá removerse con ayuda de una jeringa con aguja de punta cha-
ta o una pipeta Pasteur.
3. El paquete de glóbulos rojos se mezcla suavemente con SSF a una proporción
de 1:10 (una parte de soluto o glóbulos rojos, por nueve partes de diluyente o
SSF, y se centrifuga nuevamente a 300 g por diez minutos, o a 1000 g durante
cinco minutos.
4. Este paso se repite al menos dos veces más, hasta que el sobrenadante sea to-
talmente transparente.
Los glóbulos rojos lavados se emplean a diferentes concentraciones. Los cál-

culos para preparar una suspensión de glóbulos rojos se hacen como se mencionó
en la práctica de diluciones:
Para preparar una solución porcentual necesito saber:
1. La concentración a la que se requiere.

2. El volumen que se necesita preparar.
Si deseo preparar 10 mL de una suspensión de glóbulos rojos al 2 %, cada

100 mL de esta suspensión tendrá 2 mL de glóbulos rojos. Si requiero un volumen
de 10 mL, entonces haré una regla de tres:
2 mL de glóbulos rojos son para 100 mL, ¿cuántos mililitros de glóbulos rojos

(X) son para 10 mL?
Mililitros de glóbulos

Glóbulos rojos Mililitros
2 100
X 10
(2)(10) = 20, 20/100 = 0.2 mL o 2/100 = 0.02, (0.02)(10) = 0.2 mL
Necesito 0.2 mL de glóbulos rojos (soluto) y 9.8 mL de solución salina como

diluyente (10 mL - 0.2 mL = 9.8 mL).
]] Obtención de suero. Para obtener el suero del animal, la muestra se toma sin
anticoagulante, el líquido que se desprende después de formado el coágulo se
denomina suero y contiene los mismos elementos que el plasma sin fibrinóge-
no (pues este se activó en la formación del coágulo). Las muestras de suero se
emplean para la titulación de anticuerpos mediante el uso de diversas pruebas
serológicas. Algunos de los aspectos importantes para la obtención de suero
son:
Si la especie lo permite, la muestra se toma preferentemente en tubos sellados

al vacío sin anticoagulante, estos tienen la ventaja de estar esterilizados lo que
se traduce en una menor probabilidad de contaminación de la muestra. En el
laboratorio, porque es más práctico, la muestra suele tomarse con jeringas. Si
la muestra se transporta al laboratorio en jeringas, bolsas de plástico o frascos,
tendrá un alto riesgo de contaminación, lo que interferiría en las pruebas sero-
lógicas. Es importante que al momento de tomar la muestra, la sangre se des-
lice por las paredes del tubo para evitar la hemólisis o ruptura de los glóbulos
rojos. La hemólisis es una condición no adecuada, ya que puede provocar que

las pruebas serológicas den resultados incorrectos.
Después de obtener la muestra, es conveniente inclinar el tubo para que
al formarse el coágulo, se pegue al tapón del tubo, y se desprenda fácilmente
cuando se utilice. Durante el tiempo de coagulación, los tubos que contienen
la sangre, deben mantenerse a temperatura ambiente.
Siempre se deben transportar las muestras al laboratorio dentro de cajas
de unicel a 4-8 °C con refrigerantes o hielo; el unicel es un material que per-
mite mantener la temperatura en el interior de la caja unas seis horas siempre
y cuando la caja esté cerrada y sellada. Las muestras no deben tener contacto
directo con los refrigerantes o el hielo, ya que estos se encuentran a una tem-
peratura cercana a los 0 °C y los glóbulos rojos se lisan o rompen a esta tem-
peratura; para evitarlo, coloque papel periódico o viruta de madera alrededor
de los tubos.
Es conveniente que la muestra llegue lo antes posible al laboratorio des-
pués de que fue tomada; una muestra con el coágulo permanece en condicio-
nes aceptables hasta tres días, posteriormente empezará a hemolizarse. Un

suero normal va de amarillo claro a naranja, dependiendo del grado de hemóli-
sis, cambiará de un rojo translúcido hasta un rojo intenso semejante al del vino
tinto. En el laboratorio, se evalúa el grado de hemólisis, si es alto, la muestra
se rechaza, por lo que es necesario realizar un nuevo muestreo, lo que implica
gasto de tiempo, dinero y esfuerzo.
Si la muestra tardará más de tres días en llegar al laboratorio, es reco-
mendable quitarle el coágulo y dejar que sedimenten los glóbulos rojos que
quedaron en la muestra. Auxíliese de una jeringa con aguja, tome el suero
sin sedimento, páselo a otro tubo lo más limpio posible y colóquele un tapón
(puede ser otro tubo: un Vacutainer). Bajo estas condiciones, el suero puede
congelarse y enviarse al laboratorio. Entre un suero y otro es importante en-
juagar la jeringa y la aguja con agua limpia (hervida de preferencia) para evitar
mezclar los sueros. NOTA. Una muestra de suero con coágulo se hemolizará
si se congela.
Vías de sangrado
Cualquier procedimiento que cause mayor dolor o molestia en los animales, que
la producida por inyección o marcaje en orejas, requerirá el uso de tranquilizantes,
analgésicos o anestésicos. Si es necesario efectuar un procedimiento doloroso sin
el uso de anestesia, analgésicos, o tranquilizantes, porque su uso afectaría los re-
sultados del experimento, debe ser aprobado previamente (NOM). A continuación
se describen las técnicas de toma de muestra sanguínea:
Gallina doméstica
Vena radial:
1. Sujetar a la gallina en decúbito lateral.

2. Extender el ala para localizar los ligamentos de la articulación húmero-radio-ulnar.
3. Desinfectar la zona con una torunda con alcohol (Figura 15).
4. La persona que tome la muestra debe sujetar el ala con una mano y con la otra
introducir lentamente la punta de la aguja con el bisel hacia arriba por debajo
del ligamento de la articulación, dirigiéndola hacia la bifurcación de la vena
radial (Figura 16).
5. Introducir en la vena y sostener tanto al ave como el ala con firmeza ya que esta
vena es muy delgada y si el animal se mueve se produce un gran hematoma
inutilizando esta ala para seguir el proceso de sangrado.
6. Generar vacío en la jeringa lentamente ya que de lo contrario la vena tiende a
colapsarse y las probabilidades de la formación de un hematoma aumentan.

7. Colocando una torunda con alcohol sobre la aguja, sacarla lentamente a
la vez que se presiona el sitio con el dedo pulgar de la mano izquierda del

manipulador.
15
16
Figuras 15 y 16. Toma de muestra sanguínea de la vena radial de la gallina doméstica.

Conejo
Vena central de la oreja:
8. Un ayudante sujeta al conejo en decúbito ventral dejando accesible la oreja

para quien extraerá la muestra.
9. Localizar la vena central o marginal de la oreja, desinfectar la oreja con una
torunda con alcohol, de ser necesario se rasura o se depila la zona (Figura 17).
10. Sostener la oreja con la palma de la mano izquierda y el dedo pulgar.
11. Puncionar la vena directamente con una aguja del número 27 o 22, la aguja
entra casi paralela a la piel con el bisel hacia arriba. Succionar lentamente para
evitar colapsar la vena. Es importante no doblar demasiado la oreja desde su
base, porque se corta la circulación sanguínea (Figura 18).
12. Obtenida la cantidad necesaria de sangre, presionar el sitio de punción con
una torunda de algodón seca para provocar hemostasis por presión.
17
18
Figuras 17 y 18. Toma de muestra sanguínea en el conejo.
Para una punción cardiaca (no se realiza en esta práctica), si se necesita cam-
biar la dirección de la aguja, se sacará y de nuevo se introducirá buscando la di-
rección correcta. NUNCA SE DEBE MOVER LA AGUJA DENTRO DE LA
CAVIDAD TORÁCICA, PUES SE CORRE EL RIESGO DE DESGARRAR EL
TEJIDO CARDIACO Y/O PULMONAR OCASIONANDO LA MUERTE DEL
ANIMAL.
NOTA. Si la muestra tiene anticoagulante, se quita la aguja de la jeringa para

que la sangre se deslice lentamente por las paredes del tubo, así se evita la hemó-
lisis de los glóbulos rojos. Si la muestra no tiene anticoagulante, hay que dejar que
se forme el coágulo en la jeringa, entonces se obtiene el suero quitando el émbolo
y decantándolo en un tubo.
Cuadro 4
Vías de sangrado empleadas en esta práctica
Especie Sangrado
Ave Vena radial

Conejo Vena auricular

]] 1 a 2 conejos

]] 1 a 2 gallinas
]] 1 a 2 cuyos
]] 3 – 5 jeringas de 3 mL
]] 3 – 5 jeringas de 5 mL
]] 3 frascos con anticoagulante (Alsever)
]] 5 tubos de ensayo
]] 3 frascos con torundas en alcohol
]] 4 lancetas y 4 agujas
]] 6 frascos con 5 ml de solución salina fisiológica (SSF)
]] 6 tubos de sangre con anticoagulante (2 tubos por mesa)
]] 6 tubos de sangre sin anticoagulante (2 tubos por mesa)
]] 1 centrífuga
]] 2 pipetas serológicas de 5 mL
]] 1 pinza sin dientes
Material por alumno
]] 1 ratón
]] 1 jeringa de insulina
]] 1 pipeta de transferencia de plástico
]] 1 tubo de ensayo 13 × 100
1. Indicar la forma de medir adecuadamente el volumen con las jeringas de insu-

lina para la inoculación del ratón.
2. Inocular por vía intramuscular, subcutánea e intraperitoneal al ratón; en las
regiones descritas en el Cuadro 1 y siguiendo las indicaciones del asesor.
3. Algunos alumnos harán inoculación intramuscular y subcutánea en el ave, el
conejo y el cuyo en las regiones señaladas en el Cuadro 1.
4. Algunos alumnos sangrarán a la(s) aves por la vena radial utilizando anticoagu-
lante, y a los conejos, por vena central de la oreja sin anticoagulante.
5. Observar la forma en que el asesor centrifuga el tubo que contiene sangre con
anticoagulante para apreciar la separación de los elementos que la forman.
Preguntas
1. Mencione las regiones anatómicas en las que se puede inocular vía intramus-
cular a las especies animales manejadas en la práctica.
2. ¿Con qué finalidad se utiliza anticoagulante al tomar una muestra sanguínea?

3. ¿Qué diferencias hay entre plasma y suero?
4. Delimite anatómicamente la(s) vía(s) de sangrado de cada una de las especies
animales utilizadas durante la práctica.
5. ¿Con qué finalidad se lavan los glóbulos rojos?
6. Calcule para preparar 10 mL de una suspensión de glóbulos rojos al tres por
ciento.
1. Benjamín, M. M. Manual de patología clínica, Limusa, México, pp. 9-20, 1985
2. Kuby, J. Immunology. 4th ed, New York, USA. Freeman and Company, 2000.
3. NOM-062-ZOO-1999. Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y
uso de los animales de laboratorio. DF, México. Segob, 1999.
4. Olguín, F. R. Los animales de laboratorio: importancia, cuidados y manejo.
Material de consulta. DF, México: UNAM, 1982.
5. Guide for the care and use of laboratory animals. United States of America.
Washington DC. National Research Council. National Academy Press. 2009.
5
61
Práctica
Mecanismos moleculares
de inmunidad innata en el suero
Alfredo Castañeda Ramírez
Alejandro Benítez Guzmán
Objetivo general
Evidenciar la actividad microbicida del suero, mediante la incubación de un cultivo
de Salmonella gallinarum con suero inactivado por calor y sin tratar, para comparar
el crecimiento de la bacteria en ambas condiciones y asociarlo con la presencia de

proteínas antimicrobianas termolábiles.

1. Disminuir la concentración del cultivo de salmonela mediante diluciones se-

riadas para obtener colonias aisladas.
2. Incubar el cultivo de salmonela con suero inactivado por calor y sin tratar, para
evidenciar la eficacia de los mecanismos bactericidas que posee el suero.
Introducción
Los mecanismos de defensa que intervienen inicialmente, cuando un agente pa-
tógeno (bacterias, virus, hongos y parásitos) entra en contacto con el hospedador,
son los que pertenecen a la inmunidad innata. Como características principales
de la inmunidad innata se encuentran: el no presentar memoria, el individuo la
posee desde su nacimiento y se considera la primera barrera de defensa contra
agentes extraños al organismo. Los mecanismos innatos se pueden dividir en tres
categorías:
1. Anatomo-fisiológicos. Se refieren a todos aquellos tejidos u órganos que for-

man barreras físicas, o bien que funcionalmente de manera indirecta, impiden
el establecimiento de agentes patógenos; por ejemplo, la piel, las mucosas, las
plumas, las lágrimas, los cornetes, la micción, la descamación, etcétera.
2. Moleculares. Estos mecanismos incluyen una serie de moléculas que actúan

como efectoras en la destrucción de agentes extraños, tal es el caso de enzimas
como la lisozima o las proteínas del suero, que tienen características antimi-
crobianas, como las catelicidinas, las defensinas y las generadas por el com-
plemento. En el Cuadro 1 se muestra una lista más extensa de proteínas con
propiedades antimicrobianas.
El sistema del complemento es un conjunto de más de 30 proteínas plasmáti-

cas que intervienen en procesos de destrucción de microorganismos, aunque tam-
bién se sabe que actúa de manera activa como un punto de comunicación entre
la inmunidad adaptativa y la inflamación. Su activación se puede llevar a cabo por
tres vías: a) clásica, (activada por reacciones antígeno-anticuerpo), b) de las lecti-
nas, (activadas por este grupo de proteínas con capacidad de unirse a polisacáridos
bacterianos) y c) la alterna, (activada por polisacáridos bacterianos y estabilizada
por la proteína properdina). En todos los casos, los componentes del sistema for-
man complejos de ataque de membrana con la capacidad de destruir microorganis-
mos. La primera vía de activación forma parte de la respuesta inmune adaptativa,

mientras que las dos restantes pertenecen a la innata.
3. Celulares. Como su nombre lo indica, se refiere a las células que participan

en las fases del reconocimiento antigénico e inflamación, sin inducir una me-
moria inmunológica y pueden orquestar una respuesta inmune, mediante la
secreción de mediadores químicos. Las células que los componen son neu-
trófilos, dendríticas, macrófagos, eosinófilos, basófilos, células NK y células
cebadas.
Las substancias que ejercen su efecto antimicrobiano son de naturaleza protei-

ca, y dentro de sus características fisicoquímicas se encuentra la termoestabilidad;
la resistencia a la desnaturalización que tiene una proteína al aplicar calor. La des-
naturalización se produce porque el calentamiento genera un cambio en la estruc-
tura conformacional proteica, induciendo la disminución o pérdida de su efecto
biológico. En el caso particular del suero, el científico Jules Bordet descubrió que
al calentarlo a 56 °C durante 30 minutos el poder bactericida del suero disminuia.
Posteriormente se encontró, que algunas de las proteínas del complemento son
termolábiles, es decir que pierden su actividad biológica cuando son sometidas a
temperaturas arriba de los (56 °C/30 min). Esta práctica tiene como finalidad ex-
plorar las características antimicrobianas del suero inactivado por calor y el suero
sin tratamiento.
Práctica 5  Mecanismos moleculares de inmunidad innata en el suero 63
Cuadro 1.
Principales sustancias bactericidas localizadas en fluidos y tejidos del
organismo
Principal origen
Grupo Nombre Acción Cofactor
y/o localización
Gram+,
menos eficaz
Suero y en Gram−.
leucocitos Previene
Enzima Lisozima pH ácido
Secreciones fijación de
(saliva, lágrimas) virus a los
receptores
celulares.
Contra
Beta lisina
Suero Gram+
Defensinas
Neutrófilos y Gram-
Péptidos Protegrinas
Macrófagos Hongos
antimicrobianos Histatinas

Plaquetas Virus (virus
Indolicinas
envueltos)
Bactenecinas
Protozoarios
Gram+

Suero
Proteínas que fijan Transferrina Gram−
Leucocitos
al hierro Lactoferrina Secuestran
y leche
hierro
Macrófagos, Bacterias,
Componentes del hepatocitos, virus, Ca++
Complemento
complemento bazo, riñón y parásitos y y Mg++
suero. hongos.
Espermina Páncreas, riñón Gram+
Aminas básicas
Espermidina y próstata Gram-
Leche
Mecanismos de Lactoperoxidasa Neutrófilos Bacterias,
descomposición Mieloperoxidasa Macrófagos virus
del peróxido Xantinooxidasa Suero, saliva y parásitos
Tiocianato y leche
Todas las células

Virus,
IFN-α excepto los
Interferones bacterias y
IFN-β neutrófilos en
parásitos.
bovinos (*)
Saturados Glándulas Hongos
Ácidos grasos
Insaturados sebáceas Gram+
Material por alumno
]] 1 gradilla
]] 1 vial con un cultivo de Salmonella gallinarum de 18 a 24 horas
]] 3 tubos de ensayo estériles de 12 × 75 con tapón de algodón
]] 3 pipetas serológicas de 1 mL, 1/100, estériles
]] 1 pipeta serológica de 5 o 10 mL, 1/10 estéril
]] 3 cajas de Petri de 60 mm con agar triptosa envasadas estérilmente.
]] 1 frasco con 20 mL de solución salina fisiológica (SSF), estéril
]] 1 frasco con capacidad de 10 mL, vacío y estéril
]] 1 frasco con capacidad de 5 mL, vacío y estéril
]] 1 frasco con suero normal (SN)
]] 1 frasco con suero calentado (a 56 °C/30 min) (SC)
]] 1 tira de cinta adhesiva
1. Calcular una dilución en pasos 1/5000 en 5 mL. Como diluyente se utilizará la

SSF estéril y como soluto un cultivo de Salmonella gallinarum.
Dilución inicial 1/100 en 10 mL

Dilución intermedia 1/50 en 5 mL
2. Rotular los dos frascos estériles y los tubos de ensayo estériles de la siguiente
forma:
Recipientes Rótulo
Frasco con capacidad de 10 mL 1/100

Frasco con capacidad de 55 mL 1/5000
Tres tubos de ensayo estériles SC, SN y control respectivamente
SC, SN y control con el nombre del
Tres cajas de Petri
alumno
*SC: suero calentado, SN: suero normal.
Esta práctica se hace en condiciones de esterilidad, por ello se mantendrá el

mechero prendido y se trabaja en un área de 15 cm de diámetro de distancia del
mechero.
3. Con una pipeta estéril de 5 o 10 mL, añadir 9.9 mL de SSF estéril al frasco
rotulado 1/100, y 4.9 mL al frasco rotulado 1/5000.
4. Con una pipeta de 1 mL estéril, añadir 0.25 mL de SSF estéril al tubo de en-
sayo rotulado como control.
5. Con la misma pipeta añadir 0.1 mL de cultivo de S. gallinarum (cultivo de
18 horas), previamente homogeneizado, al frasco de 10 mL. Homogeneizar
perfectamente y transferir 0.1 mL de esta dilución (1/100) al frasco de 5 mL,
rotulado 1/5000. (Figura 1).

Figura 1. Proceso para la obtención de la dilución de trabajo de S. gallinarum.
6. Homogeneizar perfectamente con la pipeta y transferir 0.25 mL de esta dilu-

ción a cada uno de los tubos de ensayo estériles previamente rotulados: SN,
SC y control.
7. Con una segunda pipeta estéril añadir 0.25 mL de suero normal al tubo de
ensayo rotulado SN y con una tercera pipeta estéril añadir 0.25 mL de suero
calentado al tubo rotulado SC.
8. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
9. Vaciar todo el contenido de los tubos rotulados SN, SC y control en las respec-
tivas cajas de Petri previamente rotuladas.
10. Incubar a 37 °C durante 24 horas y hacer la lectura.
Resultados
Los resultados esperados para cada caja de Petri son:
Control: crecimiento bacteriano abundante.

Suero normal: ausencia de crecimiento o disminución considerable del suero.
Suero calentado: crecimiento bacteriano semejante al obtenido en el control
sin suero.
Si los resultados obtenidos no concuerdan con los esperados explique las po-
sibles causas.
Preguntas
1. Esquematizar los resultados obtenidos en las mezclas S. gallinarum + SSF, S.

gallinarum + SN y S. gallinarum + SC, y discutir si lo observado en cada caso
corresponde a lo esperado.
2. Explique por qué es menos eficaz la lisozima en bacterias Gram negativas.

3. Explique por qué cuando el suero se calienta a 56 °C por 30 min, pierde su
efecto contra S. gallinarum.
1. Bach, J. F. Inmunología, Limusa, D.F México, p. 371-373, 1985.
2. Cooper, N. R. El sistema del complemento. En: Stites, D. P., Stobo, J. D.,
Fudenberg, H. H. y Wells, J. V. Inmunología Básica y Clínica. Manual Moderno,
D.F, México, 5a. edición, p. 119, 1985.
3. Herbert, W. J. Inmunología Veterinaria. Acribia, Zaragoza, España Capítulo 3,
1972.
4. Werb, Z. and Goldstein, I. M. Células fagocíticas: Funciones quimiotácticas y
efectoras de los macrófagos y los granulocitos. En: Stites, D. P., Stobo, J. D.,
Fudenberg, H. H. y Wel15, J. V. Inmunología Básica y Clínica. Manual Moderno,
D.F, México, 5a.edición p.103, 1985.
5. Wood, W. B. and Davis, B. D. Host-Parasite relations in bacterial infections. In:
Davis, B. D., Dulbecco, R., Eisen, H. N. and Ginsberg, H. S. Microbiology. Harper
and Row Publishers, U.S.A., 3th. edition, chapter 24. 1980.
6. Hancock, R. E. W. and Diamond, Gill. The role of cationic antimicrobial peptides
in innate host defenses. Canada, Trends Microbiol 8(9): 402-410, 2000.
7. Tizard, I. Inmunología Veterinaria. 6ª ed, Texas, USA, Interamericana, 2001.
8. Ricklin, D. Hajishengallis, G. Kun, Yangi, K. Lambris, J. D. Complement: a key
system for immune surveillance and homeostasis. Philadelphia, USA, Nature im-
munology 11(9) 2010
9. Namekar, M. Kumar, M. O’connell, M. and Nerurkar, V. R. (2012). Effect of

serum heat-inactivation and dilution on detection of anti-WNV antibodies in mice
by West Nile virus E-protein microsphere immunoassay.
10. Callewaert, L. Aertsen, A. Deckers, D. Vanoirbeek, K. G. Vanderkelen, L. Van
Herreweghe, J. M. and Michiels, C. W. (2008). A new family of lysozyme inhibitors
contributing to lysozyme tolerance in gram-negative bacteria. PLoS Pathog, 4(3).

12
69
Práctica
Prueba de la tuberculina
Alfredo Castañeda Ramírez
Alejandro Benítez Guzmán
Objetivo general
Realizar la prueba cervical doble comparativa mediante la inoculación intradérmi-
ca de derivado proteico purificado (PPD)* en vacas y analizar casos hipotéticos,
para conocer el procedimiento y la interpretación oficial empleados en el diagnós-

tico de tuberculosis bovina.

1. Aplicar PPD en la tabla del cuello de un bovino mediante la inoculación intra-

dérmica del antígeno, de acuerdo con los lineamientos descritos en la Norma
Oficial Mexicana NOM-031-ZOO-1995 para el diagnóstico de la tuberculosis
bovina.
2. Analizar los posibles resultados de la prueba de tuberculina con el uso de
la gráfica oficial para establecer la toma de decisiones dependiendo del esta-
do sanitario de los bovinos positivos, negativos y sospechosos a la prueba de
intradermorreacción.
Introducción
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica causada por bacterias ácido
(alcohol resistentes del género Mycobacterium. Mycobacterium bovis es la causa
principal de la tuberculosis en el ganado bovino, sin embargo, el humano, las cabras
y los cerdos también son susceptibles a esta especie. La principal vía de transmi-
sión entre animales es la aerógena, aunque la infección al hombre se da principal-
mente por vía oral, a través de la leche, así como cualquier producto lácteo crudo
o mal pasteurizado. Esta enfermedad, ocasiona grandes pérdidas económicas en la
industria pecuaria, ya que la capacidad productiva de los animales disminuye en
un 10 a 25%.El descubrimiento por Koch de la reacción de la tuberculina en 1890

aportó un instrumento útil para el diagnóstico y control epidemiológico de esta en-
fermedad. Posteriormente se pudo demostrar que esta enfermedad es una expre-
sión de la inmunidad mediada por células que desempeña el principal mecanismo
de defensa contra muchos de los microorganismos intracelulares facultativos como
lo es el Mycobacterium.
La prueba de tuberculina o de intradermorreacción (IDR) es una respuesta in-
mune mediada por células que se clasifica como hipersensibilidad tipo iv. Después
de la reacción antígeno-linfocito sensibilizado, este último produce factores bio-
lógicamente activos llamados citocinas, que inducen cambios funcionales en los
linfocitos T y en los macrófagos —células que intervienen en la respuesta celular
de tipo tuberculina—. La reacción a la tuberculina alcanza su mayor intensidad
a las 72 horas postinoculación, es cuando se observa una inflamación a nivel ma-
croscópico caracterizada por eritema y engrosamiento de la piel debido a la vasodi-
latación y al aumento en la permeabilidad vascular, pero, sobre todo, a una intensa
migración celular. Microscópicamente la población celular que infiltra el tejido
corresponde principalmente a células mononucleares (macrófagos y linfocitos).

Al antígeno que se utiliza para esta prueba, se le conoce con el nombre de tu-
berculina (de ahí su nombre). Antiguamente se utilizaron la tuberculina vieja de

Koch (TV u OT, por sus siglas en inglés Old Tuberculin) y una tuberculina con-
centrada por calor (HCSM, Heat Concentrated Synthetic Medium Tuberculin). La
primera se prepara cultivando el Mycobacterium en un medio de cultivo al que se
le añade carne. Después de que haya crecido la bacteria, el cultivo con o sin ellas,
se concentra aproximadamente 10 veces en un baño de vapor, así se eliminan los
residuos por filtración y se le añade glicerol como estabilizador. La segunda es
similar a la OT, pero el germen se cultiva en un medio sintético, así se evitan los
tejidos animales en el medio de cultivo. Para su preparación, solo se necesitan los
productos metabólicos del Mycobacterium cultivado.
Se usa el Derivado Protéico Puro (PPD, por sus siglas en inglés Purified Protein
Derivative), una tuberculina similar a la HCSM, pero con mayor grado de purifica-
ción. El PPD se prepara principalmente a partir de los productos de secreción del
Mycobacterium crecido en un medio sintético simple. Estos son precipitados varias
veces con sulfato de amonio saturado al 50 % o con ácido tricloroacético. El PPD es
el antígeno oficial de la Campaña Nacional contra la Tuberculosis Bovina (CNCTB)
y tiene las siguientes características de acuerdo con la NOM-031-ZOO-1995:
a. PPD bovino: es elaborado con Mycobacterium bovis cepa AN5, para la prueba
caudal, cervical comparativa y cervical simple.
b. PPD aviar: es elaborado con Mycobacterium avium cepa D4, para la prueba
cervical comparativa. La tuberculina de PPD aviar contiene como colorante el
rojo de Ponceau, para distinguirla de la de PPD bovino que no lleva colorante.
Práctica 12  Prueba de la tuberculina 71
c. Las tuberculinas se transportan y conservan en frío a una temperatura de 4 a

8 °C, además se les protege de la luz solar directa durante el trabajo de cam-
po, se verifica el lote y la fecha de caducidad del producto. Una vez utilizado
el antígeno, se desecha el resto del contenido del envase si no se va a utilizar
el mismo día.
Puesto que, la base del esquema de erradicación de tuberculosis de la CNCTB

es la prueba de la tuberculina, es necesario un conocimiento exacto de las venta-
jas y desventajas de esta prueba de diagnóstico, así como todas sus variantes. Las
pruebas de intradermorreacción o de la tuberculina aceptadas por la CNCTB y
descritas en la NOM-031-ZOO-1995 son:
Prueba en el pliegue caudal o intradérmica única (IDU). Se aplica 0.1 mL de

PPD bovino en el pliegue anocaudal, previamente desinfectado y examinado para
detectar cualquier anormalidad que pudiera confundir la prueba. La lectura se
realiza a las 72 horas (± 6 horas) después de la inoculación y la reacción se con-

siderará positiva cuando sea visible y/o palpable cualquier engrosamiento, rubor,
calor, dolor o necrosis en el sitio de aplicación. Será negativa cuando no se observe

ni se palpe algún cambio en la piel del sitio de aplicación. En Latinoamérica, ésta
es la prueba más utilizada, en Estados Unidos, además de inocular en el pliegue
anocaudal, se aplica al mismo tiempo en el labio de la vulva, en la unión mucocu-
tánea, mientras que, en Inglaterra, se aplica en la piel del cuello.
De acuerdo con la NOM-031-ZOO-1995 “es la prueba básica operativa de
rutina, cuando se desconoce la situación zoosanitaria del hato en materia de tuber-
culosis; en estos casos, deberá ser aplicada por un médico veterinario certificado o,
cuando la Sagarpa lo determine, será realizada por un médico veterinario oficial”.
Prueba cervical comparativa. En esta prueba se utilizan los dos tipos de tuber-
culina, el PPD bovino y el PPD aviar. El PPD aviar se utiliza para diferenciar la
reacción por una infección con M. bovis e infecciones por M. avium, M. paratuber-
culosis (incluyendo vacunación), Nocardia farcinicus (muermo bovino), así como
por micobacterias atípicas (fotocromógenas, ectocromógenas, no cromógenas y de
crecimiento rápido) que llegan a ser habitantes habituales del suelo y que, por su
parentesco, llegan a producir reacciones inespecíficas. En la prueba doble compa-
rativa, se inyectan simultáneamente las tuberculinas aviar y bovina en dos lugares
del mismo lado del cuello, y se realiza la lectura 72 horas (± 6 horas) después. Se
inocula comúnmente en la tabla del cuello, porque se ha observado que, en esta
parte, la piel es más sensible que la del pliegue ano-caudal.
De acuerdo con la NOM-031-ZOO-1995

Esta es la única prueba autorizada para confirmar o descartar animales
reactores a la prueba de pliegue caudal. Se podrá efectuar por única vez
dentro de los 10 días naturales siguientes a la lectura de la prueba caudal; o

bien, después de transcurridos 60 días naturales, debiéndose aplicar por un
médico veterinario oficial o aprobado, se aplica en hatos o regiones con pre-
sencia de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y/o Mycobacterium
avium subsp. Avium.
Prueba cervical simple. En esta prueba, la inoculación también es intradérmica

en la tabla del cuello, en la región media a 10 cm de la cresta, de 0.1 mL de PPD
bovino y, mediante observación y palpación del sitio en donde se inyectó, el médico
veterinario que la aplicó, la lee a las 72 ± 6 horas después de su inoculación. Las
reacciones que se observan son:
Negativa: cuando no se observe ni se palpe ningún cambio en la piel del sitio
de aplicación.
Reactor: cuando sea visible o palpable cualquier engrosamiento, rubor, calor,
dolor o necrosis en el sitio de aplicación.
Esta prueba se emplea para inspeccionar hatos en los que se conoce la exis-
tencia de M.bovis; o bien para examinar ganado que estuvo expuesto directa o in-
directamente con hatos infectados con M. bovis. Las reacciones a las pruebas de
la tuberculina intradérmicas o no, pueden producir reacciones falsas positivas y

falsas negativas.
Las reacciones falsas negativas se observan comúnmente en:
1. Estados avanzados de la enfermedad.

2. Animales en los últimos estadios de gestación o recién paridos.
3. Animales tratados con corticoesteroides.
4. Animales que se han tuberculinizado recientemente.
5. Animales muy viejos (anergia).
Se observan reacciones falsas positivas:
1. Por el contacto de los animales con bacterias relacionadas con M. bovis como
M. avium, M. paratuberculosis, bacterias del género Nocardia, así como otras
micobacterias atípicas.
2. En animales recientemente tuberculinizados.
3. Animales que hayan adquirido inmunidad natural activa contra la tuberculosis.
Para el diagnóstico de tuberculosis, otras de las pruebas para determinar la in-

munidad celular que pueden ser utilizadas son:
a. La prueba de MIF, que es un ensayo in vitro con el que se determina la pro-

ducción o no del factor inhibidor de la migración de los macrófagos (MIF).
El MIF es una linfocina liberada por los linfocitos sensibilizados al entrar en

contacto con antígenos del Mycobacterium.
b. La prueba de interferón gama, desarrollada por Wood en 1990. También es
una prueba in vitro y tiene la ventaja de poderse realizar sin necesidad de es-
perar intervalos de 45 a 60 días entre una prueba y otra. Para la prueba, se
obtiene una muestra de sangre periférica con anticoagulante, y se cultiva en
tres formas: con PPD aviar, PPD bovino y sin PPD; de 16 a 24 horas de in-
cubación, se obtiene el sobrenadante y se determina por la técnica de ELISA
sándwich, la cantidad de interferón gama producida en cada caso. Cuando
las células cultivadas con PPD bovino producen una mayor cantidad de IFN
γ que las cultivadas con PPD aviar y el control negativo, se considera que la
prueba es positiva.
Aunque para el diagnóstico de la tuberculosis podemos utilizar estas y otras

pruebas, para dar un resultado definitivo se requiere del aislamiento del agente
etiológico, que es la prueba inequívoca de la causa de la enfermedad.

Material por animal a probar

]] 2 jeringas de 1 mL con aguja del No. 24 al 26, y de 0.5 a 1 cm de largo
]] 1 jabón
]] 1 recipiente para agua
]] 1 navaja de rasurar
]] 5 toallas de papel
]] 1 Vernier o cutímetro
]] 1 frasco con torundas de alcohol
Material por grupo
]] 4 frascos con 10 mL cada uno de PPD aviar

]] 4 frascos con 10 mL cada uno de PPD bovino
]] Toallas de papel
]] 1 Vernier grande
La prueba se realiza en el tercio medio de la tabla del cuello, a diez centímetros
por debajo de la cruz, se rasura en dos áreas, cada una de ocho centímetros de diá-
metro, aproximadamente, y trece centímetros hacia la porción ventral (Figura 1).
Figura 1. Sitios de inoculación de PPD aviar y bovino en la prueba doble comparativa.

Posteriormente, se mide el grosor de la piel de cada una de las zonas rasuradas

con un cutímetro o Vernier. A continuación, se desinfecta e inocula 0.1mL de PPD
aviar en la primer área depilada y 0.1mL de PPD bovino en la segunda, ambas por
vía intradérmica; la aguja se inserta paralelamente a la piel (la formación de una
pápula en el sitio de inoculación indica que la inyección se puso correctamente).
A las 72 horas después de la inoculación, la misma persona que hizo la lectura an-
tes de aplicar la tuberculina, medirá de nuevo el grosor de la piel en cada sitio de
inoculación.
Interpretación
Una vez obtenidas las mediciones del grosor de la piel en la lectura inicial, y a las
72 horas postinoculación, se hará lo siguiente:
1. Lectura PPD aviar: restar a la lectura postinoculación, la lectura inicial.

2. Lectura PPD bovina: restar a la lectura postinoculación, la lectura inicial.
3. Una vez obtenidas estas diferencias, comparar con la gráfica de interpretación
según sea el caso.
Por ejemplo, las siguientes son lecturas de un bovino perteneciente a un hato

afectado por tuberculosis (interpretación severa).
PPD aviar PPD bovino
Lectura inicial 4 mm 4 mm
Lectura postinoculación (72 horas) 10 mm 7 mm
Diferencia 6 mm 3 mm
Con estos dos resultados, interpretar la gráfica. Si el resultado es sospechoso,

la prueba se repetirá 60 días después.
Resultados
Con las lecturas realizadas durante la práctica, interprete la prueba y explique cuál
es el procedimiento a seguir con ese animal en caso de que perteneciera a un hato
afectado por tuberculosis.

Preguntas
1. ¿Cuáles son las pruebas in vivo e in vitro que se pueden llevar a cabo para el
diagnóstico de tuberculosis?
2. ¿Cuántos tipos de tuberculina se conocen?
3. Explique las ventajas que tiene llevar a cabo la prueba de tuberculina doble
comparativa con respecto a las demás pruebas.
4. ¿Cuál es la vía de inoculación utilizada en la prueba doble comparativa?
5. ¿Cuánto tiempo se necesita esperar después de inocular para observar una re-
acción positiva a la tuberculina?
6. De cada una de las reacciones falsas positivas y falsas negativas listadas en la
práctica, explique los mecanismos por los que se presentan.
1. Acha, P. N. and Szifres, E. Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes a

hombre y a los animales. Organización Mundial de la Salud (OMS), Publicación
Científica. No.354, 1977.

2. Wood, P. R. and Corner, L. A. P. Plackett.1990. Development of a simple, rapid in
vitro cellular assay for bovine tuberculosis based on the production of γ interferon.
Res. Vet. Sci. 49: 46-49.
3. Hagan, W. A. and Bruner, D. W. Infectious diseases of domestic animals, 7th ed.
Cornell Universitv Press, Ithaca, USA, 1981.
4. Kay, B. M. M. Envejecimiento y declinación de la respuesta inmunitaria. En:
Fudenberg, H. H., Stites, D. P., Cadwell, J. L. y Wells, J. V. Inmunología Clínica,
3a ed. El. Manual Moderno. México 1982.
5. Lesslie, I. W. and Hebert, C. N. Comparison of the specificity of human and
bovine tuberculin PPD for testing cattle. Vet Rec 96: 338-341, 1975.
6. Roswurm, J. D. Kantor, I. N. Marchevsky, N. Spinelli, R. and Spath, E. Sensibilidad
de las pruebas tuberculínicas en ganado bovino con Mvcobacterium bovis en
Argentina. Bol Of Sanit Pan 86(5): 420-431, 1979.
7. 7. Tizard, I. Inmunología veterinaria. 6a ed. Interamericana. McGraw Hill.
México. 2001.
8. Lee, E. and Holzman, R. S. Evolution and current use of the tuberculin test. Clin
Infect Dis. 34(3) :365-370, 2002.
9. http://www.michigan.gov/emergingdiseases/0,1607,7-186-25804_25810-74334--,00.html
10. http://www.ucd.ie/vetmed/html/research/summary/interferon.htm
11. Slovis, B. S. The case against anergy testing as a routine adjunct to tuberculin skin
testing. JAMA, 283:2003-7, 2000.
12. Norma Oficial Mexicana NOM-031-ZOO-1995, Campaña nacional contra la

tuberculosis bovina (Mycobacterium bovis). Publicada en el Diario Oficial de la
Federación el 8 de marzo de 1996. Modificación 27 de agosto de 1998.
13. Castañeda-Ramírez, A. Heterogeneidad del derivado proteico purificado (DPP)
utilizado en la prueba de tuberculina que se emplea en la república mexicana.
Tesis de Licenciatura. UNAM, 1987.

Anexo I. Residuos peligrosos

biológico-infecciosos (rpbi’s)
De acuerdo con la NOM 087 de la Semarnat.
Sangre
La sangre y sus componentes sólo en su forma líquida, así como los derivados no
comerciales, incluyendo las células progenitoras, hematopoyéticas y las fracciones
celulares o acelulares de la sangre resultante (hemoderivados).
Cultivos y cepas de agentes biológico-infecciosos

Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación, así
como los generados en la producción y control de agentes biológico-infecciosos.
Los utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cul-
tivos de agentes biológico-infecciosos.

Patológicos
Los tejidos, órganos o partes que se extirpan o remueven durante las necropsias,
la cirugía o algún otro tipo de intervención quirúrgica, que no se encuentren en
formol. Así como, las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico,
citológico e histológico, y los cadáveres y partes de animales que fueron inoculados
con agentes enteropatógenos en centros de investigación y bioterios.
No anatómicos
Los recipientes desechables que contengan sangre líquida. Los materiales de cu-
ración, empapados, saturados, que gotean sangre o cualquiera de los siguientes
fluidos corporales: líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido pleural, líquido ce-
falorraquídeo o líquido peritoneal; los materiales absorbentes utilizados en las jau-
las de animales que hayan sido expuestos a agentes enteropatógenos.
Punzocortantes
Los utensilios que han estado en contacto con humanos o animales, o sus mues-
tras biológicas durante el diagnóstico y tratamiento, únicamente: tubos capilares,
navajas, lancetas, agujas de jeringas desechables, agujas hipodérmicas, de sutura,
de acupuntura y para tatuaje, bisturís y estiletes de catéter, excepto todo material
de vidrio roto utilizado en el laboratorio, el cual deberá desinfectarse o esterilizarse
antes de ser dispuesto como residuo municipal.
Anexo I  Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI’S) 79
Los generadores deben cumplir con las siguientes fases de manejo: identifi-
cación, envasado, almacenamiento, recolección y transporte interno, tratamiento y
disposición final, según sea el caso.
Identificación y envasado
En las áreas de generación, (laboratorios de docencia o investigación), se deberán
separar y envasar todos los RPBI, de acuerdo con sus características físicas y bio-
lógicas infecciosas, conforme al Cuadro 2 que se presenta a continuación. Los re-
siduos peligrosos biológico-infecciosos no deberán mezclarse con ningún otro tipo
de residuos municipales o peligrosos.
Las bolsas se llenarán al 80 % de su capacidad y se cerrarán antes de ser
transportadas al sitio de almacenamiento temporal: no podrán ser abiertas o vacia-
das. Los recipientes para los residuos peligrosos punzocortantes se llenarán hasta
el 80 % de su capacidad y se asegurarán los dispositivos de cierre: no se deberán
abrir o vaciar.

Identificación y envasado de los residuos peligrosos biológico-infecciosos

Tipo de Estado
Envasado Características
residuo físico
Cultivos y cepas
Polietileno traslúcido, calibre
de agentes Sólidos
300 mm, contenido de metales
infecciosos
Bolsa roja pesados de no más de una parte
por millón (ppm) y libres de cloro,
Residuos no
Sólidos marcadas con el símbolo universal de
anatómicos
riesgo biológico y la leyenda Residuos
Peligrosos Biológico-Infecciosos.
Deberán cumplir los valores mínimos
Bolsa de los parámetros indicados en la
Patológicos Sólidos
amarilla Tabla 3 de la NOM-087.
Rígidos, de polipropileno color rojo,

contenido de metales pesados de no
más de una parte por millón (ppm)
y libres de cloro, destructibles por
métodos físicos. Deberán tener
Objetos Recipiente
Sólidos separador de agujas y abertura para
punzocortantes rojo
depósito con tapa de ensamble seguro
y cierre permanente, marcados con el
símbolo universal de riesgo biológico
y la leyenda Residuos Peligrosos
Biológico-Infecciosos
Almacenamiento
Los residuos peligrosos biológico-infecciosos envasados deberán almacenarse en
contenedores metálicos o de plástico con tapa y se rotulan con el símbolo univer-
sal de riesgo biológico, con la leyenda “Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos”.
Estos contenedores deben desinfectarse y lavarse después de cada ciclo de reco-
lección. En el caso de residuos patológicos, deberán almacenarse a 4 °C.
Recolección y transporte externo

Los residuos deben cumplir con el envasado, etiquetado o rotulado como se men-
cionó anteriormente, para poder ser recolectados. Estos residuos no deben ser
compactados durante la recolección y transporte. Si se cuenta con vehículos re-
colectores deben ser de caja cerrada y hermética, contar con sistemas de capta-
ción de escurrimientos, y operar con sistemas de enfriamiento a 4 °C. Durante su
transporte, los residuos peligrosos biológico-infecciosos sin tratamiento no debe-
rán mezclarse con ningún otro tipo de residuo municipal o de origen industrial.
Tratamiento
Los residuos peligrosos biológico-infecciosos deben ser tratados por métodos físi-
cos o químicos que garanticen la eliminación de microorganismos patógenos. La

sangre y los líquidos contaminados se tratan con una solución de cloro (0.4 a 0.7 %
de concentración final) y se mantienen así durante una hora antes de desecharlos.
Disposición final
Los residuos peligrosos biológico-infecciosos tratados e irreconocibles se dis-
pondrán como residuos no peligrosos en sitios autorizados por las autoridades
competentes.
a. Residuos peligrosos radiactivos: de acuerdo con la NOM 004 NUCL de
la Secretaría de Energía, se definen como cualquier material que contenga o
esté contaminado con radionúclidos a concentraciones a las señaladas en esta
normatividad y para el cual no se prevé uso alguno. Se clasifican en nivel bajo,
medio y alto. Las fases de manejo incluyen el envasado, transporte, almacena-
miento temporal y disposición final.
b. Manejo de sustancias químicas: en los laboratorios microbiológicos, también
se manejan sustancias químicas que son potencialmente peligrosas, que consti-
tuyan un riesgo si no son identificadas y manejadas correctamente. Las NOM’s
018 y 114 de la STPS establecen los requisitos mínimos para la identificación
y comunicación de peligros y riesgos por sustancias químicas peligrosas con
respecto a sus características físicas, químicas, de toxicidad, concentración y
tiempo de exposición, que afecten la salud del personal que las maneja o que
dañe los centros de trabajo. Se debe contar con la hoja de seguridad de cada
Anexo I  Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI’S) 81
una de ellas y tenerla disponible para todos los trabajadores involucrados en

su manejo. La información estará en español y contendrá por lo menos los si-
guientes elementos: datos de la sustancia química peligrosa (nombre químico,
sinonimias, nombre comercial), identificación de los grados de riesgo (salud,
inflamabilidad, reactividad, especial), propiedades físicas y químicas, riesgos
de fuego y explosión, datos de reactividad, riesgos para la salud y primeros au-
xilios, indicaciones en caso de fuga o derrame, protección específica especial
en casos de emergencia, entre otros. Es fundamental disponer de un adecuado
almacenamiento de las sustancias químicas peligrosas de acuerdo con su grado
de compatibilidad, para proteger la salud del personal del laboratorio o centro
de trabajo donde se utilicen estos reactivos.
c. Desinfección y esterilización: para la bioseguridad en el laboratorio, la des-

infección de instrumentos y superficies del mobiliario de trabajo constituye la
forma más adecuada de evitar el posible contagio. En el manejo de los desinfec-
tantes, es muy importante conocer su espectro de actividad, los riesgos ligados
con su uso y las recomendaciones del fabricante. La limpieza previa es funda-

mental para conseguir una correcta desinfección o esterilización. Dentro de los
principales grupos de desinfectantes se encuentran los siguientes: alcoholes
(etanol al 70 %), compuestos fenólicos (triclosán y cloroxilenol), cuaternarios de

amonio (cloruro de benzalconio 0.4-1.6 %), aldehídos (formaldehído 5 %, gluta-
raldehído 2 %), cloro (hipoclorito de sodio 1 g/L), yodóforos (povidona-yodada),
oxidantes (peróxido de hidrógeno al 3 %, ácido peracético al 0.01-0.02 %).
El medio más eficaz y fiable de esterilizar material del laboratorio es la apli-

cación de vapor de agua a presión (autoclave) con un ciclo de 15 minutos a
121 °C. Estas condiciones verían dependiendo del material a esterilizar.

Manual Tercera Edición-Primera Parte - 220914 - 092305

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El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología

de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018)

diagnóstico, servicios hospitalarios (medicina humana y veterinaria), in-

1. Los niveles de bioseguridad

8. Desinfección y planes de contingencia

Todo lo anterior con el objetivo de proteger al personal y al medio ambiente, cuidar

1. Contención primaria: es la protección del personal y del medio ambiente

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2. Contención secundaria: se refiere a la protección del medio ambiente ex-

Señalización y código de colores

Manejo de residuos peligrosos

nejar de acuerdo con los procedimientos establecidos en la legislación ambiental

ductivos que no se reutilizan; se encuentran en cualquier estado físico que, por

1. Residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI’s). De acuerdo con

2. Residuos peligrosos químicos. La NOM-052 de la Semarnat, los define

El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología

normas de seguridad (prácticas microbiológicas estándar). Algunas de estas nor-

I. Actividades y desarrollo de la práctica

Práctica Equipo de protección personal

Vías de inoculación y sangrado de animales

2. Mediante una dinámica de grupo, discutir la aplicación de las medidas de

Elementos Consultorio médico Explotación pecuaria

Equipo de protección personal

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1. Utilizar la perilla de seguridad y hacer ejercicios prácticos.

6. Santos, E. Cruz-Gavilán, I. Manual de procedimientos de bioseguridad en los

7. Natalia, M. Cediel, B.I. Luis, C. Villamil, J. II. Riesgo biológico ocupacional en

El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología

1 Corresponde a las partes de soluto

4 Corresponde a las partes totales

Saber la dilución y el volumen requeridos

Para preparar una dilución ¼ en dos mililitros, sabemos que se requiere

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Por ejemplo, para cuantificar los anticuerpos de un suero contra H. somnus, se

A continuación se muestra un esquema de cómo se realiza la dilución seriada

SOLUTO Vol. de Vol. de Vol. de Vol. de

0.5mL Vol. de recepción

0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL

Dilución inical X 1/2 X 1/2 X 1/2

Dilución inicial (tubo 1):

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Dilución final obtenida en cada tubo:

Los datos obtenidos se pueden resumir en el siguiente cuadro:

Dilución obtenida 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128

Diluciones décuples seriadas

1. La dilución inicial (que no necesariamente es 1/10, puede ser cualquier otra)

3. El número de tubos de ensayo requerido para las diluciones

A continuación se muestra un esquema de cómo se realiza la dilución seriada

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3.6mL 3.6mL 3.6mL 3.6mL 3.6mL

Dilución inical X 1/10 X 1/10 X 1/10 X 1/10

Dilución inicial (tubo1):

Dilución seriada (tubos 2 a 4):

Dilución final en cada tubo:

Los datos obtenidos se pueden resumir en el siguiente cuadro:

Dilución obtenida ½ 1/20 1/200 1/2000

Vol. de soluto 2.5 mL