Aplicaciones Biotecnológicas en Acuicultura

Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
TEMA 1: TRANSFERENCIA DE GENES
INTERES DE LOS ANIMALES

MODIFICADO GENÉTICAMENTE
Hay muchas cosas que no se pueden hacer

en humanos por lo que se investigan en
animales (= investigación básica) +
Biomedicina.
Xenotransplantes: Se usan cerdos para el

trasplante de órganos en humanos.
Específicamente en peces: puedo modificar

genes para conseguir peces que crecen más y
obtengan un mayor peso corporal. También
se pueden modificar características para que
sean resistentes a enfermedades. Se pueden
mejores desde el punto de vista
nutricional, se pueden usar los peces
como biorreactores. Se pueden realizar
modificaciones que hagan que los peces
asimilen mejor otros nutrientes para no
usar por ejemplo las harinas de pescado
(peces carnívoros) para minimizar el
impacto ambiental.
TECNOLOGÍA TRANSGÉNICA
Tecnología transgénica: Es lo primero que se aplicó desde el punto de vista clásico.

Objetivos principales de las tecnologías transgénicas:
Crecimiento
 Hormona del crecimiento
 Follistaina: otro tipo de gen que hace que los
individuos sean más grandes
Resistencia a enfermedades
 Cecropina
 Lactoferrina
 Lysozima-C3
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Tolerancia al frio: Ahora vuelve a estar de moda. Para poder incrementar los sitios donde se puede cultivar los peces más
cerca de los peces incorporando genes para proteínas anticongelantes así que aguanten temperaturas más bajas.
 Proteína anticongelante
Composición corporal
 B actina desaturasa
 Gen fat: hace que los individuos sean más gordos
Sabor
 DNA de camarones
Todas estas tecnologías transgénicas tienen muchos problemas en cuanto al tema de la comercialización porque no están
permitidas en todos los países.
HORMONA DEL CRECIMIENTO
Se introducen una H del crecimiento, incluso del mismo pez, para aumentar su crecimiento. Se consigue un incremento
del tamaño corporal.
Se ha trabajado sobre todo con:
 Trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss)
 Goldfish (Carassius auratus)
 Carpa (Cyprinus carpio)
 Tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus)
 Pez medaka (Oryzias latipes)
 Lucio (Exos lucius)
Salmón: se manipuló genéticamente para obtener un
crecimiento rápido introduciendo el gen de la
hormona de crecimiento bajo el control del
promotor del gen de proteína anticongelante del
abadejo y la región 3 'no traducida. Se necesita un
promotor muy fuerte que permite mucha expresión de la H del crecimiento.
Se consigue que los peces sean más grandes, PERO también más feos por lo que la comercialización es peor. En muchos
países los peces se venden ya fileteados por lo que este problema se evita un poco, pero en ES o IT están enteros.
OTROS GENES DE CRECIMIENTO

Introducción del gen de la follistatina de la carpa herbívora en la dorada
(Megalobrama amblycephala).
Se mete en la dorada en este caso y se obtiene un incremento en el tamaño,

aunque no son incrementos espectaculares.
RESISTENCIA A ENFERMEDADES
Truchas arcoiris transgénicas que expresan el transgén de la cecropina P1 o un

análogo sintético de la cecropina B, el CF-17 presentaban características de
resistencia a los patógenos bacterianos de los peces, Pseudomonas fluorescens y
Vibrio anguillarum. Transferencia de genes de péptidos antibacterianos.
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RESISTENCIA AL FRIO
Salmón atlántico y Goldfish
Proteína anticongelante de la platija: Se introduce la proteína anticongelante de

la platija como promotor para que el pez sea resistente a los cambios de Tº
COMPOSICIÓN CORPORAL
Mejorar la composición corporal y el contenido de nutrientes y producir

sustancias bioactivas en los peces.
Tecnología transgénica para generar peces ricos en LC-PUFAs n-3 (Omega-3 long-chain
polyunsaturated fatty acid) utilizando el pez cebra como modelo animal.
Peces cebras. El corrión es transparente por lo que se ve super bien y se puede trabajar con
ellos muy bien.
SABOR
Microinyeción de ADN total extraído de camarones chinos (Fenneropenaeus

chinensis) al cigoto de la carpa común con el objetivo de mejorar el sabor: Se inyecta
ADN de camarones para mejorar el sabor.
Otras posibilidades es usar los peces como:
BIORREACTORES
Los peces una vez que se consiguen como tienen muchos descendentes permiten
producir en gran cantidad por ejemplo proteínas.
Se modifican las células para por ejemplo producir insulina, se produce en gran
cantidad, se extrae la proteína y se purifica.
Desarrollo de un sistema de biorreactor para suministrar y

acumular proteínas foráneas en los huevos utilizando el pez
medaka Oryzias latipes con la ayuda de una secuencia parcial
de vitelogenina (Vtg)
BIOSENSORES
El pez Medaka se manipuló genéticamente para utilizarse

como biosensor capaz de detectar contaminantes ambientales
(por ejemplo, estrógenos o metales). Se utilizó un promotor
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inducible por estrógenos (el promotor de la vitelogenina) para controlar la expresión del gen GFP (= biofluorescente y por
ello lo detecto).
Se manipulan los peces para que puedan detectar determinados contaminantes. En presencia del contaminantes se
expresa el gen biofluorescente y así se puede detectar.
PLEIOTROPÍA
Los salmones genéticamente modificados son pleiotrópicos. Efecto

pleiotrópico = indeseado como anomalías en el crecimiento,
esterilidad, etc.
Para algunas cosas se manipulan los peces pero en otros casos no.
PROBLEMAS PECES MODIFICADOS GENÉTICAMENTE
La acuicultura se expande rápidamente
El riesgo de los peces GM está asociado a su introducción en la naturaleza y su competencia con las especies salvajes. Los
riesgos de la acuicultura actual son extrapolables al cultivo de peces transgénicos.
 ESCAPES DE PECES: escape y aparezcan en el medio natural como especie invasoras, por ejemplo
 HIBRIDACIÓN CON OTRAS ESPECIES: casi todos los peces tienen fecundación externa por lo que puede que
haya cruce con otras especies lo cual puede ser un peligro para las especies libres
Esquema de un pez modificado genéticamente (rojo) que se mezcla con

los normales (azules):
 Puede que no pase nada

 Puede que se mezcle con la población dando lugar a híbridos
que van desplazando a la población natural
 Puede que cause el fin de la población
PECES ESTÉRILES
Se intenta que sean estériles así que si hay escapes no haya problemas.
Los triploides en general suelen ser estériles. Si tengo peces infértiles, significa que
SIEMPRE necesito un suministro: al final los beneficio que puede que los estériles
aporten implican también desventajas.
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Para que sean estériles lo que se hace, por ejemplo, es impedir el desarrollo de la línea germinal metiéndolos en un
compuesto esterilizante: me da individuos normales pero infértiles.
CONTROL DE ESPECIES INVASORAS
Otra forma para evitar problemas de escapes y riesgos para la población naturla es:
Cromosoma y troyano + daughterless carp
Cromosoma Y troyano: se va seleccionando para eliminar el cromosoma X: se consiguen

peces con un transgén aromatasa por lo que las hembras no se desarrollan.
Pez que contiene una inserción transgénica del gen de la aromatasa en múltiples sitios del
autosoma. No hay hembras en la descendencia.
ESPECIES COMERCIALES
Las regulaciones EU son muy estrictas PERO la opinión del público es muy importante.
Salmón: Es el primer organismo genéticamente modificado que se puede comercializar.
Se vende en Canadá y USA. Esto es la tecnología transgénica de los años 90' = con la H
de crecimiento. Muchos problemas de donde se cultivan estos salmones: Canadá y estados
unidos.
REGULACIÓN
Es aplicable para todos los OGM. Debe ser organismos seguros:
 No tóxicos
 No alergénicos
 Con nuevas características nutricionales
 La composición debe ser adecuada
 Las características de los procesos deben ser adecuadas
PROTOCOLO DE BIOSEGURIDAD DE CARTAGENA
Protocolo de Cartagena: Están sujetos prácticamente todos los países. Va

cambiando todos los años.
El Protocolo de Cartagena sobre Bioseguridad es un instrumento internacional que regula los organismos vivos
modificados, OVMs, producto de la biotecnología moderna. Este acuerdo promueve la seguridad de la biotecnología,
estableciendo normas y procedimientos que permitan la transferencia segura, manipulación y uso de OVMs, enfocado
específicamente al movimiento transfronterizo.
Su nombre completo es Protocolo de Cartagena sobre Seguridad de la Biotecnología del Convenio de Diversidad
Biológica. Cartagena es el nombre de una ciudad colombiana en donde en febrero de 1999 el Protocolo de Bioseguridad
fue originariamente programado para ser concluido y adoptado.
Sin embargo, debido a ciertos asuntos por resolver, el Protocolo fue finalizado y adoptado un año después, el 29 de enero
del 2000 en Montreal, Canadá.
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En EU son muy estrictos frente a los OGM. Lo que hay en ES es básicamente lo mismo que dice EU porque seguimos las
mismas leyes.
EDICIÓN GENÉTICA
Desde el punto de vista regulatorio la edición genética es complicada
CONCEPTOS BÁSICOS:
1. Como cortar y pegar fragmentos de ADN

2. ¿Qué es en promotor?
3. ¿Qué es un vector de clonación?
4. ¿Qué es una construcción?
5. ¿Qué es un gen de selección?
6. ¿Qué es un gen reporter?
7. ¿Qué es transfectar células?
8. ¿Cómo se integra el DNA en el genoma?
9. ¿Cómo se inserta un gen en un genoma?
10. ¿Cómo se comprueba el éxito del experimento?
ENZIMAS ÚTILES PARA MANIPULAR ÁCIDOS NUCLEICOS
Necesitamos extraer el ADN y para manipularlo necesitamos enzimas
Nucleasas: digieren el ADN. Pueden ser exo o endo-nucleasas según si eliminan nucleótidos en el extremo 3’ o 5’
 Exonucleasas ADN
 Endonucleasas ADN
o Enzimas de restricción
 Ribonucleasas: nucleasas para ARN
Enzimas:
 Ligasas: unen extremos de ADN

 Fosfatasas: eliminan fragmentos de fosfato
 Quinasas: añaden fosfato
Polimerasas: pegan fragmentos
 Polimerasas de ADN
 Polimerasas de ARN
COMO CORTAR Y PEGAR FRAGMENTOS DE ADN
 Enzimas de restricción
 Ligasas
 Fosfatasas
¿QUÉ ES UN PROMOTOR?
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 Promotor: secuencia, situada corriente arriba de la codificadora, que interactúa con la polimerasa de ARN.
Asegura que la transcripción comience siempre en el mismo sitio. El promotor está en la parte 5’.
 Secuencia codificadora: secuencia de ADN que será transcrita a ARN por la polimerasa de ARN. No siempre
está.
 Terminador: secuencia situada corriente abajo de la codificadora de ARN que especifica dónde termina la
transcripción.
En eucariota hay muchos tipos de promotores mientras que en

procariotas son muy sencillos. Dependiendo de lo que se vaya a usar, a
veces se necesitan promotores más o menos fuertes.
PROMOTORES DE EUCARIOTAS: Los promotores son necesarios

para que la RNA polimerasa se una al DNA. Las bases en el promotor se
numeran con el signo negativo (-). Contienen secuencias cortas que son
críticas para el reconocimiento. Estas secuencias son similares entre
diferentes especies. La secuencia consenso es la más frecuente.
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a. Promotor básico
b. Promotor más sofisticado. Puede hacer que incremente la expresión de los genes o lo silencie.
Elementos funcionales en al expresión.
¿Qué tipos de promotores hay?
Los genes con expresión basal tienen promotores muy simples, pero luego hay otros genes que son más específicos.
 Específicos de tejido/ no específicos (generalistas): según el tipo de tejido necesito un promotor más o menos
básico
 Constitutivos/inducibles
 Fuertes/débiles: cuando son constitutivos suelen ser débiles porque, aunque la expresión sea constante de normal
no necesita que se exprese mucho.
 Amplio rango de especificidad/ estrecho: algunos activan más tipos de genes diferentes, mientras que otros
promotores, los estrechos, solo activan genes específicos
En manipulación se suelen querer

promotores fuertes, que den mucha
expresión y que se pueden usar para
muchos tejidos. Esto lo suele cumplir los
promotores de virus por eso son muy
comunes.
Virus de mamíferos y aves: Son promotores

fueres constitutivos y válidos para todos los tejidos
 RSV (virus del sarcoma deRous)

 TK (thimidina kinasa)
 SV40 (virus simio)
 CMV (citomegalovirus)
Respuesta a elementos: Son promotores que se inducen si hay hidrocarburos, metales, etc. y activan el gen de
fluorescencia, por ejemplo. Son ejemplos de los centinelas, por ejemplo.
 Hidrocarburos
 Metal (Hg, Cu, Ni, Cd, Zn)
 Estrógenos
¿QUÉ ES UN VECTOR DE CLONACIÓN?
Ejemplo de vector de procariota.
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Tiene siempre un origen de clonación, un gen de resistencia y el sitio de clonación donde se inserta el ADN.
¿QUÉ ES UN VECTOR DE EXPRESIÓN?
En el vector de expresión ya debemos tener promotores.
Muchos vectores de expresión son mixtos: que pueden crecer en bacterias y luego ya pasan a células animales.
Vector de 3423 bp: es pequeño. Según el tamaño de lo que tenga que clonar el vector serán más o menos grandes
Virus como vectores: Se suele usar una mezcla entre un plásmido y un

virus.
Los virus tienen los extremos para dar recombinación por eso se usan.
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Lentivirus se usan mucho para fragmentos muy grandes.
QUÉ ES UNA CONSTRUCCIÓN?
Voy a necesitar:
 La secuencia codificante del gen que quiero expresar

 Promotor
 Terminador (o no)
QUÉ ES UN GEN DE SELECCIÓN?
Para ver si el experimento va bien es muy útil usar genes de

selección. Son genes que convierten a las células resistencias por ejemplo a un ABs: al final del experimento veo si hay o
no resistencia, si el experimento ha ido bien si serán resistentes.
En célula de eucariota se usa la blasticida y el Gen418 y son genes de resistencia a ABs.
Son genes que confieren una nueva función a la célula y le permiten vivir en presencia de un agente selectivo, que suele
ser un antibiótico. Dicho agente, añadido al medio de cultivo, mata células no transformadas. Un buen agente de selección
es aquel que puede usarse en una dosis lo suficientemente alta como para impedir la viabilidad de las células no
transformadas y lo suficientemente baja como para no dañar las células transgénicas.
 Blasticidina
o Inhibe la síntesis de ADN en células de mamífero
o El vector contiene el gen de resistencia
 G418 (Geneticina)
o Bloquea la traducción
o La resistencia es la neomicina fosfotransferasa (NeoR)
o El vector contiene el gen de la neomicina fosfotransferasa
Selección por interferencia con el metabolito de

purina y pirimidina.
Gen TK es el gen que da el herpesvirus

simple. Es un gen que mata a las células:
Fosforila un producto que se llama
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ganciclovir. Las células con el gen TK fosforila el ganciclovir y hace que se interrumpa la síntesis de ADN por lo que la
célula acaba muriendo.
Las células que tienen éxito viven si le añado ganciclovir.
QUÉ ES UN GEN REPORTER?
Son los que sintetizan algo que me permiten identificar fácilmente lo que tengo modificado.
Los genes reportes se usan para saber si tengo un promotor y que está co-regulando.
Son secuencias de ácidos nucleicos que

codifican proteínas fáciles de analizar, Se
utilizan para análisis de la expresión
génica, por ejemplo, identificar regiones
de unión a factores de trascripción,
determinar eficacia de los promotores.
Ejemplo de genes repórter:
GAL (b-galactosidasa): Hydroliza X-gal

dando como resultado un compuesto
coloreado. Se detecta por el cambio/
producción de color. Este es el de las
bacterias.
 SEAP (secreted human placental alcaline phosphatase): Fosfatasa alcalina bioluminiscente, es muy sensible.
Puede dar bioluminiscencia.
 LUC (luciferasa): Oxidiza la luciferina y emite fotones. Se contabilizan fotones con un luminómetro o con una
cámara para contar fotones. Hay diferentes tipos de luciferasa
 GFP (green fluorescent protein): Emite fluorescenciaverde cuando se irradia con luz ultravileta.Procede de la
medusa Aequoera victoria. Es el que más se usa: se ve perfectamente con los rayos UV.
 mCherry: Miembro de la familia mFruits de proteínas fluorescentes rojas monoméricas (mRFP). Como RFP,
mCherry se deriva de DsRed del nidario. Discosoma
QUÉ ES TRANSFECTAR CÉLULAS?
Tienes que alterar las bacterias para que introducir un material exógeno. Tengo un plásmido
donde introduzco mi ADN por una reacción de ligación y se da una recombinación. Este plásmido lo
tengo que introducir en una bacteria: obtengo colonias de bacteria y tengo que ver cuáles son las
transformadas y cuales no.
Es alterar genéticamente una bacteria como resultado de la absorción directa, incorporación y/o
expresión del material genético exógeno (ADN exógeno).
La transfección consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas

mediante plásmidos, vectores víricos u otras herramientas.
Como puedo hacer que el ADN entre en la cél: muchas opciones

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 Puedo hacer micro-inyecciones en el huevo fecundado
 Infecciones con retrovirus durante las primeras etapas del desarrollo
Tengo células madre y una vez que tengo integrado el ADN ya sea por transfección o infección con virus, lo que hago es
transferirlas a un blastocisto crear una quimera e ir a buscar los individuos en los que haya funcionado y esté el gen que
quiera.
Electroporación: es lo más usado: hago un choque eléctrico para insertar el ADN. Es muy masivo por lo que viene bien
en grandes números y es más sencilla.
Electroporación: rompe la membrana = hay una elevada mortalidad cel. Con los virus se pierden menos cél. (más
exitosa).
¿QUÉ TIPOS DE TRANSFECCIONES HAY?
Transitorias: los circulitos son los fragmentos que introducimos. Puede

que la expresión de los genes sea transitoria y luego la célula se
encarga de destruir este ADN extraño.
 Corto plazo
 No requieren selección
 Porcentaje de éxito pequeño
Estables: El ADN se incorpora dentro del genoma.
 Permanentes - generan una nueva línea

celular
 Requieren selección
 Todas las células tienen DNA transfectado
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COMO SE INTEGRA EL DNA EN EL GENOMA?
Al azar: Expresión variable
 Inactivación por metilación del DNA

 Ausencia de intensificadores
 Integración en heterocromatina
= se introduce al azar: puede pasar que: que no se exprese, que haya modificaciones epigenéticas y que el ADN se
inactive o que el promotor no sea lo suficientemente fuerte y que luego no se exprese.
Lugares determinados gene targeting (Recombinación homóloga): complicado = introducir el gen en un sitio
determinado
 Remplazar un gen funcional por otro no funcional (‘knock-out’): el knock-out se ha ido sustituyendo en muchos
casos por la edición génica
 Inserción de un gen nuevo (‘knock-in’)
 Reparación de una mutación dentro de un gen (terapia génica): esto de normal funciona cuando afecta a una
parte del genoma
 Remplazar un gen por otro (mismo promotor/intensificador diferente gen)
RECOMBINACIÓN
Todos estos sucesos tienen

tener lugar por recombinación
= es un suceso muy improbable
porque tengo que sustituir un
gen por otro.
Homóloga: Debe tener lugar un

evento de recombinación que
haga que mi fragmento vaya
exactamente donde quiero =
complicado
INTEGRACIÓN AL AZAR
El gen APT (aminoglycoside phosphotransferase)

confiere resistencia a G418
Tk es marcador se selección negativo: El ganciclovir

es un análogo de un nucleóxido. En presencia de
ganciclovir las células con el gen TK se van a morir.
Las células TK+ fosforilan el ganciclovir dando como resultado un producto tóxico.
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Obtengo células resistenes al ABs PERO que en
presencia de ganciclovir se mueren porque tienen el
gen TK.
Integración por recombinación homóloga
Si la inserto por recombinación homóloga: quiero

remplazar el gen por el transgén.
Si consigo esta incorporación por la recombinación

homóloga el gen TK me queda fuera mientras que el
gen de resistencia queda dentro: serán células
resistentes al ABs y no sensibles al ganciclovir.
COMO SE INSERTAUN GEN EN UN GENOMA?
Cultivo celular de células totipotenciales >

por electroporación, por ejemplo,
introducimos el vector dentro de las células
por recombinación = obtengo células
resistentes al ABs en principio.
Hago una selección para las células con el

ganciclovir de manera que distingo las que
insertaron al azar de las que tuvieron
recombinación homóloga.
Inyecto las totipotenciales por

recombinación homóloga en el blastocito >
se introduce en una madre de alquiler > se
producen una descendencia de ratones
quimeras > se cruzan con ratones normales
(diferencian por color) > genero individuos
puros por el gen que he introducido con el
vector.
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EJERCICIO 1: DISRUPCIÓN DE GENES
La inactivación específica de genes es una técnica que permite analizar la función biológica de un gen.
En este experimento una parte del gen denominado X (= el objetivo es eliminar el gen y ver que pasa para saber cómo
funciona ese gen) se inserta en un vector knock out (figura 1). Este vector es un plásmido que no contiene un origen de
replicación de mamíferos (= para que NO se replique en el plásmido) y que lleva dos marcadores de selección. Uno de
estos marcadores es el gen neoR (que hace que las células sean resistentes a geneticina (tóxico para la síntesis de
proteínas) regulado por promotor de mamíferos y que se inserta en uno de los exones del gen.
1) ¿Cuáles pueden ser las consecuencias de insertar el gen neoR en un exón del gen X?
Que las células que tengan involucrado el gen neoR si se le añade geneticina al medio SI sean capaces de
sintetizar proteínas porque serán resistentes a tal producto y a la vez, al intentar el gen neoR se interrumpe el gen
X que ya NO será funcional y de esta manera podemos ver el efecto de su NO expresión y estudiarlo.
2) ¿Cuál es el significado de unir un promotor de mamíferos al gen neoR?

Regular la expresión del gen neoR. El promotor no tiene por qué ser de mamífero, puede ser de virus. Lo
importante es que se replique en el mamífero (podría ser un virus).
El segundo marcador de selección del vector es tkHSV el gen de la timidita kinasa del virus del herpes simplex que
cuando se expresa en células de mamífero tratadas con el antiviral ganciclovir las conduce a la muerte (= si no meto
ganciclovir no pasa nada a las células).
En el experimento se trató un cultivo de células de ratón con el vector indicado en su forma lineal en condiciones que
favorezcan la transformación. La mayoría de las células no son capaces de incorporar el DNA. En algunas ocasiones lo
hacen pero los ácidos nucleicos se degradan. Otras veces las células si son capaces de de captar el vector y pueden hacerlo
de dos formas. EL vector se integra al azar en el ADN de la célula (suceso más frecuente) o se integra por recombinación
homóloga (suceso infrecuente) en este caso el gen Neo remplaza al gen X en la célula y en el vector ocurre lo contrario, el
gen neo es remplazado por el gen X ( Ver figura 2)
3) ¿Qué células (A y B de la figura 2) replican el gen neoR durante la fase S del ciclo celular?
Las dos porque si está integrado, al replicar el genoma se replica todo, el gen neoR también.
4) ¿Qué células (A y B de la figura 2) expresan el gen neoR?

En principio las dos porque tienen un promotor de células eucariotas específico para el gen neoR.
5) ¿Qué células (A y B de la figura 2) degradan y pierden el gen tkHSV rápidamente?

B, porque el gen TK se queda fuera de los brazos de recombinación.
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6) ¿Qué células (A y B de la figura 2) expresan el gen tkHSV solamente de forma transitoria?

B, porque mientras las inserto hay un momento de 24 horas en el el gen TK se queda en la célula, pero a no estar
integrado en el genoma se irá degradando (tarda unas horas en degradarse tras no ser integrado) mientras que
las A sí que es integrado de forma permanente.
7) ¿En qué células (A y B de la figura 2) la función del gen X es inhibida?

B, porque pasa al vector (= se remplaza) mientras que el neoR se inserta en la célula.
8) ¿Qué mata a las células que no captan el DNA foráneo durante la transfección? ¿La geneticina o el ganciclovir?
Geneticina, porque al no integrar el gen neoR no van a ser resistentes a la genaticina que es un tóxico para la
síntesis de proteínas.
9) ¿Qué mata a las células en las que el DNA foráneo es degradado en el citoplasma? ¿La geneticina o el
ganciclovir?
Geneticina, porque es lo mismo: si no se integra en gen neoR y no hay expresión no son resistentes.
10) ¿Qué mata a las células en las que el vector se integra al azar en el DNA? ¿La geneticina o el ganciclovir?
Ganciclovir, porque las células son resistentes a la geneticina pero llevan el gen TK por lo que si añadimos
ganciclovir morirán ya que se bloquea la síntesis de las proteínas.
11) ¿Qué mata a las células en las que el vector se integra por recombinación homóloga? ¿La geneticina o el
ganciclovir?
Las homólogas son las resistentes y en principio no se mueren ya que tienen el gen neoR que las hace resistentes
a la geneticina y no presentan el gen TK que las hace sensibles al ganciclovir.
COMO SE COMPRUEBA EL ÉXITO DEL EXPERIMENTO?
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Técnica básica
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Tema 2: Conceptos avanzados Aplicaciones biotecnológicas en
Acuicultura
TEMA 2: CONCEPTOS AVANZADOS
Transposón Tol 2
En peces no hay células madres multipotenciales por lo que

debemos encontrar otras técnicas para insertar fragmentos
de ADN en el genoma.
Hay diferentes tipos de transposones: de ADN con

intermedio de ARN que se insertan en el ARN o transposones
de ARN.
Los transposones son muy frecuentes en el genoma, pero no suelen ser funcionales. Dentro del transposón hay:
 Extremos de reconocimiento
 Transposasa, es la enzima que le permite “moverse”
Lo que se hace es modificar el transposón eliminando la transposasa y entre los dos elementos de reconocimiento es
donde se puede insertar el trozo de ADN que quiero insertar en el genoma.
El elemento Tol2 de medaka es un transposón autónomo que codifica una transposasa funcional. La proteína transposasa
puede catalizar la transposición de una construcción que contenga 200 y 150 pares de bases de ADN de la secuencia de
Tol2 en los extremos izquierdo y derecho, respectivamente. Estas secuencias contienen repeticiones invertidas terminales
esenciales. Entre estas secuencias, se pueden clonar Insertos de ADN de tamaños bastante grandes (hasta 11 kilobases) sin
reducir la actividad de la transposición.
EXPRESIÓN TRANSITORIA & INTEGRACIÓN EN LÍNEA GERMINAL
Tengo transposón dentro de un

plásmido y este se inyecta dentro
del huevo fertilizado junto con el
RNAm de la transposasa. Si se
expresa esta reconoce los extremos
del transposón. Si se integra en el
genoma se consigue una expresión
permanente.
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Acuicultura
Sistema cre-lox
Permite expresar genes en momentos determinados
 Cre es una recombinasa (= lo mismo que la transposasa) de 38 kDa producto del gen cre del bacteriófago P1: cre
reconoce una secuencia y la elimina. Reconoce secuencias LoxP de 34 bp.
 Cre reconoce una secuencia de 34 bp del genoma del bacteriófago llamado LoxP, cataliza la recombinación
recíproca y conservativa entre dos sitios LoxP
 LoxP consiste en dos secuencias repetidas invertidas de 13 bp separadas por una región asimétrica de 8 bp
Tengo una secuencia de genes flanqueada por

dos sitios LoxP. Cre reconoce LoxP y elimina
uno de los dos.
Este sistema es muy útil para activar genes en

momentos determinados.
Utilización del sistema CRE/loxP
Ratón transgénico 1: tiene un promotor específico

de tejido (verde) y la recombinasa Cre.
Ratón transgénico 2: tiene el gen X que quiero

eliminar con alrededor las secuencias LoxP.
Cruzo estos individuos y obtendo un doble-

transgénico: se expresa Cre que elimina las
secuencias LoxP y en algunos tejidos (aquellos
específicos para el promotor) el gen X se expresa.
Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce

diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish
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Acuicultura
EJERCICIO 3: SISTEMA DE RECOMBINACIÓN CRE / LOXP
En este experimento se crearon dos grupos de ratones transgénicos. En uno de ellos (designado hCMV-cre) la región
codificante del gen cre está unida al promotor fuerte del citomegalovirus humano y al extremo distal de cre hay un
elemento de poliadenilación (= se asume como señal de terminación), (Fig. 1A.).
1) ¿Por qué es necesario añadir el promotor del virus del gen cre?
Si tengo un gen y quiero expresarlo necesito un promotor y al ser mamíferos necesito un promotor de mamífero
en este caso usa el promotor del citomegalovirus humano ().
2) ¿Cuál es la consecuencia de la inclusión del elemento de poliadenilación?

La poliadenilación se añade para que tenga un ARN mensajero mucho más estable lo cual significa que la
probabilidad que se traduzca sea mayor.
Figura 1. Estructura de las construcciones de ADN

utilizadas para generar ratones transgénicos (mirar
apuntes diapositivas).
(A): hCMV-cre. (B): mαA-espaciador-T (las flechas

verticales señalas los sitios de restricción de BamH1; las
flechas horizontales corresponden a los cebadores
utilizados en las reacciones de PCR de las Figuras 3 y 4,
las puntas de flechas apuntan a los extremos 3 'de los
cebadores).
El otro ratón transgénico (mαA-espaciador-T) consiste en el promotor de un gen murino αA-cristalina (mαA, activo en
las células del cristalino de los ojos = puede estar en todas las células, pero se expresa solo en las células del cristalino),
el gen de del virus SV40 que codifica para el antígeno T grande (la expresión de la gran proteína T transforma en malignas
las células de mamíferos), y un fragmento espaciador insertado entre el promotor y el gen T grande (Fig. 1B). El
espaciador, además de otras secuencias, contiene un elemento de poliadenilación (= induce la traducción de ADN) y está
flanqueado por dos sitios loxP (= se elimina si hay Cre).
3) ¿Qué ocurriría si esta construcción se introduce en una célula del cristalino de mamífero?
No pasa nada. La construcción se puede o no integrar, PERO el problema es que la transcripción se da desde el
promotor hasta la señal de terminación (que se encuentra dentro el promotor) y en este caso el gen del virus está
más allá de la seña de terminación.
4) ¿Es cierto que la transfección de células murinas del cristalino con el transgén mαA-espaciador-T conduciría a su
transformación maligna debido a que el antígeno T grande se expresaría activamente?
No porque no hay expresión (es la misma pregunta que antes).
5) ¿Cuál será, aproximadamente, el tamaño de transcrito producido a partir de esta construcción en células del
cristalino?
< 1300 bp más o menos, a ojo serán 700 pb (= desde mαA hasta el elemento de poliadenilación).
20
Acuicultura
Los ratones transgénicos hCMV-cre se cruzaron con los ratones transgénicos mαA-
espaciador-T y se analizaron los descendientes de la presencia de los dos transgenes
(Figs. 2 y 3). Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar
Cre y el gen grande T (= 269 bp y 195 bp) (Fig. 2A) y para estudiar la región LoxP
(= 220 bp) (Fig. 2B) en tres crías de una camada. (En las condiciones de PCR
utilizadas las regiones de más grandes de 500 pb no se amplificaron = para que no
amplifique más de 500 pb debo reducir el tiempo de extensión de la PCR). El tamaño
de los productos de la PCR se determinó por electroforesis en geles de agarosa (Figs.
2A y 2B). La región mαA-espaciador-T se analizaron por Southern-blot (Fig. 2C).
Figura 2. Genotipos de tres crías resultantes de cruce de ratones mαA-espaciador-T

y ratones hCMV-cre. (A): análisis mediante PCR de muestras de ADN extraído de la
cola de tres las crías utilizando los cebadores CRE (véase la Fig. 1A.) y los cebadores
específicos T grande (véase la Fig. 1B.), (B): análisis de PCR de muestras de ADN de
la cola utilizando el par de cebadores que amplifican el fragmento espaciador (véase
la Fig. 1B), (C): análisis de transferencia de Southern de muestras de ADN de la cola
digerido con BamHI utilizando el fragmento de mαAespaciador- T (véase la Fig. 1B.)
como una sonda (pb, pares de bases)
6) ¿Qué crías tienen el gen cre?

Todos porque todos tienen el fragmento de 269 bp.
En la 1 y en la 3. En la 2 no hay el gen transgénico no sabemos si se expresa o no. Si se expresa Cre no se
elimina del todo el fragmento, sino que se queda un lox.
7) ¿En qué crías se expresará el gen cre?

Cre se expresa y lo que hace en el doble transgénico es reconoce el sitio de unión en LoxP y eliminarlos = me
queda un gen específicos T grande con el promotor específico para el cristalino: como este gen tiene un promotor
específico de tejido está en todos los tejidos, pero se expresa solo en cristalino. Esto es lo que pasa en 1 y 3
porque tienen Cre y el gen grande T.
En el caso de la muestra 2 solo presenta Cre pero al no ser un doble transgénico y no tiene el gen grande T.
8) ¿En qué crías se expresará la proteína T en las células del cristalino?

En principio en la 1 (= en todas las células se eliminación LoxP y el elemento de poliadenilación) y algunas de
las 3. En la muestra 3 no en todas las células del cristalino no en todas tenemos dobles transgénicos: ha habido
inserciones múltiples en el genoma por lo que en algunas células Cre supo eliminar el fragmento LoxP y en otras
no.
9) ¿En qué crías se expresará la proteína T en las células de fibroblastos?

En las células del fibroblasto NO se expresa porque tengo un promotor específico del cristalino (m-alfa-A). El
gen de la proteína T está en las células del fibroblasto de 1 y 3 porque estos presenten el gen, PERO se expresa
solo en las células del cristalino porque el promotor es específico para este tejido (= promotor de un gen murino
αA-cristalina).
10) ¿El genoma de qué crías contiene un único sitio loxP?

La 1 solo tiene un sitio LoxP y en la 3 algunas tienen un solo sitio LoxP y otras tienen dos.
21
Acuicultura
11) ¿El genoma de qué crías contiene múltiples copias de la construcción mαA-espaciador-T?
La muestra 3 porque vemos que las bandas son más gordas.
12) ¿Qué ratones son de doble transgénico (mαA-spacer-T/hCMV-cre)?

Los dobles transgénicos son el 1 y el 3.
Utilizando PCR, se determinaron los genotipos de un gran número de ratones; los resultados se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1. Líneas de
ratones transgénicos y la aparición de tumores en el cristalino.
Por último, se analizó la región LoxP de cola y tejido ocular muestras de

dos ratones transgénicos usando el par de cebadores se muestra en la
figura. 1B. Los resultados de este análisis de PCR se muestran en la
figura. 3.
Figura 3. Análisis PCR de las regiones LoxP en los ratones transgénicos
Las siguientes afirmaciones ¿son verdaderas o falsas?
13) El promotor de hCMV está activo sólo en las células del

cristalino
Falso porque está activo en todas las células.
14) El promotor de hCMV está activo sólo en los fibroblastos.

Falso porque está activo en todas las células.
15) La proteína T se expresa en los fibroblastos de ratones transgénicos mαA-espaciador-T

Falso porque se expresa solo en las células del cristalino.
16) La proteína T se expresa en las células del cristalino de ratones transgénicos mαA-espaciador-T.
Falso porque solo se expresa en los dobles transgénicos.
17) La deleción de la región espaciadora dirigida por la recombinasa Cre se logró en todos los ratones de doble
transgénico de la Tabla 1.
Si, en los 15 doble transgénicos.
22
Acuicultura
microARN (miARN)
Bloquean la traducción o la transcripción, pero más normalmente la

traducción. Se trabaja mucho con los microARN porque muchas veces los
organismos tienen microARN de defensa por lo que el gen que me interesa
al final no llega a expresarse.
El microARN se inserta en un vector específico para bloquear

determinadas señales.
ARN pequeños de entre 19-30 nucleótidos de largo que actúan como guías
de complejos de ribonucleoproteínas para dirigir la degradación de ARN
codificantes para proteínas o mensajeros (ARNm), la inhibición de la
traducción, la formación de la heterocromatina y la regulación
transcripcional. Los microRNAs regulan genes vinculados a procesos tales
como desarrollo, diferenciación celular, apoptosis, señales de transducción,
organogénesis y proliferación celular, entre otros.
 “Dicer” corta un horquilla de 70-130 nt en fragmentos de 14-19 nt

(miARN).
 Los miARN se emparejan con regiones 3’ no traducidas de ARNm
maduros, bloqueando la traducción.
 Los miARN se pueden unir al ADN modificando la cromatina: metilación del ADN dirigida por ARN (RdDM) de
la citosina.
Experimentos con miRNA
23
Acuicultura
EJERCICIO 2: REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DEL GEN FOS MEDIANTE MICRO-ARN
El proto-oncogen fos codifica para un componente del factor de transcripción AP1, que es importante en la expresión de
genes y en la proliferación celular. La desregulación de la función de AP1 puede llevar a la transformación maligna de las
células.
El experimento tiene como objetivo estudiar el papel del micro ARN 7b (miR-7b) en la regulación de la expresión del gen
fos. La secuencia de miR-7b es parcialmente complementaria a la región 3´no traducida del mRNA del gen fos. El
fragmento de ADN que codifica para miR-7b fue clonado en un vector de expresión (= si se uniera al gen Fos inhibe la
traducción). También se clonó otro micro-RNA no relacionado con el gen fos. Los plásmidos recombinantes designados
si-miR-7b (muestras 3 y 4 en la figura 1) y si-miR-neg (muestras 5 y 6 en la figura 1) se transfectaron en fibroblastos de
ratón. Como control se utilizaron células no transfectadas (muestras 1 y 2 en la figura 1). Una parte de los cultivos,
muestras 2, 4 y 6, se trató con ester de forbol (fobol acetato miristato PMA) y la otra parte no se trató (muestras 1, 3 y 5).
El ester de forbol es un análogo del diacilglicerol que es capaz de estimular la proteinkinasa C = produce un incremento
de la actividad celular)
Dos horas después del tratamiento con PMA se preparó un extracto de proteínas de cada uno de los cultivos y se realizó
un Western blot utilizando anticuerpos anti-Fos y anti-Actina. (Ver figura 1 A).
En otra réplica de los cultivos, una hora después del tratamiento con PMA se extrajo el RNA y se realizó un Northern blot
utilizando como sonda el cDNA del gen fos. (Ver figura 1 B).
1) ¿Para qué se realiza el Western blot?

Para detectar las proteínas con un Ac en este caso se detectan el fos y la actina con un anti-fos y una anti-actina.
Siempre se necesita un control de proteínas y el control de proteínas suele ser la actina porque se expresa
siempre (= es constitutivo).
2) ¿Para qué se realiza el Northern blot?

Se usa para medir ARN y como control se usa los ribosomales 28S y 18S que son los más abundantes (el control
se usa para ver si hay algo que afecte a la transcripción).
3) Si se bloquea la ORF del mRNA ¿se inhibe la síntesis de la proteína Fos?

En principio si: si bloque el miR se inhibe la síntesis
4) ¿Los esteres de forbol, estimulan la traducción del fos mRNA?

No, lo que estimulan es la transcripción = estimula la producción de ARNm.
5) ¿Tiene el miR-7b un efecto inhibitorio general de la transcripción en fibroblastos?

NO, tiene sobre la traducción = lo que hace es unirse al ARNm y así no se puede traducir
6) La expresión de un RNA exógeno ¿tiene un efecto general inhibitorio de la transcripción en fibroblastos?

RNA exógeno es los que van a expresar el miR control = muestra 5 y 6. Este es igual al Control tanto en Western
como Northern por lo que no tiene efecto ni sobre la transcripción ni sobre la traducción.
7) El miR-7b ¿tiene un efecto inhibitorio general de la traducción en fibroblastos.
24
Acuicultura
NO porque la actina está igual, tienen siempre la misma expresión. Lo que tiene es un efecto inhibitorio sobre el
ARNm del fos: vemos que se da muy poca proteína (línea muy finita).
8) La expresión de un RNA exógeno ¿tiene un efecto inhibitorio general de la traducción en fibroblastos?

No, porque el ARN no bloquea nada, es igual del control.
9) El miR-7b ¿bloquea específicamente la expresión de la proteína Fos?

Si ya que no afecta a la expresión de la actina.
Figura 1. Análisis de los efectos del si-miR-7b

en la expresión génica en fibroblastos de ratón
mediante Western blot (A) y Northern blot (B).
Hipótesis que el miR interfiere con el gen fos: miR

interacciona o inhibe parcialmente la traducción ya
que el si-miR-7b no se traduce el gen fos pero en los
controles se produce igual.
Fos: Solo se expresa en las células tratadas con los

esteres de forbol = el proceso de transcripción no se ve
afectado por los miR.
Si no están tratadas NO hay transcripción = No hay

ARNm.
Morfolinos
Es una especie de ARN de interferencia, pero

es sintético, pero en lugar de tener ribosa
tiene un anillo morfolino por lo que la
ventaja que tiene es que no se degrada por
las nucleasas (= muy resistente).
25
Acuicultura
Morpholinos: Usos de oligonucleotidos antisentido
Quiero bloquear la expresión de un gen > inyecto el

morfolino (es como un RNA de doble cadena que no
puede ser traducido) = se inhibe el gen y por ello no se
expresa.
B. C. D.: Como modificar un gen: se pueden hacer

combinaciones diferentes con el mismo gen y el morfolino
para saber cuáles son las partes importantes del gen
(exones).
F: El morfolino va unido a un inhibidor que se puede

eliminar cuando se irradia con luz ultravioleta y entonces
el morfolino se libera y se une a con el ARN. De esta
manera se inhibe la expresión de un gen de manera
concreta.
26
Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
TEMA 3: EDICIÓN DE GENES
La edición génica tiene a que ver con

hacer roturas en el ADN y usar los
mecanismos de reparación de las células.
Hay ≠ tipos de reparación como la no
homologa que puede dar origen a
mutaciones puntuales, inserciones,
deleciones. Si eso ocurre dentro de un gen
este puede dejar de funcionar. Sino puede
haber reparación homologa de un
fragmento por otro.
La no homologa me puede servir para

hacer genes no funcionales mientras que
la homologa para hacer que un gen sea
funcional.
NUCLEASAS DE DEDOS DE ZINC
Los factores de transcripción son proteínas que tienen dominios para

ADN y dominios para otras proteínas.
Los dedos de zinc son proteínas que tiene una parte que reconocen
secuencia de ADN de forma específica. Los dedos de zinc se pueden
crear artificialmente para reconocer secciones específicas.
Se unen dos proteínas a dedos de zinc y en el medio va una

nucleasa: las nucleasas producen cortes asimétricos por lo que lo
más probable es que se dé un mecanismo de reparación no
homologa que inactiva el gen.
27
TALENT
Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) son enzimas de restricción artificiales generadas por la fusión de
un domino de unión TALEN y dominio de corte de DNA.
Son enzimas de
restricción artificiales: son unas proteínas de bacterias que infectaban plantas y que activaban determinados genes.
Cada módulo de proteínas reconoce secuencia especifica de bases de ADN. Es el mismo concepto que antes: generar
daños (= doble digestión) que se va a resolver con reparación no homologa que inactiva el gen.
TAL (transcription activator-like) effectors (TALEs) son proteínas de la bacteria Xanthomonas que se pueden unir a
secuencias promotoras de las plantas que infecta la bacteria y activar la expresión de genes. Tienen un dominio N-terminal
responsable de la translocación, un dominio C terminal activador de la transcripción y un domino repetido central
formado por repeticiones variables de aproximadamente 34 que hace que sean capaces de reconocer secuencias
específicas.
Experimentos con TALENT
Supresión de la actividad de un gen:
 Unión a la secuencia
 Doble digestión enzimática con FoK1
 Reparación por recombinación no homól
28
CRISPR/Cas9
El sistema CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR associated protein 9) es un
mecanismo de defensa adaptativa utilizado por Archea y bacterias para degradar material genético extraño. En estos
organismos, el material genético del bacteriófago es integrado en la región CRISPR. que será utilizado como
resistencia contra futuras infecciones del bacteriófago.
Tenemos el gen CAS que produce

una proteína como la Cas 9 (que es la más usada) que es una proteína que puede digerir.
Crispr tiene unas repeticiones (cuadros negros). Cuando un bacteriófago infecta la bacteria, parte del genoma del
bacteriófago se integra en el Crispr (cuadros con números) y crea una especie de memoria.
Estos fragmentos de secuencia

especifican se traducen en
CRISPR ARNs cortos (crRNAs) y
funcionan como guía para dirigir la
escisión del ADN invasor
complementario, mediante
actividad nucleasa de la proteína
CRISPR-asociada (Cas) codificada
también en el locus CRISP.
1. Se transcribe todo: las

repeticiones propias de la bacteria y las
que vienen del bacteriófago = pre-crARN
2. Al pre-crARN se une un tracrRNA que se
codifica por otro locus dentro de la
bacteria, el producto de la proteína Cas
que se codifica dentro de la bacteria
también.
3. Con la ARNasa se dan diferentes cortes y
se quedan como complejos individuales y
cada uno lleva la proteína Cas y el crARN.
La parte verde es la parte que forma la
bacteria y la roja es la secuencia de
reconocimiento de los bacteriófagos
invasores.
29
4. Cuando llega un bacteriófago se busca la secuencia complementaria. PAM es muy importante. Los complejos
reconocen y se une a los bacteriófagos invasores y la proteína Cas digiere el ADN invasor.
HNH: endonucleasas que

pueden digerir el ADN
propio
Aunque esto se aplica

desde 8-9 años, este sistema se descubrió en 1993. En 2012 se cree que este sistema se podría usar para manipular el
ADN. Es un sistema que está
patentado.
30
En el normal hay: Los sistemas CRISPR contienen

dos componentes: un ARN guía (gRNA) y una
endonucleasa asociada a CRISPR (proteína Cas).
El gRNA es un ARN sintético corto compuesto por

una secuencia de andamiaje necesaria para la unión a
Cas y un espaciador de ∼20 nucleótidos definido por
el usuario que es complemengtario la diana genómica
que se va a modificar.
Lo que se hace en unir los dos elementos de la versión normal (= ARN guía y
endonucleasa asociada a CRISPR) = se crean de forma sintética el RNA guía.
PAM = secuencia de reconocimiento. Para que se una debe ser complementaria

según el organismo donde quiero que se una.
31
Proteína cas 9: 6 dominios
Unión de extremos
no homólogos
Este sistema permite hacer mutaciones puntuales,

deleciones, inserciones, deleciones de exones, invertir
exones, etc. por ejemplo, si se producen dos cortes =
el sistema permite realizar una base o fragmentos
grades según como se aplique.
32
Lo que obtengo es que un gen deje de ser funcional o repararlo para que vuelva ser funcional. Puedo editar bases
El donador pueden ser un ADN de cadena sencilla donado, un plásmido donador, o mediada por recombinación no
homologa, etc.
33
dCas9: Las mutaciones en

los dominios de las nucleasas
RuvC y HNH (D10A y
H840A en la Cas9 de
Streptococcus pyogenes dan
lugar a una variante de Cas9,
denominada dCas9, capaz de
unirse a la secuencia
objetivo, pero incapaz de
escindir su objetivo.
Puedo producir sustituciones: mutaciones puntuales para cambiar genes.
Cas al tener un dominio de unión puedo llevar activadores de genes o represores de genes, puedo hacer modificaciones
en las histonas también. Cas se usan como transportadores de proteínas al ADN pero NO son capaces de digerir.
34
Editores sin doble digestión
35
Se suele usar la Cas9

pero hay otros tipos
de proteínas. Hace
digestión en ADN en
doble cadena.
Cas12: digestión en
una sola cadena de
ADN
Cas13: digestión en
el ARN
36
Cas13a corta ARN
Permite cortar ARN = puedo inactiva la traducción del gen en

lugar que inactivar el gen.
SHERLOCK (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)
Detecta virus. Es muy sensible.
SI hay virus hay fluorescencia.
Existen varios sistemas de CRISPR

para reparar enfermedades y
mutaciones pero hay problemas éticos.
EXPERIMENTOS
37
Identificar la secuencia diana
Quiero manipular un genoma: identifico el motivo

PAM > cuento 20 pb = secuencia que determina el
ARN guía. Se puede hacer con programas
informáticos.
Tengo que llevar al ARN guía a mi ADN para que se de

la codificación. Para ello puedo usar por plásmidos,
vectores, etc.
Posibles errores en el ARN guía.
Hay ≠
Lentiviral vector for expressing U6 sgRNA and CAGGS

Cerulean fluorescent protein
38
Diseñar sgRNA
39
Verde = PAM + 20 bp = ARN guía que tiene que ir en el vector.
Consigue un ADN quimérico que cuando se incorpora en la célula
Experimentos con CRISPR/Cas9:

reparación del gen albino
40
One-cell stage zebrafish embryos were injected with ∼2-3 nl of a solution containing
250 ng/μl Cas9mRNA,
15 ng/μl sgRNA and 5-
50 ng/μl template DNA.
Gen albino: hay una mutación puntual de una G por una T en el

exón 6 y la quiero reparar.
Tengo que buscar en el exón 6 la secuencia diana para raparla =

diseño las 20 bp y el sitio PAM para reponer.
Quiero una sustitución homologa de un gen por otro.
Con el CRISPR corto donde quiero e inyecto el gen nuevo a través de

un vector.
Reducción de la tolerancia térmica en un coral portador de mutaciones inducidas por CRISPR en el gen de un
factor de transcripción de choque térmico
El objetivo es estudiar la respuesta al stress. Identifican y mutan con CRISPR-Cas el gen que codifica el Factor de
Transcripción de Choque Térmico 1 (HSF1) y obtuvieron larvas en las que >90% de las copias del gen eran mutantes. Las
larvas mutantes sobrevivieron bien a 27 °C pero murieron rápidamente a 34 °C, una temperatura que no produjo
mortalidad las larvas de tipo salvaje.
Concluyen que la función del HSF1 (presumiblemente su inducción de genes en respuesta al estrés térmico) desempeña
un importante papel protector en los corales. En términos más generales, concluyen que la mutagénesis CRISPR en
corales debería permitir la realización de pruebas amplias y rigurosas de la función de los genes tanto en las larvas como
en los corales adultos.
Modifican en exón 3 y el 8 para

inhibir el gen.
Consiguen muy pocas secuencias

mutantes.
sgRNA
41
Las secuencias de los cromosomas mutantes

que contienen deleciones que abarcan el
intervalo del exón 3 al exón 9 del HSF1. Con
el ADN de los animales inyectados se hizo una
PCR utilizando los cebadores 1 y 4
secuenciación de estos productos detectó
deleciones de ~2,6 kb
Identificación del éxito de la inyección de las

larvas de A. millepora. Imágenes de campo claro y de fluorescencia de larvas representativas no inyectadas (A-B) e
inyectadas (C-F). Las larvas inyectadas se clasificaron a las 12 horas dela fecundación en grupos con (C y D) o sin (E y F)
fluorescencia visible del
marcador de inyección
Alexa Fluor 488-
dextrano.
Cuando si consiguen
inhibir el gen los corales
sí que son menos
resistentes al incremento
de Tº.
42
43

Aplicaciones Biotecnológicas en Acuicultura

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Aplicaciones Biotecnológicas en Acuicultura

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Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura

TEMA 1: TRANSFERENCIA DE GENES

INTERES DE LOS ANIMALES

Hay muchas cosas que no se pueden hacer

Xenotransplantes: Se usan cerdos para el

Específicamente en peces: puedo modificar

Tecnología transgénica: Es lo primero que se aplicó desde el punto de vista clásico.

HORMONA DEL CRECIMIENTO

OTROS GENES DE CRECIMIENTO

Se mete en la dorada en este caso y se obtiene un incremento en el tamaño,

Truchas arcoiris transgénicas que expresan el transgén de la cecropina P1 o un

Salmón atlántico y Goldfish

Proteína anticongelante de la platija: Se introduce la proteína anticongelante de

Mejorar la composición corporal y el contenido de nutrientes y producir

Microinyeción de ADN total extraído de camarones chinos (Fenneropenaeus

Otras posibilidades es usar los peces como:

Desarrollo de un sistema de biorreactor para suministrar y

El pez Medaka se manipuló genéticamente para utilizarse

Los salmones genéticamente modificados son pleiotrópicos. Efecto

PROBLEMAS PECES MODIFICADOS GENÉTICAMENTE

La acuicultura se expande rápidamente

Esquema de un pez modificado genéticamente (rojo) que se mezcla con

 Puede que no pase nada

CONTROL DE ESPECIES INVASORAS

Cromosoma y troyano + daughterless carp

Cromosoma Y troyano: se va seleccionando para eliminar el cromosoma X: se consiguen

Salmón: Es el primer organismo genéticamente modificado que se puede comercializar.

Es aplicable para todos los OGM. Debe ser organismos seguros:

PROTOCOLO DE BIOSEGURIDAD DE CARTAGENA

Protocolo de Cartagena: Están sujetos prácticamente todos los países. Va

Desde el punto de vista regulatorio la edición genética es complicada

1. Como cortar y pegar fragmentos de ADN

ENZIMAS ÚTILES PARA MANIPULAR ÁCIDOS NUCLEICOS

Necesitamos extraer el ADN y para manipularlo necesitamos enzimas

 Ligasas: unen extremos de ADN

Polimerasas: pegan fragmentos

COMO CORTAR Y PEGAR FRAGMENTOS DE ADN

En eucariota hay muchos tipos de promotores mientras que en

PROMOTORES DE EUCARIOTAS: Los promotores son necesarios

Elementos funcionales en al expresión.

¿Qué tipos de promotores hay?

En manipulación se suelen querer

Virus de mamíferos y aves: Son promotores

 RSV (virus del sarcoma deRous)

¿QUÉ ES UN VECTOR DE CLONACIÓN?

Ejemplo de vector de procariota.

¿QUÉ ES UN VECTOR DE EXPRESIÓN?

En el vector de expresión ya debemos tener promotores.

Virus como vectores: Se suele usar una mezcla entre un plásmido y un

QUÉ ES UNA CONSTRUCCIÓN?

 La secuencia codificante del gen que quiero expresar

QUÉ ES UN GEN DE SELECCIÓN?

Para ver si el experimento va bien es muy útil usar genes de

En célula de eucariota se usa la blasticida y el Gen418 y son genes de resistencia a ABs.

Selección por interferencia con el metabolito de

Gen TK es el gen que da el herpesvirus

Las células que tienen éxito viven si le añado ganciclovir.

QUÉ ES UN GEN REPORTER?

Son secuencias de ácidos nucleicos que

Ejemplo de genes repórter:

GAL (b-galactosidasa): Hydroliza X-gal

QUÉ ES TRANSFECTAR CÉLULAS?

La transfección consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas