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Aplicaciones Biotecnológicas en Acuicultura
Aplicaciones Biotecnológicas en Acuicultura
TECNOLOGÍA TRANSGÉNICA
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Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Tolerancia al frio: Ahora vuelve a estar de moda. Para poder incrementar los sitios donde se puede cultivar los peces más
cerca de los peces incorporando genes para proteínas anticongelantes así que aguanten temperaturas más bajas.
Proteína anticongelante
Composición corporal
B actina desaturasa
Gen fat: hace que los individuos sean más gordos
Sabor
DNA de camarones
Todas estas tecnologías transgénicas tienen muchos problemas en cuanto al tema de la comercialización porque no están
permitidas en todos los países.
Se introducen una H del crecimiento, incluso del mismo pez, para aumentar su crecimiento. Se consigue un incremento
del tamaño corporal.
Se ha trabajado sobre todo con:
Trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss)
Goldfish (Carassius auratus)
Carpa (Cyprinus carpio)
Tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus)
Pez medaka (Oryzias latipes)
Lucio (Exos lucius)
Salmón: se manipuló genéticamente para obtener un
crecimiento rápido introduciendo el gen de la
hormona de crecimiento bajo el control del
promotor del gen de proteína anticongelante del
abadejo y la región 3 'no traducida. Se necesita un
promotor muy fuerte que permite mucha expresión de la H del crecimiento.
Se consigue que los peces sean más grandes, PERO también más feos por lo que la comercialización es peor. En muchos
países los peces se venden ya fileteados por lo que este problema se evita un poco, pero en ES o IT están enteros.
RESISTENCIA A ENFERMEDADES
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Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
RESISTENCIA AL FRIO
COMPOSICIÓN CORPORAL
Tecnología transgénica para generar peces ricos en LC-PUFAs n-3 (Omega-3 long-chain
polyunsaturated fatty acid) utilizando el pez cebra como modelo animal.
Peces cebras. El corrión es transparente por lo que se ve super bien y se puede trabajar con
ellos muy bien.
SABOR
BIORREACTORES
Los peces una vez que se consiguen como tienen muchos descendentes permiten
producir en gran cantidad por ejemplo proteínas.
Se modifican las células para por ejemplo producir insulina, se produce en gran
cantidad, se extrae la proteína y se purifica.
BIOSENSORES
Se manipulan los peces para que puedan detectar determinados contaminantes. En presencia del contaminantes se
expresa el gen biofluorescente y así se puede detectar.
PLEIOTROPÍA
Para algunas cosas se manipulan los peces pero en otros casos no.
El riesgo de los peces GM está asociado a su introducción en la naturaleza y su competencia con las especies salvajes. Los
riesgos de la acuicultura actual son extrapolables al cultivo de peces transgénicos.
ESCAPES DE PECES: escape y aparezcan en el medio natural como especie invasoras, por ejemplo
HIBRIDACIÓN CON OTRAS ESPECIES: casi todos los peces tienen fecundación externa por lo que puede que
haya cruce con otras especies lo cual puede ser un peligro para las especies libres
PECES ESTÉRILES
Se intenta que sean estériles así que si hay escapes no haya problemas.
Los triploides en general suelen ser estériles. Si tengo peces infértiles, significa que
SIEMPRE necesito un suministro: al final los beneficio que puede que los estériles
aporten implican también desventajas.
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Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Para que sean estériles lo que se hace, por ejemplo, es impedir el desarrollo de la línea germinal metiéndolos en un
compuesto esterilizante: me da individuos normales pero infértiles.
Otra forma para evitar problemas de escapes y riesgos para la población naturla es:
Pez que contiene una inserción transgénica del gen de la aromatasa en múltiples sitios del
autosoma. No hay hembras en la descendencia.
ESPECIES COMERCIALES
Las regulaciones EU son muy estrictas PERO la opinión del público es muy importante.
Se vende en Canadá y USA. Esto es la tecnología transgénica de los años 90' = con la H
de crecimiento. Muchos problemas de donde se cultivan estos salmones: Canadá y estados
unidos.
REGULACIÓN
No tóxicos
No alergénicos
Con nuevas características nutricionales
La composición debe ser adecuada
Las características de los procesos deben ser adecuadas
El Protocolo de Cartagena sobre Bioseguridad es un instrumento internacional que regula los organismos vivos
modificados, OVMs, producto de la biotecnología moderna. Este acuerdo promueve la seguridad de la biotecnología,
estableciendo normas y procedimientos que permitan la transferencia segura, manipulación y uso de OVMs, enfocado
específicamente al movimiento transfronterizo.
Su nombre completo es Protocolo de Cartagena sobre Seguridad de la Biotecnología del Convenio de Diversidad
Biológica. Cartagena es el nombre de una ciudad colombiana en donde en febrero de 1999 el Protocolo de Bioseguridad
fue originariamente programado para ser concluido y adoptado.
Sin embargo, debido a ciertos asuntos por resolver, el Protocolo fue finalizado y adoptado un año después, el 29 de enero
del 2000 en Montreal, Canadá.
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Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
En EU son muy estrictos frente a los OGM. Lo que hay en ES es básicamente lo mismo que dice EU porque seguimos las
mismas leyes.
EDICIÓN GENÉTICA
CONCEPTOS BÁSICOS:
Nucleasas: digieren el ADN. Pueden ser exo o endo-nucleasas según si eliminan nucleótidos en el extremo 3’ o 5’
Exonucleasas ADN
Endonucleasas ADN
o Enzimas de restricción
Ribonucleasas: nucleasas para ARN
Enzimas:
Polimerasas de ADN
Polimerasas de ARN
Enzimas de restricción
Ligasas
Fosfatasas
¿QUÉ ES UN PROMOTOR?
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Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Promotor: secuencia, situada corriente arriba de la codificadora, que interactúa con la polimerasa de ARN.
Asegura que la transcripción comience siempre en el mismo sitio. El promotor está en la parte 5’.
Secuencia codificadora: secuencia de ADN que será transcrita a ARN por la polimerasa de ARN. No siempre
está.
Terminador: secuencia situada corriente abajo de la codificadora de ARN que especifica dónde termina la
transcripción.
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Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
a. Promotor básico
b. Promotor más sofisticado. Puede hacer que incremente la expresión de los genes o lo silencie.
Los genes con expresión basal tienen promotores muy simples, pero luego hay otros genes que son más específicos.
Específicos de tejido/ no específicos (generalistas): según el tipo de tejido necesito un promotor más o menos
básico
Constitutivos/inducibles
Fuertes/débiles: cuando son constitutivos suelen ser débiles porque, aunque la expresión sea constante de normal
no necesita que se exprese mucho.
Amplio rango de especificidad/ estrecho: algunos activan más tipos de genes diferentes, mientras que otros
promotores, los estrechos, solo activan genes específicos
Respuesta a elementos: Son promotores que se inducen si hay hidrocarburos, metales, etc. y activan el gen de
fluorescencia, por ejemplo. Son ejemplos de los centinelas, por ejemplo.
Hidrocarburos
Metal (Hg, Cu, Ni, Cd, Zn)
Estrógenos
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Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Tiene siempre un origen de clonación, un gen de resistencia y el sitio de clonación donde se inserta el ADN.
Muchos vectores de expresión son mixtos: que pueden crecer en bacterias y luego ya pasan a células animales.
Vector de 3423 bp: es pequeño. Según el tamaño de lo que tenga que clonar el vector serán más o menos grandes
Los virus tienen los extremos para dar recombinación por eso se usan.
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Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Lentivirus se usan mucho para fragmentos muy grandes.
Voy a necesitar:
Son genes que confieren una nueva función a la célula y le permiten vivir en presencia de un agente selectivo, que suele
ser un antibiótico. Dicho agente, añadido al medio de cultivo, mata células no transformadas. Un buen agente de selección
es aquel que puede usarse en una dosis lo suficientemente alta como para impedir la viabilidad de las células no
transformadas y lo suficientemente baja como para no dañar las células transgénicas.
Blasticidina
o Inhibe la síntesis de ADN en células de mamífero
o El vector contiene el gen de resistencia
G418 (Geneticina)
o Bloquea la traducción
o La resistencia es la neomicina fosfotransferasa (NeoR)
o El vector contiene el gen de la neomicina fosfotransferasa
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Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
ganciclovir. Las células con el gen TK fosforila el ganciclovir y hace que se interrumpa la síntesis de ADN por lo que la
célula acaba muriendo.
Son los que sintetizan algo que me permiten identificar fácilmente lo que tengo modificado.
Los genes reportes se usan para saber si tengo un promotor y que está co-regulando.
SEAP (secreted human placental alcaline phosphatase): Fosfatasa alcalina bioluminiscente, es muy sensible.
Puede dar bioluminiscencia.
LUC (luciferasa): Oxidiza la luciferina y emite fotones. Se contabilizan fotones con un luminómetro o con una
cámara para contar fotones. Hay diferentes tipos de luciferasa
GFP (green fluorescent protein): Emite fluorescenciaverde cuando se irradia con luz ultravileta.Procede de la
medusa Aequoera victoria. Es el que más se usa: se ve perfectamente con los rayos UV.
mCherry: Miembro de la familia mFruits de proteínas fluorescentes rojas monoméricas (mRFP). Como RFP,
mCherry se deriva de DsRed del nidario. Discosoma
Tienes que alterar las bacterias para que introducir un material exógeno. Tengo un plásmido
donde introduzco mi ADN por una reacción de ligación y se da una recombinación. Este plásmido lo
tengo que introducir en una bacteria: obtengo colonias de bacteria y tengo que ver cuáles son las
transformadas y cuales no.
Es alterar genéticamente una bacteria como resultado de la absorción directa, incorporación y/o
expresión del material genético exógeno (ADN exógeno).
Tengo células madre y una vez que tengo integrado el ADN ya sea por transfección o infección con virus, lo que hago es
transferirlas a un blastocisto crear una quimera e ir a buscar los individuos en los que haya funcionado y esté el gen que
quiera.
Electroporación: es lo más usado: hago un choque eléctrico para insertar el ADN. Es muy masivo por lo que viene bien
en grandes números y es más sencilla.
Electroporación: rompe la membrana = hay una elevada mortalidad cel. Con los virus se pierden menos cél. (más
exitosa).
Corto plazo
No requieren selección
Porcentaje de éxito pequeño
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Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
COMO SE INTEGRA EL DNA EN EL GENOMA?
= se introduce al azar: puede pasar que: que no se exprese, que haya modificaciones epigenéticas y que el ADN se
inactive o que el promotor no sea lo suficientemente fuerte y que luego no se exprese.
Lugares determinados gene targeting (Recombinación homóloga): complicado = introducir el gen en un sitio
determinado
Remplazar un gen funcional por otro no funcional (‘knock-out’): el knock-out se ha ido sustituyendo en muchos
casos por la edición génica
Inserción de un gen nuevo (‘knock-in’)
Reparación de una mutación dentro de un gen (terapia génica): esto de normal funciona cuando afecta a una
parte del genoma
Remplazar un gen por otro (mismo promotor/intensificador diferente gen)
RECOMBINACIÓN
INTEGRACIÓN AL AZAR
Las células TK+ fosforilan el ganciclovir dando como resultado un producto tóxico.
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Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Obtengo células resistenes al ABs PERO que en
presencia de ganciclovir se mueren porque tienen el
gen TK.
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Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
La inactivación específica de genes es una técnica que permite analizar la función biológica de un gen.
En este experimento una parte del gen denominado X (= el objetivo es eliminar el gen y ver que pasa para saber cómo
funciona ese gen) se inserta en un vector knock out (figura 1). Este vector es un plásmido que no contiene un origen de
replicación de mamíferos (= para que NO se replique en el plásmido) y que lleva dos marcadores de selección. Uno de
estos marcadores es el gen neoR (que hace que las células sean resistentes a geneticina (tóxico para la síntesis de
proteínas) regulado por promotor de mamíferos y que se inserta en uno de los exones del gen.
1) ¿Cuáles pueden ser las consecuencias de insertar el gen neoR en un exón del gen X?
Que las células que tengan involucrado el gen neoR si se le añade geneticina al medio SI sean capaces de
sintetizar proteínas porque serán resistentes a tal producto y a la vez, al intentar el gen neoR se interrumpe el gen
X que ya NO será funcional y de esta manera podemos ver el efecto de su NO expresión y estudiarlo.
El segundo marcador de selección del vector es tkHSV el gen de la timidita kinasa del virus del herpes simplex que
cuando se expresa en células de mamífero tratadas con el antiviral ganciclovir las conduce a la muerte (= si no meto
ganciclovir no pasa nada a las células).
En el experimento se trató un cultivo de células de ratón con el vector indicado en su forma lineal en condiciones que
favorezcan la transformación. La mayoría de las células no son capaces de incorporar el DNA. En algunas ocasiones lo
hacen pero los ácidos nucleicos se degradan. Otras veces las células si son capaces de de captar el vector y pueden hacerlo
de dos formas. EL vector se integra al azar en el ADN de la célula (suceso más frecuente) o se integra por recombinación
homóloga (suceso infrecuente) en este caso el gen Neo remplaza al gen X en la célula y en el vector ocurre lo contrario, el
gen neo es remplazado por el gen X ( Ver figura 2)
3) ¿Qué células (A y B de la figura 2) replican el gen neoR durante la fase S del ciclo celular?
Las dos porque si está integrado, al replicar el genoma se replica todo, el gen neoR también.
8) ¿Qué mata a las células que no captan el DNA foráneo durante la transfección? ¿La geneticina o el ganciclovir?
Geneticina, porque al no integrar el gen neoR no van a ser resistentes a la genaticina que es un tóxico para la
síntesis de proteínas.
9) ¿Qué mata a las células en las que el DNA foráneo es degradado en el citoplasma? ¿La geneticina o el
ganciclovir?
Geneticina, porque es lo mismo: si no se integra en gen neoR y no hay expresión no son resistentes.
10) ¿Qué mata a las células en las que el vector se integra al azar en el DNA? ¿La geneticina o el ganciclovir?
Ganciclovir, porque las células son resistentes a la geneticina pero llevan el gen TK por lo que si añadimos
ganciclovir morirán ya que se bloquea la síntesis de las proteínas.
11) ¿Qué mata a las células en las que el vector se integra por recombinación homóloga? ¿La geneticina o el
ganciclovir?
Las homólogas son las resistentes y en principio no se mueren ya que tienen el gen neoR que las hace resistentes
a la geneticina y no presentan el gen TK que las hace sensibles al ganciclovir.
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Tema 1: Transferencia de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Técnica básica
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Tema 2: Conceptos avanzados Aplicaciones biotecnológicas en
Acuicultura
Transposón Tol 2
Los transposones son muy frecuentes en el genoma, pero no suelen ser funcionales. Dentro del transposón hay:
Extremos de reconocimiento
Transposasa, es la enzima que le permite “moverse”
Lo que se hace es modificar el transposón eliminando la transposasa y entre los dos elementos de reconocimiento es
donde se puede insertar el trozo de ADN que quiero insertar en el genoma.
El elemento Tol2 de medaka es un transposón autónomo que codifica una transposasa funcional. La proteína transposasa
puede catalizar la transposición de una construcción que contenga 200 y 150 pares de bases de ADN de la secuencia de
Tol2 en los extremos izquierdo y derecho, respectivamente. Estas secuencias contienen repeticiones invertidas terminales
esenciales. Entre estas secuencias, se pueden clonar Insertos de ADN de tamaños bastante grandes (hasta 11 kilobases) sin
reducir la actividad de la transposición.
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Tema 2: Conceptos avanzados Aplicaciones biotecnológicas en
Acuicultura
Sistema cre-lox
Cre es una recombinasa (= lo mismo que la transposasa) de 38 kDa producto del gen cre del bacteriófago P1: cre
reconoce una secuencia y la elimina. Reconoce secuencias LoxP de 34 bp.
Cre reconoce una secuencia de 34 bp del genoma del bacteriófago llamado LoxP, cataliza la recombinación
recíproca y conservativa entre dos sitios LoxP
LoxP consiste en dos secuencias repetidas invertidas de 13 bp separadas por una región asimétrica de 8 bp
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Tema 2: Conceptos avanzados Aplicaciones biotecnológicas en
Acuicultura
En este experimento se crearon dos grupos de ratones transgénicos. En uno de ellos (designado hCMV-cre) la región
codificante del gen cre está unida al promotor fuerte del citomegalovirus humano y al extremo distal de cre hay un
elemento de poliadenilación (= se asume como señal de terminación), (Fig. 1A.).
1) ¿Por qué es necesario añadir el promotor del virus del gen cre?
Si tengo un gen y quiero expresarlo necesito un promotor y al ser mamíferos necesito un promotor de mamífero
en este caso usa el promotor del citomegalovirus humano ().
El otro ratón transgénico (mαA-espaciador-T) consiste en el promotor de un gen murino αA-cristalina (mαA, activo en
las células del cristalino de los ojos = puede estar en todas las células, pero se expresa solo en las células del cristalino),
el gen de del virus SV40 que codifica para el antígeno T grande (la expresión de la gran proteína T transforma en malignas
las células de mamíferos), y un fragmento espaciador insertado entre el promotor y el gen T grande (Fig. 1B). El
espaciador, además de otras secuencias, contiene un elemento de poliadenilación (= induce la traducción de ADN) y está
flanqueado por dos sitios loxP (= se elimina si hay Cre).
3) ¿Qué ocurriría si esta construcción se introduce en una célula del cristalino de mamífero?
No pasa nada. La construcción se puede o no integrar, PERO el problema es que la transcripción se da desde el
promotor hasta la señal de terminación (que se encuentra dentro el promotor) y en este caso el gen del virus está
más allá de la seña de terminación.
4) ¿Es cierto que la transfección de células murinas del cristalino con el transgén mαA-espaciador-T conduciría a su
transformación maligna debido a que el antígeno T grande se expresaría activamente?
No porque no hay expresión (es la misma pregunta que antes).
5) ¿Cuál será, aproximadamente, el tamaño de transcrito producido a partir de esta construcción en células del
cristalino?
< 1300 bp más o menos, a ojo serán 700 pb (= desde mαA hasta el elemento de poliadenilación).
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Tema 2: Conceptos avanzados Aplicaciones biotecnológicas en
Acuicultura
Los ratones transgénicos hCMV-cre se cruzaron con los ratones transgénicos mαA-
espaciador-T y se analizaron los descendientes de la presencia de los dos transgenes
(Figs. 2 y 3). Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar
Cre y el gen grande T (= 269 bp y 195 bp) (Fig. 2A) y para estudiar la región LoxP
(= 220 bp) (Fig. 2B) en tres crías de una camada. (En las condiciones de PCR
utilizadas las regiones de más grandes de 500 pb no se amplificaron = para que no
amplifique más de 500 pb debo reducir el tiempo de extensión de la PCR). El tamaño
de los productos de la PCR se determinó por electroforesis en geles de agarosa (Figs.
2A y 2B). La región mαA-espaciador-T se analizaron por Southern-blot (Fig. 2C).
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Tema 2: Conceptos avanzados Aplicaciones biotecnológicas en
Acuicultura
11) ¿El genoma de qué crías contiene múltiples copias de la construcción mαA-espaciador-T?
La muestra 3 porque vemos que las bandas son más gordas.
Utilizando PCR, se determinaron los genotipos de un gran número de ratones; los resultados se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1. Líneas de
ratones transgénicos y la aparición de tumores en el cristalino.
16) La proteína T se expresa en las células del cristalino de ratones transgénicos mαA-espaciador-T.
Falso porque solo se expresa en los dobles transgénicos.
17) La deleción de la región espaciadora dirigida por la recombinasa Cre se logró en todos los ratones de doble
transgénico de la Tabla 1.
Si, en los 15 doble transgénicos.
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Tema 2: Conceptos avanzados Aplicaciones biotecnológicas en
Acuicultura
microARN (miARN)
ARN pequeños de entre 19-30 nucleótidos de largo que actúan como guías
de complejos de ribonucleoproteínas para dirigir la degradación de ARN
codificantes para proteínas o mensajeros (ARNm), la inhibición de la
traducción, la formación de la heterocromatina y la regulación
transcripcional. Los microRNAs regulan genes vinculados a procesos tales
como desarrollo, diferenciación celular, apoptosis, señales de transducción,
organogénesis y proliferación celular, entre otros.
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Tema 2: Conceptos avanzados Aplicaciones biotecnológicas en
Acuicultura
El proto-oncogen fos codifica para un componente del factor de transcripción AP1, que es importante en la expresión de
genes y en la proliferación celular. La desregulación de la función de AP1 puede llevar a la transformación maligna de las
células.
El experimento tiene como objetivo estudiar el papel del micro ARN 7b (miR-7b) en la regulación de la expresión del gen
fos. La secuencia de miR-7b es parcialmente complementaria a la región 3´no traducida del mRNA del gen fos. El
fragmento de ADN que codifica para miR-7b fue clonado en un vector de expresión (= si se uniera al gen Fos inhibe la
traducción). También se clonó otro micro-RNA no relacionado con el gen fos. Los plásmidos recombinantes designados
si-miR-7b (muestras 3 y 4 en la figura 1) y si-miR-neg (muestras 5 y 6 en la figura 1) se transfectaron en fibroblastos de
ratón. Como control se utilizaron células no transfectadas (muestras 1 y 2 en la figura 1). Una parte de los cultivos,
muestras 2, 4 y 6, se trató con ester de forbol (fobol acetato miristato PMA) y la otra parte no se trató (muestras 1, 3 y 5).
El ester de forbol es un análogo del diacilglicerol que es capaz de estimular la proteinkinasa C = produce un incremento
de la actividad celular)
Dos horas después del tratamiento con PMA se preparó un extracto de proteínas de cada uno de los cultivos y se realizó
un Western blot utilizando anticuerpos anti-Fos y anti-Actina. (Ver figura 1 A).
En otra réplica de los cultivos, una hora después del tratamiento con PMA se extrajo el RNA y se realizó un Northern blot
utilizando como sonda el cDNA del gen fos. (Ver figura 1 B).
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Tema 2: Conceptos avanzados Aplicaciones biotecnológicas en
Acuicultura
NO porque la actina está igual, tienen siempre la misma expresión. Lo que tiene es un efecto inhibitorio sobre el
ARNm del fos: vemos que se da muy poca proteína (línea muy finita).
Morfolinos
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Tema 2: Conceptos avanzados Aplicaciones biotecnológicas en
Acuicultura
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Los dedos de zinc son proteínas que tiene una parte que reconocen
secuencia de ADN de forma específica. Los dedos de zinc se pueden
crear artificialmente para reconocer secciones específicas.
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
TALENT
Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) son enzimas de restricción artificiales generadas por la fusión de
un domino de unión TALEN y dominio de corte de DNA.
Son enzimas de
restricción artificiales: son unas proteínas de bacterias que infectaban plantas y que activaban determinados genes.
Cada módulo de proteínas reconoce secuencia especifica de bases de ADN. Es el mismo concepto que antes: generar
daños (= doble digestión) que se va a resolver con reparación no homologa que inactiva el gen.
TAL (transcription activator-like) effectors (TALEs) son proteínas de la bacteria Xanthomonas que se pueden unir a
secuencias promotoras de las plantas que infecta la bacteria y activar la expresión de genes. Tienen un dominio N-terminal
responsable de la translocación, un dominio C terminal activador de la transcripción y un domino repetido central
formado por repeticiones variables de aproximadamente 34 que hace que sean capaces de reconocer secuencias
específicas.
Unión a la secuencia
Doble digestión enzimática con FoK1
Reparación por recombinación no homól
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
CRISPR/Cas9
El sistema CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR associated protein 9) es un
mecanismo de defensa adaptativa utilizado por Archea y bacterias para degradar material genético extraño. En estos
organismos, el material genético del bacteriófago es integrado en la región CRISPR. que será utilizado como
resistencia contra futuras infecciones del bacteriófago.
Crispr tiene unas repeticiones (cuadros negros). Cuando un bacteriófago infecta la bacteria, parte del genoma del
bacteriófago se integra en el Crispr (cuadros con números) y crea una especie de memoria.
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Lo que se hace en unir los dos elementos de la versión normal (= ARN guía y
endonucleasa asociada a CRISPR) = se crean de forma sintética el RNA guía.
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Unión de extremos
no homólogos
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Lo que obtengo es que un gen deje de ser funcional o repararlo para que vuelva ser funcional. Puedo editar bases
El donador pueden ser un ADN de cadena sencilla donado, un plásmido donador, o mediada por recombinación no
homologa, etc.
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Cas al tener un dominio de unión puedo llevar activadores de genes o represores de genes, puedo hacer modificaciones
en las histonas también. Cas se usan como transportadores de proteínas al ADN pero NO son capaces de digerir.
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Editores sin doble digestión
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Cas13a corta ARN
EXPERIMENTOS
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Identificar la secuencia diana
Hay ≠
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Diseñar sgRNA
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Verde = PAM + 20 bp = ARN guía que tiene que ir en el vector.
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
One-cell stage zebrafish embryos were injected with ∼2-3 nl of a solution containing
Reducción de la tolerancia térmica en un coral portador de mutaciones inducidas por CRISPR en el gen de un
factor de transcripción de choque térmico
El objetivo es estudiar la respuesta al stress. Identifican y mutan con CRISPR-Cas el gen que codifica el Factor de
Transcripción de Choque Térmico 1 (HSF1) y obtuvieron larvas en las que >90% de las copias del gen eran mutantes. Las
larvas mutantes sobrevivieron bien a 27 °C pero murieron rápidamente a 34 °C, una temperatura que no produjo
mortalidad las larvas de tipo salvaje.
Concluyen que la función del HSF1 (presumiblemente su inducción de genes en respuesta al estrés térmico) desempeña
un importante papel protector en los corales. En términos más generales, concluyen que la mutagénesis CRISPR en
corales debería permitir la realización de pruebas amplias y rigurosas de la función de los genes tanto en las larvas como
en los corales adultos.
sgRNA
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
Cuando si consiguen
inhibir el gen los corales
sí que son menos
resistentes al incremento
de Tº.
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Tema 3: Edición de genes Aplicaciones biotecnológicas en Acuicultura
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