Preparación para los estudios de ACS

Conocer las diferentes técnicas de la tecnología del ADN (Capítulo 9)

 El gel blot es una técnica para visualizar un subconjunto particular de macromoléculas -
proteínas o fragmentos de ADN o ARN- inicialmente presentes en una mezcla compleja.
 Los pasos implicados en el gel blotting son,
1. Separación de las moléculas por electroforesis. Esto se hace en un gel que permite a las
moléculas migrar bajo la influencia de un campo eléctrico
2. La electroforesis resultante se "secará" con un filtro de nitrocelulosa. Las moléculas se
adhieren fuertemente al filtro y conservarán sus posiciones relativas cuando se inunden
de fluido en el siguiente paso
3. A continuación, el filtro se baña con una solución que contiene una "sonda"
 La sonda se combinará específicamente con las moléculas diana, es decir, las
que se buscan
 La sonda lleva un medio de visualización (un marcador radiactivo o fluorescente)
 El procedimiento para detectar fragmentos de ADN que contienen una secuencia determinada
es el siguiente
1. El ADN se extrae de la célula
2. El ADN es digerido parcialmente por una endonucleasa de restricción - también
llamadas enzimas de restricción, reconocen y escinden el ADN en secuencias específicas
(secuencias de reconocimiento o sitios de restricción) para generar un conjunto de
fragmentos más pequeños
3. Los fragmentos de ADN resultantes se separan por electroforesis y luego se
desnaturalizan para formar moléculas monocatenarias (ssADN).
4. Sin alterar sus posiciones, las bandas separadas de ssADN se transfieren a un filtro de
nitrocelulosa y se exponen a un cADN o ARN marcado radiactivamente.
5. Si la sonda detecta secuencias de ADN complementarias, se unirá a ellas.
 Los diferentes tipos de blots son los siguientes:
Moléculas
Tipo de
separadas por Sonda
mancha
electroforesis
Sur ssADN ADNc o ARN
ARN
Norte ARN o ADNc
desnaturalizado
Occidental Proteína Anticuerpos
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/G/GelBlotting.html
 El northern blot es una técnica utilizada en la investigación en biología molecular para estudiar
la expresión génica mediante la detección de ARN (o ARNm aislado) en una muestra
 La electroforesis en gel es una técnica utilizada para la separación de moléculas de ADN, ARN o
proteínas mediante un campo eléctrico aplicado a una matriz de gel.
 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) consiste en amplificar secuencias específicas de
ADN
o El proceso consiste en amplificar el número de copias de un determinado segmento de
ADN
 o Se trata de una técnica de biología molecular que permite amplificar una o varias copias
de un fragmento de ADN en varios órdenes de magnitud, generando entre miles y
millones de copias de una determinada secuencia de ADN.
o El proceso implica y se basa en ciclos térmicos, que consisten en ciclos de calentamiento
y enfriamiento repetidos de la reacción para la fusión del ADN y la replicación
enzimática del ADN. Los cebadores (fragmentos cortos de ADN) que contienen
secuencias complementarias a la región diana junto con una ADN polimerasa son
componentes clave para permitir la amplificación selectiva y repetida
o A medida que avanza la PCR, el ADN generado se utiliza como molde para la replicación,
lo que pone en marcha una reacción en cadena en la que el molde de ADN se amplifica
exponencialmente.
1. Las cadenas de ADN se separan por calentamiento
2. Las cadenas de ADN se recoplan con un exceso de cebadores sintéticos cortos
de ADN que flanquean la región que se desea amplificar
3. Se sintetiza nuevo ADN por polimerización

Conocer el aspecto genético de la bioquímica

 Un codón triplete en una secuencia de ácido nucleico suele especificar un único aminoácido
 El código genético define una correspondencia entre secuencias de tres nucleótidos,
denominadas codones, y aminoácidos.
 El ADN (ácido desoxirribonucleico) es un ácido nucleico que contiene las instrucciones genéticas
utilizadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos y de
algunos virus.
o La función principal de las moléculas de ADN es el almacenamiento de información a
largo plazo
o El ADN está formado por dos largos polímeros de unidades simples denominadas
nucleótidos, cuyas columnas vertebrales están formadas por azúcares y grupos fosfato
unidos por enlaces éster.
o Las dos hebras discurren en direcciones opuestas, por lo que son antiparalelas.
o A cada azúcar se une uno de los cuatro tipos de moléculas denominadas bases
o Es la secuencia de estas cuatro bases a lo largo de la columna vertebral la que codifica la
información
o Esta información se lee mediante el código genético, que especifica la secuencia de los
aminoácidos de las proteínas.
 El ARN (ácido ribonucleico) es un tipo de molécula biológicamente importante que consiste en
una larga cadena de unidades de nucleótidos
o Cada nucleótido está formado por una base nitrogenada, un azúcar ribosa y un fosfato.
o El ARN se transcribe a partir del ADN mediante enzimas denominadas ARN polimerasas,
y generalmente es procesado posteriormente por otras enzimas
o El ARN es fundamental para la síntesis de proteínas
 Diferencias entre ARN y ADN
o El ARN suele ser monocatenario, mientras que el ADN suele ser bicatenario.
 ARN una cadena de nucleótidos mucho más corta
o Los nucleótidos del ARN contienen ribosa, mientras que el ADN contiene desoxirribosa
(un tipo de ribosa que carece de un átomo de oxígeno).
 Estos grupos hidroxilos hacen que el ARN sea menos estable que el ADN porque
es más propenso a la hidrólisis
 o El ARN tiene la base uracilo, mientras que el ADN tiene la base timina.
 La base complementaria de la adenina no es la timina, como en el ADN, sino el
uracilo, que es una forma no metilada de la timina.
 Los ARN ribosómicos (ARNr ) son componentes de los ribosomas, los complejos que llevan a
cabo la síntesis de proteínas.
 Los ARN mensajeros (ARNm ) son intermediarios que transportan la información genética de
uno o varios genes hasta el ribosoma, donde se sintetizan las proteínas correspondientes.
 Los ARN de transferencia (ARNt ) son moléculas adaptadoras que traducen fielmente la
información del ARNm en una secuencia específica de aminoácidos.

Saber qué son los fragmentos de Okazaki

 Los fragmentos de Okazaki son fragmentos relativamente cortos de ADN (sin cebador de ARN
en el extremo 5') creados en la cadena rezagada durante la fragmentación del ADN.
o Cuando la hebra retrasada se replica en la hebra original, debe utilizarse el patrón 5'-3';
por lo tanto, se produce una pequeña discontinuidad y se forma un fragmento Okazaki.
o Estos fragmentos son procesados por la maquinaria de replicación para producir una
cadena continua de ADN y, por tanto, una hélice hija completa de ADN.
o Cuando se trata de la síntesis de cadenas complementarias de ADN, la cadena principal
emergente siempre se lee de 3' a 5'. La hebra complementaria antiparalela, la hebra
rezagada emergente lee de 5' a 3'
 Dado que las hebras originales de ADN son antiparalelas, y que sólo puede
sintetizarse una nueva hebra continua en el extremo 3' de la hebra principal
debido a la polaridad 5'-3' de las ADN polimerasas, la otra hebra debe crecer de
forma discontinua en la dirección opuesta
 En cuanto a la cadena rezagada, el resultado de la replicación discontinua de
esta cadena es la producción de una serie de secciones cortas de ADN
denominadas fragmentos de Okazaki
 Cada fragmento Okazaki se inicia cerca de la horquilla de replicación en un
cebador de ARN creado por una primasa, y es extendido por la ADN polimerasa
III

Conservador frente a semiconservador

 La replicación del ADN es semiconservativa
o Cada cadena de ADN sirve de molde para la síntesis de una nueva cadena, produciendo
dos nuevas moléculas de ADN, cada una con una nueva cadena y una antigua.
o La replicación semiconservativa produciría dos copias que contendrían cada una una de
las hebras originales y una nueva hebra
o La replicación conservadora dejaría las dos cadenas de ADN molde originales juntas en
una doble hélice y produciría una copia compuesta por dos nuevas cadenas que
contienen todos los nuevos pares de bases de ADN.

Conocer las enzimas y las enzimas restrictivas

 Las enzimas son proteínas que catalizan (aumentan la velocidad de) las reacciones químicas.
o En las reacciones enzimáticas, las moléculas al principio del proceso se denominan
sustratos, y la enzima las convierte en moléculas diferentes, denominadas productos.
o Las enzimas actúan como catalizadores y reducen la energía de activación de una
reacción, aumentando así su velocidad.
 o La actividad enzimática puede verse afectada por otras moléculas
 Los inhibidores son moléculas que disminuyen la actividad enzimática, los
activadores son moléculas que aumentan la actividad enzimática.
 Los fármacos y venenos son inhibidores enzimáticos
 La actividad se ve afectada por la temperatura, el entorno químico y la
concentración de sustrato.
o Las enzimas son muy específicas en cuanto a las reacciones que catalizan y los sustratos
que intervienen en ellas.
 El tamaño, la carga y las características hidrofílicas e hidrofóbicas
complementarias de las enzimas y los sustratos son responsables de esta
especificidad.
 Los cofactores son componentes de las enzimas que algunas de ellas necesitan. Estas moléculas
no proteicas se unen a algunas enzimas para su actividad
 Las coenzimas son pequeñas moléculas orgánicas que transportan grupos químicos de una
enzima a otra.
 Las enzimas de restricción, o endonucleasas de restricción, son enzimas que cortan el ADN
bicatenario o simple en secuencias de nucleótidos de reconocimiento específico conocidas como
sitios de restricción.

Conocer la hibridación
 La hibridación de ADN consiste en tomar dos muestras de ADN para compararlas. Se
desnaturalizan completamente por calentamiento. A continuación, cuando se mezclan dos
soluciones y se enfrían lentamente, las cadenas de ADN de cada muestra se asocian con su
pareja complementaria normal y se recombinan para formar dúplex. Si los dos ADN tienen una
similitud de secuencia significativa, también tienden a formar dúplex parciales o híbridos entre
sí. Cuanto mayor sea la similitud de secuencia entre los dos ADN, mayor será el número de
híbridos formados
Conocer las proteínas y sus interacciones
 Las proteínas son compuestos orgánicos formados por aminoácidos dispuestos en una cadena
lineal y plegados en forma globular.
 Los aminoácidos de un polímero se unen mediante enlaces peptídicos entre los grupos carboxilo
y amino de los residuos de aminoácidos adyacentes.
 La secuencia de aminoácidos de una proteína viene definida por la secuencia de un gen, que
está codificada en el código genético
 Las interacciones proteína-proteína implican no sólo la asociación por contacto directo de las
moléculas proteicas, sino también interacciones de largo alcance a través del electrolito, medio
de solución acuosa que rodea a las proteínas hidratadas vecinas
o Las interacciones entre proteínas son importantes para la mayoría de las funciones
biológicas

Conocer pH, pI, pK

 El pH (potencial de concentración de iones de hidrógeno) es una medida de la acidez o
basicidad de una solución.
 pI (punto isoeléctrico, pH isoeléctrico) es el pH característico en el que la carga eléctrica neta es
0
  El pK (constante de disociación de los ácidos) es una medida cuantitativa de la fuerza de un
ácido en solución. Es la constante de equilibrio para una reacción química conocida como
disociación en el contexto de las reacciones ácido-base.

Hemoglobina frente a mioglobina

 La hemoglobina es la proteína de los eritrocitos (glóbulos rojos) que transporta el oxígeno.
o La capacidad de transporte de oxígeno depende de cuatro iones de hierro
 La mioglobina es una proteína fijadora de oxígeno que se encuentra en el tejido muscular
 Es la parte hemo del hierro la que da color a los glóbulos rojos y al músculo rojo.
 En la sangre, es la hemoglobina la que contiene hierro, y en las células musculares, la mioglobina
contiene el hierro
 Los glóbulos rojos contienen hemoglobina, no mioglobina, por lo que es la hemoglobina la que
da color a los glóbulos rojos

Conocer las fuerzas intermoleculares

 Las fuerzas intermoleculares son fuerzas que actúan entre moléculas estables o entre grupos
funcionales de macromoléculas.
o incluye las atracciones momentáneas entre moléculas, elementos libres diatómicos y
átomos individuales
o Estas fuerzas, en particular las fuerzas de dispersión de Londres, las interacciones
dipolo-dipolo y los enlaces de hidrógeno, son mucho más débiles que los enlaces iónicos
o covalentes, pero siguen teniendo un efecto químico notable.
o las fuerzas intermoleculares se deben a diferencias en la densidad de carga de las
moléculas

Conocer las cadenas laterales de los aminoácidos

 Los aminoácidos son moléculas que contienen un grupo amino, un grupo ácido carboxílico y una
cadena lateral que varía entre los distintos aminoácidos.
o El tamaño de estas cadenas laterales puede variar, desde un átomo de hidrógeno en la
glicina hasta un grupo metilo en la alanina, pasando por un gran grupo heterocíclico en
el triptófano.
o Los aminoácidos se suelen clasificar por las propiedades de sus cadenas laterales en
cuatro grupos
 La cadena lateral puede hacer que un aminoácido sea un ácido débil, o una base
débil, y un hidrófilo si la cadena lateral es polar, o un hidrófobo si es no polar.

Conocer las técnicas de separación de proteínas

 La cromatografía en columna aprovecha las diferencias de carga, tamaño, afinidad de unión y
otras propiedades de las proteínas.
 Cromatografía de intercambio catiónico, la matriz sólida tiene grupos cargados negativamente.
En la fase móvil, las proteínas con carga neta positiva migran a través de la matriz más
lentamente que las que tienen carga neta negativa, porque la migración de las primeras se ve
más retardada por la interacción con la fase estacionaria
 La cromatografía de exclusión por tamaño separa las proteínas en función de su tamaño. Con
este método, las proteínas grandes salen antes de la columna que las pequeñas, un resultado un
tanto contradictorio.
 o La fase sólida está formada por microesferas con poros o cavidades de un tamaño
determinado.
o Las proteínas de gran tamaño no pueden entrar en las cavidades, por lo que recorren un
camino corto y rápido a través de la columna, alrededor de las perlas
o Las proteínas pequeñas entran en las cavidades y migran por la columna más
lentamente
 La cromatografía de afinidad se basa en la afinidad de unión de una proteína. Las perlas de la
columna tienen un grupo químico unido covalentemente. Una proteína con afinidad por este
grupo químico en particular se unirá a las perlas de la columna y, como resultado, se retrasará
su migración.
 La HLPC (cromatografía líquida de alto rendimiento) utiliza bombas de alta presión que
aceleran el movimiento de las moléculas de proteína por la columna, así como materiales
cromatográficos de mayor calidad que pueden soportar la fuerza de aplastamiento del flujo
presurizado.
o El HLPC puede limitar la dispersión difusional de las bandas de proteínas y mejorar así
considerablemente la resolución

Conozca la RMN
 La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) es un método para determinar las estructuras
tridimensionales de las macromoléculas.
o Es la propiedad que tienen los núcleos magnéticos en un campo magnético al que se le
aplica un pulso o pulsos electromagnéticos, que hacen que los núcleos absorban energía
del pulso EM e irradien de nuevo esta energía hacia el exterior
o La energía radiada se produce a una frecuencia de resonancia específica que depende
de la intensidad del campo magnético y de otros factores.

Conocer el espectrómetro de masas

 La espectrometría de masas es una técnica analítica para la determinación de la composición
elemental de una muestra o molécula
o El principio de la EM consiste en ionizar compuestos químicos para generar moléculas
cargadas o fragmentos de moléculas y medir su relación masa/carga.

Conocer la cristalografía de rayos X

 La cristalografía de rayos X es un método para determinar la disposición de los átomos dentro
de un cristal, en el que un haz de rayos X incide sobre un cristal y se difracta en muchas
direcciones específicas.
o A partir de los ángulos e intensidades de estos haces difractados, un cristalógrafo puede
producir una imagen tridimensional de la densidad de electrones dentro del cristal
o A partir de esta densidad electrónica, se pueden determinar las posiciones medias de los
átomos en el cristal, así como sus enlaces químicos, su desorden y otras informaciones
diversas.

Destino del piruvato

 El piruvato es una molécula que constituye una intersección clave en varias vías metabólicas
o Puede obtenerse a partir de la glucosa mediante la glucólisis, suministra energía a las
células vivas en el ciclo del ácido cítrico y también puede convertirse en hidratos de
 carbono mediante la gluconeogénesis, en ácidos grasos o en energía mediante el acetil-
CoA, en el aminoácido alanina y en etanol.

Saber qué son las condiciones anaeróbicas y aeróbicas

 Los microorganismos adaptados a estos entornos obtienen energía transfiriendo electrones al
nitrato (formando N2), al sulfato (formando H2S) o al CO2 (formando CH4).
 En condiciones aeróbicas, el suministro de oxígeno es abundante y algunos organismos
residentes obtienen energía de la transferencia de electrones de las moléculas de combustible al
oxígeno.

Conocer la regulación de la gluconeogénesis

 Mientras que la mayoría de los pasos de la gluconeogénesis son inversos a los de la glucólisis,
tres reacciones reguladas y fuertemente exergónicas se sustituyen por reacciones cinéticamente
más favorables
o Las enzimas hexocinasa/glucocinasa, fosfofructocinasa y piruvato cinasa de la glucólisis
se sustituyen por glucosa-6-fosfato, fructosa 1,6-bifosfatasa y PEP carboxiquinasa.
o La mayoría de las enzimas responsables de la gluconeogénesis se encuentran en el
citoplasma
o La tasa de gluconeogénesis está controlada en última instancia por la acción de una
enzima clave, la fructosa 1,6-bifosfatasa, que también está regulada a través de la
transducción de señales por el AMPc y su fosforilación.
o El acetil CoA y el citrato activan las enzimas de la gluconeogénesis (piruvato carboxilasa
y fructosa 1,6-bifosfatasa, respectivamente)
 Debido al control recíproco del ciclo, el acetil-CoA y el citrato también tienen
funciones inhibidoras de la actividad de la piruvato quinasa
Conocer la regulación del ciclo del ácido cítrico
 La regulación del ciclo del TCA viene determinada en gran medida por la disponibilidad de
sustrato y la inhibición del producto
 El NADH, producto de todas las deshidrogenasas del ciclo del TCA (excepción: succinato
deshidrogenasa) inhibe la piruvato deshidrogenasa, la isocitrato deshidrogenasa, la α-
cetoglutarato deshidrogenasa y también la citrato sintasa.
 El acetil CoA inhibe la piruvato deshidrogenasa
 La succinil-CoA inhibe la succinil-CoAsintetasa y la citrato sintasa
  El ATP inhibe la citrato sintasa y la a-cetoglutarato deshidrogenasa
 El calcio se utiliza como regulador y activa la piruvato deshidrogenasa, la isocitrato
deshidrogenasa y la a-cetoglutarato deshidrogenasa.
 El citrato se utiliza para la inhibición por retroalimentación, ya que inhibe la fospofructoquinasa,
una enzima implicada en la glucólisis, que cataliza la formación de fructosa 1,6-bifosfato,
precursor del piruvato.

Conocer la regulación de la glucólisis

 La glucólisis se regula ralentizando o acelerando determinados pasos de la vía de la glucólisis
o Esto se consigue inhibiendo o activando las enzimas implicadas.
 o Cualquier paso con una energía libre cercana a 0 no está siendo regulado
o Se supone que un paso con un gran cambio negativo en la energía libre está regulado

Conocer el complejo piruvato deshidrogenasa

 El complejo piruvato deshidrogenasa es un complejo de tres enzimas que transforman el
piruvato en acetil-CoA mediante un proceso denominado descarboxilación del piruvato
o El acetil-CoA puede utilizarse en el ciclo del ácido cítrico para llevar a cabo la respiración
celular, y este complejo une la vía metabólica de la glucólisis con el ciclo del ácido
cítrico.
 La descarboxilación del piruvato también se conoce como "reacción de la piruvato
deshidrogenasa" porque también implica la oxidación del piruvato.

Conocer la transducción de señales

 La transducción de señales es la conversión de información en un cambio químico
o La señal representa información que es detectada por receptores específicos y
convertida en una respuesta celular, que siempre implica un proceso químico

Conocer a los mensajeros secundarios

 Los segundos mensajeros son moléculas que transmiten señales desde los receptores de la
superficie celular a moléculas diana dentro de la célula, en el citoplasma o en el núcleo.
o Transmiten las señales de hormonas, factores de crecimiento y otros, y provocan algún
tipo de cambio en la actividad de la célula
o Amplifican enormemente la intensidad de la señal
o Los mensajeros secundarios son un componente de las cascadas de transducción de
señales

Conocer la función del receptor tirosina quinasa (RTK)

 Los receptores tirosina quinasas (RTK ) son receptores de superficie celular de alta afinidad para
muchos factores de crecimiento polipeptídicos, citoquinas y hormonas.
o Se ha demostrado que no sólo son reguladores clave de los procesos celulares normales,
sino que también desempeñan un papel fundamental en el desarrollo y la progresión de
muchos tipos de cáncer.

Conocer la vía de las pentosas fosfato

 La vía de la pentosa fosfato conduce a la oxidación de la glucosa 6-fosfato a pentosa fosfatos
o Es un proceso que genera NADPH y pentosas
o Hay dos fases distintas en el proceso
 La primera es la fase oxidativa, en la que se genera NADPH, y la segunda es la
síntesis no oxidativa de azúcares de 5 carbonos
 Esta vía es una alternativa a la glucólisis
Reconocer las enzimas del ciclo del ácido cítrico
 Véase el diagrama anterior

Conocer la diferencia entre vías catabólicas y anabólicas

 Las vías catabólicas degradan los nutrientes orgánicos en productos finales simples para extraer
energía química y convertirla en una forma útil para la célula.
 Las vías anabólicas comienzan con pequeñas moléculas precursoras y las convierten en
moléculas progresivamente más grandes y complejas.

Conocer los estados de transición análogos

 Los análogos del estado de transición son compuestos químicos con una estructura química que
se asemeja al estado de transición de una molécula de sustrato en una reacción química
catalizada por una enzima.
o Los análogos del estado de transición no experimentan una reacción química y pueden
actuar como inhibidores enzimáticos bloqueando su sitio activo.

Conocer las proteasas de serina

 Las serina proteasas son proteasas (enzimas que cortan los enlaces peptídicos de las proteínas)
en las que uno de los aminoácidos del sitio activo es la serina.

Saber qué es la quimotripsina

 La quimotripsina es una enzima digestiva que puede realizar proteólisis (degradación/digestión
dirigida de proteínas por enzimas celulares llamadas proteasas o por digestión intramolecular)
 o Corta preferentemente enlaces amida peptídicos en los que el lado carboxilo del enlace
amida es una tirosina, un triptófano o una fenilalanina.
 Contienen un anillo aromático en su cadena lateral que encaja en un bolsillo
hidrofóbico de la enzima

¿Qué es una solución tampón?

 Una solución tampón es una solución acuosa formada por una mezcla de un ácido débil y su
base conjugada o de una base débil y su ácido conjugado.

¿Qué es el equilibrio?
 Cuando un sistema está en equilibrio, la velocidad de formación del producto es exactamente
igual a la velocidad a la que el producto se convierte en reactivo.
o No hay cambio neto en la concentración de reactivos y productos; se alcanza un estado
estacionario.

¿Qué es la fosforilación?
 La fosforilación implica la transferencia de grupos fosforilo
 El propósito de esto tiene que ver con el cambio conformacional
 La fosforilación es la adición de un grupo fosfato a una proteína u otra molécula orgánica.
o La fosforilación activa o desactiva muchas enzimas proteínicas

¿Qué es la cadena de transporte de electrones?

 Una cadena de transporte de electr ones acopla una reacción química entre un donante de
electrones (como el NADH) y un aceptor de electrones (como el O2) a la transferencia de iones
H a través de una membrana, mediante un conjunto de reacciones bioquímicas mediadoras
o Los iones H se utilizan para producir trifosfato de adenosina (ATP), el principal
intermediario de los organismos vivos, a medida que se desplazan a través de la
membrana.
o Los ETC se utilizan para extraer energía de la luz solar (fotosíntesis) y de reacciones
redox como la oxidación de azúcares (respiración).