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    200° imimas ssuplementar al agua como dadores de protones en ests situacion, del mismo modo que bases organicas débiles ‘pueden servir como aceptores de protones. El término ‘catélisis dcido-base general hace referencia a las transferencias de protones faciitadas por Scdos y bases débiles que no son el agua. ‘Enel sitio activo de un enzima, en donde puede que 1 agua no esté disponible como dador o aceptor de Drotones, la catdlisis dcido-base general adquiere grant importancia. Varias cadenas laterales de aminodcidos pueden, y de hecho actian, como dadores y aceptores de protones (Fig. 6-9). Estos grupos se pueden posi- cionar de forma precisa en el sito activo de un enaima ‘para permitir la transferencia de protones, generando Inerementos de velocidad del orden de 10" a 1. Este tipo de catéisis tiene hugar en la gran mayoria de los enaimas, Gatilisis covalente En 1a catélisis covalente se forma un Sine tomes orutrietSeeny e to. Consideremos la hidrélisis de un enlace entre los Sane aver Bn pte dean arson (en sina ‘con un grupo nucleoflco X-) la reaccién se transforma, en AB+h SO AK+B SAGER La formacién y descomposilén de un intermedio cova- Jente crea una nueva ruta para la reaccion pero solo produce catiliss sila nueva ruta tiene una energla de ‘activacén inferior que la ruta no caalizada. Los dos nuevos pasos han de ser mas répidos que a eaccién no catalizada. Diversas cadenas laterales de aminodcios, entre las que se cuentan todas las de la Fig. 6-9, asi como los grupos furcionales de algunos cofactores ena améticos, sven como muciedfles para la formacién de enlaces covalentes con los sustrats. Estos compleos covalentes siempre expertmentart una reaccién adicio- nal con el fin de regenerar el enaima libre. Bt enlace covalente formado entre el ensima y el sustrato puede tetvar un sustrato para una nueva reaceion de una forma que es normalmente espectfica pars el grupo © coenzima impicado Gatalisis por iones metalicos Los metals, tanto si estan fuertemente unidos al enzima o son captados de a slu- cin junto con el sustrato, pueden participar de diferen- tes maneras en la cals. Interacciones inicas entre un ‘metal fjado al envima y el sustrato pueden ayudar a orientar a un sustrato para que reaccione o estabilzar estades de transicién de la reaceién que estén eargades. Esta utiizacién de interacciones de ficion débles entre ‘el metal y ol sustrato es similar a algunos de los sos de la energia de fjacion enzima-sustrato descrita anterior mente. Los metales también pueden facitar reacciones de oxidecidn-reduccion mediante cambios reversibes en. ‘1 estado de oxidacin del ion metdlico. Casi una tercera pparte de los enzimas conocicos requieren uno o més Jones metlicos para su actividad catalitica. ‘La mayoria de enzimas utiizan una combinacién de ‘varias estrategias cataliticas para conseguir un incre- ‘mento de velocidad. Un buen ejemplo de ello es la utili- ‘zacién de la catilisis covalente, cabslisis écido-base {General y estabilizacion del estado de transicién en la reacci6n catalizada por la quimotripsina deserita con ‘mayor detalle en la Seccién 6.4 RESUMEN 6.2 Funcionamiento de los enzimas Los enzimas son catalizadores muy eficientes, cape. ‘ces de aumentar las velocidades de reaccién en un fac tor de entre 105y 10°. Las reacciones eatalizadas por enzimas se caracteri- zzan por la formacién de un complejo entre el sustrato y 1 enzima (complejo ES). La fijcion del sustrato se produce en una bolsa del enaima llamada sitio activo, La funcidn de los enzimas y de otros eatalizadores ‘consiste en disminuir ls energia de activacién, AG", de ‘una reaccién con el fin de incrementar su velocidad de reacciGn. Bl equllbrio de una reaccién nose ve afectado por el enzima. Una parte signficativa de la energa utiizada para el ‘neremento dela velocidad de las reacciones encimticar ‘prowiene de las interacciones débils (enlaces de hidrége- ‘no, interacciones hidrofébicas e interaeciones idnicas) ‘entre encima y sustrato. El sitio activo del enzima tiene ‘una estructura tal que hace que algunas de estas interac cones débiles tengan lugar de modo preferente en el ‘estado de transicion de la reaccin, con lo que lo estabili- zan. Una delas razones del gran tamafo de los enzimas es Ja necesidad de que existan mltiples interacciones. La energla de Niacién, AG,, se utiliza para compensar la ‘energia de activacién rejuerida, AG", de diversas mane- ras. Puede utilzarse, por ejemplo, para disminuir la fentropia del sustrato, desolvatario o para producir unt cambio de conformacién en el enaima (encaj inducido). La energia de faci es también la responsable de la ‘exquisita especificidad de los enzimas hacia sus sustratos, 'mLanecesidad de que hayan miltiples interacciones es tuna de las razones del gran. tamafio de los enaimas. La energia de fijscion, AG, se utiliza para compensar, de diversas maneras, la enetgia requerida para la acivacion, AG}, disminuyendo, por ejemplo, la entropla del sustrato ‘dando lugar ala desolvatacion del sustrato, o mediante un ‘cambio conformacional en el encima (ena indueido). La enengia de faciin también explica la exquisitaespeci- ficidad de los enaimas coin respecto a sus sustratos M Entre los mecanismos catalticos adicionales ‘emipleados por los enzimas se cuentan la catlisis éci- ddo-base general, la catélisis covalente y la catélisis por ‘ones metélicos. La catdlsis suele implicar la existencia de interacciones covalentes transitorias entre el sustra- to y el enzima, 0 transferencias de grupos desde 0 al ‘enaima, con el fin de adoptar un camino de reaccién nuevo y de menor enersia. En todos los casos, el enim, ‘vuelve a adquirir el estado no igado une ver se ha com pletado la reaccién. 6.3 La cinética enzimatica como método para comprender el mecanismo Los bioqufimicos utilizan normalmente diversos métodos: Dara estudiar el mecanismo de accién de enzimas puri- ficados. La estructura tridimensional de la proteina (63a cnt enzimsta como métdo pra amprender el mecnism is) aS mm Cancer produ (F) FIGURA 6-10 Velciades Ince de Ins reaconescatindss ensimdticaerte, Us entina cts cts I vac SO Pv se cereuerit presi sure cence slice para cata ae clin ala velcad mma, Ve | pam. a contaie de Mecha eK, (eokcaa eel tet, eo OS ya Se muesan la canes oe (908 , yporicis del marr, La wc dae dea reac ataliad bor el enzna escese aise conetindo susan reco. La Vy de cada ean rovorcions informacién imeortante. aue se puede ‘completar con la obtenida pot la quitica de proteinas clisica y por los métodos modernos de mutagénesis dirigida (el cambio de la secuencia de aminoscidos de luna protein mediante ingemiena genetic; vease la Fig 9-10). Estas tecnologias permiten a los enaimélogos fexaminar 4 papel de amincicidos coneretos en la FIGURA 6-11 fect de a concentra de suntratesore I velo dad inal de a eacin ataliads yor un era Ew pes eraté peo rea aesea VU concetacion de stato 8 iad def msi ose Constante de Mena Men ten ES un expeimerts de est tp a nceracin de enzima es gene raiment an fa ue [5] >> (Enea cuando (S]se dese cama bao rbtvanenie baja Las uid resetadas Son tincas de las acces caauaas por enimasy 560 se muestan ai pa ajuda (str ef iaiode de [I (Codrvene gut la curve deeb arte Ge una la rectarulr con saat enV, S38 cmt rue Incuna yor baa eS) = 0 seaproximaris ur tit vert ala S)=-) 201 iGn enzméticas, que cortinia siendo el més importan- te, consiste en la determinacién de la velocidad de la reaccion ¥ del modo en que ésta cambia en respuesta a ‘cambios en los parémebos experimentalet, diseiplina ‘que se conoce como elnética enzlmética \ continua ‘idn se expone una introduecién bisica a lacinética de las reacciones catalizadas por enzimas. Laconcentracion de sustrato afecta ala velocitad de las reacciones catalizads por enzimas Uno de Jos factores clave que afetan ta veda le ‘una resecion catalizada yor un enaima es laconcentra- ‘iin de sustrato presente, (8). Sin embargo, el estudio de los efector de la concontracién de sustnto es rom. plicado debido al hecho de que [S} eambia durante el ‘ranscurso de una reacdén in vitro a metida que el sustrato se eonvierte en producto. Una aproximacién ‘que sive para simpificar los experimentcs cinéticos consisie en medir la velocidad inicial, dcsignada V, (Pig. 6-10). Bn una reaccin tipica, el encima puede ‘estar presente en concentraciones del Orde Haloro- lar, mientras que (S] puete ser cinco o seis rdenes de ‘magnitud mayor. Si solo ve toman datos delinicio de la reaceién an al quo los cumbios on (5) so liitan a un pequetio porcentaje y puede considerarse que la con- ceentracién permanece ‘puede explorarse el valor de Ge es aistado por el twestgador. EL eecto de ls variacin de [S] sobre ¥, cuando se mantien» constante 3 Boa mesea denornina ijo ES corsttuye a clave para entender 1 portamento einético. del mismo medo que repre- ‘se1uo un punto Ge parce para is ascusion 28 ia cata sis, El patrén cinético dela Figura 6-11 hiac que Victor Henri, bajo ls direceion de Wurtz, propusiese en 1903 que la combinacién de un eraima con au noléeula de sustrato para formar el camplejo BS es un piso necesa- rio en la catdisis enzimitica. Esta idea fue ampliada ‘para dar lugar a una teork general de la accén enzims- Uea, en particular a cargo de Leonor Michaelis y Maud (sent: Cortese ce Arrives Service Cente, Jnversy of Prsoucs) (fuente Roce Active Cente 202 trzimas Menten en 1913. Postularon que el endima se combina fen primer lugar de forma reversible con su sustrato formando un complejo enzima-sustrato on un paso reversible relaivamente ripido: B+s Es on Et complejo ES se descompone seguidamente en un segundo paso mAs lento dando el enzima Ire yel pro: ‘cto de la reacetén P: estes on Puesto que la segunda react s) es la mis Jenta he de liitar, slobal, que ha de sé ‘que reacciona en el segundo paso, e decir, En cualquier momento de una reaceidn catalzada ‘por un enzima, éste existe eu dus fvenao, la fanaa ire ‘osin combinar Ey la forma combinada BS. A baa (SI), la ‘mayor parte del enzima estard en la forma sin combinar B. Aquf Ia velocidad sert proporcional a [S} porque el cequilibrio de la eeuacién 6-7 sera empujado facia la formacién de més BS a medida que (8) sumenta, La ‘velocidad inicial maxima de la reaccion catalzads (V,.) se observaré cuando virtualmente todo el enaina exté ‘en forma de complejo BS y Ia concentracién de E sea ‘extremadamente pequefia. En estas condiciones, el cenzima esté “saturado” con su sustrato de modo que el mento adicional de (S| no tendré efecto sobre a velo- ‘dad. Esta condicién se produciré cuando (S| sea lo suficienternente alta como para que todo el enzina libre se haya corvertido en la forma BS. Cuando el camplejo, ES se descompone dando et producto P, el anzima ‘queda libre para catalizar Ia reaccién con otra molécula el nombre de cineca de saturacion, Cuando el enzima se mezca iniciamente con wn san fexceso de sustrato, existe un periodo incial, denoninado estado pre-estacionario, durante el cual aumnta ls concentraciin del complejo ES. En rmchas reacciones eniméticas este perfodo es muy brove. Normalrute es demasiado corto para que sea observado fécilente y ‘dura tan sélo unos microsegundos por lo que no marece en la Figura 6-10. (Volveremos al rio més adelante en esta secci6n. oceplia bor GE. Briggs y Haldane en 1925 es una aproxinacién ‘asada en una realidad sencilla. Tal como se ha mencio- nado anteriormente, los eraimas son catalimdores ‘poderosos'que se encuentran, en general, a concentra- iones que son érdenes de magnitud inferior & la ‘concentracin de sustrato. Una vez transcurrdala fase cfimera del estado pre-estacionario ({recuentemente después de un solo ciclo enzimético; esto es, la conver- si6n de una molécula de sustrato en una de producto por cada molécula de engima), P se genera a la risma ‘velocidad que se consume § sélo sila eoncentracién del Intermedio ES permanece estacionaria. La V, medida roflja goneralmente el estado estacinar, alm cuando ¥, se limite a ae La relacién entre concentracin de sustratoy velocidad de reaccén enzimatica se puede expresar de manera ‘qanttatva La curva que representa la relacion entre (S] y V, Fis 6-11) tiene la misma forma general para la mayor de ensimas (se acerea a una hipérbola rectangular), ¥ 5¢ mente mediante la ecuscién de Estos investigndores. dedujeron. ‘esta ecuacion a partir de su hipétesis bésica de que et paso limitante de velocidad en las reacciones enainti- ‘cao eo la Ueatunnanicidn vel copie BS pasa firmar ‘el producto el erzima libre, La ecuaciGn es Vaal Vo Ko + (8) ee Los términos importantes son [S], Vjy Vay, ¥ una cons- tante lamada constante de Michaelis 0 R "Todos estos ‘Aqui desaroaremos los pasos lic lgebnicos ‘osieos para plantear mia decelon modem le ‘cuacié de Michaelis-Menten que sume la existencia el estado extacionaio introducida por Briggs y Tilda ne, Ladeducein oil con las dos reacciones basioas ‘Que intervienen en Ia formarin 7 descomposicin de ES (Eens. 6-7 y 6-8). En los primeros momentos de la reaccién a concentracin del prodct, [Pex dese lable y se contemola la smplifcacén de que puede \anorase la reaceininversa P — (dosent por). Esta suporcia no introduce distorsones critics y simpliica noestrs tea, La reaccin gota se redue & 10) ¥, viene determinada por la descomposicion de ES para dir producto, que viene fijada por (BS): is Vo = kalES] uy Dado que [HS] de la Ecuacién 6-11 no se puede medtir experimentalmente con faciidad, hemos de empezar por encontrar una expresién altemativa para este tr mino, En primer lugar introduciremos el término (E,) que representa la concentraciin total de enaime, (la sma de enzima libre ¥ enzima unio al sustrata}, Eh enuims bre, 0 no Mado, se puede representar, por tanto, como [&|HIES]. Ademés, debido aque [Se wai- nariamente micho mayor que (Bla eantidad de sus- tratofjada por el enzima en cualquier momento ée ln reaccin es despreciable comparado con la (8) tal ‘Teniendo en cuenta estas consideraciones, Ios pasos siguientes nes conducirén a una expresién de ¥, en funcicn de parametros que se miden fécilmente B+setes+e+p Paso 1. Las velocdades de formacién y descompostién. de ES vienen determinadas por las constantes de veoci- {6.3 ucétiaerzimstica come mitodo para comprender el mearismo 203 ac, (formaci6n) y &,+ k (descomposicidn a reactivos Y¥ productos, respectivamente), seg las expresiones: Velocidad de formacion de ES = (Ex) ~ (B8){8} (6-12) ‘Velocidad de descomposicién de ES = ke (BS) + (BS) (6-13) Paso 2. Damos ahora por supuesta una importante con- sideraci6n: que la velocidad inicial de reaccién refleja ln estado estacionario en el que [ES] €s constante, es decir, a velocidad de formacién de BS es igual afa velo- Cidad de descomposicién. A esto se le denomina hip6- tenis del estado estacionario, Las expresiones de las Bowaciones 6-12 y 6-13 pueden igualarse en el estado cestacionario dando: ‘ky ((B_] ~ [ESDIS) = k1ES] + keES] (6-14) Paso 8. Se realize unt sorte de pasos algebraicos para resolver la Beuacidn 6-14 en funcién de [HS], Se efectiia Ja multiplicacion de la parte izquierda de la igualdad y se simplifiea la derecha dando As(ES] ~ ky{ESY(S] = Oe, + ad(BS) (6-16) ‘Sumando el términok,[ES}[8} a ambos lados de la ecua- ibn y sirmpiicando da A(B IIS] = CIS] +k + heJIBS) (6-16) Despejando [ES] se obtiene: = eEulISh (ESI ~ Vig) + isthe Sue ‘Beta expresin atin se puede simplificar més de forma ‘que Se combinen todas las constantes de velocidad en tuna expresion: (9) - leas) Sidi tam reo) FIGURA 6-12 Dependent del vlc inl con repacto& e ‘concentra etna ico se ruestan ks Ptaneto ‘tos ae denen es estes de ncaa (1 0 be Ae (SL K_>> [51 porlo que etme [5] cl detorirardee ecucin ce Mcho: Menten (En. 69) es rlgicon secs s init sV, Vag (SVK, Vgtine una perder esl con especo aS] a cre se naa 8 ata] en conde (S) > Kako, dl emai a ecuacién de Michaels Menien as Pagrieart Smolen react 3 eto et de ur con b meta ue ge ean 25] eve La econ de Michoule- Menten es pues conan con ladeperdenacberaes or Yo respect a(S. arma de ce (5:8 dete por ore VK a SV Vg a(S) Bl término (k, + ;)/k, se define como la constante de Michaelis-Menten, X,. Sustituyéndola alora en la Ecuacién 6-18 la expresion se simpifica a 5 JE,)S) (OS = + (8) aso 4. Ahora podemosexpresr ¥en faci de 25 Sastnuyendo (25 nla Bewslon 6211 pore lado dere Cho del ecuscin 61, cbteneon selEdIS) Kn (81 sta ecuacién atin se puede simplificar més. Dado ave 1a velocicad maxima se obtendré cuando el enzima esta saturado (es decir, cuando (ES] = (Bt), Vj,. 5 puede ‘definir como KJEt}. Sustituyendo esto en Ta Ecuacion 6-20 da la Beuacign 6-9: Haast Ky (8) Esta es la ecuacién de Michaclis-Menten, la ecun- ci6n de velocidad de una reaccién catalizada eins ticamente con un sustrato. Es un defnicién de la relacién cuantitativa entre la velocidad inicial ¥,, la velocidad maxima ¥., y la eancentrariGn inicial de Sus- trato [5], todos ellos Flacionados através dela constan- tede Michaelis, X,, Obsérvese que K, tiene uridades de concentracion molar. {Se ajusta esta ecuacién a los hhechos? ‘Sf, podemos confirmarlo considerando las situaciones iite donde [8] es muy alta o muy baja, tal como muestra la Figura 6-12. De la ecusciin de Michaelis Menten emerge una ‘elacin numérica importante en el caso especial en que ¥, es exactamente la mitad de V,,, (Pig. 6-12). En ese a90 19) (620) Yom Vmax _ _VeoaxlS) 2 Ka+ SI cy At dividie por V,, obtenemos 1__ 1s 27 kewl 2) Despejando K,, obtenemos K, + [8] = 21}, 0 K, = 8}, cuanto V,=¥V,., n= (8, when Vo~ MV ym (623) ‘Esta es una definicién prictica muy Ut de K,: K, €5 ‘equivalente ala concentracion de sustrato a i cual ¥, es a mitad de V,. La ecuaci6n’de Michaelis-Menten (Ben 6-8) puede transformarse algebraicarente en formas que son titles ‘bata la determinacién préctca de Ky ¥,.; (Recuadro 6-1) y, tal como desertbireros més delarc, en el and- isis de la acedn de los inhibidores (véase el Recuadro 6-2 ena pagina 200), Los pardmetrs cnéticos se utilizan para comparar actividades enzimaticas Es itmportante distinguir entre la ecuaciéin de Michac- 1is-Menten y el mecanismo cinético espectico sobre el ‘que se bas originalmente. La ecnacién describe el com- Portaniento cinético de muchos enzimas,diciéndose de todos los enzimas ane myestran una dependencia hiner 204 Eines La ecuacign de Michaelis-Menten ver Burk, tiene la gran ventaja de permitir una deter- | VinaslS} Oe Km + (8) se puede antomaralgeracament en frase | Sleepers epeerur bs dio expevineton Cha | Gantermctn comin se bene mand sabe | ees twee an uns ines dn cual de | Michaelis-Menten, dando hugar a: | 1 _ kt 18) Vo Vmasl8} Separrdo os eoponerss del mamerndor el segundo miembro de a ecuacién da aie Vo” Vous aque se simpliica a | pea} Ve Vaal ST * Vas Esta forma de la ecuacién de Michaelis Menten se ddenomina ecuacién de Lineweaver-Burk. Para los enaimas que obedecen la relacén de Michaelis-Men- tena grea de 1/V, frente a 1S) (el "doblerecipro- 0" de a gréfica de Vente a(S) que hemes utizado | hnasta este momento} da una linea recta Pig. 1. Esta i 181 Vines) lines tiene una pencionte igual @ K,/V,,. la intersec- cion sobre el ge Ves UV, y la incerseccidn sobre el ee 1/5] es igual a -L/A La presernaeién doble recfproca, también denomifiada gréfica de Linewea- boica de ¥, frente a {S} que siguen una cinética de ‘Michaelis-Menten. La regla practica de que K, = (8) cuando V, = 4V,,, (Ben, 6-23) es valida para todos los cenzimas Que sigien la cinética de Michaolis- Menten, (Las principales excepciones a Ia cinétics de Michae- Jis-Menten son los enzimas reguladores, que se discuten cn la Seccién 6.5.) Sin embargo, la ecuacion de Michae- liseMenten no depende del mecanismo relativamente sencillo de doe pasos propuesto por Michaelis y Menten, (Ben. 6-10). Muchos enzimas que siguen. cinética de Michaelis-Menten tienen mecanismos de reaceién muy diferentes y enzimas que catalizan reacciones con seis | ©-Glucosa x | -Pructosa 1s CCarbénico ankidrasa ICO; 26 } Quimotripsira Giiciirosiilticina 108 N-Benzoitiosinamie B-Galactosidasa -Lactosa ‘Treonina deshidratasa 25 | 40 | Treonina 50 | ‘ireeién mucho més precisa de Vay, Ia cual s6lo puede ser obtenida aproximodamemie a partir de luna grafica simple de ¥, frente (S] (néase la Fig. 6-12), ‘Se han deducido y utilizado otras transformacio- res de la ecuacton de Michaelis-Menten, Cada una de cllas tiene alguna ventaja al analizar los datos cinéti- 0s eraimaticos. (Véase et problema 16 al final del) ccapftu). 1a gréfica de los dobles recfprocos de las velocidades de reacciin enziméticas es muy til para distinguir entre ciertos tipos de mecarismos de reaccidn end riticos (véase Ia Fig. 6-14) y para analizar la inhibi- | i6n enzimatica (wéase el Recuadro 6-2) FIGURA 1 Gedfco de dotesrecomeos 0 de Sree Buk ocho pasos identificables mnestran menu, el mismo comportamiento cinético en el estado estacionaro ‘Aungue la ecuacién 6-23 es valida para muchos enzi ‘mas, tanto la magnitud como el significado real de V,,, ¥ de K, pueden cambiar de un enzima a otro. Esta& una tmitacion mpartante dela apreximacion det estado ‘estacionario ala cinetica enaimatica. Vy K, son paré- ‘metros que se pueden obtener experinntalmente para cualquier enzima, peo que por s{misrnos proporcionan ‘muy poca informaciin acerca del nimero, velockisd 0 saturaleza quimica de cada uno de los pasos dscretos enlareaccién. La cindtica de evado estacionario repre- senta, no obstante, el lenguale esténdar mediante et cual se caracterizan y comparan las eficacascataliti- as de los enaias. : Interpretaciéa de ¥,., ¥ de K, Bn la Figura 6-12 se muestra un métode Bric seneillo para obtener un valor aproximado de K,- En et Recuadro 6-1 se ‘presenta un procedimients més préctico, utleando ‘una grifiea doble reefproca. K, puede variar con- Siderablemente de un erzima a”otro, incluso para liferentes sustrstos del mismo enaima (Tabla 6.6). veces el tennino se utliza (@ menudo de forma fnadecuada) como une indicacion de la afinidad de ‘un enzima por su sutrato. El significado real de K_ depende de aspectos especficos det mecarismo de 63 La cindtia enzmstic como métodoparacomprenderel mearisna 205 reacein tales como ef riimero y velocidades relativas de Jos pasos individuales de la reacclén. Para reaeciones de dos pasos, ign Beth i Cuando k, es limitante de velocidad, k, << k., Por lo que A, se simplifica @&,/k, que se define como constamte ae disociacién, K,, del complajo BS. Cuando se dan cstas condiciones, &, representa una medida de la af- ‘dad del enzima por'su sustrato en el complejo BS, Sin ‘embargo, esta situacion no es valida para la mayorta de fetimas. A veces, k, >> &, por lo que K,, = k/k,. En ‘otros casos ky &, Son comparables por lo que K€ una funcion mas compleja de las tres constantes de veloc- dad en. 6:24). La ecuacin de Michaelis-Menten y el comportamiento de saturacién caracteristico del-enwi- ‘ma contimian siendo validos, pero A, no se puede con- siderar como una medida seneilla dela afinidad por el sustrato, Atin son més comunes los casos en los que la reaccin transcurre a través de miltiples pasos despuss lrlstsmet (8) Loe estan empreenines ce una econ entities rroesian quel etae peta ne logo aoe gemaoe 53 1o segundon Eta es una rasccn evar lens yee wre cama jo porque se pune Seg de anes cower el estado estar ‘ona La penne de slings dsp de 15 semvdon re ‘tad etacorara La extooacsn de esta pendent a Nempe coe Ja ruta mostrada en la Ecuacion 6-25. En este ejemplo también interviene un enzima que cataliza una reaccién relativamente lenta, por lo que el estado pre-estaciona- rio se observa de modo mas cenveriente. Para muchos enaimas, la dsoeiacion del producto cs mltante de velocidad, En este ejemplo (Fig 6-166, ©) la velocidad de disoeiacion del producto (k,) es mais lenta que su velocidad de formacion (K,). Por tanto, la cisociacion del producto dita las velocidades observa- Gas en el estado estaconario.{Cémo saberos que k, es limitante de velocidad? Una &, lenta da hugar a tna explosion (burst) de formacion de producto en el esta- do pre-estacionaro porque las etapas precedentes son relativamente répidas, El burst refleja la conversin ride de una molécula de sustrato en une de producto en cal sito activo del ezima. La velocidad observada de formacién de producto se enlentece a la velocidad del estado estacionario a medida que el producto fjado se Ueralentamente, Cada ciclo eraimatico después del primero ha de transcurir a través del paso lento de Uberacin del producto. No tstante, la rpida genera- ‘eldn de profheto en aquel primer ciclo proporciona ‘mucha informacion. La arplitod del burst, cuando se ‘genera una molécula de producto por moléeula de enai- 1a presente (Fig, 6-16) medida por extrapolacién de Ja linea de progreso en el estado estacionario a tiempo cero, es la mayor ampltud posible. Blo constituye una prueba de que la iberacitn de producto es, desde uego, ‘Arlt dl burt ou) sem oo © (eas tao do a aed del fase de burst prowess reacidn durante estdo pe-estaconar rea prepared los pasos qumcas ce a ez (no se muestan detalles dees mises). La presencia de n bust 0 easlosiin ce que un paso oespts de apa cuca qe ecece Pe tant Ge void on este ca ik Frain de pode). Obsdrvee uel itersecién de ep: en ater = 0 aumenta 2 mea que aera [ED (La gta de ls opis del burt i invreaccores (0) ete E} esa ue soa ina mics de Po cada at Sto auartea ae dl burst (estado preston) sa ex una pats equ paso 3 Hoe ne product. paso titan de velociad ya que es ic mo que sn» foracin de rocto en esta esc enamsice senclla ensima ulizade on ese expertreta es Rasa Pure de los RNA cataticos ders eno Capito 26 [Funte(8.) Dates de ihe a RNA 5:22, 2009), itante de velocidad, La constante de velocidad del aso correspondiente a i reaccién quia, f, puede Calcularse a partir del veloidad dela fase coFrespon- dionte al burt, Cletamente, no todee los ensimas actian siempre segin el senciloesquema de reaccén de ln Ecuaclin 6-25. Formaimente, la obeervacion de una explosion indica que desputs ela formacién det producto monitoraada converientemente existe un ‘aso lmitante de vlocta! (normalmente la beracn de producto, un cambio conformacinal det erat tro paso qimico). Ota experimentos 9 andi ae cionales pueden defini, a menudo, las velocidades de cada paso en una reaccién enaimatica con mitiples pasos, En la desripion de enaimas especcos en la Seccién 64 se incluyen algunos eleiplos de la aplica- can del einéica del estado pre-etacionaro, Los enzimas estan sujetos a inhibicin eversible Dimeversible Los inhibidores enaimaticos son moléculas que interfie- ren en la catdlisis, enlenteciéndola o deteniendo las reacciones enziméticas. Lo enaimas caalizan, préctica- mente, todos los procesos celulares por lo que no es sorprendente que los inhibidores enziméticos se fencuentren entre los agentes farmacéuticos conocidos mds importantes. Por ejemplo, a aspirina (acetilsalics {o) inhibe el enzima que cataliza el primer paso de la 210 trams eo nhibicincompettia tes ae eee bss ts eee '&-@ @ b Fe-@ el le @*@ FIGURA 6-17 Te pos de bic reverie (a) 1 ibioes “compatitios so une. 3 to activo elena: K a a contac ce ‘exo unt desir €@) Lo ibkoes carpets Se an eu so dst, peo to se uren a compo ES Kes is Constante de eclibo de ni del ini» ES.) Los iibiores rats unen 2 ston Separados pero pueden unis taro 2 € come sintesis de prostaglandinas, compuestos que intervie ren en muchos procesos, algunos de los cuales produ- ‘cen dolor. El estudio de los inhibideres enaimsticos también ha proporcionado informacion vaiosa sobre ‘mecanismas erimitios y ha ayudado a defilr algunas rutas metabéticas. Hay dos amplias clases de inhibide- res enimaticos: reversible e ireversibies, Inhibidén reversible Un tipo de inhibiciGn reversible ‘comin es la que se denomina inhibicién competitiva ‘(Fig 6-17). Un Inhibidor competitive compite con €l sustrato por el sitio activo del enzima. Mientras el Inhibidor (D) ocupa el sitio activo impide la Ajacion del ssustrato al enzima. Muchos intibidores competitivos son estructuralnente simlares al sustrato comnbinéndo- se eon el enzima y formando un complefo EI, que no conduce a la caaliss. Incluso combinaciones transito- ras de este tipo afectarsn negativamente a la eficlencia dol enzima_ Al considerar la geometria molecular de los Inhibidores podemos legar a menudo a conclusiones sobre qué regiones de un sustrato normal interaccionan, ‘con el erzima. La inhibiciin competitiva se puede ana~ lizar cuantitativamente mediante cinética del estado ‘estacionario. En presencia de un inhibidor competitivo, la ecuacién de Michaelis-Menten (Een 6-9) pasa a ser Vaart S1 one 628) donde ail zim eet 2 Sy La ecuncién 6-28 describe las caracteristias importan- tes dela inhibicion competitiva. Bl térnino variable aK, deterninado experimentalmente, lo, obsermda ef presencia de inhibidor, a menudo se defiomina K, “apa- rene”. lider unido no inactiva el nama. Cuando se isola el inbidar puede urirsey reacclonar el sustra- to, Debido aque enhibidor se une de manera reversi- ble al enzima, se puede cambiar el sentido dela compe- tion en favor del sista simplemente atadiendo més sustrato. Cuando [S] excsde sobradamente a [1] se ‘mimi la probebilidad de qu se fie na molécula de inher, por lo que la reaceién muestra una V., not mal, No obstante, len presencia de inhibidor, se écest- tan concentraciones de sustrato mayores para aprox rmarse esa Va (S) ala cual V, = Wi 1a K, apa- Tene, aumentara en presencia de inhibit en foc- tor a. Bate efecto sobre la K, aparente combinado con Ia ausencia de efecto sobre'la V, €8 diagnéatioo de Inkiicion competitiva, y se poné de manifesto cil mente en una gritiea de dobles reciprocos (Recusdro 6.2). La constante de equilro para a faci de inh bidor, K, puede obtenerse a partir de la misma gréfca. 1a inhibin compettiva se utiliza en terapia médica para tratar pacientes que han ingerdo ‘etanol,dsolvente que se utiliza como anticongelante, El enzirta heptico alcohol deshidrogenasa convierte el ‘metanol en formaldehide, un compuesto perudicil para muchos tejidos. La ceguera es frecuentemente el resultado de la ingestin de metanol debido a que los ‘jos son especialmente sensbles al formaldehido. El anol compite de manera efectivacon el metanol como sustrato de a alcohol deshidrogenasa. El efecto del eta- nol es muy parecido al de un inhbidor eompetitivo, con la distincion de que ol etanol también es un sustato ¥ su concentracién disminuiré con el tiempo a medida ‘que of enzima lo convierta en acetaldehido. La terapia para el envenenaniento por metanol es la infusion {ntravenoss lenta de etanol @ una velocidsd que man- tenga una concentracion controlada en el torrente san- guineo durante varias hors. Esto reduce la tasa de onmactin de formakiehido, retuciendo el pligro mien- tras os rfones filtran el metanol que se exeretaé ino- ‘cuamente por la orna. Hay otros dos tipos de inkibicin reversible, acom- petty mixta, que a menudo se definen aplicades a fenzimas eon un solo sustrato pero que en la practica slo se observan eon ensimas que actin con dos o mas sustratos. Un tahibidor acompetitivo (Fis. 6-15b) es que oe fja aun sitio distnto del que se Bj el sustrato 63 adi entnstia como née pura comprenderelmecnimo 211 || La grfica de los dobies recfprocos (véase el Recuadro 6-1) ofrece una forma fécil de determinar sun ini dor enaimético es competitivo, accmpetitivo 0 mixto. | Se Devan a cabo dos grupos de experimentos de velo- Céidad en los que la concentracion de enzima se man- tiene constante en cada grupo. En el primer grupo (S] también se mantiene constante, lo que permite medir el efecto del incremento de la concentracion de inhi- bidor [sobre la velocidad inicial V, (no se muestra en. la figura). En el segundo grupo [ll 'se mantiene cons- tante y se varia [8]. En la grifica de dobles reciprocos se representa LV, frente a 1(3} ‘La Figura 1 muestra un conjunto de gréficas de ddobles reciprocos obtenidas en ausencia de inhibidor y a dos concentraciones diferentes de un inkibidor ‘competitivo. £1 incremento de {I da ugar a la produe- cidn de una familia de lineas con ura interseccicn ccomtin en el eje 1/Y, pero con pendientes diferentes. Debida a que la interseccién sobre el ee 1/V, es igual | (is) in Sir Penete = I Gs) ‘en cl sitio activo y que, a diferencia del inhibidor com- petitvo, so se une al complejo ES. En presencia de un. Inhibidor acompettivo, la ecuacién de Michaelis-Men- ten cambia a Vast Vet Rs a8] (629) fay aut wns oy ‘Como se deserve en la Ecuacién 6.29, a elevadas con- centraciones de sustrato, V, se aproxima 8 Vaal. Ast, Un inhibidor acompetiivo dsminuye la V, cBservada’ La X, aparente también disminuye debido a que la [8] ‘eceSaria para alearaarla ita de a V, disrinuye en un factor a. Bste comportamienta puede exphiarse de Ja manera siguiente. Dado que el enaima es inactivo ‘cuado se halla unio el inhibidorineorpetitvo, peo el inhibidor no compite con el sustrato para su fijacién, el Inhibidor elimina de manera efectiva de la reaccin una fraccisn de as moléculas enaimatica, Debio aque V.. ependo de EJ, la V,,observada dismiruye y dado que linhibider solo se Une al complejo BS s6lo ES (1 el 6 (eae FIGURA 2 ncn scompetina a W.,,,podemos ver que Vo cambia en presencia del nhibidor competitivo. Bs decir, independiente. mente de la concentraciGn de un inhibidor competiti- vo, lay siempre una concentracién de sustrato sufl- clentemente elevada para desplazar al inhibidor del sitio activo del enzima. Encima de la grafica se mues- tra la reordenacion de Ia Ecuacion 6-28 en la que se basa la representacin, Se puede calcular el valor de ‘a partir del cambio de pendiente para cualquier valor de (il. Conociendo {Il y a, se puede calcular K, partir de a expresién wu Ki {En la inhibicién acompetitiva y mixta, representacio- res similares de ls datos de velocidad dan las faniias de linens que se ven en las Figuras 2 y 3. Los cambios ‘en los puntos de interseccion con los ees indican cambios en Yau e-aa hp emit Siig & (as) FIGURA 3 mbit me cenaimma bre) se elimina de ta eacetén por Jo que la (S} necesaria para alcarzar MV,.., es decir K,, disminuye cen a misma canta Un Inhibidor mbxto (Fig. ¢-17¢) también se fa a 1m sitio distnto al sustrato, pero se fj tanto @ B como ‘BS. La ecuacion de velocidad que describe a la inhibi- cin mixta es Yul 0° ky 1S) fen Teenhar Yio | Ninguno |e Compeitvo Yo, | Acompetitivo Vou! | sixto Vf" 22 traimas onde «.y os¢ definen igual que anteriormente. Nor ralmente, un intubidor mixto afecta tanto a K_ como 8 Vu Vay Ged afectada porque el inkibidor ace que uf pa de as moléculas de erzima asequbles sean Jnactivas cisminuyendo la [E efectivas dela que depen- eV. LaK, puede aumentar o disinir sgn sea la form Uel endima, B o ES, la cual se una més fuerte- mente el inhibider El caso especial en ave a = ,rara mente encontrado en a préctica, se define lsicamente ‘como inhibictén no competitiva. Examine Jz Zeus in 6-20 pars ver por qué un inhibidor no competitivo afectarla & Voy Dero nO aK, 1a ecuatién 6-30 se tiliza como una expresion ‘gener de los efectos de los inhibidores reverables,

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