Phoma exigua var. diversispora Enfermedad: Ascoquita Manejo del hongo en el laboratorio Guillermo Castellanos, Experto en Investigacién-2 Carlos Jara Ing. Age. MS. Asociado en Investigaciin Gloria Meequera, Ftopatéloga, Ph... Lider de Proyecto Fitopatologia de Foil Eo Contenido Generalidades| Procedimientos 'A, Recoleccién y transporte de las muestras BB Preparacin del medio de cultino FDA, . Alslamiontos de P.exigua vr. dversispora 1. Enel medio de cuio PDA, 2. Como cultve menospérico D. Incremento deP exigus 1. Sobre el medio de cultho PDA junto con hojas de iol , Inoculaien des plantas 1 Indcule para plantas en imvernadero 2, Ingoulo para aspersiin en el campo FF Conservacion del hongo para almacenamiento 1 Lotlscién 2. Conservacén en pape tro a 20°C 3. Canservacién coma suspensién en solucion de peptona-suerose, en papal tr @ 20°C G. Prusha de almacenamiento HL. Recuperacién del ong almacenado 1. Conservado en auspersién letilzada en ampolitas 2. Conservado en pape itr @-20°C 3, Conservado a~20°C en pape fitro de suspension en peptone-sucross 12 13 13 16 W W 13 1 mm 13 13 1 1g 1g 125 128 130 131 131 133 134Generalidades Cuias Prictions de Lal Phoma exigua var. diversispora es el hongo que causa la enfermedad del frijol denominada ascoquita (por la antigua taxonomia del hongo). Las condiciones ambientales éptimas para el desarrollo de la enfermedad son una temperatura entre 15 y 20 °C y una humedad relativa alta (entre 80% y 100%), condiciones que se dan en altitudes superiores a los 500 msn, Los sintomas iniciales aparecen en las hojas (Foto 1) como nes circulares de color gris oscuro que, al crecer, n un conjunto de circulos concéntricos. En ellas se desarrollan cominmente masas de pequefios picnidios negros. Estas lesiones aparecen mas tarde en los peciolos, los pedtinculos, las vainas y los tallos. Si las condiciones ambientales son favorables, el ataque de este patégen a como tina quemadura severa del follae que leva ala defoliacién prematura y, finalmente, a la muerte de las plantas. El hongo se puede transmitir por sernillas contaminadas. La Foto 2 muestra las lesiones tipicas de ascoquita en las vainas.Guta Préctica I: Phoma exigua var dversispora Enfermedad: Acooguits| A. Recoleccién y transporte de las muestras Para aislar el hongo Phoma exigua se necesita telido vegetal que presente los sintomas tipicos de la ‘enfermedad con lesiones bien desarrolladas. Nunca se deben recolectartejidos de plantas viejas © ssenescentes porque en éstos se encuentran algunos agentes saprofitos que dificultan el aislamiento de P.exigua. Se debe descartar también el telido vegetal ‘enfermo que tenga sehales de dafio de insectos 6 intomas de otras enfermedades. Conviene ademés tener en cuenta des puntos: — Elaislamiento de este patégeno se facilta si se realiza a partir de tejido foliar, porque en las hojas aparecen varias lesiones y de cada lesién pueden obtenerse varios aislamientos. Cuando se recolecten vainas enfermas, deben preferirse las que estén verdes, porque el procesamiento de este tipo de muestras es més Fé Materiales — Toallas de papel — Bolsas de papel = Rétulos para identificar las muestras = Marcador o lépizGulas Préetioas de Laboratorio para el ‘Mangjo de Patégenos del Frjol Toallas de papel. La muestra de tefido de frijol infectado (de vainas, hojas 0 tallos) que se colecté se envuelve en una toalla de papel que sirve, ademés, para absorber su humedad. Si no hay toallas, pueden usarse materiales similares coro servilletas, papel higinico, pafiuelos faciales y, en timo caso, papel periédico. Bolsas de papel. Las muestras de tejido infectado envueltas en algtin papel absorbente se colocan en bolsas o sobres de papel. No se deben usar bolsas plésticas porque no son porosas y contribuyen, por ello, a la acumulacién de humedad en su interior; esta humedad favorece el crecimiento de microorganismos saprofitos, los cuales dificutarén, el aislamiento del patégeno que se hace partiendo de tejidos de fii Rétulos para marcar las muestras. Es muy importante identifcar claramente la muestra con la siguiente informacién: variedad (0 genotipo) de frijol, tamafio y color de sus granos, lugar donde se toma Ja muestra (localidad, provincia, departamento, pais), fecha de recoleccién de la muestra, nombre del recolector y, en lo posible, latitud y longitud (@proximadas) del lugar en que se hizo la recoleccién. Elrotulo debe quedar bien adherido en cada muestra.uta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita Recomendaciones — Indicar en el étulo sila recoleccién se hi el campo de un agricultor o en una esta experimental. — Guando no haya suficientes rétulos para todas Jas muestras, marcar las bolsas con un cédigo y registrar la informacién completa en una libreta de campo. — No recolectar material vegetal himedo; si esté en esas condiciones, secarlo con toallas de papel antes de ser transportado. (ina vez en el laboratorio, ysi 1no se procesa inmediatamente, dejarlo sobre toallas de papel al aire libre para que termine de secarse. én Pasos del proceso + Paso 1 ‘Tomar una muestra del teido infectado (hoja o vaina) que presente los sintomas tipicos de la enfermedad (ver A. Recoleccién y...} + Paso2 Envolver la muestra en una toalla de papel, colocarla en una bolsa o sobre de papel y adherit a ésta el rétulo que corresponda (ver A. Recoleccidn y...Gulas Préetioas de Laboratorio para el ‘Mangjo de Patégenos del Frjol + Paso 3 Enviar la muestra, tan pronto como sea posible, al sitio o laboratorio donde se haré el aislamiento del hongo. Nunca envie las muestras dentro de bolsas plésticas o envueltas en papel alurinio (ver antes). B. Preparacién del medio de cultivo PDA Las siglas PDA corresponden a los componentes del medio: papa, dextrosa y agar. Este medio se usa para aislar el patégeno. Materiales — PDA deshidratado 39 giltro — Agua destilada 1 litro — Frascos erlenmeyer de 1000 ml 2 Caja petri 50 Preparacién —_ Se pesan los ingredientes, se colocan en un recipiente ‘grande, que puede ser un vaso de precipitado, y se les agrega el agua; esta solucién se ervasa en dos frascos cerienmeyer (500 ml en cada uno). = Los frascos erlenmeyer con el medio de cultivo PDA se esteriizan en el autoclave, Esta méquina, con tna presién de 20 libras y una temperatura de 121 °C, realiza el proceso total de esterilizacién en. 40 minutos.uta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita — El medio esterilizado se deja enfriar hasta que pueda ‘manipularse y se vierte luego en cajas peti, arazén de 20 ml por caja ‘Nota: El hongo P. exigua se desarrolla en el medio de ultivo PDA mediante un protocolo sencillo porque el tejido vegetal colonizado por el patégeno alberga pocos saprofitos (0 esta casi libre de ellos), y esto facilta el proceso de aislamiento. Aislamientos de P. exigua var. diversispora 1. Enel medio de cultivo PDA Materiales — Cémara de flujo laminar = Incubadora — Tijeras — Cajas petri de 100 y 60 mm = Toallas de papel = Muestra vegetal con sintomas — Pipetas Aqua destilada estéril = Hipoclorito de sodio al 2.5% — Medio de cultivo PDA = Mechero = Marcador de punta fina — Pinzas = After — Triangullo de vidrio 1-7Gulas Préetioas de Laboratorio para el ‘Mangjo de Patégenos del Frjol Nota: Todos los procedimientos se deben ejecutar dentro de la cdmara de flujo laminar; ademas, deben ‘cumpiirse todas las condiciones de asepsia y esterilidad {que Se exigen en un laboratorio. En otras palabras, se aplican siempre las buenas practicas microbiologicas (BPM). Pasos del proceso + Paso 1 Cortar varios trozos del tefido enfermo utilizando una tiera estén (Foto 3). + Paso 2 Desinfectar los trozos de muestra de posibles contaminantes en una caja petri de 60 mm que contenga una solucién de hipoclorito de sodio al 2.5%, durante 3 minutos (Foto 4). + Paso 3 Enjuagar luego con agua destilada estéril los trozos desinfectados en otra caja petri, vertiendo el agua sobre la muestra con una pipeta estéril (Foto 5). + Paso 4 Colocar los trozos lavados sobre toallas de papel estériles durante 10 minutos para que se sequen (oto 6).uta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita + Paso 5 ‘Cuando las muestras estén secas, tomar los pedazos de tejido con una pinza estéril y'sembrarlos' en una caja petri (cuatro por caja) que contenga el medio de cultivo PDA (Foto 7), + Paso 6 Incubar las cajas @ 20 °C durante 10 dias, tiempo en que el hongo producité micelio, plenidios y masas de conidias; estas iimas se tomaran para hacer los aislamnientos monospéricos (Foto 8) 2. Como cultivo monospérico La pureza genética de un aislamiento de P. exigua se garantiza si se parte de una sola conidia para hacer el aislamiento. Conviene recordar que en una muestra de tejido enfermo puede haber una mezcla de cepas del ppatégeno. Pasos del proceso + Paso 1 Observar, a través de un estereoscopio, la masa de conidias del honge y, con un alfiler flameado, tocar muy suavemente la masa de conidias para que varias de ellas queden adheridas a la punta del alfiler (Foto 9).Foto 10 Gulas Préetioas de Laboratorio para el ‘Mangjo de Patégenos del Frjol Paso 2 Desprender (sobre el medio PDA de una caja pet Jas conidias del afiler con agua destilada est toma el agua con una pipeta y se vierten de 4 a 6 gotas en el alfiler suspendido sobre el medio (Foto 10). Esparcir bien con un triangulo de vidrio, sobre la superficie del medio, las gotas que llevan las conidias. Esta operacién exige el uso de instrumentos estériles; el triangulo de vidrio se debe flamear antes de cada uso para no contaminar el medio. Paso 3 Incubar las cajas petri del paso anterior a 20 °C durante 24 horas. Pasado ese tiempo, las conidias empezarén a germinar. Paso 4 Enfocar las conidias germinadas con un estereoscopio. Elegir una y sacarla con un alfiler previamente flameado para transferila a una caja, petri que tenga medio de cuitivo PDA; la caja se incuba a 20 °C. La conidia se desarrollaré en ese medio el cual, después de 12 dias, queda totalmente cubierto por las estructuras del hongo (cultivo monospérico). Elaislamiento monospérico es el punto de partida de los diversos procesos que involucran un aislamiento especifico del patégeno (inoculacién, extraccién de ADN del micelio, conservacion), 1-10uta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita D. Incremento de P. exigua 1. Sobre el medio de cultivo PDA junto con hojas de frijol Este incremento debe hacerse partiendo de un aislamiento monosporico (ver antes). Se hace en una ‘caja petri que contenga el medio de cultivo PDA y, en algunos aislamientos, es mejor agregar hojas de frjol esterilizadas al medio para estimular la esporulacisn del hongo. Preparacién de las hojas Las hojas de frijol escogidas, que estarén libres de fungieidas, se esterlizan en autoclave. Se eligen solamente hojas maduras de cerca de 30 dias de ‘edad y de tamaiio mediano, porque las hojas jOvenes se desintegran en el autoclave. Si se usan hojas muy grandes, éstas no cabrén en las cajas petri que ya contienen el medio de cultivo PDA. Las hojas (unas 20) se colocan en cajas petri grandes con el envés hacia arriba, y se rocian con unas gotas de agua destilada, Las cajas petri se envuelven luego en papel aluminio y luego en papel de envolver y se evan al autoclave.Gulas Préetioas de Laboratorio para el ‘Mangjo de Patégenos del Frjol Materiales = Aislamiento del hongo sobre medio de cultive PDA. — Agua destilada estéril — Pipeta con chupo = Triéngule de vidrio — Medio de cultivo PDA — Hojas de frjol sanas, libres de fungicidas y esterilizadas Pasos del proceso + Paso 1 Trasladar, con una pinza estétil, una o dos hojas de fiijol estériles desde la caja grande donde se esterilizaron a la caja con medio de cultivo PDA (Foto 11), + Paso2 Por otro lado, agregar un poco de agua destilada estéril al aislamiento monospérico y raspar con la misma pipeta la superficie del medio de cultivo (en la caja petri), con el fin de desprender de éste las conidias y el miceli.uta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita + Paso 3 ‘Tomar un poco de la suspensién del hongo que se cobtuvo en el paso anterior y depositaria en las hojas de frijol colocadas sobre el medio de cultivo. Esparcir, con un triéngulo de vidrio previamente flameado, la suspension sobre toda el érea de la hoja. + Paso 4 Incubar las cajas petri del paso anterior a 20 °C durante 12 dias. En este tiempo, el hongo producirs conidias en abundancia que proporcionaran inéculo suficiente para hacer las inoculaciones previstas en el invernadero (Foto 12). E. Inoculacién de las plantas 1. Inéculo para plantas en invernadero Pasos del proceso + Paso 1 Incrementar el hongo 10 dias antes de la inoculacién, segtin el ntimero de plantas que se quiera inocular Hacer un céleulo aproximado de las cajas peti (con ‘medio de cultivo PDA) que se necesitan y en ellas ‘sembrar’ el hongo (ver D. Incremento de...); una caja peli bien esporulada produce, aproximadamente, Litto de indculo que aleanzaria, més 0 menos, para 120 potes (tres plantas x pote). Este cdlculo depende de las caracteristicas del aislamionto (no todos esporulan de la misma manera). 1-13Foto 13 Gulas Préetioas de Laboratorio para el ‘Mangjo de Patégenos del Frjol Paso 2 Agregar aqua destilada estétil a los incrementos del hongo de las cajas petri del paso anterior, y raspar luego la superficie del medio con una espatula estéril para desprender las conidias. Obtenida asi la suspensién de conidias,filtrarla con una gasa estéril para separar las particulas como restos de agar y micelio, y recoger en lun vaso esteril mediano (0 en una caja peti ester grande) el fitrado con las conidias (Foto 13). La separacién de estas particulas sélidas tiene dos objetivos: facilitar el conteo de las conidias y evitar que se tapone la boquilla del aspersor ‘DeVilbiss’ (designado aqui por su marca) que se emplea, junto con un ccompresor, para aplicar el inéculo sobre las plantas. En ver del aspersor DeVilbiss se puede usar un aerdgrafo 0 tun atomizador de liquidos. Paso 3 Contar (empleando el microscopio) las conidias observadas en la cuadricula central del hemacitémetro (los cuatro cuadros de las esquinas y el del centro). ‘Multiplicar por 50,000 el ntimero de conidias contadas. La concentracién que debe tener (en este caso) el indculo del patégeno es de 1 x 10° conidias/rl Entonces, dado un volumen final del inéculo que se asperjaré y dada la concentracién de conidias del inéculo original, utilizar la siguiente formula para hallar el volumen tequerido de este indculo original para preparat el de la aspersién: YxC, nx = Vax C ieduta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita Ejemplo Se contaron 150 conidias en el hemacitémetro. Por tanto, 150 x 50.000 = 750.000 = 75 x 10° (conidias en 1 mi) Esta es la concentracién del inéculo original. Ahora bien, si se necesitan 250 mi de un inéculo que tenga tuna concentracién de 1 x 10° (conidias/eml), se sustituyen esos datos en la férmula anterior y se el valor del volumen (V,) de! inéculo original o jal que se toma para preparar el que ahora se necesita: V, x 7.5.x 10° = 250 mlx Lx 10° Por tanto, V, = 200ml x 1x10° 7x1 Se toman entonces 33.3 ml del inéeulo inicial y se completan hasta 250 ml con agua destilada estéril para obtener la concentracién final deseada,Gulas Préetioas de Laboratorio para el ‘Mangjo de Patégenos del Frjol Paso 4 Obtenida la concentracién requerida (conidias por niliitro de agua) para la inoculacién, verter un volumen de esta suspension de inéculo en un frasco. erlenmeyer de 250 ml, que se conecta luego a un DeVilbiss (0 un aerdgrafo) y éste a un compresor (Foto 14) para hacer la inoculacién por aspersién. Se inoculan plantas de 17 dias de edad en la primera hoja trfoliada. El volumen de inéculo aplicado a la hoja se calcula de tal manera que la superficie foliar quede totalmente humedecida sin que drene 0 escurra la suspensién del inéculo. Paso 5 evar las plantas asperjadas a una cémara himeda cuya humedad relativa sea mayor que 90% (Foto 15) y dejarlas alli durante 7 dias. Pasado este tiempo, retirarlas de la cémara, colocarlas durante 3 dias ras cen una mesa y finalmente evaluarias (10 dias después de la inoculacién). Para hacer la evaluacién se aplica la escala esténdar del CIAT, cuyas categorias van del 1 al 9y se distribuyen asf de 1 a3: planta resistente de 4a 6: planta de reaccién intermedia de7 a9 planta susceptible En la Foto 16 se muestra un genotipo de fiijol, susceptible a ascoquita, que fue calificado con 9 en. tuna evaluacién en que se usé la escala anterioruta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita 2, Inéculo para aspersi6n en el campo Materiales —Incrementos de P. exigua en medio de cultive PDA, — Licuadora industrial — Recipient grande = Agua corriente — Embudo| — Hemacitémetro Pasos del proceso + Paso En el vaso de la licuadora industrial verter agua cottiente y depositar (con ayuda de una espatula) el medio de cultivo PDA con el hongo incrementado (Foto 17), Cincuenta cajas de petti ‘medianas en las que el hongo ha crecido durante 10 dias son suficientes para producir el indculo que requiere la aspersion de 1 hectarea de cultivo, Calcular el agua de tal manera que el homogenizado no quede muy denso, + Paso 2 Licuar el contenido (medio de cultivo PDA y estructuras del hongo) hasta obtener un producto homogéneo. Diluirlo en 20 litros de agua.Gulas Prdeticas de Laboratorio para el Manejo de Pategenas del Paso 3 ‘Cuantificar la concentracién de conidias en el homogenizado de 20 litros mediante un hemacitémetro. Calcular luego el valumen de solucién final del inéculo segiin el rea de cultivo que se quiere inocular, y ajustar la concentracién final del indculo. Ver mas abajo un ejemplo de lculo respecto a 1 hectarea, Paso 4 Verter, utilizando un embudo, el inéculo en un recipiente fécil de manejar (Foto 18). La boca de entrada del recipiente se cierra muy bien y éste se revisa con frecuencia para detectar fisuras 0 fugas. Para hacer una inoculacién artificial en 1 hectérea de un cultivo de frljol en el campo se requieren, come minima, los siguientes materiales: de 50 a 70 cajas petri de incrementos de P. exigua bien esporulados diluidas en 140 litros de agua. Se obtiene asi una suspensién de conidias con la concentracién. requetida (1 x 10° con/m)) para inocular 1 hectarea. Las inoculaciones con este patégeno deben hac siempre al caer la tarde, cuando la temperatura va en descenso y la humedad relativa aumenta,uta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita F. Conservacién del hongo para almacenamiento Para conservar el hongo P. exigua se emplean tres métodos: lalioflizacién, el papel filtro en trazos uardados en sobres, y el papel fro impregnado con Una suspension del hongo en solucién de peptona- sucrosa, 1. Liofilizacién Es el métocio mas confiable para conservar microorganismos en almacenamiento, Materiales — Lioflizador — Ampolletas para liofilizar de ‘cristal neutro! (Cneutral glass}) de 0.5 ml — Pipetas pasteur largas = Tijeras y algodén —_Incremento del hongo en medio de cutive PDA = Peptona al 10% = Sucrosa al 20% (Foto 19) Nota: Los aislamientos deben prepararse 12 dias antes, de empezar el proceso de lioflizacién (ver D. Incremento de..). Al iniciar esta etapa de almacenamiento, deben haber esporulado y estar libres de contaminantes. 1-19Gulas Préetioas de Laboratorio para el Manejo de Patégenos del Fitjol Pasos del proceso + Paso 1 Escribir 0 marcar en papel ftro la identificacién de los aislamientos que se van a liofilizar. La lentificacién incluye el nombre del hongo (género y especie), el nombre del aistamiento (cédigo empleado por cada laboratorio) y la fecha en que se almacena el aislamiento. Esta informacién se es con letra pequeiia en teas reducidas del papel (azem9, + Paso2 Cortat, con una tijera estéril, los trozos de papel filtro con la identificacién del hongo e introducir uno en cada ampolleta hasta el fondo. — Preparar luego el tapén de algodén con que se tapa la ampolleta, de modo que cubra, més 0 menos, los dos tercios superiores de la ampolleta, Extender un trozo de algodén hasta que tenga unos 5 x3 em y enrollario sobre una pinza (0 la parte delgada de un asa), presionando con los dedos hasta formar el tapdn sobre ese extremo del asa (Fotos 20, 21 y 22). Dejar un poco de algodén sin enrollar en el lado opuesto del tapén. — Introducir el tapén en la ampolleta y reirar la pinza (0 el asa) suavernente con una mano, mientras se sostiene el tapén dentro de la ampolleta con la otra, 1-20uta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita — Preparar ampolletas adicionales con sus respectivos tapones para tener més tapones en caso de que se necesiten. Si un tapén se desintegra al ser manipulado, es necesario remplazarlo con uno que esté esterilizado en las ampolletas adicionales + Paso 3 Llevar este material (ampolletas con sus tapones) al autoclave para esterilzarlo durante 40 minutos. + Paso 4 Proparacién de las soluciones de peptona y de sucrosa Se toman 10 g de peptona y se disuelven en 100 ml de agua destlada. Se prepara de igual modo una solucién de sucrosa (o de dextrosa) al 20%, disolviendo 20 g de este producto en 100 ml de aqua destilada. Las dos soluciones, que se preparan por separado, se levan al autoclave. Una vez esterilzadas, se mezclan partes iquales de cada una en un recipiente estéril para hacer una solucion homogénea de peptona-sucrosa.Gulas Préetioas de Laboratorio para el ‘Mangjo de Patégenos del Frjol Paso 5 Con una pipeta pasteur larga, succionar de 2 a 3 ml de la mezcla peptona-sucrosa (ver Paso 4) y verterlos sobre el cultivo del hongo (Foto 23). Obtener luego tun homogenizado con el hongo y la solucién de peptona-sucrosa haciendo primero un raspado del cultivo (micelio y conidias) y luego, mediante succin y cexpulsién repetidas de la mezcla con la misma pipeta pasteur, lograr el homogenizado. Paso 6 ‘Tomar, con la misma pipeta pasteur, unas gotas (2:3 mi de esa suspensién del hongo (Foto 24) y depositarlas en el interior de la ampolleta siguiendo estos pasos: Tomar con una mano la pipeta pasteur y con Ja otra la ampolleta con su respectivo tapén (obtenida en el Paso 2). —_Sujetar la pipeta pasteur con los dedos indice y pulgar, y con el mefiique de la misma mano retirar cuidadosamente el tapén de algodén de Ja ampolleta por su extremo suetto y mantenerio firmemente adherido conta el borde de la palma de esa mano, Enseguida, verter la suspension del hongo contenica en la pipeta en el fondo de Ja ampolleta, donde esta el papel filtro con la identificacién del aislamiento. = Tapar luego la ampolleta (Foto 25) introduciendo suavemente en ella el tapdn, tal como esta sostenido entre el meiique y la palma de la mano (ver antes) 1-22uta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita ‘Sil algodén del tapén entra en contacto con otra superficie © con alguna sustancia, se contamina, por lo que se debe desechar y remplazar con uno de los ‘que se habian preparado (ver Paso 2) para estos + Paso7 Cortar, con una tijera flammeada, la parte del tapén ‘que qued6 por fuera de la ampolleta (Foto 26). Introducirfinalmente en la ampolleta el resto del tapén de algodén empleando la punta de la tiera, hasta dejar 1 cm entre el borde de la ampolieta y el tapén (Foto 27) + Paso8 Colocar las ampolletas en una gradilla. Empujar luego el algodén hacia el fondo de cada una hasta «que toque el trocito de papel filtro que lleva la identificacin del hongo; para ello se utiliza un ‘objeto alargado (como la parte superior de un asa), ‘el cual se flamea constantemente para evitar que se contaminen los tapones (Foto 28). La parte superior de la ampolleta, que no contiene algodén, se sellaré después del proceso de lioilizacién, + Paso 9 Una vez organizadas las arpolletas,llevatlas a un ‘congelador a 0 °C durante 15 minutos. Cuando las muestras se hayan congelado, se inicia el proceso de lioflizacién.Foo 29 Foto 30 Gulas Préetioas de Laboratorio para el Manejo de Patégenos del Fitjol Paso 10 Colocar la gradilla en la campana del liofilizador y encenderlo (Foto 29). El aparato hace descender en su interior la temperatura hasta -55 °C e inicia un proceso de secamiento de la muestra porque le extrae el agua mediante una bomba de vacio. Este proceso tarda entre 20 y 22 horas. Paso I Al dia siguiente, apagar el lioflizador y retirar de él la gradila con las ampolletas. Preparar luego una pistola de gas propano y proceder al ‘estiramiento’ de las ampolletas en la parte opuesta a aquella en que esta la muestra, es decir, hacer un cuello en cada una ablandando el vidrio con la llama y estirando la ‘ampolleta por sus extremos (Fotos 30 y 31). El procedimiento requiere mucha precaucién para evitar quemaduras en las manos por la lama. El objetivo de este paso es reducir el espacio por donde puede entrar aire (con humedad) a la muastza, antes de sellarla completamente. Paso 12 na vez estiradas todas las ampolletas, colocarlas en el érbol del liofiizador insertando el extremo abierto de cada una en los soportes del arbol, De esta manera, el extremo que contiene la muestra quedaré més visible (Foto 32). Repetir el proceso de secamiento en el liofilizador durante 1 hora, aproximadamente, para eliminar la humedad que pudo haber entrado ala muestra durante el Paso 11uta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita + Paso 13 Sin apagar el ioflizador, sellar al vacio las ampolletas, una por una, empleando la pistola de gas propano, derrtiendo el vidrio con la llama donde se hizo el cuello 0 estiramiento (Foto 33). Una vez selladas, finaliza el proceso de liofilizacién, En caso de que se pierda el vacio al estar sellando una ampolleta, retirar esta parte de la ampoileta, remplazarla por una nueva y esperar que el vacio llegue al punto indicado para poder continuar con el sellado de las otras ampolletas. La duracién de una muestra en almacenamiento, conservada mediante el proceso de lioflizacién, no se ha establecido formalmente; sin embargo, en nuestro laboratorio se han recuperado muestras lioflizadas «que permanecieron almacenadas durante 30 afios. La lioilizacion de muestras microbiolégicas tiene, no obstante, una desventaja: para recuperar una muestra hay que romper toda la ampolleta y, por consiguiente, es necesario tener varias copias de cada una de las muestras lioflizadas para poder mantener adecuadamente una coleccién.Gulas Préetioas de Laboratorio para el Manejo de Patégenos del Frijol 2. Conservacién en papel filtro a-20°C Este método permite conservar microorganismos durante periodos largos de tiempo. Materiales — Papel filtro estél, cortado en trozos pequefios — Incremento de P. exigua — Pinzas — Cajas petri estériles — Agua destilada estéril Pipeta ~ Sobres de papel mantequilla Pasos del proceso + Paso 1 Cortar cuadritos (60-80) de papel filtro de 1 em?, colocarios dentro de una caja petri o de un contenedor cerrado y esterlizarlos en autoclave. + Paso2 Colocar 10 cuadritos de papel fitro esterilizado sobre el medio de cultivo PDA en cada caja petriuta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita de conidias y micelio de un aislamiento del hango, de la siguiente manera: = Agregar agua destilada estéril sobre un aislamiento desarrollado en una caja pets. — Raspar luego la superficie del aislamiento con la punta de la pipeta hasta que se logre la ssuspensién. ‘Tomar un poco de esa suspensién con la pipeta y 2 colocar una gota en cada cuadrito de papel filtro esterilizado (en las cajas petri del Paso 2). + Paso 4 Incubar las cajas @ 20 °C durante 12 dias. + Paso 5 Pasados los 12 dias, etirar los euadritos de papel filtzo de las cajas petri de incubactén con una pinza estérily, cumpliendo con todas las condiciones de asepsia, depositarios en una caja petri esteril vacia Colocatls invertidos (la cara en que esta el hongo hacia abajo) para que no se enrollen al secarse. ‘Secar los cuadtitos de papel filtro durante 7 dias a 2arc.Gulas Préetioas de Laboratorio para el ‘Mangjo de Patégenos del Frjol + Paso 6 Pasar los cuadrites secos (con una pinza flameada) a bolsitas de papel mantequilla estéril (Foto 34), las cuales se introducen, a su vez, en otra bolsa mas grande del mismo material (9 en una cajila adecuada), para almacenarios (Foto 35). Esta titima bolsa, en Ja que se coloca toda la informacion referente al hongo P, exigua, se almacena a -20 °C. 3. Conservacién como suspensién en solucién de peptona-sucrosa, en papel filtro a -20°C Materiales — Peptona al 10% = Sucrosa al 20% ~ Cajas pets — Papel filtro cortado en trocitos esterilizados de 0.5 cm* ~ Pinza ~ Espatula — Pipetasuta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita Preparacién de las soluciones de peptona y de sucrosa (0 dextrosa) Ver F,, 1. Liofilizacién, Paso 4. Pasos del proceso + Paso ‘Tomar una caja petri que contenga un aislamiento esporulado del hongo y agregarle 2 ml de la solucién de peptona-sucrosa. + Paso 2 Raspar, con una espétula estérilo con la misma pipeta con que se agregé la solucién, la superficie del aislamiento contenido en la caja petri para desprender las conidias del hongo. De este modo se obtiene una suspensién ce conilias + Paso 3 Depositar, con una pinza estéril, 20 cuadritos de papel fitro esterlizados en la caja petri del Paso 2 impregnarlos con la suspensién del hongo en la solucion de peptona-sucrosa, + Paso4 Ratirar los cuadtitos de papel filtro de esa caja petri con una pinza estéril y colocarlos en una caja peti estéril que tenga papel filtro en el fondo, para que se sequen a 24 °C durante 7 dias.~ < Gulas Préetioas de Laboratorio para el ‘Mangjo de Patégenos del Frjol + Paso 5 Transcurrido ese tiempo, guardar los cuadritos en sobres estéries ce papel mantequilla (ver Foto 34) para almacenatlos a -20°C, escribiendo en ellos la informacién referente al hongo, como fecha de almacenamiento, nombre de la cepa, ete. (ver Foto 25) G. Prueba de almacenamiento Esta prueba es la forma clara, practica y confiable de garantizar que el hongo secado pot 7 dias esta libre de contaminantes, viable y que puede ser almacenado. Pasos del proceso + Paso 1 ‘Tomar uno de los cuadritos de papel filtro que habia sido impregnado con la suspensién del hongo y que fue secado por 7 dias a 24 °C. + Paso 2 ‘Sembrar el cuadrito en medio de cultivo PDA. Después de 5 dias, el patdgeno debe haber crecido en este medio de cultivo.uta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita + Paso 3 Observar el crecimiento del hongo en el estereoscopio. Si presenta agentes contaminantes, como otros hongos © bacterias, tanto la muestra observada como los demas cuadtitos de papel filtro deberan desecharse, y se repetiré entonces el proceso de conservacién. H. Recuperacién del hongo almacenado 1. Conservado en suspensién liofilizada en ampolletas Materiales — Ampolletas con el hongo lioflizado = Pipeta con chupo = Solucién de peptona al 10% Mazo (de mortero) — Solucién de sucrosa al 20% ~ Servlleta estéril = Cajas petri con medio de cultivo PDA = Pinza (Foto 36)Foto 37 Gulas Préetioas de Laboratorio para el ‘Mangjo de Patégenos del Frjol Pasos del proceso + Paso 1 Romper la ampolleta que contiene el hongo golpeéndola con un mazo (Foto 37) por el extremo puesto a aquél en que esta el hongo liflizado (la senvilleta sive para amortiguar el golpe y la rotura del vidrio). Retirar con la pinza el algodén que est dentro de la ampolleta (Foto 38). + Paso2 Depositar con la pipeta, en la mitad abierta de la ampolleta, cuatro gotas de la solucién de peptona- sucrosa (ver F, 3, Conservacién como...). Las células lofllzadas del hongo quedan asi suspendidas en la solucion y pueden retirarse de la ampolleta (Foto 39). + Paso 3 Transferir la suspensién del hongo de la ampolleta a tuna caja petri que contenga el medio de cultivo PDA, para reiniciar el proceso de crecimiento del microorganismo (Foto 40).uta Préctica 1: Phoma exigua var diversigpora Enfermedad: Ascoquita 2. Conservado en papel filtro a -20°C Pasos del proceso + Paso Trasladar, con una pinza estéril, uno de los cuadritos de papel filtro con el hongo —que habian sido almacenados en bolsitas a ~20°C (wer F, 2. Conservacién en... Paso 6)— a una caja petri (Foto 41) que contenga el medio de cultivo PDA. + Paso 2 Depositar 1 0 2 gotas de la solucién de peptona- sucrosa en los cuadritos de papel filtro que contienen el hongo: asf se hidrata el hongo y podré ser esparcido sobre toda la superficie del medio (Foto 42), usando la punta de la pipeta. De esta manera se aumenta el campo de crecimiento del hhongo. + Paso 3 Incubar las cajas petti del paso anterior a 20°C. El desarrollo del hongo se reactivara y después de 12 dias estaré listo para ser usado en los procesos: que se realizarén més adelante.Gulas Préetioas de Laboratorio para el Manejo de Patégenos del Frijol 3. Conservado a -20 °C en papel filtro de suspensién en peptona-sucrosa Pasos del proceso + Paso 1 Sacar de los sobres de papel mantequilla Wer F, 3. Conservacién como..., Paso 5, Foto 35) de 1 a2 trocitos de papel filtro que contienen el hongo almacenado en suspension de peptona- sucrosa, y ‘sembratlos’ en el medio de cultivo PDA contenido en las cajas petri + Paso 2 Incubar las cajas petri del paso anterior a 20°C. Después de 2 0 3 dias se puede ver el crecimiento del hongo. A los 10 dias después de la incubacién, el hhongo estar listo para ser incrementado,