UNIVERSIDAD DE CIENCIAS Y

ARTES DE CHIAPAS

FACULTAD DE INGENIERÍA
PROGRAMA EDUCATIVO DE INGENIERÍA AMBIENTAL

REPORTE
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN Y
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

PRESENTA:
EDUARDO LORENZO RUEDA
IVÁN MENDOZA PÉREZ
EDSON ELÍ OCAÑA MADARIAGA
MARÍA MAGDALENA PARRA REVUELTA
ADRIANA CAROLINA PÉREZ ESPINOSA
CESAR RAMOS MOLANO
KARLA PATRICIA VÁZQUEZ FLORES
KRYSTEL VELÁZQUEZ ESCALANTE

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

PROFESOR(A):
DRA. REBECA ISABEL MARTÍNEZ SALINAS

TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS 21 DE MARZO DE 2021

INDICE
PRÁCTICA No. III MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
INTRODUCCIÓN
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
MATERIAL
METODOLOGÍA
DIAGRAMA
OBSERVACIONES
INVESTIGACIÓN
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
PRÁCTICA No. IV PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCIÓN
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
MATERIAL
METODOLOGÍA
DIAGRAMA
OBSERVACIONES
INVESTIGACIÓN
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS
PRÁCTICA No. III MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos, aunque en distinto grado, son susceptibles a la acción del calor,
el cual llega a toda la masa, actuando en lugares del material que podrían no ser
alcanzados por otros agentes. El mecanismo de este como agente esterilizante implica
la desnaturalización proteica, la fusión y desorganización de membrana y/o la
ocurrencia de procesos oxidativos irreversibles (2).

Pero el aire es un mal conductor del calor, y el aire caliente penetra mucho más
lentamente que el vapor de agua en materiales porosos.

Las variables principales de un proceso de esterilización por calor son la temperatura y

el tiempo de exposición. La destrucción de los microorganismos por el calor no se
produce en forma instantánea, existe una relación tiempo- temperatura- condiciones
generales del producto a esterilizar (2).

Según este criterio, los microorganismos pueden clasificarse en dos grandes grupos
sobre la base de su resistencia al calor:

1. Células vegetativas cuya resistencia térmica es relativamente pequeña, gastando

por regla general una exposición a 80°C durante un minuto para su destrucción.
2. Bacterias esporuladas capaces de sobrevivir al ser sometidas a temperaturas de
100°C y mayores durante tiempos relativamente largos.

La esterilización es la eliminación o la destrucción de todas las formas de vida

microbiana. El calor es el método más común para eliminar microbios, incluidas las
formas más resistentes, como las endosporas. Un agente que produce esterilización se
denomina esterilizante. La esterilización mediante la eliminación de microbios de los
líquidos o los gases puede realizarse por filtración (1).

La OMS define la esterilización como la técnica de saneamiento cuya finalidad es la

destrucción de toda forma de vida, aniquilando todos los microorganismos, tanto
patógenos como no patógenos, incluidas sus formas esporuladas, altamente resistentes.
La esterilización supone el nivel más alto de seguridad (y por lo tanto de letalidad, o
eficacia biocida) en la destrucción de microorganismos o de sus formas de resistencia
(3).

El calor húmedo como vapor saturado a presión es el método más seguro y utilizado.
En la esterilización con calor húmedo a la causa de muerte del microorganismo es
distinta de la esterilización con calor seco; en efecto, con calor húmedo el microbio
muere por la coagulación de las proteínas del protoplasma del germen, componente
básico del mismo (2). Sometidos a la acción directa del vapor de agua saturado sin
interposición de ningún obstáculo, todos los gérmenes conocidos, a un los más
resistentes, son absolutamente destruidos al cabo de:

1. 121°C con vapor de agua saturado durante 15 a 2o minutos.

2. 134°C con vapor de agua saturado por 3 a 4 minutos (en ciclos previos)

La esterilización confiable con calor húmedo requiere temperaturas superiores a la de

la ebullición del agua. Estas temperaturas elevadas se alcanzan con más frecuencia
mediante vapor bajo presión en una autoclave.
 Entre los primeros autoclaves con vapor de agua que se usaron, figura el autoclave de
desplazamiento gravitacional o descendente (autoclave de Chamberland). El ciclo
comienza con el ingreso de vapor de agua a la cámara. El aire, que es más pesado,
desciende al fondo de la cámara y sale de la misma, mientras ingresa el vapor a lo alto
de la cámara. La temperatura se suele medir en el sitio de salida para tener la seguridad
de que se ha eliminado el aire de la cámara. Es requisito indispensable que el vapor
llegue a todo el material, sino el método es inútil (2).

Cuanto mayor sea la presión en la autoclave mayor será la temperatura. Por ejemplo,
cuando el vapor que fluye libremente a una temperatura de 100 °C se encuentra a una
presión de 1 atmósfera por encima de la presión a nivel del mar, es decir, 1,05 kg de
presión por centímetro cuadrado (15 libras de presión por pulgada cuadrada, psi), la
temperatura se eleva a 121 °C. El aumento de la presión a 1,40 kg por centímetro
cuadrado (20 psi) aumenta la temperatura a 126 °C (1).

Mientras que el calor seco destruye principalmente por medio de un proceso de

oxidación. Una analogía simple es la carbonización lenta del papel en un horno
calentado, aún cuando la temperatura permanezca por debajo del punto de ignición del
papel. Uno de los métodos más sencillos de esterilización por calor seco es el flameado
(1).

Este método se utiliza muchas veces en el laboratorio de microbiología para esterilizar

asas de siembra y todo lo que hay que hacer para que la esterilización sea eficaz es
calentar el alambre al rojo vivo. Se utiliza un principio similar en la incineradora, una
forma eficaz de esterilizar y desechar recipientes de cartón, bolsas y ropa contaminados.
Otra forma de esterilización por calor seco es la esterilización por aire caliente. Los
objetos que se van a esterilizar con este método se colocan en una estufa en la que el
mantenimiento de una temperatura de alrededor de 170 °C durante cerca de 2 horas
asegura la esterilización. El lapso más prolongado y la temperatura más elevada (en
comparación con el calor húmedo) se necesitan porque el calor en el agua se transfiere
con más rapidez a un cuerpo frío que el calor en el aire (1).

OBJETIVO GENERAL
Conocer el procedimiento y utilidad de los métodos de esterilización del material utilizado
en el laboratorio de microbiología.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
● Realizar la esterilización de material de vidrio por método de calor seco.
● Realizar esterilización de material de vidrio por calor húmedo.
● Realizar esterilización de un medio de cultivo para la prueba de esterilidad por calor húmedo.

MATERIAL
Por estudiante:
 ● Marcador Permanente
● Tijeras

Por equipo:

● *Papel estraza
● *Algodón
● *Gasas
● *Encendedor
● *Cinta masking
● 6 tubos de ensaye para medio de cultivo
● 7 Cajas de Petri
● 6 pipetas de 2.0 ml
● 2 pipetas de 5 ml
● 3 pipetas de 10 ml
● 1 Probeta de 50 ml
● 1 Probeta de 25 ml
● 1 matraz volumétrico de 1000 ml
● 2 Mecheros
● 1 pinza
● 1 gradilla
● Pizeta con agua destilada
● Sanitas

Estudiantes (Por grupo):

● Balanza analítica
● Horno limpio y precalentado a 160º C
● Autoclave a 121º C
● Incubadora a 37º C
● Medio de cultivo (Agar nutritivo)
● Dextran (proporcionado por el profesor)
● Escobillones (proporcionados por el profesor)
● 1 Placa de calentamiento
● 1 Espátula
● 1 Charola para pesar

METODOLOGÍA
1) Lavar la cristalería con jabón (de preferencia usar Dextran). Enjuagar con agua de la llave
y posteriormente con agua destilada.
2) Dejar secar el material de vidrio a temperatura ambiente o en la estufa.
3) Acondicionar horno a 180º C.
4) Envolver con papel estraza todo el material a esterilizar anotando en el papel el número
de piezas, la fecha de preparación, el volumen del instrumental y número de equipo.
5) Preparar tapones de algodón y gasa para matraces y tubos.
 6) Colocar en la boquilla de las pipetas un filtro de algodón con ayuda de las pinzas de punto
roma de manera que el aire pase a través de él.
7) Esterilizar el material de vidrio en horno a temperatura de 180º C durante 1 hora.
8) Esterilizar parte del material en el autoclave durante 15 minutos a 21 libras de presión y
de acuerdo a las instrucciones.
9) Para comprobar la esterilidad del material se preparará un medio de cultivo (agar
nutritivo) el cual se estabilizará en la autoclave.
10) Realizar los cálculos para preparar un volumen correspondiente a 1 caja de Petri por
equipo.
11) Encender los mecheros para esterilizar el área donde se vaciará el medio de cultivo a las
cajas de Petri. Esperar a que solidifique el medio.
12) Incubar las cajas con el medio de cultivo durante 24 horas a 37 ° C.
13) Después de la incubación verificar las cajas y anotar sus observaciones.

Métodos de
esterilización

DIAGRAMA Lavar toda la cristalería con agua (de llave y enjuagar con
agua destilada) y con jabón (de preferencia Dextrán).

Dejar secar a temperatura ambiente.

Envolver el material en papel estraza anotando cantidad, fecha,

volumen y equipo. A las boquillas de los tubos y pipetas se le
pondrá algodón de forma que circule el aire a través de ellos.

Esterilizar el material de vidrio en horno antes precalentado a 180°C

OBSERVACIONES
 Figura 1. Se lavó el material con agua y jabón y
Figura 2. Se puede observar el material de
se dejó secar a temperatura ambiente y
todos los equipos dentro del horno.
posteriormente se terminó de secar en el horno
precalentado a 180 °C.

Figura 4. Una vez cubiertos con el papel

estraza se vuelven a exponer al calor del
horno para la eliminación de
microorganismos.

Figura 5. Es importante no sólo esterilizar el material Figura 6. Se preparan agares nutritivos en

sino también el área y el individuo por lo que se las cajas de Petri ya estériles para realizar
procedió a encender mecheros y con el calor esterilizar medios de cultivo.
ambas cosas.

INVESTIGACIÓN

1. ¿Cuál es el fundamento de la esterilización mediante calor seco y mediante calor húmedo?

¿Qué les sucede a los microorganismos?

Calor seco: La destrucción microbiana se produce por oxidación de los componentes celulares y
desnaturalización de proteínas. Este es un proceso menos eficaz por la ausencia de agua y por lo tanto
deben incrementarse tanto las temperaturas como los tiempos de exposición.
La efectividad del calor como método de esterilización depende de:

● Temperatura
● Tiempo de exposición

(Pérez, Silóniz, Torralba & Vázquez, 2010)

Calor Húmedo: El calor húmedo por medio de utilización de vapor de agua es el agente esterilizante
más frecuentemente utilizado. Este mecanismo destruye eficazmente los microorganismos por
desnaturalización de proteínas y enzimas, y desestabilización de membranas. Estos efectos se deben
principalmente a dos razones:

● El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas (DNA, RNA,
proteínas, etc) son producidas por reacciones que eliminan el agua. Por lo tanto, reacciones
inversas podrían dañar a la célula a causa de la producción de productos tóxicos. Además, las
estructuras secundarias y terciarias de las proteínas se estabilizan mediante uniones puente de
hidrógeno intramoleculares que pueden ser reemplazadas y rotos por el agua a altas
temperaturas.
● El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el
aire. Por lo que, los materiales húmedos conducen el calor mucho más rápidamente que los
materiales secos debido a la energía liberada durante la condensación.

(Pérez, Silóniz, Torralba & Vázquez, 2010); (Ramírez Octavio, 2017)

2. ¿Cuáles son las indicaciones que indica la Organización Mundial de la Salud en los
procesos de esterilización?

1. Todo material resistente al calor e incompatible con humedad debe ser autoclavado. Este es
el principal método en una CE.
2. Todo material resistente al calor e incompatible con la humedad debe ser esterilizado por calor
seco.
3. La esterilización con métodos químicos gaseosos, deberán realizarse en cámaras con ciclos
automatizados que brinden seguridad al usuario y garantía de los procesos.
4. La esterilización con métodos químicos líquidos por inmersión, hecha en forma manual, será
siempre el último método de elección.
5. Estos procesos son difíciles de controlar, con grandes posibilidades de contaminación durante
el enjuague o el secado, y no permiten el almacenado.

3. ¿Qué otros métodos existen para la esterilización en el laboratorio de microbiología?

Filtración: Las aplicaciones de la esterilización por filtración son diversas en el campo de la

microbiología, se puede aplicar para eliminar microorganismos de soluciones, fluidos o gases o para
la esterilización del ambiente de trabajo, en todos los casos los microorganismos no son destruidos
sino que son retenidos físicamente o adsorbidos por los filtros con un tamaño de poro adecuado. El
tamaño de poro que se considera en la actualidad esterilizante es el de 0,22 m aunque más
recientemente se tiende a la utilización de poros de 0.1 m (MELTZER y JORNITZ, 2006 citado en
Pérez, Silóniz, Torralba & Vázquez, 2010).

Radiaciones: Las radiaciones de distinto tipo se utilizan también en microbiología con la finalidad de
la esterilización (LAMBERT y HANSEN, 1998 citado en Pérez, Silóniz, Torralba & Vázquez, 2010).
La más utilizada en el laboratorio de microbiología es la radiación ultravioleta (UV) de una longitud
de onda de unos 260 nm. Aunque suele ser poco eficaz debido a su escaso poder de penetración en
los materiales, tales como vidrio, agua, películas de suciedad, sin embargo, es muy útil para esterilizar
el aire y las superficies. Otras radiaciones, como los rayos gamma, radiaciones electromagnéticas más
penetrantes, por su menor longitud de onda (<0,1 nm), suelen ser más efectivas como agentes
esterilizantes, pero suelen tener menor uso en el laboratorio microbiológico y, sin embargo, un uso
industrial muy extendido.

Esterilizantes gaseosos: Dentro de este apartado incluimos todos aquellos compuestos químicos
que se suelen utilizar como esterilizantes, y que se suelen utilizar en fase gaseosa generalmente. Entre
estos compuestos ya hemos mencionado el óxido de etileno o el formaldehído. Estos suelen utilizarse
para esterilizar materiales sensibles al calor o que no pueden someterse a radiaciones. Sus aplicaciones
suelen darse en la industria farmacéutica o en medicina. El compuesto más utilizado es el óxido de
etileno, que actúa por medio de su actividad alquilante sobre los hidrógenos lábiles en ácidos nucleicos
y otras macromoléculas, activándose. El proceso de esterilización en estos casos suele darse en cámaras
herméticas y suele requerir en general tiempos de exposición largos (30 minutos - 18 horas). Aunque
procesos a temperaturas entre 60- 80ºC pueden disminuir el tiempo de exposición (30 min-6 h)
(BLOCK, 2001 citado en Pérez, Silóniz, Torralba & Vázquez, 2010). Suele ser poco usado en el
trabajo rutinario del laboratorio microbiológico.

DISCUSIÓN

Por los fundamentos de cada método y por las condiciones en las que trabajamos en el laboratorio se
considera que éstos fueron eficientes; con el calor seco se cumplió con las especificaciones del manual
al esterilizar los materiales a 180° por 1 hora y con calor húmedo se aseguró con la cinta testigo de
que alcanzara temperaturas adecuadas para la eliminación de los microorganismos y todas las formas
de resistencia, sin que se produzca ebullición de los medios líquidos

En el caso de laboratorios microbiológicos la importancia es grande y notoria ya que la esterilización

permite eliminar toda clase de seres vivos microscópicos para que el material quede completamente
estéril y al momento de realizar cultivos no se vean contaminados por otras fuentes, por lo que se
podrá tener resultados esperados y estudiar el crecimiento de manera que se pueda aprender y estudiar
más de ello.

Se obtuvieron los resultados esperados a la hora de realizar la práctica porque se aprendió a usar los
equipos de manera correcta. En caso de haber fallado en la realización de la práctica es aconsejable
revisar la metodología y ubicar el paso que no se hizo adecuadamente. Para volver a realizar la práctica
se necesitaría tener en cuenta los siguientes puntos:
 ● Tener el conocimiento del manejo adecuado de la autoclave y el horno.
● Es de suma importancia que tanto los materiales, el área y el individuo estén completamente
ESTERILIZADOS. De lo contrario no serviría sólo esterilizar el material ya que los agares
tendrían agentes microbianos no deseados.
● Al crear los medios de cultivo es indispensable saber la técnica que se llevará a cabo y hacerlo
de manera adecuada.
● Monitorear.

CONCLUSIONES

Al elaborar la esterilización se tiene que tener mucho cuidado a la hora de colocar el material en el
autoclave ya que debe de estar perfectamente cubierto con el papel estraza para que quede totalmente
estéril y libre de microorganismos y esporas. También teníamos que estar regulando el autoclave para
que se desarrollara bien la esterilización. Cuando el material salió del autoclave ya no lo podíamos abrir
en cualquier lugar porque se contaminaría otra vez, es por eso que se preparó un área aséptica para
evitar posibles contactos con microorganismos.

La esterilización debe ser un método seguro, que permita el rápido procesamiento del material
quirúrgico, garantizando su esterilidad en el momento de su entrega. Así mismo, es necesario el
mantenimiento de un ambiente laboral que no afecte a la salud del personal integrante del servicio.

Al llevar a cabo esta práctica en laboratorio, argumentamos que es muy importante saber el uso
adecuado de cada instrumento, las condiciones en que deben estar antes y después de las muestras
cultivos o de cualquier análisis por tomar. Desde el minucioso mechero, matraz, pinzas, placa petri,
tubo y condiciones de temperatura ambiente.

La manera correcta en que se ubicaran los medios de cultivo para su enfriamiento, por lo cual en los
medios sólidos contenidos en los tubos se dejaron inclinados en un determinado tiempo ya que al
momento de su solidificación adoptaron la forma de agar inclinado o técnicamente conocido como
pico de flauta.

Imagen 01: Medios sólidos contenidos en tubo.

REFERENCIAS
Couso, A., & Robilotti, S. (2011). Procesos de esterilización. Buenos Aires, Argentina: CODEINEP.
ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS. (s.f.).
Obtenido de
https://itescam.edu.mx/principal/docentes/formatos/f3051a7c1a20d76b2013aaf7c7bf6fa0.pdf
Esterilización. Procedimientos relacionados. (s.f.). Obtenido de
https://www.mheducation.es/bcv/guide/capitulo/8448164180.pdf

Osorio Óscar, (2016). Métodos de esterilización. Laboratorio de microbiología. Sitio web:

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_M%C3%A9todos
_de_esterilizaci%C3%B3n.pdf

Pérez-Uz, B., Silóniz, M. I., Torralba, B., & Vázquez, C. (2010). Metodología de esterilización en el
laboratorio microbiológico. Reduca (Biología), 3(5), 1- 14.
Ramírez Octavio, (2017). Generalidades de la esterilización. Seminario de esterilización. Sitio web:
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/Seminarioesterilizacion.htm

TORTORA, G. J., FUNKE, B. R., & CASE, C. L. (2007). Introducción a la Microbiología (9na ed.). España:
PANAMERICANA.

PRÁCTICA No. IV PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIÓN
A finales del siglo XIX, Koch entendió la necesidad de utilizar cultivos puros. El segundo de sus
postulados plantea la necesidad de cultivar y aislar los microorganismos de interés en el laboratorio
para estudiarlos. Los microorganismos son demasiado pequeños para ser estudiados como individuos
por lo tanto se manejan como colonias, que son grupos de células idénticas que derivan del mismo
individuo por divisiones sucesivas. La multiplicación de los microorganismos en el laboratorio se logra
en ambientes artificiales especiales denominados medios de cultivo. El medio de cultivo constituye el
aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos y su composición
química o nutricional es muy variada (1).
La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades
nutricionales varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien
en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas
sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer (2).

La composición de los medios de cultivo varía en función del grupo microbiano que se pretende
estudiar, y la preparación del medio depende de la complejidad química (composición), el estado físico
y otras condiciones requeridas (pH, concentración, etc.). Existen medios de cultivo comerciales
empleados para el desarrollo de los microorganismos más comunes, sin embargo en muchas
ocasiones se requiere preparar el mismo mediante la mezcla de sus componentes.

Los medios de cultivo poseen una serie de componentes (3):

1. Indispensables: Entre los primeros se incluye el agua, nutrientes orgánicos (hidratos de carbono,
aminoácidos, vitaminas, etc) y nutrientes inorgánicos (P, Fe, N, Mg, S, etc)
2. Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-agar), tampones, indicador
de pH, etc.
Durante las prácticas se van a manejar medios de cultivo de composición muy variada y de tres tipos
diferentes en cuanto a consistencia: medios sólidos, semisólidos y líquidos. Este último aspecto es
importante a la hora de la preparación de los mismos. Aunque los medios artificiales o sintéticos se
pueden preparar a partir de sus componentes individuales, se pueden adquirir comercialmente como
medios deshidratados a los que solamente hay que añadir la cantidad de agua necesaria. El fabricante
indica la composición, la caducidad, y la cantidad que debe pesarse por cada litro a preparar e incluso
como debe esterilizarse.

Clasificación de medios de cultivo de acuerdo a su composición:

a) Medios nutritivos: son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse
el crecimiento de bacterias que no necesitan requerimientos especiales. El medio más conocido de
este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo.

b) Medios de enriquecimiento: incorporan una serie de factores que resultan indispensables para el
crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros
productos biológicos que aportan dichos factores. Un ejemplo de este tipo es el Agar Chocolate.

c) Medios selectivos: son utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en
una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente
el crecimiento de una población polimicrobiana específica. Un ejemplo de estos medios es el Caldo
Selenito.

d) Medios inhibidores: cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente el
crecimiento de un determinado grupo microbiano, se denomina inhibición de crecimiento. Los medios
inhibidores podrían considerarse como una variante más restrictiva de los medios selectivos. Un
ejemplo de este tipo de medios es el Mac-Conkey.

e) Medios diferenciales: se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayudan a
diferenciar géneros o especies. Algunos ejemplos de este tipo de medios de cultivo son el C.L.E.D.
(lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), entre
otros.

f) Medios de identificación: son los destinados a comprobar alguna cualidad específica que puede
servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios deben poseer los
elementos necesarios para asegurar el crecimiento de microorganismos, el sustrato específico que vaya
a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. Ejemplos de estos medios son el Agar
Kligler y el Simmons.

g) Medios de multiplicación: sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un
microorganismo ya aislado. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo típico de estos
medios.

Medios indicadores.- Están constituidos por un medio base adicionando una sustancia específica que
permite poner de manifiesto una determinada reacción metabólica como la fermentación de un
carbohidrato (caldo lactosa), o la producción de un ácido orgánico, la actividad enzimática del
microorganismo (producción de ureasa) o la asimilación de algún sustrato.

OBJETIVO GENERAL
Conocer la metodología para la preparación de medios de cultivo líquidos y sólidos, así como diferenciar sus
características de acuerdo a su clasificación y utilidad en el aislamiento de los microorganismos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Preparar un medio de cultivo agar nutritivo

• Preparar un medio de cultivo agar Papa-Dextrosa

MATERIAL
Por equipo:

• Material esterilizado en la práctica II

• 2 Mecheros
• *Encendedor
• Asa bacteriológica
• 1 pinza
• 1 gradilla
• 1 Espátula
• Vidrios de reloj
• *Marcador permanente
• *Tijeras
• *Cinta masking
• Pizeta con agua destilada
• *Franela
• *Algodón
• *Gasas
• *Papel estraza
 Por grupo:

• Balanza analítica
• Autoclave
• 2 placas de calentamiento
• 4 matraces Erlenmeyer de 250 ml
• 3 tapones de algodón y gasa para los matraces

METODOLOGÍA
• Realizar una previa investigación sobre la utilidad de los medios de cultivo que se almacenan en
el laboratorio.
• Realizar los cálculos para la preparación de los medios de cultivo y preparar el volumen de
medio de cultivo necesario según el número de tubos y cajas de Petri, de acuerdo a las
indicaciones del profesor.
• Esterilizar los medios de cultivo en la autoclave durante 15 minutos a 21 libras de presión según
procedimiento indicado.
• En medio estéril (encender mecheros previamente) vaciar el medio de cultivo en cada tubo y
cajas de Petri previamente etiquetados. Dejar que solidifiquen y almacenar con la tapa invertida
en incubadora a 8º C.
• Para comprobar la esterilidad de los medios, incubar todos los tubos y cajas con el medio de
cultivo indicado en la incubadora durante 24 horas a 37º C. Al término de este tiempo, revisar
cuidadosamente el material y observar que no haya desarrollo microbiano en los blancos.

DIAGRAMA
OBSERVACIONES

Se colocaron las medidas o proporciones que se trabajaron, el resultado depende del volumen de las
pipetas y lo que se indicaba en los contenedores de los medios de cultivo.

Se utilizaron algunos de los materiales que fueron previamente esterilizados en la práctica anterior.

Se colocó al medio de cultivo un tapón hecho de gasas y algodón, para evitar pérdidas de propiedades
del medio.

Se ingresaron los cultivos preparados en matraces a la autoclave durante 15 minutos, mientras se

colocaron los materiales en orden.

Se esperó el tiempo indicado para la extracción de los materiales y los medios de cultivo.

Se colocó al medio de cultivo un tapón hecho de gasas y algodón, para evitar pérdidas de propiedades
del medio.
Rápidamente se pipeteo y se colocó el medio de cultivo en los tubos de ensayo y en las cajas Petri
indicadas previamente rotuladas con el tipo de medio indicado, tratando de mantener un margen de
error pequeño en cuanto al volumen de cada caja y cada tubo.

Se movió la caja petri en forma de ocho para homogeneizar y se dejó reposar los medios para obtener
la solidificación esperada, mientras que el caldo únicamente quedó vertical después de colocarle el
tapón.

Se recomienda mantener el orden en el lugar de trabajo para evitar la contaminación del mismo ya que
para este tipo de práctica se requiere mantener con mecheros encendidos todo el tiempo y sin la
entrada o salida de compañeros.

INVESTIGACIÓN

1. Complete la tabla con la información de cada uno de los medios de cultivo que se encuentran
en el laboratorio de Ingeniería Ambiental: Colocar referencias.

Nombre del Formulación Tipo de medio de Microorganismos Referencia

medio de cultivo cultivo según que crecen en este consultante
clasificación medio

Agar Nutritivo Peptona 5 g Sólido y Simple -Pseudomonas https://www.brita

Extracto de carne aeruginosa nialab.com/back/p
3g ATCC 27853 ublic/upload/prod
Agar 15 g uctos/upl_6070764
pH 6.8 ± 0.2 a -Shigella flexneri 1dee11.pdf
25°.
 -Staphylococcus
aureus
ATCC 25923

Escherichia coli
ATCC 25922

Enterococcus faecalis
ATCC 29212

Caldo Nutritivo Peptona de Sólido y Simple Streptococcus https://webcache.g

gelatina 5 g, pyogenes ATCC oogleusercontent.c
Extracto de carne 12344 om/search?q=cach
3g, e:Kem_WzkWPzU
PH 6.9 ± 0.2 a 25° Enterobacter J:https://www.brita
aerogenes ATCC nialab.com/back/p
13048 ublic/upload/prod
uctos/upl_6070769
Staphylococcus bd7fef.pdf+&cd=1
epidermidis ATCC 3&hl=es&ct=clnk
14990 &gl=mx

Escherichia coli
ATCC 25922

Salmonella typhi
ATCC 6539

1. De acuerdo a los medios de cultivo que se prepararon en esta práctica ¿qué tipo de
microorganismos esperas que puedan crecer en cada uno de ellos?

Del agar nutritivo serían Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Enterococcus faecalis.

Del caldo nutritivo serían Streptococcus pyogenes, Enterobacter aerogenes, Staphylococcus epidermidis, Escherichia
coli, Salmonella typhi

2. Indica 3 ejemplos de medios de cultivo clasificados como selectivos y para qué tipos
de microorganismos se han formulado.

El agar MacConkey contiene cristal violeta, que inhibe el crecimiento de bacterias grampositivas
y hongos, facilitando el desarrollo de bacterias gram negativas.

Agar sangre Campy y caldo tioglicolato para Campylobacter. Son medios selectivos para especies
de campilobacterias.

Medio Lowenstein-Jensen. Es un medio selectivo que se utiliza para el cultivo de especies de micobacterias
(Mycobacterium spp.) como Mycobacterium tuberculosis.
3. Indica 3 ejemplos de medios de cultivo diferenciales y para qué tipo de
microorganismos se han formulado.

Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos). Es un medio diferencial recomendado

para el análisis bacteriológico de orina ya que en él crecen profusamente la gran mayoría de
las bacterias, tanto Gram negativas como Gram positivas, que provocan infecciones urinarias,
pudiéndo diferenciar o identificar sus respectivas colonias.

Agar Hektoen entérico (HE). Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento y

diferenciación de especies del género Salmonella y Shigella. Entre otros componentes, tiene
sales biliares y colorantes como fucsina ácida y azul de bromotimol. Estos retrasan el
crecimiento de otras bacterias, favoreciendo el desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

Agar MacConkey. Es un medio diferencial y selectivo muy utilizado para el aislamiento e

identificación de enterobacterias (bacilos gramnegativos). Llevan en su composición sales
biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento de grampositivos y hongos. Contienen
también lactosa y rojo neutro como indicador de pH. Las bacterias fermentadoras de lactosa
(lactosa+) acidifican el medio y adquieren un color rosado (por ejemplo, E. coli), mientras que
las no fermentadoras de lactosa (lactosa–) aparecen incoloras (por ejemplo, Salmonella).

4. Indica 3 ejemplos de medios de cultivos de medios enriquecidos y para qué tipos de

microorganismos se han formulado.

Agar sangre columbia CNA. Es un medio rico en nutrientes con un 5% de sangre de carnero.
Las siglas CNA son las de dos antibióticos de su composición (colistina y ácido nalidíxico)
que inhiben el crecimiento de la mayoría de bacterias gramnegativas. Esto permite el
crecimiento selectivo de cocos grampositivos.

Agar chocolate. Es un medio enriquecido muy parecido al agar sangre; la diferencia es que los
glóbulos rojos están lisados y liberan al medio nutrientes como la hemoglobina, factor X
(hemina) y factor V (NAD). La lisis se produce cuando se añade el agar base fundido a la
sangre. La hemólisis le confiere un color marrón característico parecido al del chocolate, de
ahí su nombre. Se utiliza para el cultivo de bacterias exigentes que necesitan estos factores
para su desarrollo, como es el caso de Neisseria gonorrhoeae (agente causal de la gonorrea) y
varias especies del género Haemophilus.

Medio BCYE, de enriquecimiento para especies de Legionella (Legionella spp.).

5. Además de la importancia que brindan los nutrientes al medio de cultivo ¿Cuáles son
los factores que brindan las condiciones necesarias para el crecimiento bacteriano en
el medio de cultivo? (pH, temperatura, presión osmótica, oxígeno, etc.)

Los requisitos para el crecimiento microbiano incluyen factores físicos y químicos, entre los
factores físicos tenemos la temperatura, PH, presión osmótica, etc. Los factores químicos
necesarios para el crecimiento de bacterias son diversos elementos constitutivos de las células.

Requisitos físicos:
 Temperatura (termófilos, mesofilos, sicrofilos), PH (6.5 – 7.5) y presión osmótica. (Tortora,
G.S, 2007).

Requisitos químicos:

Carbono, nitrógeno, azufre y fósforo; hierro, cobre, zinc y oxígeno y otros factores orgánicos
de crecimiento tales como vitaminas, aminoácidos, purinas, etc. (Tortora, G.S, 2007).

DISCUSIÓN

Con esta práctica se pretende aprender las técnicas de preparación de medios de cultivo, su
esterilización y su almacenaje, así como la importancia de los medios de cultivo y su uso además
también se pretende que el alumno se familiarice con las técnicas empleadas en microbiología para el
cultivo y la manipulación de microorganismos en condiciones de esterilidad.

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que

crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos "puesto que la diversidad
metabólica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy
grande. La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso
hidratar. La preparación de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de medio y
se disolver en agua destilada libre de inhibidores del crecimiento y siguiendo las instrucciones del
fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los
componentes previamente esterilizados en la autoclave. En términos microbiológicos se entiende por
siembra el proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos
(inóculo) de un cultivo bacteriano a un medio nutritivo para su crecimiento.

Cada medio de cultivo tiene sus particularidades y sus detalles, es recomendable seguir las instrucciones
en el orden indicado y evitar saltarse pasos para poder así obtener un medio óptimo y adecuado.

Se debe tener un cuidado especial en la preparación de así como al tomarlo después de la autoclave ya
que este se encuentra a una temperatura elevada y así evitar accidentes, de la misma manera se requiere
tener un espacio estéril ( Uso de mecheros).

En la práctica se pudo observar a detalle el procedimiento adecuado para la realización de los medios
de cultivo a analizar (Agar Nutritivo y Caldo Nutritivo), en el cual se llevó a cabo cada indicación
dada por la maestra para tener así un medio de cultivo apto de la siembra de los microorganismos a
analizar, se observó que el procedimiento es tardado ya que el lugar de trabajo debe estar estéril y debe
mantenerse cerrado todo el tiempo, para la práctica se utilizó 8 tubos de Agar Nutritivo y Caldo
Nutritivo, para cada tubo se determinó la cantidad de 10 ml.

CONCLUSIONES

Los medios de cultivo son sustancias adecuadas para el estudio de los microorganismos ya que proveen
los sustratos adecuados para que se desarrollen y se puedan analizar sus características bioquímicas de
forma fácil, además, al existir diferentes medios de cultivos con cualidades especializadas, se pueden
usar en diferentes ocasiones, dependiendo del tipo de bacteria, el tipo de estudio o las condiciones que
se quieren desarrollar para el análisis. En esta práctica fue muy importante conocer los cuidados que
se deben de llevar a cabo para la preparación, ya que de no ser llevada a cabo de forma correcta puede
afectar la composición del medio de cultivo y ocasionar problemas durante los análisis de los
microorganismos

Es importante recalcar que cada medio de cultivo tiene una preparación diferente de acuerdo a las
condiciones de su composición, agar nutritivo y sangre son los dos grupos representativos, y de
acuerdo a este trato el medio de cultivo cumplirá con su función; también es conveniente cuidar
demasiado la temperatura, ya que de lo contrario en el agar podrían caramelizar los azúcares y perder
proteínas, así como repetir la práctica. Mantener con vida al medio de cultivo también requiere
controlar condiciones de pH, puesto que, para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio
de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y
presión de oxígeno, adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de
cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.

Con el conocimiento adquirido se pudo entender que un medio de cultivo es un sustrato o una
solución de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de
laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en
las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias. Los microorganismos son
los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y
tensión de oxígeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos
más importantes para su desarrollo están el carbono, el oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono e
hidrógeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento
específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros.

REFERENCIAS
Cuevas, L. B. (s.f.). Microbiología clinica. Obtenido de
https://www.sintesis.com/data/indices/9788490773185.pdf
P., N. M. (2021). MICROBIOLOGÍA TECNOLOGÍA SUPERIOR EN AGROECOLOGÍA. México:
Instituto Superior Tecnológico. Obtenido de
http://instipp.edu.ec/instipp/assets/pdf/guias/manuel/s4_microbiologia.pdf
Salinas, M. B., Moreno, S. P., Ramírez, J. G., Alanís, J. C., & Borgne, S. L. (2016). MANUAL DE
PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA BÁSICA. Cujimalpa. Obtenido de
http://www.cua.uam.mx/pdfs/conoce/libroselec/23Manual%20de%20microbiologia_09diciembre2
016.pdf