Universidad Nacional de Luján

Toxicología de Alimentos

Trabajo Final Integrador

Glifosato en Agua

Integrantes:
Ayerbe, Maria Sol
Pighin, Alan
Tornatore, Romina
Uribarri, Maria Agustina

Fecha:
Entrega final: 23-Jun-2021
Introducción:

El glifosato es un herbicida que se utiliza para eliminar hierbas y arbustos. Su

estructura química es la siguiente:

Dado que tiene compuestos polares, es una molécula hidrofílica, que puede
disolverse en agua rápidamente. Es un polvo cristalino blanco, incoloro.

Este compuesto inhibe la enzima que sintetiza los aminoácidos fenilalanina,

tirosina y triptófano, lo que produce que la planta se muera. Los cultivos modificados
genéticamente resisten al glifosato, por este motivo se utiliza para eliminar competencia
en los cultivos, por ejemplo, de soja. Otros usos en la agricultura son: Desecante en la
caña de azúcar, eliminación de malezas en vía pública, etc. Para dichas aplicaciones se
suele usar entre 25 y 50 cc cada 100 Litros de Agua.

Algunos de los nombres comerciales del Glifosato son: Aquaneat, Aquamaster,

Rodeo, Roundup, Genesis Extra, Razor Pro, Buccaneer. En estas formulaciones, el
glifosato se encuentra junto con otros componentes, como por ejemplo surfactantes, otros
herbicidas, etc.

La Organización Mundial de la Salud y la EPA lo clasificaron como “de baja

toxicidad” en 1993, y en el 2015 la Organización Mundial de la Salud lo declaro como “un
probable carcinógeno para los seres humanos”, y lo clasificó en el Grupo 2A. Dado que
todavía no se encuentra demostrado que el compuesto sea cancerígeno, existe mucha
controversia en su uso. Además, existen denuncias y juicios contra las empresas que
fabrican y comercializan el glifosato. Por ejemplo, en Estados Unidos, La firma “Bayer” se
vio implicada varios juicios y tuvo que pagar 40 millones de dólares por haber escondido
los riesgos del glifosato, por publicidad engañosa en sus herbicidas.

Sin embargo, dado que no está demostrado que sea un compuesto carcinógeno,
en muchos lugares se sigue utilizando, y no se encuentra prohibido. Por ejemplo en
Argentina es uno de los herbicidas más utilizados. Decimos que es un compuesto
controversial porque gran parte de la sociedad reclama la prohibición de su uso, y otra
parte niega que el compuesto sea dañino para los seres vivos o medio ambiente.

Toxicocinética:

El mecanismo de acción de este herbicida en las personas es por el desacople de

la fosforilación oxidativa. Se estima que se absorbe entre el 30 y el 36% del químico a
nivel de tubo digestivo, pero posee una baja absorción por vía cutánea. Una vez
absorbido se distribuye por todo el cuerpo, depositándose mayoritariamente en los
huesos. De lo absorbido, el 15-29% se excreta por la orina, el 2% por el aire respirado y el
70% por las heces.

Otras vías de ingreso son los ojos y la vía respiratoria. Estos casos se dan
especialmente en trabajadores que manipulan la sustancia.
 La mayor parte del glifosato es eliminado del organismo sin sufrir un proceso de
biotransformación. Su único metabolito es el ácido amino‐metil‐fosfónico (AMPA), con una
vida media de dos días, aproximadamente.

Toxicodinámia:

El glifosato que entra en contacto con la piel, los ojos o las vías respiratorias
puede generar irritación.

El glifosato que es ingerido vía oral produce una intoxicación aguda y puede
generar un aumento en la producción de saliva, quemaduras en la boca y la garganta,
náuseas, vómitos, diarrea, dificultad respiratoria, entre otras.

Los efectos de la intoxicación crónica están en discusión y, como mencionamos

anteriormente, son controversiales. Sin embargo, cada vez son más los estudios que
indican que el glifosato causa daño al ADN y a los cromosomas de las células humanas, y
puede afectar el sistema nervioso por inhibir la expresión de las proteínas neuronales. Un
caso de estudio muy interesante es el de un hombre que mostró en sus propios análisis
de orina la presencia de 1 µg por litro de orina de glifosato. Esto demuestra que
consumimos agua y alimentos contaminados con el pesticida continuamente, tema que
desarrollaremos a continuación.

¿Cómo llega al agua?:

El glifosato no llega fácilmente al agua subterránea ya que posee una fuerte

afinidad al suelo donde puede permanecer hasta 6 meses (dependiendo el clima y el tipo
de suelo) hasta que es consumido por las bacterias. Sin embargo, el mismo puede ser
transportado hacia las capas profundas del suelo por macroporos, o a través de cursos
superficiales de agua.

Está demostrado que este compuesto puede desplazarse con el viento y la lluvia,
por lo que los cursos de agua superficiales, como por ejemplo ríos, pueden contaminarse
rápidamente. Además, el glifosato no desaparece con facilidad del campo, como
mencionamos anteriormente puede persistir hasta 6 meses hasta su descomposición.

Un estudio sobre hojas muertas indica que la mitad del glifosato se desintegra a
los 8 o 9 días de la aplicación. Sin embargo, en otro trabajo de investigación realizado* se
estimó que existe un incremento de 1 mg de glifosato por kilo de suelo cada 5 veces que
se pulveriza el herbicida.

Dadas las características del herbicida la forma de llegar al alimento o al agua es

no respetando el tiempo correspondiente desde la aplicación a la cosecha (Tiempo de
Carencia). Un estudio indica que la zanahoria o la lechuga pueden absorber parte del
glifosato del suelo.

En Argentina, el glifosato es el herbicida de mayor volumen empleado, asociado

al uso casi exclusivo de variedades transgénicas de soja (32 millones de ha/año) y a los
tratamientos para barbecho en siembra directa. Esto implica que se puede contaminar el
agua y posteriormente los alimentos con glifosato. Por ejemplo, un estudio realizado**
mostró que en Monte Maíz Córdoba, fue detectado glifosato en: agua de bebida, polvo de
salas de juegos de niños, y cáscaras de granos.
 En Entre Ríos, se llevó a cabo una red de monitoreo para detectar la presencia de
glifosato en cursos de agua cercanos a lotes agrícolas. Se muestrearon 300 puntos en 3
momentos del año (uno al comienzo de la cosecha, otro a la salida del invierno, y otro
alrededor de la siembra). Se encuentran concentraciones muy altas de glifosato en 2
puntos de esos 300, y están asociados a un curso de agua lindero a tratamiento de
envases. La época de mayor presencia es el invierno, porque la baja temperatura
disminuye la degradación de glifosato. Además las lluvias arrastran el sobrante del
glifosato. Por otro lado, el mono cultivo de soja deteriora el suelo y favorece el
escurrimiento al no tener rotación de cultivo. De esta forma se arrastran nutrientes y
químicos utilizados en el campo hacia las aguas superficiales y profundas. Para minimizar
el impacto del glifosato hay que hacer rotación de cultivos, monitorear el suelo y
sistematizar los lotes.

Implicancia de su presencia en alimentos:

Los agroquímicos utilizados en la actividad agropecuaria pueden generar

contaminación ambiental, siendo el agua uno de los principales componentes susceptibles
de ser contaminado. Hay dos aspectos que ponen en riesgo la calidad de las aguas
debido al uso agrícola:

1) El aporte difuso de las fugas de agroquímicos desde agrosistemas por lixiviación,

deriva o escurrimiento.
2) El aporte puntual debido a malas prácticas agrícolas, como lavado de equipos
pulverizadores en arroyos o disposición de envases.

Por el momento no se tiene suficiente información sobre el efecto generado en el

ecosistema tanto acuífero como terrestre. Esto se debe a que los costos de análisis de
laboratorio son muy elevados, y no es fácil su monitoreo. Sin embargo hay varios estudios
sobre su toxicidad en anfibios donde se demuestra que los mismos se ven afectados con
dosis inferiores a las utilizadas en agricultura.

La implicancia en los alimentos es que los mismos son ingeridos por seres
humanos, a los cuales puede llegar el químico, generando un grave problema para la
salud de las personas. Los cultivos donde más se utiliza el glifosato son: Maíz, sorgo,
canola, alfalfa, algodón y trigo.

Los síntomas que se pueden presentar por intoxicación con glifosato incluyen:
Cólicos abdominales, vómitos, dificultad respiratoria, entre otros. Los síntomas digestivos
comienzan a los pocos minutos de haber ingerido el tóxico. El tratamiento es solamente
sintomático, ya que no se tiene un antídoto para el glifosato, es decir que se tratan los
síntomas ocasionados por la intoxicación mientras se espera que el organismo elimine el
tóxico.

El glifosato también puede ingresar vía cutánea si se encuentra en frutas o

verduras que se encontraban contaminadas y no fueron higienizadas correctamente. En
este caso los síntomas son algo menores, como por ejemplo irritación, ardor, salpullido,
etc.

El panorama puede empeorar, si luego de haber tocado el tóxico, el mismo es

ingerido por ejemplo si no hubo limpieza de manos, superficies, utensilios, etc.
 Dado que el glifosato puede ocasionar intoxicaciones alimentarias, es sumamente
necesario que el agua que se utilice en la manipulación y producción de alimentos no lo
contenga. Si se sospecha que el agua pudiera estar contaminada, es necesario realizar
un monitoreo eficiente tanto al agua como al producto final para asegurar su inocuidad.

Reglamentaciones vigentes:

En Argentina, para el SENASA, el herbicida cumple con todas las normativas, por
lo que a Nivel Nacional el glifosato no se encuentra prohibido. Según la Resolución
350/99 del SENASA, el glifosato en su uso normal está dentro del grupo de activos de
improbable riesgo agudo.

No hay acuerdo en el mundo ni en Argentina sobre cuáles son los límites en las
fumigaciones terrestres o utilización del glifosato. Según la Resolución 350/99 del
SENASA, se autoriza y rotula al glifosato según parámetros internacionales –FAO y OMS-
como de improbable riesgo agudo, de baja toxicidad, no siendo genotóxico, cancerígeno y
neurotóxico. Sin embargo, hay países que lo prohíben. En Argentina existen leyes
provinciales o municipales que limitan el uso del glifosato, por ejemplo en la provincia de
Misiones se encuentra prohibido el uso de glifosato, sus componentes o afines en los
centros urbanos del territorio de la provincia (Art 1 de la Ley 124).

En la CAA, el Art. 982 establece que el agua potable debe encontrarse libre de
cualquier tipo de sustancias orgánicas. En el Art 985 se establece únicamente que el agua
mineral debe tener ausencia de pesticidas, sin hacer referencia específicamente al
glifosato.

Para las plantas elaboradoras de alimentos, el SENASA no establece un límite de

pesticidas ni de glifosatos en el agua, sino que se establecen límites para los productos
finales elaborados en los establecimientos y para los cultivos.

Para la EPA (Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos), el nivel de

concentración máximo se fijó en 0,7 ppm porque se cree que con los recursos y
tecnologías actuales, este es el nivel máximo que se puede remover el contaminante del
agua potable. El glifosato está clasificado por la EPA como clase E (evidencia de no
carcinogénesis en humanos). Exposiciones continuadas a residuos en aguas en
concentraciones superiores a 0,7mg/l pueden causar efectos negativos en seres
humanos.

En Europa, se encuentra prohibido para el uso no profesional (privado en huertas,

jardines y uso doméstico), en parques públicos y patios de recreo, y también está
prohibido en el uso agrícola cuando sean aplicables métodos sostenibles de control de
malezas. En el 2017 se votó para su total prohibición, pero se otorgó un plazo de 5 años
(hasta el 2022) para adecuarse. Por lo tanto, por el momento se permite el uso profesional
en los cultivos, pero es una situación que se encuentra en discusión abierta.

Métodos de detección y cuantificación:

El glifosato puede cuantificarse a través de técnicas ELISA y también a través de

la técnica UHPLC-MS/MS (Sistema de Ultra alta presión por espectrometría de masa).
Estas dos técnicas se detallarán en la sección siguiente “Protocolos de análisis” y sirven
para conocer la cantidad exacta de glifosato que la muestra posee.
 El glifosato es un compuesto poco volátil y muy hidrófilo, para realizar la
cuantificación en agua se desarrolla un proceso de extracción, concentración y
posteriormente análisis de la muestra.

El método del ELISA se basa en la interacción del glifosato con un anticuerpo.

Este método se caracteriza por ser específico, simple, de bajo costo, sensible y selectivo

Dado que los métodos mencionados son muy laboriosos y requieren

equipamiento sofisticado, se buscan métodos de detección rápidos, ensayos cualitativos
que indiquen presencia/ausencia. La ventaja de los métodos rápidos es que se puede
monitorear el agua o alimentos constantemente y obtener resultados confiables en
tiempos cortos. A continuación detallaremos algunos métodos rápidos para la detección
de glifosato:

- Glifotest: Desarrollado por estudiantes de la facultad de agronomía de la UBA.

Detecta glifosato en muestras de agua, suelo y alimentos de manera rápida,
efectiva y económica (sin la necesidad de equipos costosos y complejos). Este test
consiste en una bacteria modificada genéticamente, fijada en una cinta de plástico.
Al poner una ota de agua o de una solución que posee la muestra de suelo o
alimento que se quiere analizar sobre la cinta reactiva, la bacteria se hidrata y se
tiñe de color azul intenso si es positivo (si hay presencia de glifosato).

- SIAFA NY-1D – Medidor de Pesticidas: Dado que los plaguicidas inhiben la

hidrólisis de la cetilcolina catalizada por la enzima colinesteasa, este kit mide el
grado de inhibición de esa reacción. Cuanto más inhibida se encuentre, mayor
cantidad de glifosato habrá (más del 50% de inhibición indica que el residuo de
glifosato es importante y necesita ser analizado cuantitativamente en el
laboratorio). Puede utilizarse en productos agrícolas, alimentos, o agua. La muestra
se coloca en un dispositivo electrónico, que indica directamente en una pantalla
digital el resultado de la prueba (Ver imagen 1). Ventaja: Es fácil de transportar y la
detección puede realizarse in situ en el lugar de toma de muestra.

Imagen 1: Medidor de pesticidas de SIAFA

- Glyphosate, Dipstick, 5-test: La prueba se basa en el reconocimiento del glifosato

por anticuerpos específicos. Se produce una reacción anticuerpo-antígeno
formando una línea visible en el área de prueba. La formación de dos líneas
 visibles de intensidad similar indica un resultado negativo (ausencia de glifosato).
Si el glifosato se encuentra presente, compite en el área de prueba por los sitios de
unión del anticuerpo, y si hay cantidad suficiente llenará todos los sitios de unión
disponibles, evitando la unión del anticuerpo marcado, por lo que no se verá la
segunda línea coloreada. El límite de detección es 2,5 ppb. Si es necesario, luego
de la detección se puede cuantificar por los métodos convencionales. Sirve para
detección en agua y alimentos (en algunos alimentos como miel o cereales se
necesita una extracción previa).

- Glyphosate, ELISA, 96 test (Ver imagen 2): El kit cuenta con la posibilidad de hacer
96 testeos. Se puede utilizar en agua, bebidas y alimentos. La prueba consiste en
un ELISA competitivo basado en el reconocimiento del glifosato por anticuerpos. La
muestra a analizar se deriva y luego se agrega a los pocillos, donde se agregará el
anticuerpo. Se deja incubar 30 minutos. Luego se agrega el conjugado de enzima
de glifosato (que produce una reacción competitiva) y se deja incubar 60 minutos.
Finalmente se lava y se agrega una solución que genera una señal de color. Se
mide la absorbancia a 450nm utilizando un lector ELISA de microplaca. La
intensidad del color azul es inversamente proporcional a la concentración de
glifosato en la muestra. El límite de detección es 0,05 ppb.

Imagen 2: Kit Gyphosate ELISA

Protocolos de análisis de los métodos cuantitativos:

Recolección de muestra
- Tome un recipiente de PVC color ámbar de 200 ml y lávelo con HCl (pH 2) y
posteriormente enjuague con agua de-ionizada.
- Para colectar las muestras lave 2 veces dicho recipiente con el agua a muestrear.
- La muestra se almacena en la oscuridad y a -20ªC.

Determinación de la concentración de glifosato en agua por método ELISA

- El analito derivado se pre-incuba con el anticuerpo específico para glifosato
- Agregue 200 µL de solución de ensayo a 50 µL de muestra y 20 µL de reactivo de
derivación para realizar la derivación.
- Mezcle e incube a temperatura ambiente durante 10 min.
- Decante las solución
- Adicione la solución (azul/celeste) que contiene el sustrato enzimático y el reactivo
cromógeno incubados 20 min.
- Un producto coloreado (amarillo) indica la presencia de glifosato debido a el
marcado con la enzima unida al anticuerpo antiglifosato.
- Incube 20 min, la reacción es detenida con una solución para ese fin.
- Mida la absorbancia a (450 nm). Esta es inversamente proporcional a la
concentración de glifosato.
 - Arme las curvas de calibración con 4 soluciones patrones de concentración 0.075,
0.2, 1 y 4 µg/L, por triplicado.

NOTA: También se utiliza una solución de calidad analítica (0.5 µg/L), empleada como
testigo interno de las soluciones patrón.

- Calcule la regresión lineal para determinar la existencia de relación entre los

valores de absorbancia y las concentraciones de glifosato en las muestras de
agua.

Determinación de la concentración de glifosato por la técnica de UHPLC-MS/MS:

- Utilice un volumen de muestra de 3 mL,
- Homogeinice la solución
- Filtre con un filtro de membrana de celulosa de 0.45 µm.
- Coloque las muestras en tubos de centrífuga de teflón de 15 mL de capacidad,
agregue ácido clorhídrico 6 M a pH 1.
- Marque las muestras con glifosato marcado como patrón interno y neutralice a pH
7 con hidróxido de potasio 6 M.
- Haga reaccionar durante toda la noche (12 h) a temperatura ambiente (22 ºC),
- Inactive el paso de derivación con ácido fórmico (AF) a pH 3.
- Filtre con un filtro de celulosa de 0.45 µm, el extracto derivado y coloquelo en un
cartucho Oasis HLB (200 mg, Waters, Milford, MA, EUA).
- Acondicione los cartuchos con 5 mL de MeOH seguido por 5 mL de AF al 0.1 %
(v/v).
- Eluya el analito del cartucho con 9 mL de MeOH.
- Evapore y eluya la alícuota alcohólica con la fase móvil H2O/MeCN (98:2 + 0.1 %
AF).
- Filtre con jeringa de nylon de 0.2 µm e inyecte los filtrados para su análisis.
- Realice el análisis por UHPLC-MS/MS:
• Utilice alícuotas de 10 µL del patrón
• Fase móvil: H2O/MeCN (98:2 + 0.1 % AF, denominada A1) y MeCN
(0.1 % AF, denominada B1),
• Gradiente de tiempo de ejecución de 10 min.

- Arme curvas de calibrado con estándares en los siguientes niveles de

concentración: 0.1, 0.5, 1, 10, 100 y 500 µg/L para realizar el análisis cuantitativo

Conclusiones:

En el presente trabajo se hace un breve análisis del glifosato, su aplicación, la vía

a la que puede llegar a los alimentos, y los posibles efectos en la salud de los
consumidores. Por otra parte, se presentan métodos de detección y cuantificación en
agua.

Según el análisis de los estudios investigados, es factible la implementación de la

técnica ELISA en programas de monitoreo de la calidad del agua. Este método puede ser
utilizado para cuantificar, o también puede usarse su principio de detección en un kit de
detección rápida para determinar de forma cualitativa la presencia o ausencia del glifosato
rápidamente. Los kits rápidos de detección otorgan una gran ventaja a la hora de la toma
de decisión de uso del agua, y monitoreo continuo de la misma. En caso que se encuentre
presencia de glifosato por detección del método rápido, es necesario realizar un ensayo
cuantitativo para saber la concentración exacta del pesticida presente.
Bibliografìa:

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