I.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN INFECŢIILE CU VIRUSURILE GRIPALE

- familiei Orthomixoviridae, afinitate predilectă pentru mucoproteine
- Se descriu 3 tipuri de virusuri gripale: A, B şi C.
a. RECOLTAREA ŞI PRELUCRAREA PRODUSELOR PATOLOGICE
 Se va realiza cât mai precoce de la debutul bolii. Primele 48h !!!; greu de izolat dupa 4 zile
 secreţia nazofaringiană se recoltează prin spălătura nazofaringiană sau cu tamponul pentru
exudate;
 secreţia traheobronşică se recoltează prin aspirat bronşic
 sângele pentru evidenţierea seroconversiei (se recoltează două probe de ser, una la
începutul bolii şi alta în convalescentă, urmând a se compara în dinamică titrul de anticorpi)
 Transportul probelor - maximum 3 ore
 Conservarea probelor-70oC.
b. IZOLARE
c. TITRAREA VIRUSULUI IZOLAT
Se face prin realizarea de diluţii binare, punând în contact virusul izolat în lichidul amniotic
sau alantoidian cu eritrocite de cocoş. Titrul hemaglutinant este dat de diluţia cea mai mare
de virus unde s-a produs o hemaglutinare completă. Titrul se exprimă în unităţi
hemaglutinante (UH).
d. IDENTIFICAREA VIRUSULUI IZOLAT
Reacţiile utilizate în vederea identificării serologice a virusurilor gripale sunt:
imunofluorescenţa, reacţia de inhibare a hemaglutinării, dubla imunodifuzie în gel.

 Imunofluorescenţa directă - detectarea antigenelor virale prin folosirea de anticorpi

specifici marcaţi cu substanţă fluorescentă. Secreţiile nazofaringiene se centrifughează,
iar sedimentul rămas după îndepartarea supernatantului se etalează pe lama de studiu, se
acoperă cu un amestec de anticorpi monoclonali (anti-gripal tip A, anti-gripal tip B, eventual,
anti-paragripal tip 1, 2, 3, anti-Adenovirus) marcaţi cu fluoresceină, care se fixează pe celulele
infectate şi care la microscopul în U.V. vor apare fluorescente.

II. DIAGNOSTICUL SEROLOGIC IN GRIPA PRIN REACTIA HAI

Se bazează pe evidenţierea creşterii în dinamică a titrului de anticorpi într-un ser de bolnav recoltat în
faza precoce a infecţiei virale (până la maximum 4 zile de la debutul simptomelor) şi un ser de la
acelaşi bolnav recoltat în faza de convalescenţă, 15 zile mai târziu. Perechea de seruri se analizează
concomitent.

 Reacţia de inhibare a hemaglutinării

- cea mai utilizată metodă pentru diagnosticul serologic uzual,
- folosind ser de testat şi antigene standard de tip sau subtip pentru determinarea
prezenţei în serul de bolnav a anticorpilor faţă de un virus hemaglutinant si urmărirea
titrului în dinamică.
- Principiu: în urma punerii în contact a serului de bolnav cu antigenul viral standard şi cu
suspensia de hematii indicatoare, în prezenţa anticorpilor specifici, virusul îşi pierde
capacitatea hemaglutinantă.
- Se citeşte titrul anticorpilor hemaglutinoinhibanţi în ambele seruri recoltate de la
bolnav: cea mai înaltă diluţie a serului la care se mai constată inhibarea hemaglutinării.
Creşterea în dinamică de cel puţin 4 ori a titrului anticorpilor (la nevaccinaţi) pune un
diagnostic cert de gripă.
III. DIAGNOSTICUL SEROLOGIC IN POLIOMIELITA PRIN SERONEUTRALIZARE

Se bazează pe reacţia de seroneutralizare.

Principiu - în prezenţa unui ser de referinţă corespunzător tipului de enterovirus izolat, efectul
virus-specific la gazda sensibilă nu mai apare, datorită neutralizării specifice a virusului. În reacţie
intervin, deci, 2 factori: serul de refeinţă şi virusul izolat.

- Serul de referintă este specific de tip - antipoliomielitic Se livrează de către Institutul

Cantacuzino seturi de seruri de referinţă, preparate cu tulpini virale standard, pe iepure. Acestea
se vor dilua în mediu de întreţinere.

- Virusul izolat este reprezentat de proba de la primul pasaj în cultura celulară sau la şoarecele
nou-născut. Virusul izolat se va dilua astfel încât să se obţină 100 doze infectante 50/amestec ser
de referinţă-virus.

Reacţia constă în punerea în contact a diluţiilor corespunzătoare din serul de referinţă şi virus
izolat, incubarea 1-2 ore la 370C şi inocularea amestecului ser-virus la gazda sensibilă unde s-a
obţinut izolarea virusului. Reacţia se consideră pozitivă dacă la amestecul respectiv nu mai apare
ECP în cultura celulară sau paralizie la şoarece, în condiţiile martorului de virus cu leziuni
prezente.

IV. DIAGNOSTIC SEROLOGIC PRIN HAP

 Elementele reacţiei:
- Ser de cercetat recoltat în două perioade: debut şi convalescenţă. Din ambele seruri,
după inactivarea lor la 56°C timp de 30 de minute, se fac diluţii binare.
- Antigen standard
- Suspenise hematii
 Înainte de efectuarea reacţiei propriu-zise, se sensibilizează hematiile cu antigen atandard
(antigenul este adsorbit pe hematii cu ajutorul acidului tanic care dezveleşte anumiţi
receptori de pe suprafaţa hematiei).
 Principiu: Prezenţa anticorpilor (specifici antigenului) în serul de cercetat este urmată de
formarea unor reţele, cu prinderea hematiilor şi apariţia aspectului de hemaglutinare.
 Titrul: cea mai mare diluţie de ser cu hemaglutinare prezentă. Serul I are titrul 1/2, iar serul
II, recoltat în perioada de convalescenţă, are titrul 1/32. Se poate pune un diagnostic cert,
diferenţa de titru între cele două seruri fiind mai mare de patru trepte binare.
 Aplicaţii: diagnosticul serologic al rujeolei, stabilirea eficienţei vaccinării antivariolice
efectuată cu ajutorul virusului vaccinia
 V. DIAGNOSTIC SEROLOGIC PRIN RFC
 Reactie de Fixare a Complementului
- Calitativa – Exista sa nu anticorpi fixatori de complement
- Cantitativa – stabileste titrul si cresterea in dinamica a anticorpilor
 Elementele reacţiei:
- Ser de cercetat recoltat în două perioade: debut şi convalescenţă. Din ambele seruri,
după inactivarea lor la 56°C timp de 30 de minute, se fac diluţii binare;
- Antigen standard (bacterian, viral, parazitar);
- Complement (C´) sau alexină. Este necesară titrarea acestuia (în prezenţa sistemului
hemolitic), introducându-se în reacţie o cantitate bine stabilită (2 unităţi alexice în
infecţiile bacteriene, 3 unităţi alexice în infecţiile virale);
- Sistemul hemolitic-SH (hematii sensibilizate cu anticorpi corespunzători) obţinut prin
punerea în contact a suspensiei de hematii de oaie (rol de antigen) şi a serului hemolitic
(anticorpi anti-hematii de oaie);
- Ser sigur pozitiv (ser anterior testat cu anticorpi fixatori de complement)
- Ser sigur negativ (ser anterior testat în care nu s-au evidenţiat anticorpi fixatori de
complement).
 Reacţia are loc în două etape:
1. se pun în contact primele trei elemente (serul de cercetat, antigenul standard,
complementul).
2. se adaugă în reacţie sistemul hemolitic.
 Principiu: Prezenţa anticorpilor (specifici antigenului) în serul de cercetat este urmată de
formarea cu antigenul standard a complexelor antigen-anticorp. Complexele formate fixează
(consumă) complementul, sistemul hemolitic, adăugat în partea doua a reacţiei, rămâne
nemodificat.
- Reacţie pozitivă (prezenţa anticorpilor specifici antigenului) este evidenţiată prin lipsa
hemolizei
- Reacţie negativă (absenţa anticorpilor) este urmată de prezenţa hemolizei
(complementul se va fixa pe hematiile sensibilizate, declanşând liza acestora).
 Titrul: cea mai mare diluţie de ser cu hemoliză absentă.
 Martorii reacţiei de fixare a complementului

Pentru controlul reactivilor şi interpretarea corectă a reacţiei de fixare a complementului, obligatoriu

se efectuează martori pentru fiecare element al reacţiei (ser de cercetat, antigen standard,
complement, sistemul hemolitic, ser sigur pozitiv, ser sigur negativ).
 VI. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR IN INFECTIA DE VHA
 Virusul hepatitei A (VHA): aparţine familiei Picornaviridae; este un virus ARN, dimensiuni
mici, simetrie icosaedrică, fără înveliş. Determină hepatita virală de tip A, cu transmitere
digestivă, cu evoluţie benignă, fără cronicizare;
I. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE: materii fecale; produs de puncţie-biopsie
hepatică; sânge: 2 prize, la interval de 2-3 săptămâni.
II. DIAGNOSTIC VIRUSOLOGIC
 Examen direct al produsului patologic – cu scopul evidenţierii virusului sau a antigenelor
virale sau a agregatelor imune. Metode folosite în acest scop:
- Imunelectronomicroscopia materiilor fecale folosind seruri specifice anti-VHA.
Evidenţiază agregatele imune specifice în prezenţa martorilor, pozitiv şi negativ.
- Examinarea materialului obţinut prin biopsie hepatică prin: imunofluorescenţă (IF) sau
colorare cu peroxidază. Aceste metode evidenţiază virusul sau antigenele virale.
- Examinarea la microscopul electronic a secţiunilor ultrafine hepatice în cazul infecţiuilor
experimentale la maimuţe, cimpanzei.
 Evidenţierea ARN viral în produsele patologice prin: tehnici de hibridizare a ARNv cu sonde
ARN sau ADN c; PCR (polymerase chain reaction).
 Izolarea virusului prin inocularea produselor patologice în culturi celulare sau la animale
(nu este o metodă curentă de diagnostic).
III. DIAGNOSTIC SEROLOGIC
 Tehnici folosite: ELISA; RIA. Anticorpii detectaţi:
- Anticorpi antiVHA de tip Ig M: persistă 10-12 săptămâni; atestă o infecţie acută recentă;
- Anticorpii anti-VHA de tip Ig G: se dezvoltă lent şi sunt detectabili ani de zile; pun
diagnostic retrospectiv.
IV. INVESTIGAŢII BIOCHIMICE

Aceste investigaţii alterate ridică suspiciunea de afectare hepatică, posibil virală:

- sindrom de hepatocitoliză: GOT peste 40U/L; GPT peste 37U/L;

- perturbări ale metabolismului pigmenţilor biliari: creşterea bilirubinei totale şi directe în
ser; prezenţa urobilinogenului în urină;
- dezechilibru al proteinelor serice, evidenţiat pe electroforeză: creşterea α, β, γ-
globulinelor; scăderea albuminelor; inversarea raportului albumine/globuline.
VII. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN HEPATITA VIRALĂ DE TIP B
 Virusul hepatitei B (VHB): familiei Hepadnaviridae; virus ADN, cu înveliş, determină hepatita
virală de tip B, cu transmitere parenterală, cu evoluţie prelungită, cu cronicizare frecventă şi
chiar implicat în etiologia cancerului hepatic primitiv;
I. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE: ţesut hepatic, sânge,
II. DIAGNOSTIC VIRUSOLOGIC
 Evidenţierea antigenelor VHB pe preparate de ţesut hepatic prin:
- coloraţie cu imunofluorescenţă;
- coloraţie cu imunoperoxidază, ce evidenţiază: AgHBs în citoplasma hepatocitelor şi Ag HBc în
nucleul hepatocitelor.
 Evidenţierea virionului complet (particula Dane) – din ser, prin m.e
 Evidentierea existentei ADN-polimerazei virale - din ser, reprezentativă pt stadiul de
viremia; apare la scurt interval după AgHBs; poate fi decelat înaintea simptomelor clinice.
 Detectarea AgHBsinfectie acuta/cronica cu VHB, prin ELISA, din ser
 Detectarea AgHBereplicare virala intensa, prin ELISA, din ser
 Detectarea AgHBctendinta de cronicizare=evolutie nefavorabila, din tesut hepatic
 Detectarea ADN-VHB = marker de certitudine al infectiei cu VHB, prin:PCR, hibridizarea.
III. DIAGNOSTIC SEROLOGIC
 Detectarea anticorpilor anti-HBs
Metode: ELISA sandwich
Interpretare: prezenţa anticorpilor anti-HBs denotă: însănătoşire după boala acută;
antecedente de hepatită cu VHB; vaccinare anti-VHB în antecedente.
Persistenţa lor denotă rezistenţă la reîmbolnăvire.
 Detectarea anticorpilor anti-HBe
Metode: ELISA competitivă; RIA.
Interpretare: sunt importanţi în hepatita cronică B pentru precizarea apariţiei
seroconversiei, a corelării cu evoluţia clinică şi a terapiei cu interferon.
 Detectarea anticorpilor anti-HBc
Metode: ELISA competitivă (imunocaptare). pot fi:
- de tip Ig M: apar în hepatita acută, la scurt timp după apariţia AgHBs şi persistă în
convalescenţă. După 6 luni (la sfârşitul convalescenţei) dispar;
- de tip Ig G: apar după 6 luni de la infecţie şi se menţin împreună cu anticorpii anti-HBs, toată
viaţa.
Interpretare:
▫ În hepatita acută, până la apariţia anticorpilor anti-HBs (în perioada de fereastră
imunologică) sunt prezenţi anticorpii Ig M anti-HBc, indicatori ai infecţiei cu VHB;
▫ În hepatita cronică: anticorpii anti-HBc de tip IgG -prezenţi; AgHBs prezent; niveluri scăzute
de anticorpi anti-HBc de tip Ig M.
▫ Pentru diagnostic retrospectiv: anticorpi anti-HBc totali (IgM + IgG) prezenţi.
VIII. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN HEPATITA VIRALĂ DE TIP C
I. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE
Se recoltează ser şi probe bioptice de ficat.

II. DIAGNOSTIC VIRUSOLOGIC

Se bazează pe evidenţierea ARN viral al VHC.
Metode: PCR (TR-PCR);
Interpretare:
- detectarea ARN-VHC este pozitivă la 2 săptămâni postransfuzional şi poate persista toată
viaţa;
- o singură probă pozitivă - confirmă infecţia;
- o probă negativă - nu exclude infecţia.

III. DIAGNOSTIC SEROLOGIC

Evidenţiază răspunsul în anticorpi faţă de antigene recombinante: C-100-3, C22, C33 (NS3),
C100-3 (NS4).
Metode: ELISA, RIBA (recombinant immunobloting assay) - test de confirmare.
Dezavantaj: datorită seroconversiei tardive, diagnosticul formei acute este greu de confirmat,
ceea ce impune monitorizare serologică constantă.

IX. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITEI VIRALE DE TIP D

I. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE
Se poate recolta: sânge şi ţesut hepatic recoltat prin biopsie.

II. DIAGNOSTIC VIRUSOLOGIC

 Examen direct: evidenţierea AgHD în ţesut hepatic prin: imunofluorescenţă; coloraţie pentru
imunoperoxidaze (AgHD este prezent în citoplasma şi nucleul hepatocitelor infectate).
 Determinarea ARN-VHD prin hibriduzare in situ.
 Determinarea Ag HD în ser prin: ELISA, RIA, Western-blot.

III. DIAGNOSTIC SEROLOGIC

Constă în determinarea în ser a anticorpilor anti-VHD prin: ELISA, RIA.
Anticorpii anti-VHD pot fi: de tip Ig M; de tip Ig G.
Interpretare:
 Coinfecţie:
- Ag HD prezent în prima perioadă de boală;
- apoi apar tranzitoriu anticorpii anti-VHD de tip Ig M;
- anticorpi Ig M anti-HBc (VHB) prezenţi.
 Suprainfecţie:
- AgHBs prezent;
- AgHD prezent;
- anticorpii Ig M şi Ig G anti-VHD prezenţi; anticorpii Ig M anti-VHD persistă perioade
îndelungate;
 - anticorpii anti-HBc absenţi.
 În hepatitele fulminante:
- markerii infecţiei cu VHD sunt detectabili numai în hepatocite, nu şi în ser.

X. HIV
 Metode de diagnosticare grupate in doua categorii:
1. Metode care stabilesc prezenta si cantitatea de virus
2. Metode care identifica raspunsul imun antiviral
1. Merode care stabilesc prezenta si candtitatea
 Metode de determinare a incarcaturii virale:
a. Cantitatea de virus in stadiu latent sau replicativ prezenta la individ
infectat
 Metode de masurare a cantitatii virale celulare:
a. Decelare nr de celule sanguine mononuclearea purtatoare de ADN proviral
b. Se urmareste: formarea de sincitii, prezenta antigen p24 in supernatant,
determinarea revertranscriptazei virale in supernatant
c. Cuantificarea viemiei celulare presupune determinarea titrului infectat
celular de virus
b. Determinare cantitatica a ADN celular prin PCR
c. Determinare ARN viral celular
d. Determinarea cantitativa a ARN plasmatic prin PCR
 Metode de masurare a incarcaturii virale plasmatice
a. Antigenemia p24 HIV 1
b. Cocultivarea plasmatica

2.Metode care identifica raspunsul imun – serologice

Tehnici imunoenzimatice 0 cu ELISA

Tehnici de confirmare – Western Blot, RIPA. Imunofluorescenta indirecta

XI. ETAPELE DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR INTR-O INFECTIE VIRALA

I. Recoltare si prelucrare a produselor patologice
 Eficienta examenului de lab depinde de recoltarea corecta: momentul prelevarii, locul de
unde se recolteaza, tipul produsului, modul de recoltare.
 Prod patologice pot fi:sange, fecale, lcr, secretii nazale, sputa, lichid vezicular etc.
 Prod patologice se amesteca cu mediul de conservare suplimentat cu antibiotice, pentru
inhibarea florei microbiene
 Prod patologice se centrifugheaza iar supernatantul obtinut va forma proba de lucru, in care
se vor evidentia particulele virale
II. Izolare
 Se face pe sisteme celulare vii: ou embrionat de gaina, culturi celulare, animale de laborator;
In functie de agentul viral presupus si se urmaresc efectele virus specifie
 Efecte virus specifice pe culturi celulare:
a. Efect citopatic (distructiv, sincitial, in focare) = modificari morfologice ale celulei din
cauza multuplicarii virusului
b. Efect hemaglutinant
c. Efect hemadsorbant
 d. Incluzii virale
e. Efect Transformant
 Efecte virus specifice pe oul embrionat
f. Inocularea se poate face: intramaniotic, intralantoidian,membrana corio-alantoid
g. Efect Hemaglutinant: mixovirusuri
h. Vezicule pe membrana c-a: Poxivirusuri, herpesvirususri
i. Incluzii virale
 Efecte virus specifice pe animale de lab
j. Inocularea se poate face: subcutanat, intraperitoneal,intracerebral,intranazal
k. Paralizii
l. Incluzii virale
m. Tumori
III. Titrarea virusurilor
 Determinarea concentratiei de virus
 Etape: Dilutie(binara/logaritmica)inoculare pe acelasi tip de gazda pe care s-a izlat
virusulaparitie efecte virus specificestabilire titrul viral = CEA MAI MARE DILUTIE DE
VIRUS, CAPABILA SA DETERMINE EFECTUL VIRUS SPECIFICexprimare titru = in UH, doze
citopatogene 50, doze letale
IV. Identificare virala
 Doua tipuri:
n. Initial, ORIENTATIVA – bazata pe simptome, date epidemiologice, produse
patologiceajuta sa se retranga ancheta; dupa inoculare, in functie de efectele v-s
obtinute se suspecteaza diverse
o. De certitudine SEROLOGICA – bazata pe reactie antigen-anticorp. Elementul
necunoscut= virus izolat/antigen; Element cunoscut = ser imun standard tipic =
anticorpi cunoscuti
p. Pt identificare Serologica folosim reactii precum:
a. Imunofluorescenta (florocromi+anticorpi se leaga de antigencomplex
antigen-anticorp fluorescent
b. Seroneutralizare – anticorpii neutralizeaza efectele anigenului. Rezultat pozitiv –
NU exista efecte ale antigenului, adica exista corespondenta intre anticorp si
antigen. Rezultat negativ – exista efecte ale antigenului, deci nu exista
corespondenta intre antigen si anticorp
c. Inhibare a hemaglutinarii – daca exista corespondenta intre serul imun si
antigen, acesta din urma este neutralizat si NU mai produce efectul
hemaglutinant. Rezultat positiv – NU exista hemaglutinare. Rezultat negativ –
Exista hemaglutinare
d. Inhibare a hemadsorbtiei
e. Fixare a complementului
f. ELISA, RAI
V. Diagnostic Imunobiologic
q. Presupune testarea reactivitatii imune dpdv celular si umoral, a individului infectat
r. Testarea reactivitatii imune umorale: detectam, identificam, cuantificam ANTICORPI.
Cunoastem antigenul, nu cunoastem Exitenta, tipul, numarul anticorpilor; Folosim
reactii antigen-anticorp: HAI,HAP, Fixare complement
s. Testarea reactivitatii imune celulare – efectorul este limfocitul T. Teste folosite:
Intradermoreactia de tip tuberculinic, Testul de transformare blastica limfocitara,
Testul de citotoxicitate imuna etc.
 XII. REACTII SEROLOGICE FOLOSITE IN DIAGNOSTICUL VIRAL
HAI – inhibare a hemaglutinarii

Elementele reacţiei:

 Ser de cercetat recoltat în cele două perioade: debut şi convalescenţă.

 Antigen viral standard titrat şi diluat corespunzător celor 4 UH.
 Suspensia de hematii
Principiu: Prezenţa anticorpilor (specifici antigenului) în serul de cercetat neutralizează antigenul
standard care nu-şi mai manifestă efectul (hemaglutinant) asupra hematiilor.
- Reacţie pozitivă (prezenţa anticorpilor): inhibarea hemaglutinării

- Reacţie negativă (absenţa anticorpilor): hemaglutinare prezentă (antigenul viral îşi manifestă efectul
hemaglutinant)

Titrul: cea mai mare diluţie de ser cu inhibarea hemaglutinării. Se poate pune un diagnostic cert,
diferenţa de titru între cele două seruri fiind mai mare de patru trepte binare.

Aplicaţii: diagnosticul serologic al gripei, rujeolei, arbovirozelor, virozelor pox.

HAP – hemaglutinare pasiva

 Elementele reacţiei:
- Ser de cercetat recoltat în două perioade: debut şi convalescenţă
- Antigen standard
- Suspenise hematii

Înainte de efectuarea reacţiei propriu-zise, se sensibilizează hematiile cu antigen atandard (antigenul

este adsorbit pe hematii cu ajutorul acidului tanic care dezveleşte anumiţi receptori de pe suprafaţa
hematiei).

Principiu: Prezenţa anticorpilor (specifici antigenului) în serul de cercetat este urmată de formarea
unor reţele, cu prinderea hematiilor şi apariţia aspectului de hemaglutinare.

Titrul: cea mai mare diluţie de ser cu hemaglutinare prezentă. Se poate pune un diagnostic cert,
diferenţa de titru între cele două seruri fiind mai mare de patru trepte binare.

Aplicaţii: diagnosticul serologic al rujeolei, stabilirea eficienţei vaccinării antivariolice efectuată cu

ajutorul virusului vaccinia

RFC - Reactie de Fixare a Complementului

- Calitativa – Exista sa nu anticorpi fixatori de complement

- Cantitativa – stabileste titrul si cresterea in dinamica a anticorpilor
 Elementele reacţiei:
- Ser de cercetat recoltat în două perioade: debut şi convalescenţă.
- Antigen standard (bacterian, viral, parazitar);
- Complement (C´) sau alexină. Este necesară titrarea acestuia (în prezenţa sistemului
hemolitic), introducându-se în reacţie o cantitate bine stabilită (2 unităţi alexice în
infecţiile bacteriene, 3 unităţi alexice în infecţiile virale);
 - Sistemul hemolitic-SH (hematii sensibilizate cu anticorpi corespunzători) obţinut prin
punerea în contact a suspensiei de hematii de oaie (rol de antigen) şi a serului hemolitic
(anticorpi anti-hematii de oaie);
- Ser sigur pozitiv (ser anterior testat cu anticorpi fixatori de complement)
- Ser sigur negativ (ser anterior testat în care nu s-au evidenţiat anticorpi fixatori de
complement).
 Reacţia are loc în două etape:
3. se pun în contact primele trei elemente (serul de cercetat, antigenul standard,
complementul).
4. se adaugă în reacţie sistemul hemolitic.
 Principiu: Prezenţa anticorpilor (specifici antigenului) în serul de cercetat este urmată de
formarea cu antigenul standard a complexelor antigen-anticorp. Complexele formate fixează
(consumă) complementul, sistemul hemolitic, adăugat în partea doua a reacţiei, rămâne
nemodificat.
- Reacţie pozitivă (prezenţa anticorpilor specifici antigenului) este evidenţiată prin lipsa
hemolizei
- Reacţie negativă (absenţa anticorpilor) este urmată de prezenţa hemolizei
(complementul se va fixa pe hematiile sensibilizate, declanşând liza acestora).
 Titrul: cea mai mare diluţie de ser cu hemoliză absentă.
 Martorii reacţiei de fixare a complementului

Pentru controlul reactivilor şi interpretarea corectă a reacţiei de fixare a complementului, obligatoriu

se efectuează martori pentru fiecare element al reacţiei (ser de cercetat, antigen standard,
complement, sistemul hemolitic, ser sigur pozitiv, ser sigur negativ).

XIII. HAI-HAP
XIV. HAI-RFC
XV. HAP – RFC
XVI. REACTII FOLOSITE IN DIAGNOSTICUL SEROLOGIC AL GRIPEI
a. Reacţia de inhibare a hemaglutinării

Această reacţie, cunoscută şi ca hemaglutino-inhibare, este de departe cea mai utilizată metodă
pentru diagnosticul serologic uzual, folosind ser de testat şi antigene standard de tip sau subtip
pentru determinarea prezenţei în serul de bolnav a anticorpilor faţă de un virus hemaglutinant si
urmărirea titrului în dinamică.

Principiu: în urma punerii în contact a serului de bolnav cu antigenul viral standard şi cu suspensia de
hematii indicatoare, în prezenţa anticorpilor specifici, virusul îşi pierde capacitatea hemaglutinantă.

Se citeşte titrul anticorpilor hemaglutinoinhibanţi în ambele seruri recoltate de la bolnav: cea mai
înaltă diluţie a serului la care se mai constată inhibarea hemaglutinării. Creşterea în dinamică de cel
puţin 4 ori a titrului anticorpilor (la nevaccinaţi) pune un diagnostic cert de gripă.

b. Reacţia de fixare a complementului

Decelează antigenul nucleocapsidar “S”, dând specificitate de tip virusurilor gripale A, B, C. Se

foloseşte ser de bolnav în contact cu antigene standard de tip. La pacienţii cu primoinfectie şi în
special la copii, intervalul de timp pentru apariţia anticorpilor este tardiv, incepand cu a 4-a
săptămână de la debutul bolii şi nu mai sunt decelabili după 3-4 luni.

Concluzionând, uzual tipul de virus gripal este identificat pe baza reacţiei de fixare a complementului,
iar subtipurile prin reacţia de inhibare a hemaglutinării.

XVII. DIAGNOSTIC SEROLOGIC IN RUJEOLA

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Se recoltează: secreţii nazo-faringiene, secreţii conjunctivale, LCR, sânge recoltat pe heparină (virusul
poate infecta leucocitele), 2 probe de sânge pentru obţinerea serului pentru diagnostic serologic
(prima recoltată imediat după apariţia rash-ului, a doua în convalescenţă), urină (la sfârţitul perioadei
de stare), fragmente de creier şi organe la necropsie.

2. TRANSPORTUL PRODUSELOR PATOLOGICE

Trebuie făcut în medii conţinând ser de viţel sau serumalbumină bovină şi păstrate la +40C, nu
congelate.

3. EXAMENUL DIRECT

 Examen histopatologic: evidenţiază celulele Wartin-Finkelday, patognomonice pentru

rujeolă, pe amprente de mucoasă nazală, secreţii nazofaringiene.

 Evidenţierea antigenelor virale prin imunofluorescenţă în secreţii nazale, în leucocitele din

sângele periferic, în sedimentul de urină, în prelevatele bioptice de tegument.

 Evidenţierea antigenelor virale cu ELISA, RIA în secreţii nazofaringiene (nu sunt teste de
rutină).

 Evidenţierea ARN viral prin PCR în: plasmă, mononuclearele periferice, secreţii
nazofaringiene; nu se practică în mod curent.

4. . IZOLAREA VIRUSULUI RUJEOLOS

În culturi celulare: culturi primare de rinichi fetal uman, de rinichi de maimuţă, culturi de amnios
uman, linii celulare continue (cultură de limfocite de maimuţă transformată de v. Epstein-Barr).
Efectul citopatic apare târziu, după 2 săptămâni de la inoculare, fiind de tip sinciţial sau stelat
fuziform.

Izolarea virusului se poate face din creier, în caz de PESS: virusul este defectiv, recomandându-se
cocultivarea celulelor cerebrale cu celule permisive (linii HeLa, BSC-1).

5. IDENTIFICAREA VIRUSULUI RUJEOLOS

Se face prin hemadsorbţie cu hematii de maimuţă Rhesus pe monostraturile infectate; prin

imunofluorescenţă cu seruri monoclonale şi policlonale pe monostraturile infectate; în lichidele de
cultură prin HAI, reacţie de seroneutralizare, RFC, ELISA.