RELACIN ENTRE EL TAMAO DE VULOS INMADUROS Y ORGANOGENESIS EN Tagetes erecta L.

Aline Jannet Garca Ornelas alinejannet@gmail.com Micropropagacion de Ornamentales

Introduccin

El uso de plantas de cempaschil (T. erecta.) para jardinera y maceta es cada vez ms aceptado en Mxico. Las plantas de algunas variedades comerciales como Sweet Cream, Inca, Antigua, Perfection y Marvel presentan portes de 30 a 40 cm e inflorescencias tipo doble. Estas variedades hbridas son el resultado del cruzamiento entre lneas, o bien, resultado de la multiplicacin vegetativa in vitro. Las variedades con inflorescencia doble tambin son de alto valor para la industria procesadora de pigmentos. (Serrato 2005) Aunque en Mxico existe una amplia diversidad de germoplasma de T. erecta asociada a procesos de domesticacin milenarios realizados por grupos indgenas mesoamericanos y por ser el centro-sur de Mxico el lugar de origen de este taxa; no se tiene banco de germoplasma ni se conoce su variacin (pigmentos, colores y tipos de flor, porte de la planta, aroma, ramificacin, tamao de flor, resistencia a plagas y enfermedades, duracin de la floracin) por regiones, asociada con grupos humanos y diversidad ambiental. (Serrato 2005). Una importante va para la conservacin de este material gentico es la micropropagacin, ya que el futuro de esta es sumamente promisorio an para un pas como Mxico, la produccin en gran volumen de material libre de virus, gran vigor, y homogeneidad gentica ha permitido incrementar la productividad de numerosos cultivos as como aumentar la calidad de estos mismos agregando valor esttico y comercial. (Hurtado 2000). Objetivo Evaluar el efecto del tamao de ovarios inmaduros en la organognesis de T. erecta.

Hiptesis Se lograr la regeneracin de plantas completas a partir de la siembra de ovarios inmaduros, y que a mayor tamao del ovario se obtendr una mayor generacin de plntulas y menor generacin callosidades, y a menor tamao del ovario se obtendr una mayor generacin de callos y menor generacin de plntulas.

Marco Terico T. erecta Rzedowski (1985) menciona las siguientes caractersticas para T. erecta : Presenta tallos estriados, glabros o pubescentes; hojas hasta de 20 cm. de largo, pinnadas, foliolos 11 a 17, lanceolados a linear-lanceolados, hasta 5 cm. de largo y hasta 1.5 cm. de ancho, aserrados a subenteros; cabezuelas solitarias o agrupadas por varias, sobre pednculo hasta de 15 cm. de largo, provistos de bractea pinnadas con segmentos cordiformes en el pice; el involucro, campanulado, de 13 a 20 Mm. de alto, de 9 a 25 mm. De ancho, sus brcteas de 5 a 11, glabras, sus pices trianguladas a abovadas, de 1 a 2 cm. de largo, flores del disco de 150 a 250 en alas cabezuelas sencillas, pero en las dobles muestra grados diferentes de formacin de las ligulas, con corolas de amarillas a anaranjadas, de 8 cm. de largo, pinnadas con foliolos de 9 a 23, lineares a lanceolados, de hasta 2 cm. de largo y frecuentemente de menos de 2.5 mm. De ancho, con cabezuelas ms o menos unidas entre si. Serrato (2003) seala que presenta una inflorescencia en forma de captulo que contienen de 60 a 400 flores, mismas que pueden o no tener lgulas o ptalos. Estas flores pueden presentar una composicin sexual femenina (pistilos o estigmas), masculina (anteras) y hermafroditas. La composicin de los captulos de acuerdo con el tipo de flores individuales, pueden ser; dobles, semidobles, con varios verticilos de flores liguladas androestriles, en la parte exterior del captulo y en el centro de este, as como inflorescencias simples; ptalas aptalas. En general, el germoplasma mexicano de tiene porte alto (1 a 1.5 m o ms) y mediano (60-90 cm.) (Gmez, 1981, citado por Serrato, 2003), Esto puede propiciar algunos inconvenientes para su empleo en maceta o jardn como: el riesgo de acame y la amplia ramificacin. Aunque La ramificacin profusa es una caracterstica apropiada para el aprovechamiento de racimos. Las variedades comerciales ornamentales presentan portes enanos (25-38 cm), entrenudos de corta longitud, buen dimetro de inflorescencia (8-10 cm) y sin profusa ramificacin, lo que las hace idneas para maceta o para jardn (Serrato et al., 2003).

Cultivo de Tejidos El concepto original de cultivo de tejidos vegetales se ha extendido hasta abarcar tanto el cultivo asptico de tejidos como de clulas y /o organos, dentro de un grupo de tcnicas fundamentadas en varios principios. Uno de ellos, la totipotencialidad propuesta por Haberlandt en 1902 y la hipotecis del balance hormonal sugerida por Skoog en 1957. Estas tcnicas de cultivos aspticos han contribuido para tener un mejor entendimiento de los eventos de diferenciacin celular y adems un mejor aprovechamiento de tales eventos en la explotacin ms eficiente de las plantas. (Roca, 1991) Algunos usos de las tcnicas de cultivo in Vitro son; mejoramiento gentico, obtencin de plantas libres de patgenos, conservacin del germoplasma y la micropropagacin. El xito que se obtenga en un cultivo de tejidos vegetales, depende del uso del medio nutritivo adecuado. Usando la sustancias qumicas necesarias y las combinaciones apropiadas de nutrientes para establecer cultivos de diversas especies vegetales. Se compone de sales minerales, fuentes de carbono, vitaminas, reguladores de crecimiento, con o sin agar, y otros compuestos orgnicos (carbn activado, agua de coco, etc.) antioxidantes (cido ctrico y ascrbico) fungicidas y antibiticos. En micropropagacin se utilizan con ms frecuencia las sales de Murashige y Skoog por estar en dosis relativamente altas, aunque hay combinaciones con menor cantidad o relativamente pobres. (Lozoya, 1985) Segn Hurtado (2001) Los ingredientes en el medio de cultivo se pueden clasificar en: Sales inorgnicas Compuestos orgnicos Fuente de carbono Sustancias hormonales Vitaminas Aminocidos y Amidas Complejos Orgnicos Cultivo de ovarios y vulos El cultivo de vulos es un procedimiento complejo aconsejable slo en los casos en los que sea estrictamente necesario, ya que el porcentaje de xito es muy bajo y la manipulacin del material es difcil. Esto se debe a que el vulo es

una estructura muy pequea y delicada que requiere microciruga para su aislamiento, resultando relativamente fcil daarla. Adems, al tratarse de un tejido altamente hidratado, no debe sufrir desecacin durante su manipulacin, que debe ser rpida y llevarse a cabo bajo una lupa estereoscpica provista de una fuente de luz fra. (Carmona, 2002). El cultivo de embriones y vulos ha sido efectivo y til para el mejoramiento gentico de algunas especies como cebada, pues permite rescatar los embriones que resultan de una hibridacin til en la resistencia de bajas temperaturas invernales. (Konzak, 1951 citado por Villalobos, 1995). El cultivo de vulos completos ha mostrado tambin, ser efectivo para que rescate de embriones resultado de cruzamientos interespecficos. Cultivo de polen y anteras El estado optimo de desarrollo de las anteras es controvertido en cuanto a la respuesta in Vitro. La formacin de races en callos de antera es el tipo de organognesis ms sencillo de inducir, adems las races posibilitan el anlisis microscpico preliminar, como indicador de la eficiencia de las condiciones experimentales para producir material haploide. Los callos siguen un patrn de crecimiento muy caracterstico, : inicialmente exhiben crecimientos perifricos por medio del establecimiento de un meristemo perifrico compuesto de clulas compactadas, ricas en citoplasma y con un notable ncleo, estas clulas rodean a una regin central de clulas alargadas y altamente vacuoladas. (Gulshan et. al. 1981, citado por Serrato 1985). Gresshof y Doy descubren en jitomate, diferentes respuestas en dos etapas de desarrollo. Describen que las anteras que se encuentran en actividad meiotica temprana desarrollan callognesis y posterior formacin de tallo, mientras que microsporas en estado uninucleado no desarrollan callos o plantas haploides. Shamino y Dao (1977) usando 5 medios de cultivo y sembrando anteras en las etapas de meiosis tetrada, microspora uninucleada y polen maduro encontraron lo siguiente: Estado meiotico Fase ttrada Microspora uninucleada Polen maduro 75 a 98% de las clulas formaron callo 6 a 40% de las clulas formaron callo No hay callognesis 3 al 16% germinan

Cultivo de Tejidos en T. erecta

Protocolo Desinfestacin Medio de Cultivo MS + BAP (5mgL-1)+ AIA (5mgL-1)+ AG3 (5mgL-1) MS con BAP (1mgL-1)+AG3 (0.5mgL-1) Mtodo de Propagacin Induccin de brotes Induccin de callo Induccin de Callo Embriognesis somtica Temperatura de 28 hasta 38 C fotoperiodo de 16 h luz, intensidad de 69 moles/m2 x s y 6 h de oscuridad.

Autor

Explante Discos florales sin polinizar Segmentos de hoja Hojas Tejido Cotiledonar

Incubacin

Kothari y Chandra (1984) Kothari y Chandra (1984) Kothari y Chandra (1984) Bespalhok y Hattori (1998)

MS con BAP (1mgL-1)+AG3 (0.5mgL-1)

MS + 02 mg/L de thiadizuron. -Agua y jabn. 5 min. -Alcohol 70%. 7 min. -Hipoclorito 15% + 2 gotas de Tween. 3min. MS+ BAP (5mgL-1)+ AIA (3mgL-1)+

Hernandez (2005)

Anteras

Induccin de Callo

Materiales y Mtodos Planta Madre Para el establecimiento de los cultivos se utilizarn botones florales de plantas de T. erecta obtenidas con anterioridad en condiciones de invernadero en la UACh. Explantes Se utilizarn ovarios ubicados en los primeros tres verticilos del botn floral. Desinfestacion Lavado superficial con agua y jabn. 5 min.

Desinfestacin con alcohol al 70% V/V. 7 min. Desinfestacin con hipoclorito de sodio al 15% V/V ms dos gotas de Tween. 3 min. Enjuagado entre cada una de las anteriores con agua destilada y al final con agua destilada estril.

Medio de Cultivo y Siembra En el proceso de la siembra cada botn floral se disectar cuidadosamente y los ovarios se cultivarn aspticamente sobre el medio que previamente se preparar de la siguiente manera y esterilizado:

1. Medio bsico MS a. Solucin A ________20ml b. Solucin B ________5ml c. Solucin C ________5ml d. Solucin D ________5ml e. Solucin E ________5ml f. Solucin F________ 5ml g. Solucin G________ 5ml 2. BAP___________________5mg/l 3. AIA ___________________3mg/l 4. Sacarosa_______________30g/l 5. Agar___________________ 6g/l 6. Aforar con agua deionizada a 1L Manteniendo un pH de 5.7, una vez preparado, el medio se esteriliza. Las siembras sern efectuadas en la campana de flujo laminar en condiciones de asepsia, desinfectando previamente los explantes, y tomando las muestras (ovarios) en los primeros tres verticilos del botn floral. Los explantes sern colocados frascos de vidrio con tapa con un contenido de medio MS de 10 a 15 ml. Incubacin Los explantes sembrados se colocarn en la cmara de incubacin en condiciones controladas de luz y temperatura, donde la temperatura ser variable con valores desde 28 hasta 38 C aproximadamente y el fotoperiodo de 16 h luz, con una intensidad de 69 micromoles/m2 x s y 6 h de oscuridad.

Experimento Se evaluarn ovarios en estado inmaduro obtenidos de botones florales de diferentes dimetros en un medio de cultivo MS ms BAP y AIA y se observara su diferenciacin hacia callos o brotes, comparando los efectos por diferente tamao del ovario Se establecern cuatro tamaos de botn floral para realizar el experimento, numerados del 1 al 4, de menor a mayor tamao, obtenindose 64 explantes por tratamiento en 16 repeticiones, y cada una conteniendo cuatro muestras.

Para este caso las variables que se tomarn en cuenta sern las siguientes: Contaminacin: se especificar si presenta y si se trata de hongo o bacteria. Oxidacin: se especificar si existe o no y en qu magnitud Necrosis: se especificar si existe o no y en qu magnitud Formacin de callo: se tomar en cuenta el color, dimetro del callo. as como el

Formacin de brotes: Se evaluar el nmero, la altura, nmero de hojas por nudo, color.

La medicin se llevar a cabo por medio de tablas tomando en cuenta las variables anteriormente mencionadas que permitan evaluar el grado de desarrollo de callos o brotes.

Clave de la muestra

Fecha de Siembra

Contaminacin

Necrosis (%)

Oxidacin (%)

Callo

Brotes

Los espacios se llenaran utilizando los siguientes valores: Contaminacin: SI o NO y tipo de patgeno

Necrosis: Escala numrica de 0 a 100 Oxidacin: Escala numrica de 0 a 100 Callo: Presencia y tamao Brote: Presencia y tamao

Bloqueo de tratamientos
Los ovarios sern extrados del primer al tercer verticilo del botn floral en todos los tratamientos.

Tcnicas estadsticas
Se realizarn los clculos correspondientes para determinar las frecuencias de formacin de callo o brote, as como la media aritmtica de stas, desviacin estndar y porcentajes.

Procesamiento y ordenamiento de la informacin

Anlisis estadstico
Se determinaran las tendencias probabilsticas a desarrollar callo o brote segn el grado de desarrollo o madurez del ovario.

Ordenamiento
Se realizar una memoria grfica mediante fotografas de todo el proceso de establecimiento del cultivo hasta llevarlo a trmino obteniendo resultados que habrn de ser registrados en cuadros de concentracin de datos que permitan su interpretacin mediante grficas y tablas. Cronograma
Dia 1 Preparacin de Medio Dia 2 Obtencin de explantes y siembra Tamao 1 Dia 3 Obtencin de explantes y siembra Tamao 2 Dia 4 Obtencin de explantes y siembra Tamao 3 Dia 5 Dia 6 Toma de datos tamao 1 Dia7 Toma de datos tamao 2

Dia 8 Toma de datos tamao 3 Dia 16 Toma de datos tamao 2

Dia 9

Dia 11 Toma de datos tamao 1

Dia 12 Toma de datos tamao 2 Dia 19 Toma de datos tamao 1

Dia 13 Toma de datos tamao 3 Dia 20 Toma de datos tamao 2

Dia 14

Dia 15 Toma de datos tamao 1

Dia 17 Toma de datos tamao 3

Dia 18

Dia 21 Toma de datos tamao 3

Dia 22

Dia 23

Dia 24 Toma de datos tamao 1

Dia 25 Toma de datos tamao 2 Dia 31 Anlisis de la informacin

Dia 26 Toma de datos tamao 3 Dia 31 Anlisis de la informacin

Dia 27

Dia 28 Toma de datos tamao 1

Dia 29 Toma de datos tamao 2 Dia 31

Dia 30 Toma de datos tamao 3

Dia 31 Reunir informacin

Dia 31 Anlisis de la informacin

Dia 31

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