Nom et prenom : ouichou adel

Groupe : 04

Compte rendue N2 : extraction d’ADN par Phenol Chloroform

I : technique d’extraction liquide-liquide

L'extraction liquide-liquide est une méthode de purification
basée sur la différence de solubilité d'un soluté dans deux
phases non miscibles . En chimie organique, on utilise
habituellement une phase aqueuse et une phase organique
, dans notre extraction par phenol chloroform on s’intéresse a la phase aqueuse car il
contient L’ADN , ARN

II : Protocole D’extraction D’ADN et Rôle de chaque etape

1) Place a small piece of tissue in a sterile microcentrifuge tube (1.5ml) ans
, add 100 μL of a solution containing EDTA and NACL
➢ protéger l'ADN en inhibant les enzymes qui pourraient le dégrader.
L'EDTA chélate les ions métalliques qui utilise comme cofacteur
dans DNase ou RNase activitée
2) Add 100 μL, of sodium dodecyl sulfate (SDS)
➢ solubiliser les membranes cellulaires et denaturée les protéines
3) Add 20 μL of proteinase K
➢ dégradée les protéines ( pour élimine celle qui associer a l’ADN)
4) Incubate the sample for 30 min at 60°c
➢ activer la protéinase K et de dégrader efficacement les protéines.
5) Add 200 μL, of satured 6M NaCl solution
➢ pour précipiter les protéines dégradées par la protéinase K
6) Add the same value of phenol chloroform to the mixture
 ➢ Dissolver les proteins (séparer les phases aqueuse et organique)
7) Incubate the mixture at room temperature for 5min
➢ Cette étape permet au phénol-chloroforme de séparer
efficacement les phases.
8) Centrifuge the solution for 15 min at 14000g
➢ permet de séparer les phases aqueuse et organique
9) Transfer the cleared supernatant (aqueous phase ) into a new tube
➢ éliminer les protéines et autres impuretés restantes dans la phase
organique.
10) Add the same volume of absolute ethanol for DNA precipitation
➢ ajout d'éthanol précipite l'ADN de la solution
11) Incubate overnight at 20°c
➢ précipitation efficace de l'ADN.
12) Centrifuge the solution for 15 min at 14000g
➢ permet de séparer l'ADN précipité du liquide surnagean
13) Carefully remove supernatant
➢ éliminer les traces d'éthanol et d'autres impuretés
14) Wash the DNA with 70 ethanol
➢ Eliminer les dernières impuretés et de purifier davantage l'ADN
15) Carefully remove ethanol
➢ Pour ne pas contaminer L’ADN
16) Dissolve DNA in 100 μL nuclease free water
➢ un extrait d'ADN pur et prêt à être utilisé dans des applications
ultérieures.

III : Commercial kit Adn extraction vs extraction par phénol chloroforme.

Les données montrent que la concentration et la pureté de l’ADN extrait avec
cette méthode étaient similaires à celles obtenues à l’aide d’un kit
commercial. Par exemple, l’ADN extrait du contenu intestinal des triatomes, à
l’aide de la méthode phénol-chloroforme, a été amplifié avec succès par PCR
conventionnelle. Ceci suggère que la qualité de l'ADN extrait à l'aide de cette
méthode est similaire à celle du kit commercial, du moins à cette fin,
conformément à un rapport précédent 24 . De plus, il a été possible d’identifier
avec précision les sources de repas de sang de tous les échantillons
analysés, avec des identités de séquence BLAST supérieures à 95 %, par
rapport à la base de données GenBank , L'analyse coûts-avantages a montré
que l'extraction de l'ADN par la méthode phénol-chloroforme était environ 20
fois moins coûteuse que le kit commercial. Le kit commercial était la
méthode la plus rapide à mettre en œuvre et pouvait être réalisé en 2 heures,
contre 30heures avec le protocole phénol-chloroforme (Silva, 2020, p. 3)