SUBIECTE BIOLOGIE CELULARA SI MOLECULARA

1.ACIZII NUCLEICI

Genele sunt elemente invizibile ce contin informatie si sunt distribuite de la celula mama
la celulele fiice in timpul diviziunii.Pentru aceasta, inainte de diviziune, o celula mama trebuie
sa-si faca o copie a fiecarei gene pentru a putea transmite un set complet la celulele fiice.

Purtatorii informatiei ereditare care devin vizibili atunci cand o celula intra in diviziune
sunt cromozomii.Acidul dezoxiribonucleic(ADN) din acesti cromozomi este substanta care sta
la baza structurii genelor, fapt demonstrat pe baza studiilor pe bacterii.

Un lant de ADN este un polimer lung, neramificat, format din patru tipuri de subunitati
numite dezoxiribonucleotide, ce contin bazele azotate purinice, adenina(A) si guanina(G),
respectiv pirimidinice, citozina(C) si timina(T).Bazele azotate sunt legate intre ele prin
legaturi fosfodiesterice covalente stabilite intre carbonul 5’ al uneidezoxiriboze, cu carbonul 3’
al urmatoarei si sunt atasate la lantul fosfato-zaharidic ca margelele intr-un colier.

Moleculele de ADN sunt polimeri helicoidali, formati din doua lanturi.Bazele azotate
ale unei molecule de ADN sunt dispuse spre interiorul dublului helix.Acesta presupune ca
bazele unui lant sunt foarte apropiate de bazele celuilalt lant, ceea ce face ca acestea sa fie
imperecheate astfel:o baza azotata purinica mare(A sau G) cu o baza azotata pirimidinica
mica(T sau C) de pe celalalt lant.Imperecherea complementara de baze se formeaza intre A si T,
respectiv C si G, prin legaturi de hidrogen, si este generala relatia [G]=[C] si [A]=[T].

2.ADN-baza ereditatii, replicatia ADN, mutatiile replicatiei ADN

O gena este purtatoarea informatiei biologice si poate fi copiata si transmisa de la o celula

la toate descendentele ei.ADN-ul este un polimer dublu catenar, in care fiecare lant contine o
secventa de nucleotide, care este exact complementara cu secventa de nucleotide de pe celalalt
lant, ambele avand aceeasi informatie genetica.

Organismele difera intre ele din cauza ca moleculele lor de ADN poseda secvente
nucleotidice diferite, si deci mesaje diferite.

1
 In replicarea genelor este implicat un complex de proteine care formeaza ”aparatul
replicativ”.Reactia fundamentala este catalizata de ADN-polimeraza si consta in adaugarea a
cate unui dezoxiribonucleozid la capatul 3’ al unui lant de ADN.

Replicatia helixului incepe cu o separare locala a celor doua catene complementare,

urmand ca apoi fiecare catena sa actioneze ca matritapentru formarea unei noi molecule de
ADN, prin aditia secventiala a dezoxiribonucleozidului.Prin crearea unor legaturi pe baza de
complementaritate intre bazele nucleotidelor, se vor forma doua helixuri dublu catenare de
ADN, fiecare identic cu helixul de ADN parental.Pentru ca fiecare molecula de ADN contine o
catena originala si una nou sintetizata, mecanismul replicarii ADN se spune ca este
semiconservativ.

Aparatul replicativ poate gresi, introducand nucleotide necomplementare, acestea

reprezentand greseli genetice, numite mutatii.

Mutatiapoate fi copiata la toate generatiile celulare viitoare, deoarece secventele

”gresite” de ADN se vor copia drept ”corecte”.Consecinta unei asemenea erori poate fi grava,
determinand chiar si inactivarea unei proteine esentiale, ceea ce ar duce la moartea celulei.O
mutatie poate fi silentioasa, neafectand functia vreunei proteine.

3.DETERMINAREA SECVENTEI DE AA DINTR-O PROTEINA

ADN-ul este relativ inert si directioneaza sinteza de molecule specifice de ARN si

proteine, care la randul lor, determina proprietatile fizice si chimice ale celulelor.

Fiecare tip de proteina poseda o secventa unica de aminoacizi.Proprietatile unei proteine

depind de ordinea in care sunt aranjati aminoacizii.

ADN si proteinele sunt formate dintr-o secventa liniara de subunitati.Secventele sunt

coliniare, ceea ce inseamna ca nucleotidele din ADN sunt aranjate intr-o ordine ce corespunde
ordinii aminoacizilor din proteina pe care o codifica.

4.COPIEREA SECVENTELOR DE ADN IN MOLECULE DE ARN

Sinteza proteinelor presupune copierea unei regiuni specifice de ADN in polinucleotide

de tip diferit, numite acid ribonucleic(ARN).

2
 ARN, la fel ca si ADN, este format dintr-o secventa liniara de nucleotide, care au unele
diferentieri chimice:scheletul zaharido-fosforic contine riboza, in loc de dezoxiriboza, iar baza
azotata timina(T) este inlocuita cu uracilul(U).

ARN retine toata informatia secventei de ADN pe care a copiat-o pe baza de

complementaritate.Moleculele de ARN sunt sintetizate printr-un proces numit ARN-
transcriptie, proces similar cu ADN-replicatia, prin aceea ca unul sau cele doua lanturi de
ADN actioneaza ca matrita, pe care se imperecheaza bazele.ARN-transcriptia difera de ADN-
replicatia prin mai multe aspecte: (1) molecula sintetizata de ARN nu ramane atasata la lantul
de ADN, astfel ca ARN este monocatenar si (2) moleculele de ARN sunt relativ scurte in
comparatie cu moleculele de ADN, deoarece ele sunt copiate pe regiuni limitate ale ADN.

ARN transcris care directioneaza sinteza unei molecule proteice se numeste ARN
mesager(ARNm), pe cand alte molecule de ARN transcris reprezinta ARN de
transfer(ARNt), sau formeaza componenta de ARN al ribozomilor(ARNr).

Cantitatea de ARN care se produce este controlata de proteinele reglatoarea ale genelor,
care se leaga la situsuri specifice de ADN.Informatia continuta in doar o mica regiune din ADN,
poate directiona sinteza a milioane de copii ale unei proteine.

5.PRELUCRAREA MOLECULELOR DE ARN EUCARIOT PENTRU A FI

INDEPARTATE SECVENTELE INTRON

Genele eucariote contin secvente de codificare, exoni, intrerupte de secvente

necodificante, introni.Pentru a produce o proteina, lungimea unei gene este transcrisa la
inceput in totalitate, intr-o molecula foarte mare, numita ARN transcris primar.

Inainte ca ARN sa paraseasca nucleul, se indeparteaza enzimatic secventele intron si se

formeaza o molecula mai scurta de ARN.Dupa aceasta prelucrare, numita ARN-imbinare,
molecula de ARN trece in citoplasma ca ARNm si directioneaza sinteza unei anumite proteine.

6.CODUL GENETIC

Codul genetic reprezinta regula dupa care secventa de nucleotide dintr-o gena este
tradusa intr-o secventa de aminoacizi a unei proteine.

3
 Secventa de nucleotide din molecula de ARNm care actioneaza ca intermediar, este
citita in serie, in grupe de cate trei.Fiecare triplet de nucleotide, numit codon, specifica un
aminoacid.Pentru ca ARN este un polimer liniar format din patru tipuri de nucleotide, exista
43=64 de triplete, de codoni posibili.In structura proteinelor intra doar 20 de tipuri de
aminoacizi, ceea ce inseamna ca un aminoacid este specificat de mai multi codoni.Aceasta
inseamna ca codul genetic este degenerat.

7.ROLUL ARN de transfer(ARNt)

Translatia ARNm intr-o proteina depinde de o molecula ”adaptor”, care recunoaste si

un aminoacid, si un grup de trei nucleotide.Adaptorii sunt formati dintr-un set de molecule,
numite ARN de transfer, fiecare cu o lungime de 80 de nucleotide.

ARNt are o conformatie tridimensionala, de forma literei ”L”, ce contine regiuni

dublu catenare, tinute laolalta prin interactiuni necovalente de baze perechi.In molecula de
ARNt, care este monocatenara, perechile de baze complementare se formeaza intre
nucleotidele aceluiasi lant, ceea ce face ca molecula sa fie impachetata in mod particular.

O importanta speciala pentru sinteza proteinele o au doua serii de nucleotide

neimperecheate, aflate la cele doua extremitati ale moleculei.Una formeaza anticodonul, care
se imperecheaza cu tripletul complementar din ARNm(cu codonul), iar secventa CCA leaga
covalent aminoacidul specific.

8.ORGANIZAREA INFORMATIEI IN CELULA EUCARIOTA

Componenta informationala a celulelor eucariote este inclusa intr-un organit distinct,

numit nucleu.La exterior, nucleul este inconjurat de un invelis nuclear, la baza structurii caruia
sta o membrana dubla.Rolul primordial al invelisului nuclear este de a izola procesele genetice
esentiale(replicare ADN si sinteza ARN), de ribozomii citoplasmatici(la nivelul carora se
desfasoara sinteza proteinelor).

Nucleul eucariotelor contine ADN celular de dimensiuni foarte mari;astfel,

macromoleculele de ADN sunt impachetate pentru a incapea in nucleu.Impachetarea
organizata si distincta este asigurata de interactiunea dintre ADN si o serie de

4
proteine:histonice si nonhistonice.In urma asocierii acestor proteine cu macromoleculele de
ADN, rezulta fibrele de cromatina.

Macromolecula de ADN este un polimer lung si liniar, care contine mai multe milioane
de nucleotide aranjate in secvente neregulate, dar nu intamplatoare.Codul genetic, scris in
”cuvinte” de cate trei nucleotide(codonii), rezolva problema stocarii unei cantitati mari de
informatie genetica intr-un spatiu foarte mic.Fiecare molecula de ADN este impachetata intr-un
cromozom, iar informatia genetica totala este stocata in toatalitatea cromozomilor unei celule si
poarta numele de genom.

Genomul uman contine milioane de nucleotide, prezente in 24 de cromozomi(22

autozomi si 2 cromozomi sexuali diferiti), continand deci 24 de molecule de ADN.Intr-un
organism diploid exista doua copii din fiecare tip de cromozom, unul mostenit de la mama si
unul de la tata, astfel ca o celula umana tipica contine un total de 46 de cromozomi.

Principala functie a genomului este aceea de a produce molecule de ARN, care vor
codifica o anumita proteina(ARNm) sau vor avea rol structural(ARNt si ARNr).Fiecare regiune
din ADN, care produce o molecula functionala de ARN, formeaza o gena.Genele eucariote
contin portiuni lungi de ADN neinformational(numite introni), intercalat intre secventele
relativ scurte de ADN informational(numite exoni).

9.IMPACHETAREA MOLECULELOR DE ADN

Impachetarea ADN in celula eucariota este asigurata de interactiunea dintre ADN si o

categorie de proteine speciale, numite histone, precum si de alte proteine, numite proteine
cromozomiale nehistonice.In urma asocierilor create, rezulta fibrele de cromatina.

Histonele sunt proteine mici care contin o proportie foarte mare de aminoaicizi incarcati
pozitivi.Aceasta incarcatura pozitiva faciliteaza legarea lor de macromolecula de ADN.In
functie de structurile moleculare pe care le formeaza, histonele sunt de doua tipuri:histonele
nucleozomale H2A, H2B, H3 SI H4, si respectiv, histonele H1.

Histonele nucleozomale sunt responsabile de impachetarea primara a ADN, ceea ce duce

la formarea unei structuri numite nucleozom.Un nucleozom este format din 8 molecule de
histone nucleozomale, cate doua din fiecare tip, formandu-se astfel o particula proteica in
jurul careia se infasoara o portiune de 146 perechi de baze ale ADN.

5
 Doi nucleozomi se leaga intre ei prin ADN linker, cu o lungime de 60 de baze
perechi.Prin insiruirea nucleozomilor, se formeaza astfel fibra de cromatina de 30
nm.Moleculele de histona H1 sunt si ele responsabile de aceasta impachetare, asociindu-se la
nivelul ADN linker.

In timpul diviziunii celulare, filamentele foarte lungi de cromatina de 30 nm se

impacheteaza intr-o serie de bucle si formeaza cromozomii.

10.TRANSCRIPTIA

Sinteza moleculelor de ARN in nucleu se numeste ADN-transcriptie.Moleculele de ARN

produse sunt de mai multe tipuri:

ARNm:poarta informatia pentru sinteza unui lant polipeptidic

ARNr:intra in structura ribozomilor
ARNt:folosit ca molecula ”adaptor” in sinteza proteinelor.

ARN este sintetizat dupa o matrita de ADN prin procesul numit ADN-
transcriptie.Procesul transcriptiei este realizat de enzime speciale numite ARN-polimeraze.In
momentul inceperii transcriptiei, ARN-polimeraza se leaga de o secventa specifica de ADN,
numita promotor, care contine o secventa de 3 nucleotide, numita situsul start, ce incepe
sinteza ARN.Dupa legarea la promotor, are loc desfacerea dublu-helixului de ADN, unul din
lanturi actionand ca o matrita, astfel formandu-se un ARN nou sintetizat.Alungirea lantului de
ARN se continua pana cand se ajunge la o alta secventa de pe ADN, formata din 3 nucleotide,
numita semnal stop.

Eucariotele au trei tipuri de ARN-polimeraze:

ARN-polimeraza I:realizeaza sinteza ARN-ribozomal

ARN-polimeraza II:transcrie genele ale caror ARN va fi folosit pentru sinteza
proteinelor(ARNmesager)
ARN-polimeraza III:transcrie molecule foarte mici de ARN si toate moleculele de
ARNtransportor.

11.TRANSCRIPTIA ARNm REALIZATA DE ARN-POLIMERAZA II

6
 Pentru a recunoaste promotorul, ARN polimerazele au nevoie de o serie de proteine
ajutatoare, denumite factori de transcriptie(TF).ARN-polimerazele(I,II,III) recunosc diferite
secvente promotor si de-aceea, au nevoie de diferiti factori de transcriptie:TF I, TF II, TF
III.Factorii de transcriptie formeaza complexe relativ stabile cu promotorii specifici,
provocand initierea transcriptiei.

Cel mai important factor de transcriptie al ARN-polimerazei II este TF II D, ce este

reprezentat de un complex proteic mare, numit factor TATA, deoarece se leaga la un promotor
cu o secventa in care alterneaza timina(T), cu adenina(A).

Functia cea mai importanta a ARN-polimerazei II este aceea de a realiza sinteza tuturor
moleculelor de ARNm.

12.SINTEZA ARN ribozomal

O celula in crestere trebuie sa sintetizeze cel putin 10 milioane de copii de ARN

ribozomal pentru a-si construi cele aproximativ 10 milioane de ribozomi.O celula umana
contine circa 400 de gene pentru ARNr, care sunt transcrise de ARN-polimeraza I, iar produsul
transcris este ARN 45S.

Fiecare molecula de ARNm transcris poate fi folosita in translatia a aproximativ 10

molecule de proteine/minut.Prin folosirea unei singure molecule de ARN, se produc 10.000
molecule proteice.Datorita acestei ”amplificari”, in genom este suficienta existenta unei singure
gene.

Procesul amplificarii nu este insa posibil in cazul sintezei ARN-ului folosit in biogeneza
ribozomilor, deoarece aceste molecule de ARN sunt produsul final al transcriptiei genelor.De-
aceea, pentru a-si produce cantitatile adecvate de ARNr, genele din genomul celulelor eucariote
care codifica ARNr, se afla in copii multiple.Astfel, celulele umane contin aproximativ 200 de
copii de gene ARNr/genom haploid.Aceste copii sunt dispuse in mai multe serii, pe cinci din cei
23 de cromozomi.

13.BIOGENEZA RIBOZOMILOR

7
 Reactiile sintezei proteice, pentru a se desfasura, au nevoie de un complex
macromolecular care sa le ghideze.Aceste complexe sunt formate din proteine si ARNr si se
numesc ribozomi.Eucariotele au ribozomi 80S, formati din subunitatea mare 60S si
subunitatea mica 40S.

Genele ARNr sunt transcrise de ARN-polimeraza I.Fiecare gena produce acelasi tip de
ARN transcris primar, numit ARN 45S.Inainte ca sa paraseasca nucleul sub forma de particule
ribozomale asamblate, ARN 45S este procesat si clivat in cele trei molecule de ARNr matur,
care vor intra in structura subunitatilor ribozomale:

ARNr 18S:in subunitatea mica

ARNr 28S si 5,8S:in subunitatea mare.

A patra molecula de ARNr matur, numita ARNr 5S, este sintetizata intr-o alta parte a
genomului si intra in structura subunitatii mari ribozomale.Genele pentru sinteza acestui ARNr
au o lungime de 120 nucleotide si sunt transcrise de ARN-polimeraza III.

14.TRANSLATIA

Esentiala pentru intelegerea principiilor de baza dupa care are loc sinteza unei proteine
specifice la eucariote, este urmatoarea succesiune de procese:

Transcriptia, consta din copierea informatiei de pe ADN, intr-o molecula de ARN, si are
loc in nucleu.
ARN-procesarea, consta din prelucrarea ARN transcris primar si are ca rezultat o
molecula de ARNm.
Transportul ARNm matur, din nucleu in citoplasma.
Translatia consta in ”traducerea” informatiei din ”limbajul” folosit de ARNm,
reprezentat de o succesiune de nucleotide, in ”limbajul” unei proteine, reprezentat de o
succesiune de aminoacizi.Acest proces are loc la nivelul ribozomilor, in citosol.

Declansarea procesului de sinteza a proteinelor presupune formarea in citoplasma a unui

agregat molecular care sa contina urmatoarele componente:

Un ribozom, care constituie suportul intregului complex

O molecula de ARNm, care contine informatia dupa care trebuie sa se faca sinteza
O molecula de ARNt, care poarta aminoacizii

8
 O serie de factori si enzime.

15.PRINCIPIILE GENERALE ALE SINTEZEI PROTEINELOR

Dogma centrala a biologiei moleculare este:ADN-ARN-proteine, deoarece ADN

directioneaza sinteza ARN, ARN directioneaza sinteza proteinelor iar proteinele speciale
directioneaza sinteza de ADN, cat si de ARN.Toate cele trei categorii de molecule sunt
polimeri.

Sinteza lor se face dupa cateva principii generale comune.

(1) Proteinele si acizii nucleici sunt molecule formate dintr-un numar limitat de tipuri de
subunitati monomerice, in structura proteinelor intrand 20 de tipuri de aminoacizi, iar in
structura acizilor nucleici 4 tipuri de nucleotide.

(2) In timpul sintezei, subunitatile se leaga una cate una, pentru a forma in final
polimerul, asamblarea facandu-se ”treapta cu treapta” intr-o singura directie.

(3) Exista un punct specific de pornire a sintezei, iar cresterea moleculei are loc intr-o
singura directie, pana la un punct terminus, de la un semnal start la un semnal stop.

(4) Produsul primar este deobicei modificat, lanturile proteice si de ARN sunt deobicei
scurtate, iar lanturile de ADN sunt legate intre ele.

16.CODUL GENETIC DE PE ARN MESAGER (ARNm)

Acizii nucleici sunt polimeri liniari care contin patru tipuri de unitati
mononucleotidice.ARN contine ribonucleotide:A,C,G,U iar ADN contine
dezoxiribonucleotide:A,C,G,T.Deoarece 4 nucleotide nu pot specifica aranjarea liniara a celor
20 de tipuri de aminoacizi, codificarea unui aminoacid trebuie facuta de un grup de nucleotide.

O succesiune de 3 nucleotide a fost numit codon.61 din cei 64 de codoni posibili,

specifica un anume aminoacid.Deoarece exista 61 de codoni pentru cei 20 de aminoacizi, un
numar de aminoacizi au mai mult de un singur codon.De exemplu, serina, leucina, arginina, au
fiecare cate 6 codoni.Codonii diferiti pentru acelasi aminoacid au fost numiti codoni sinonimi
si din aceasta cauza codul genetic este considerat a fi un cod degenerat.

9
 Codonul start este AUG si specifica metionina.Alti codoni UAA, UGA, UAG nu
codifica niciun aminoacid si se numesc codoni stop.

17.ROLUL ARNt;Aminoacil-ARNt-sintetazele

Tripletele de baze din ARNm nu pot selecta aminoacizii direct, au nevoie de molecule
adaptor, reprezentate de ARN de transport (ARNt), ele avand rolul de a traduce informatia
codificata de un codon, intr-un aminoacid.Acest lucru este posibil deoarece ARNt contine
anticodonul pentru un anume aminoacid, dar si pentru ca se leaga specific de acest aminoacid.

ARNt are o conformatie tridimensionala, de forma literei ”L”, ce contine regiuni dublu
catenare, tinute laolalta prin interactiuni necovalente de baze perechi.In molecula de ARNt, care
este monocatenara, perechile de baze complementare se formeaza intre nucleotidele aceluiasi
lant, ceea ce face ca molecula sa fie impachetata in mod particular.

O importanta speciala pentru sinteza proteinele o au doua serii de nucleotide

neimperecheate, aflate la cele doua extremitati ale moleculei.Una formeaza anticodonul, care se
imperecheaza cu tripletul complementar din ARNm(cu codonul), iar secventa CCA leaga
covalent aminoacidul specific.

Recunoasterea intre molecula de ARNt si aminoacidul pentru care poarta anticodonul se

realizeaza de un set de 20 de enzime numite aminoacil-ARNt-sintetazele.In urma acestor
reactii, rezulta un aminoacil-ARNt.

18.ETAPELE SINTEZEI PROTEINELOR

INITIEREA SINTEZEI PROTEINELOR

Un ribozom poate participa la sinteza proteinelor doarece contine pe suprafata sa trei

situsuri specifice de legare a ARN-ului:

Situsul P, numit si situs peptidil-ARNt, corespunzator ultimului codon citit.

Situsul A, numit si situs aminoacil-ARNt, corespunzator codonului care urmeaza a fi
citit.
Situsul de legare a ARNm asigura asocierea ARNm cu ribozomul.

10
 Pentru ca un ribozom sa inceapa sinteza unui lant polipeptidic, este necesara o molecula
speciala de ARNt, numita ARNt-initiator, ce poarta aminoacidul corespunzator codonului start
AUG si reprezinta metionil-ARNt-initiator.

Catalizator pentru aceste procese sunt o categorie de proteine numite factori de

initiere(IF). Exista 6 factori de initiere:IF1,IF2,...,IF6.

ELONGATIA

Se desfasoara intr-un ciclu de trei etape.

In prima etapa, o molecula de aminoacil-ARNt se leaga la situsul A liber de pe ribozom,

prin formare de baze perechi intre ARNt si ARNm.
In a doua etapa, capatul carboxil din situsul P este legat la aminoacid, atasat la ARNt
din situsul A.Reactia este catalizata deenzima peptidil-transferaza.
In a treia etapa, noul peptidil-ARNt din situsul A este translocat in situsul P.Astfel,
situsul A ramane liber si leaga un nou aminoacil-ARNt.

TERMINAREA SINTEZEI

Semnalizarea terminarii procesului de translatie este realizata de codonii stop (UAA,

UAG, UGA).La codonii stop se leaga o categorie de proteine citoplasmatice numite factori de
terminatie(TF).Aceasta se intampla in momentul in care codonul stop ajunge sa fie expus in
situsul A al ribozomului.Sinteza completa a unei proteine dureaza 20-60 secunde.

19.REPLICATIA ADN

Replicatia ADN este procesul de copiere fidela a succesiunii de nucleotide din moleculele
de ADN, adica a informatiei genetice cu scopul transmiterii de-a lungul generatiilor.Procesul
este o reactie de polimerizare si are loc cu o rata de 500 nucleotide/secunda la bacterii si 50
nucleotide/secunda la mamifere.Viteza si acuratetea sunt asigurate de o masina replicativa.

FIDELITATEA REPLICATIEI ADN

Copierea ADN este un proces prin care secventa de nucleotide a ADN este duplicata prin
imperecherea complementara de baze, intr-o secventa nucleotidica complementara.Procesul
presupune recunoasterea fiecarui nucleotid si implica separarea celor doua lanturi
complementare ale dublului helix de ADN.

11
 Procesul este catalizat de ADN-polimeraza, substratul acesteia fiind
dezoxiribonucleotid-trifosfatii.ADN-polimeraza catalizeaza aditia ”treapta cu treapta” a
dezoxiribonucleotidelor, lantul nou sintetizat crescand in directia 5’-3’.

In timpul replicarii, fiecare catena veche de ADN serveste ca matrita pentru sinteza unei
noi catene, astfel secventa ADN fiind replicata semiconservativ de catre ADN-polimeraza.

FURCA REPLICATIVA

Regiunile aflate in miscare de-a lungul helixului au forma de Y si se numesc furci

replicative.

Lanturile de ADN sunt orientate antiparalel si mecanismul ar presupune ca un lant nou sa

creasca in directia 5’-3’, iar celalalt in directia 3’-5’.Astfel, furca replicativa ar avea nevoie de 2
ADN-polimeraze diferite.

La nivelul furcii replicative apar fragmente scurte de ADN, numite fragmente Okazaki,
care sunt sintetizate doar in directia 5’-3’.Dupa ce sinteza lor se incheie, ele sunt legate de
ADN-ligaza, pentru a forma lantul lung de ADN.

Furca replicativa are o structura asimetrica.Lantul nou de ADN se numeste lant

prioritar, deoarece sinteza sa precede sinteza celuilalt lant, numit lant tardiv.Sinteza lantului
tardiv ramane in urma sintezei lantului prioritar, deoarece fragmentele Okazaki s-au
desfacut.Sinteza fragmentelor Okazaki se face in sens invers sintezei lantului prioritat, tot in
directia 5’-3’, si de-aceea nu este necesara decat un singur tip de ADN-polimeraza in replicatia.

INITIEREA REPLICARII

Un cromozom uman este format dintr-o singura molecula de ADN, care contine 15
milioane de nucleotide perechi.

Pe cromozomii eucarioti este necesara existenta mai multor origini de replicare.S-a

evidentiat existenta a mai multe furci replicative, care se misca simultan.Furcile actioneaza
grupat, deci originile de replicare sunt activate grupat, grupurile numindu-se unitati
replicative.

CORECTAREA ERORILOR DE REPLICARE

Cele patru baze azotate ale ADN prezinta forme tautomerice, care se pot imperechea
gresit.

12
 Cel mai important mecanism de corectie este determinat de proprietatile ADN-
polimerazei.ADN-polimeraza nu poate incepe sinteza unui polinucleotid de la legarea a doua
nucleotide laolalta.Ea are nevoie de un capat 3’-OH liber, care sa se lege de lantul matrita, lant
numit primer.

Molecula de ADN de pe lantul matrita adaugat gresit nu poate reprezenta capat de

continuare a sintezei.ADN-polimeraza este capabila sa evite o imperechere gresita pentru ca are
o activitate 3’-5’ exonucleazica, o subunitate catalitica.

REPLICAREA PE LANTUL TARDIV

Pentru sinteza lantului prioritar, ADN-polimeraza are nevoie de o molecula primer, care
sa constituie punctul de plecare al alungirii lantului, adica a cate unui fragment Okazaki.

Producerea primerilor este realizata de ARN-primaza.

PROTEINELE DE LA NIVELUL FURCII REPLICATIVE

ADN-helicaza hidrolizeaza ATP pentru a se misca de rapid de-a lungul unei monocatene
de ADN.La nivelul furcii replicative functioneaza doua ADN-helicaze, una miscandu-se pe
nlantul primordial, iar cealalta pe lantul tardiv.

Proteinele helix-destabilizatoare, numite si proteine SSB, se leaga la catenele de ADN

desfacute din helix, fara a acoperi bazele.Ele stabilieaza forma desfasurata a monocatenelor,
prevenind astfel imperecherea bazelor din aceeasi catena.

Toate proteinele care intervin in mecanismul de replicatie formeaza un complex

multienzimatic care se misca rapid de-a lungul ADN.

Alaturi de aceste proteine mai intervine si ADN-topoizomeraza care evita ”incalcirea”

dublu-helixului de ADN in timpul despiralizarii sale.

20.INVELISUL CELULAR

Se considera ca invelisul celular este format din trei componente principale:plasmalema,

gliococalixul si corticala celulara.

13
 Plasmalema sau membrana plasmatica are o compozitie moleculara lipidica si proteica
complexa.Structura sa moleculara este in general unitara la toate celulele, precum si la toate
membranele intracelulare.

Glicocalixul se prezinta ca un invelis de natura glucidica, glicoproteica si glicolipidica, la

suprafata externa a plasmalemei.

Corticala celulara este reprezentata de o zona cu grosimea de 1-2mm din citoplasma

celulara din imediata vecinatate a fetei citoplasmatice a plasmalemei.La acest nivel exista
diferentieri fizico-chimice si structurale importante, care stabilesc relatii intre plasmalema si
citoscheletul celular.

Invelisul celular prezinta la suprafata celulei o serie de diferentieri cu rol important in

realizarea adeziunilor intercelulare:jonctiuni celulare, in marirea suprafetei celulare:microvili, si
in motilitatea celulara:cili, flageli, pseudopode.

Functiile invelisului celular sunt:functia de bariera fizica, de transport, de receptionare a

informatiilor, adeziune celulara, functia de aparare a celulei.

21.FOSFOLIPIDE MEMBRANARE

Principalele tipuri de lipide care intra in alcatuirea membranei celulare sunt:fosfolipidele,

colesterolul si glicolipidele.Toate cele trei categorii de lipide membranare au moleculele
amfipatice sau amfifile, ceea ce inseamna ca au un capat hidrofil si unul hidrofob, proprietate
extrem de importanta in formarea bistratului lipidic.

Fosfolipidele sunt de doua categorii:fosfogliceridele si sfingolipidele.

Fosfogliceridele au la baza o molecula de glicerol, la care doua grupari hidroxil sunt

esterificate acizi grasi;aceste lanturi de acizi grasi alcatuiesc partea hidrofoba a moleculei.La
majoritatea fosfogliceridelor membranare, ”coada” hidrofoba contine un acid gras saturat si
unul nesaturat.A treia grupare hidroxil este ocupata de o grupare chimica polara, ce va alcatui
portiunea hidrofila a moleculei.Gruparile organice polare sunt variabile, cele mai comune
fiind:colina(fosfatidilcolina), etanolamina(fosfatidiletanolamina), serina(fosfatidilserina),
inozitol(fosfatidilinozitol).

14
 Sfingolipidele au aceeasi structura spatiala cu a fosfogliceridelor, avand o grupare polara
hidrofila si doua lanturi hidrofobe.Cel mai raspandit sfingolipid este sfingomielina, care are la
baza structurii sale un aminoalcool cu lant lung(sfingozina), de care se leaga un acid gras
variabil.De gruparea hidroxil terminala a sfingozinei, se leaga prin legatura fosfodiesterica,
colina, contribuind la formarea capatului hidrofil.

22.GLICOLIPIDE MEMBRANARE

Glicolipidele membranare au o structura moleculara asemanatoare cu a sfingolipidelor,

deosebindu-se de acestea prin faptul ca in locul gruparii polare fosforilcolinice, au radicali
glucidici.Acesti radicali glucidici sunt orientate intotdeauna inspre fata externa a plasmalemei,
participand la formarea glicocalixului.

Dupa tipul glucidelor pe care le contin, glicolipidele sunt clasificate in doua

categorii:glicolipidele neutre si gangliozidele.

Glicolipidele neutre au radicali glucidici neutri, iar unul din cei mai cunoscuti este
galactocerebrozida, fiind sicel mai simplu.Galactocerebrozida este o componenta majora,
glicolipidica, a mielinei ce formeaza teaca axonilor neuronali;teaca de mielina este alcatuita din
membrane concentrice ale celulelor Schwann.

Gangliozidele sunt cele mai complexe glicolipide.Contin intotdeauna, pe langa radicali

glucidici neutri, si acid sialic.Gangliozidele alcatuiesc 6% din lipidele membrane neuronale, dar
sunt prezente si in alte membrane.

23.COLESTEROLUL MEMBRANAR

Membrana celulelor eucariote contine cantitati insemnate de colesterol, proportia fiind o

molecula de colesterol pentru fiecare molecula de fosfolipid.

Molecula de colesterol este amfifila, capatul hidrofil, polar, fiind reprezentat de gruparea
hidroxil a inelului sterolic, iar capatul hidrofob de lantul hidrocarbonat atasat la acest
inel.Datorita structurii bistratului fosfolipidic, in care moleculele de colesterol se insera intre
moleculele fosfolipidice, colesterolul influenteaza fluiditatea membranei.Astfel, colesterolul
impiedica miscarea libera a portiunilor externe a lanturilor de acizi grasi din bistrat dar, in

15
acelasi timp, desparte si indeparteaza regiunile interne ale acestora, ceea ce face ca zona interna
bistratului sa devina mai fluida.Un alt rol al colesterolului este acela de a scade permeabilitatea
bistratului la molecule mici, hidrofile si, de asemenea, creste flexibilitatea si stabilitatea fizica a
acestuia.

24.BISTRATUL FOSFOLIPIDIC

Datorita faptului ca moleculele lipidice membranare au proprietatea de a fi amfifile, ele

se dispun in structura membranei celulare intr-un dublu strat(bistrat lipidic), cu capetele
hidrofile orientate spre fata citoplasmatica, ir capetele hidrofobe spre interiorul
bistratului.Aceasta dispozitie ofera bistratului urmatoarele proprietati
particulare:autoasamblarea, fluiditatea si asimetria.

In urma studiului membranelor artificiale, se pot sintetiza pe cale artificiala, doua tipuri
de bistraturi lipidice:bistraturi care formeaza vezicule sferice numite liposomi si ”membrane
negre”, care sunt bistraturi plane formate pe suprafata unui mic orificiu, care separa doua medii
apoase.

Bistratul fosfolipidic este baza structurala a tuturor membranelor.S-a constatat totusi ca in

structura membranelor purificate nu intra doar lipidele, responsabile de integritatea structurala,
ci si proteinele, cu functii specifice.

25.PROTEINE MEMBRANARE

Unele proteine membranare traverseaza bistratul fosfolipidic o data sau de mai multe ori,
acestea fiind proteinele transmembranare.

Proteinele transmembranare sunt amfipatice, ele contin regiuni hidrofobe, dar si regiuni
hidrofile, expuse la apa, pe ambele fete ale membranei.Proteinele transmembranare au o
orientare unica in membrana.

Unele proteine membranare se asociaza cu bistratul prin intermediul unor lanturi

hidrocarbonate.Aceste proteine legate de lipide sunt grupate in trei clase:a)proteine ancorate la
glicozil-fosfatidilinozitol, fiind caracteristice pentru fata externa a membranei celulare,
ancorandu-se la bistrat printr-un glicolipid complex;b)proteine ancorate la miristat si proteine

16
ancorate la farnezil, ce se leaga intotdeauna pe fata citoplasmatica a membranei prin intermediul
acidului miristic sau printr-un lant policarbonat nesaturat farnezil.Acestea sunt proteine
transformate, deoarece sunt implicate in procese de transformare si diviziune celulara.c)Alte
proteine care nu patrund in interiorul hidrofob al bistratului si sunt legate pe o fata sau alta a
membranei prin interactiuni necovalente cu proteine transmembranare.Aceste proteine au fost
denumite proteine membranare specifice.

Marea majoritate a proteinelor transmembranare sunt glicozilate.Lanturile

oligozaharidice sunt prezente intotdeauna pe fata extracelulara a membranei.Caracterul
asimetric este accentuat si de gruparea sulfhidril (-SH) din cisteina.

26.MODELUL DE MOZAIC FLUID

Membrana e organizata dupa modelul de mozaic fluid care postuleaza ca:

lipidele si proteinele transmembranare sunt dispuse in mozaic;

membrana are o structura semifluida, atat lipidele, cat si proteinele, executand miscari de
translatie in planul bistratului lipidic;
fluiditatea implica existenta interactiunilor fizico-chimice slabe, necovalente intre
componentele moleculare;
fluiditatea e posibila doar in conditii de temperatura superioara;
bistratul are o structura bidimensionala, fapt rezultat din asimetria moleculelor din
membrana.

Membrana celulara poate fi imaginata ca fiind formata dintr-o ”mare lipidica”, in care
plutesc ca niste ”iceberguri” moleculele proteice.

27.STRUCTURILE SPECIALIZATE ALE MEMBRANEI CELULARE

Majoritatea celulelor animale sunt organizate in structuri multicelulare care formeaza

tesuturile.Asemenea celule isi pot indeplini functiile specifice doar daca membrana lor este
organizata in domenii distincte, fiecare prezentand specialitate.De-asemenea, pentru ca un tesut
sa aiba consistenta, celulele sale trebuie sa fie capabile sa stabileasca contacte foarte stranse
intre ele, numite jonctiuni celulare.

17
 Membranele celulare prezinta structura bidimensionala de mozaic fluid, fiind formate
dintr-o ”mare lipidica” in care plutesc proteinele.Majoritatea celulelor sunt capabile sa-si
imobilizeze proteinele membranare in zone specifice ale bistratului lipidic.De exemplu, in
celulele epiteliale din mucoasa gastrica sau din tubii uriniferi, proteinele transportoare sau
enzimele membranare sunt aglomerate la suprafata apicala a celulelor, pe cand alte proteine
membranare sunt imobilizate pe fetele laterale si bazale ale membranei.

Distributia asimetrica a proteinelor membranare este esentiala pentru functiile unui

epiteliu.Compozitia lipidica a celor doua domenii membranare(apical si bazo-lateral) este de
asemenea diferita, ceea ce inseamna ca celulele pot limita difuziunea libera nu numai a
proteinelor, ci si a lipidelor.Mentinerea distributiei separate a moleculelor lipidice si proteice in
membranele celulelor epiteliale este asigurata, in anumite cazuri, de existenta unor bariere
reprezentate de o categorie specifica de jonctiuni intercelulare(jonctiuni stranse).

28.JONCTIUNI DE OCLUZIE (STRANSE)

Jonctiunile stranse sunt formate din benzi subtiri care inconjoara celulele de jur imprejur.

Principala functie a tuturor epiteliilor este de a realiza o bariera cu permeabilitate

selectiva, separand astfel lichidele de pe cele doua fete, care au o compozitie chimica diferita.

Jonctiunile stranse prezente in epiteliul mucoasei intestinale sunt impermeabile pentru

substantele prezente in lumenul intestinal, astfel ca acestea nu pot difuza prin spatiile
intercelulare de pe fata opusa.Din aceasta cauza, substantele alimentare nu pot trece in
capilarele sanguine decat printr-un proces de transport transepitelial.

Jonctiunile stranse sunt formate dintr-o retea de siruri de molecule proteice anastomozate,
care inconjoara polul apical al fiecarei celule din epiteliu.Capacitatea jonctiunilor stranse de a
bloca trecerea ionilor prin spatiul dintre celule creste logaritmic cu numarul de siruri proteice
care formeaza jonctiunea.

Integritatea jonctiunilor stranse se pastreaza in prezenta concentratiei fiziologice a Ca2++

din spatiul intercelular;cand scade concentratia Ca2++, jonctiunile se dezintegreaza reversibil.De-
asemenea, tratamentul epiteliilor cu tripsina(enzima proteolitica) distruge jonctiunile stranse,
ceea ce demonstreaza ca proteinele sunt componenta lor esentiala.

18
 Functiile jonctiunilor stranse sunt:separa doua cavitati prin legarea stransa a celulelor
epiteliale, blocand difuziunea libera a moleculelor prin spatiile intercelulare si separa suprafata
celulelor epiteliale in pol apical si pol bazo-lateral.

29.JONCTIUNI DE ANCORARE

Jonctiunile de ancorare sunt abundente in tesuturile supuse unor solicitari mecanice

severe:muschiul cardiac, epidermul, colul uterin.

Jonctiunile de ancorare constau in doua forme structural si functional diferite:jonctiunile

de aderenta, care prezinta in citoplasma situsuri de conectare la filamentele de actina, si
desmozomii si hemidesmozomii, care prezinta in citoplasma situsuri de conectare la
filamentele intermediare.

Toate jonctiunile de ancorare au la baza organizarii lor, doua tipuri de proteine:proteine

intracelulare de atasare, care conecteaza complexul jonctional la elementele specifice ale
citoscheletului si glicoproteine transmembranare de legare, care se leaga la una sau mai
multe proteine de atasare intracelulare.

Jonctiunile de aderenta pot fi clasificate in:jonctiuni celula-celula si jonctiuni celula-

matrice.Caracteristic este faptul ca toate jonctiunile de aderenta au rolul dublul de a asigura
legarea celulelor intr-un tesut, dar si de a implica filamentele de actina.

Jonctiunile de aderenta celula-celula au forma unor benzi care inconjoara, ca un

cordon, polul apical al celulelor, imediat sub jonctiunea de ocluzie.Ele au fost denumite benzi
de aderenta.Pe fata citoplasmatica a benzilor se gasesc filamente de actina, la care se ataseaza
un complex de proteine de atasare, care contin vinculina.Astfel, se va forma, prin intermediul
glicoproteinelor transmembranare, o retea transcelulara.

Jonctiunile de aderenta celula-matrice conecteaza celulele si filamentele lor de actina

la matricea extracelulara.Pe membrana acestor celule se gasesc regiuni inalt specializate, numite
placi de adeziune(contacte focale), in care se vor termina filamentele de actina.Relatia celula-
matrice este mediata, in portiunea extracelulara, de o glicoproteina transmembranara cu functie
de receptor pentru fibronectina, care se va atasa la molecula de fibronectina din matricea
extracelulara, iar prelungirea intracelulara a glicoproteinei se va lega la o molecula de talina,
care la randul ei se leaga la vinculina si in sfarsit, la actina.

19
 Desmozomii sunt puncte de contact intercelular, sub forma de butoni, care leaga strans
celulele din diferite tesuturi.In functie de tipul celulei, filamentele intermediare pot
fi:keratina(celule epiteliale), desmina(celule musculare), vimentina(celule meningeale).

Hemidesmozomii sunt ”jumatati de desmozomi”, asemanatori morfologic, dar care

conecteaza suprafata bazala a celulelor epiteliale la lamina bazala, o structura speciala a
matricei extracelulare.

30.JONCTIUNI COMUNICANTE (GAP)

Regiunile jonctionale specializate caracterizate prin apropierea membranelor, intre ele

ramanand un spatiu de 15 nm, poarta denumirea de jonctiuni comunicante(jonctiuni gap).La
nivelul lor se afla o serie de proteine caracteristice.

Jonctiunile comunicante mediaza comunicarea dintre celule deoarece lasa sa treaca prin
ele ionii anorganici si alte molecule hidrosolubile mici.Astfel, se realizeaza cuplarea electrica si
metabolica a celulelor vecine.

O serie de particule cilindrice, numite conexoni, fac ca aceste jonctiuni sa fie

deosebite.Conexonii dintr-o membrana vin in contact cu conexonii din membrana celulei
adiacente, ceea ce determina formarea unor canale extrem de fine, prin care se conecteaza
citoplasma celor doua celule.

Un conexon este format din 6 molecule proteice diferite, numite conexine, care
alcatuiesc un hexamer.In centrul hexamerului se formeaza un canal care se continua cu canalul
conexonului din membrana celulei vecine.

In prezenta unei concentratii mai mari de ioni de Ca2++, canalele conexonilor se inchid,
impiedicand propagarea leziunii in epiteliu.Scaderea permeabilitatii jonctiunilor gap este
determinata si de scaderea pH-ului din citosol.

31.TRANSPORTUL MEDIAT DE PROTEINELE ”CARRIER”

Procesul prin care o proteina ”carrier” leaga specific si apoi transfera o molecula de pe o
fata pe cealalta a bistratului lipidic membranar, este asemanator cu o reactie enzima-
substrat.Din aceasta cauza, proteinele ”carrier” sunt considerate ca fiind enzime specializate.O

20
molecula proteica de tip ”carrier” are un situs specific de legare a substantei de transportat,
cu rol de substrat.Daca aceste situsuri de legare sunt saturate, rata de transport este
maxima.Deci, acest tip de transport are o viteza maxima, a carei valoare nu depinde de
concentratie.Transportul poate fi blocat cu inhibitori competitivi care se leaga la situsurile
active.

Clasificarea sistemelor de transport de tip ”carrier” sunt sisteme uniport, care transporta
un singur tip de molecula de pe o fata pe alta a membranei, sistem de transport cuplat, in care
transportul unei molecule depinde de transportul simultan al unei a doua molecule, in aceeasi
directie, si poarta denumirea de simport, sau in directie opusa, antiport.

Cu ajutorul proteinelor ”carrier” se realizeaza transportul pasiv al glucozei din mediul

extracelular, unde concentratia sa este foarte mare, in celula.Acest tip de transport este uniport,
si este cunoscut sub denumirea de difuziune facilitata.Atunci cand concentratia glucozei este
foarte scazuta, glucoza din lumenul intestinal si tubi uriniferi este transportata activ, dupa
principiul simport, impreuna cu Na+, a carui concentratie extracelulara este foarte mare. O alta
proteina ”carrier”, prezenta in membrana eritrocitului, functioneaza ca un sistemantiport
pentru ionii de Cl- si HCO3-.

Proteinele ”carrier” sunt proteine transmembranare capabile sa-si modifice

conformatia.La prima conformatie (”pong”), proteinele leaga pe domeniul extramembranar
molecula de transport, ceea ce determina schimbarea conformatiei in starea ”ping” si eliberarea
moleculei de cealalta parte a membranei.”Motorul” modificarilor conformationale poate fi un
gradient transmembranar de concentratie, transportul facandu-se de la o concentratie mare
la o concentratie mica, sau o sursa de energie, cum ar fi hidroliza ATP, impotriva gradientului
de concentratie.

32.TRANSPORTUL PASIV AL GLUCOZEI PRIN DIFUZIUNE FACILITATA

Transportul glucozei in eritrocite este extrem de specific.In transport este implicata o

proteina care, la fel ca o enzima, recunoaste substratul si il leaga prin interactiuni de
specificitate.Aceasta enizma a fost denumita transportorul de glucoza, glucozo-parmeaza sau,
cel mai corect, D-glucozo-parmeaza.

Dupa ce glucoza a fost transferata de pe fata externa a membranei in eritrocit, ea este

rapid fosforilata, formand glucozo-6-fosfat.Dupa fosforilare, molecula de glucoza nu mai poate

21
parasi celula si totusi, concentratia ei citoplasmatica scade.Acest lucru face ca gradientul de
concentratie sa fie mentinut la o valoarea ridicata, sistemul de difuziune facilitata continuand sa
importe glucoza.

D-glucozo-parmeaza leaga moleculele de glucoza pe fata externa a membranei, fapt ce

induce schimbarea conformationala, eliberand apoi glucoza pe fata citoplasmatica.Aceste
schimbari conformationale nu sunt induse de ATP, ci de existenta un gradient de glucoza, pasiv.

33.PROTEINELE ”CARRIER” CU ACTIVITATE ATP-azica

Au fost descrise 3 clase principale de enzime care hidrolizeaza ATP cu transportul ionilor
impotriva gradientului electrochimic.Deoarece hidrolizeaza ATP, ele se numesc ATP-aze si
sunt:ATP-azele din clasa P, ATP-azele din clasa V, ATP-azele din clasa F.

ATP-azele din clasa P sunt polipeptide transmembranare care se fosforileaza in timpul

procesului de transport.Aceasta clasa include:Na+,K+ ATP-aza, care transporta ionii de Na+
catre exteriorul celulei si ionii de K+ spre interiorul celulei, Ca2+ ATP-aza, care transporta
Ca2+ la exteriorul celulei.

ATP-azele din clasa V sunt transportori de protoni (H+) localizati in membrana

lizozomilor, mentinand pH-ul scazut din interiorul acestora.

ATP-azele din clasa F sau ATP-sintetaze se gasesc in membrana mitocondriilor si se

misca in sens opus fata de primele doua clase de ATP-aze, deoarece deplaseaza protonii in
sensul gradientului electrochimic cu sinteza de ATP din ADP si fosfat.

34.POMPA NA+,K+ATP-aza

Na+,K+ATP-aza functioneaza ca o pompa, asigurand transferul Na+ si K+ prin

plasmalema, impotriva gradientelor electrochimice.Pompa de Na+ si K+, prin hidroliza unei
molecule de ATP, ea scoate din celula 3 ioni de Na+ si introduce 2 ioni de K+.Proteina care
formeaza pompa Na+,K+ATP-azica este o proteina membranara complexa, care functioneaza
dupa sistemul antiport.

Legarea Na+ la situsul specific de legare dinspre interiorul celulei si legarea unui radical
fosfat (P) obtinut prin hidroliza ATP induc schimbarea conformationala si eliberarea Na+ la

22
exterior.In aceasta conformatie, devine activ situsul de legare al K+ din exterior, ceea ce duce
insa la pierderea gruparii fosfat (P).Pierderea fosfatului readuce molecula la conformatia
initiala, de plecare, si, in consecinta, determina eliberarea K+ in interiorul celulei.

Datorita gradientului de Na+ si K+ pe care il realizeaza, pompa Na+,K+ ATP-azica are

trei roluri importante:determina potentialul de membrana, controleaza volumul celular, intretine
transportul cuplat cu gradiente ionice.

35.TRANSPORTUL MEDIAT DE PROTEINELE CANAL

Proteinele canal din membrana celulara formeaza ”pori” hidrofili si sunt implicate in
transportul ionilor, de aceea se numesc canale ionice.Canalele ionice au trei proprietati
importante:transporta ionii de 100x mai repede decat proteinele ”carrier”, realizeaza un
transport pasiv, lasand ionii sa difuzeze in sensul gradientelor electrochimice, manifesta o
ridicata selectivitate, permitand trecerea doar a anumitor ioni.

36.CANALELE IONICE CU POARTA

Canalele ionice nu sunt niste simpli ”pori” membranari hidrofili, ci ele sunt deschise doar
tranzitoriu, ele fiind prevazute cu o ”poarta” a carei deschidere este comandata de perturbari
specifice ale membranei.In functie de factorul care determina deschiderea, ele se clasifica
in:canale cu poarta comandate de voltaj, a caror deschidere este cauzata de modificarea
potentialului de mebrana, canale cu poarta comandate de un stimul mecanic, a caror
deschidere este cauzata de aparitia unui stimul mecanic la suprafata celulei, canale cu poarta
comandate de un ligand, a caror deschidere este cauzata de legarea unei molecule
semnal:mediator extra/intracelular.

37.CANALE CU POARTA COMANDATE DE VOLTAJ

Pe cele doua fete ale membranei tuturor celulelor eucariote exista un potential electric,
determinat de compozitia diferita in ioni a citosolului si a lichidelor extracelulare, precum si de
permeabilitatea selectiva a membranei pentru diferiti ioni.

23
 Potentialul membranar de repaus este de aproximativ 60mV, fiind negativ la
interior.El este determinat, in principal, de o permeabilitatea relativ ridicata a membranei pentru
ionii de K+.

Un potential de actiune consta intr-o depolarizare scurta a membranei, urmata de o

hiperpolarizare rapida, si apoi de o revenire gradata la potentialul de repaus.Aceste
modificari sunt cauzate de o crestere rapida a permeabilitatii membranare pentru Na+, urmata
de o crestere mai lenta a permeabilitatii pentru K+.

Modificarile in permeabilitatea la Na+ sunt determinate de proteine membranare care au

functia de canale pentru Na comandate de voltaj.O alta categorie de canale, canalele pt K+
comandatate de voltaj se deschid repolarizand membrana, permitand efluxul ionilor de K+.

38.CANALE CATIONICE CU POARTA COMANDATE DE UN STIMUL

MECANIC

In urechea interna exista o categorie speciala de celule senzoriale pentru variatele tipuri
de mecanoreceptori.Ele prezinta la polul apical microvili, numiti stereocili si au fost denumite
celule paroase.Celulele paroase sunt localizate in labirintul membranos si sunt acoperite la
polul apical de o masa gelatinoasa a matricei extracelulare cu care vine in contact
direct.Miscarea masei gelatinoase apasa pe stereocili si produce o deformare mecanica, care va
genera un potential de receptor.

Conditiile ionice din labirintul membranos al urechii se caracterizeaza prin existenta unui
gradient electrochimic crescut pentru K+, si nu pentru Na+.Acestea sunt canale pentru K+
comandate mecanic.Miscarea stereocililor determina deschiderea canalelor si aparitia unui
curent de K+ care depolarizeaza membrana.

39.CANALE CU POARTA COMANDATE DE UN LIGAND

Canalele cu poarta comandate de un ligand sunt de o mare varietate, cu toate ca principiul

lor de a functiona este comun, diferentele apar in ceea ce priveste tipul de ligand care produce
deschiderea lor, precum si specificitatea la anioni si cationi.

24
 Canalele cationice dependente de un ligand extracelular sunt prezente cel mai adesea
la nivelul sinapselor, respectiv in membrana postsinaptica.Receptorul pentru acetilcolina este
cel mai cunoscut canal de acest tip.Rolul receptorilor pentru acetilcolina din jonctiunea
neuromusculara este de a converti semnalul chimic, reprezentat de o concentratie de
ligand(acetilcolina) eliberat de neuronul presinaptic, intr-un semnal electric sub forma de
potential electric din membrana postsinaptica.

Canale cu poarta comandate de un ion intracelular sunt prezente intr-o zona

specializata a membranei axonilor neuronali.Astfel, canalul pentru K+ dependent de Ca2+ se
deschide ca raspuns la cresterea concentratiei intracelulare a Ca2+, care apare in urma stimularii
repetate si prelungite a unui neuron.

Canale pentru Na+ comandate de GMP ciclic sunt prezente in membrana celulelor cu
bastonas din retina.In absenta unui semnal luminos, GMP ciclic este legat de canalele de Na+,
mentinandu-le deschise.Lumina activeaza rodopsina existenta in celulele cu bastonas, care
activeaza un lant de reactii biochimice, ce au ca rezultat fina disociere GMPc de pe canalele de
Na+, lasandu-le astfel sa se inchida.In acest fel, semnalul luminos este convertit intr-un semnal
electric.

Canalele de K+ comandate de proteina G sunt un tip particular de canale existente in

membrana celulelor musculare cardiace.Astfel, legarea acetilcolinei la receptorii din celula
musculara cardiaca, activeaza o proteina reglatoare numita proteina G, care la randul ei, va
activa direct canalele de K+ din membrana.

40.CANALE CU PIERDERE DE K+

Canalele cu pierdere de K+ reprezinta singurele canale fara poarta, deoarece nu exista un

semnal pentru a deschide.Sunt implicate in mentinerea potentialului de membrana, care depinde
in primul rand de activitatea pompei de Na+ si K+, dar si de canalele de pierdere a K+.Aceste
doua sisteme functioneaza impreuna pentru a genera un potential de membrana.

41.ENDO SI EXOCITOZA, endocitoza mediata de receptori

Macromoleculele, particulele, precum si formatiunile celulare simple ca bacteriile si

virusurile, nu pot patrunde in celule cu ajutorul proteinelor membranare de transport, ci ca

25
urmare a formarii de vezicule membranare care au capacitatea de a fuziona sau de a se
desprinde de plasmalema.

Exocitoza reprezinta impachetarea materialului intracelular in vezicule ce fuzioneaza cu

membrana celulara, continutul lor fiind eliminat in mediul extracelular.

Endocitoza reprezinta ingerarea materialului extracelular prin formarea de invaginatii ale

membranei.

Tipuri de endocitoza:

Pinocitoza:captarea de catre celula a unor picaturi mici din lichidul extracelular, prin
vezicule
Fagocitoza:captarea si ingerarea de particule cu marimi de mai multi micrometri (bacterii,
fragmente celulare), si se realizeaza astfel:

-celula emite pseudopode

-inglobeaza bacteria si o introduce in citoplasma

-bacteria ajunge la lizozomi, unde va fi digerata.

Exista doua tipuri de fagocite:macrofagele si leucocitele neutrofile.

Endocitoza mediata de receptori

Reprezinta procesul in care receptorii specifici de pe suprafata membranei recunosc o

molecula extracelulara, de care se leaga si pe care o endociteaza.Prin endocitoza mediata de
receptori, celulele capteaza selectiv proteine si mici particule din mediul extracelular.

Pe suprafata celulelor exista proteine membranare receptoare de care se leaga diferite

molecule, numite liganzi.Receptorii pot difuza liber in planul membranei; complexele ligand-
receptor se aglomereaza in mici regiuni ale membranei.

Endocitoza acestor complexe se produce la nivelul unor adancituri invelite, care apar la
suprafata celulara. Atat adancitura, cat si vezicula care se formeaza din ea, sunt invelite de un
strat proteic.Aceste vezicule cu invelis isi pierd invelisul, rezultand vezicule numite endozomi.

42.Rolul AMP-ciclic

26
 AMPc este o abreviere pentru adenozin (3’5’) monofosfatul ciclic, nucleotid sintetizat din
ATP.AMPc este mesager secund pentru mai multi hormoni, dar efectele sale difera semnificativ
in functie de tipul celulei.

Activitatea AMPc poate fi crescuta, daca se leaga de receptori B-adrenergici sau poate fi
inhibata, daca se leaga de receptori alfa2-adrenergici.AMPc determina atat stimularea
glicogenolizei, cat si inhibitia sintezei glicogenului.

In celulele neuroendocrine ale Ht, AMPc activeaza gena care codifica hormonul
somatostatina.

Totusi, toate efectele AMPc se exercita prin declansarea unor mecanisme celulare
similare: modifica activitatea unei clase speciale de enzime ca urmare a activarii unei enzime
numite protein-kinaza dependenta de AMPc.

43.ROLUL HORMONILOR IN SEMNALIZAREA CELULARA

Semnalele moleculare actioneaza asupra celulelor tinta, inducand in acestea modificari

care difera in functie de tipul celulei tinta respectiv de tipul de receptori pe care ii poseda aceste
celule.

Unele semnale induc modificari in activitatea uneia sau mai multor enzime prezente in
celula tinta. Astfel, celula raspunde rapid, intr-un interval de minute sau secunde. La animale,
majoritatea semnalelor care induc asemenea raspunsuri rapide sunt molecule hidrosolubile, care
se leaga specific la receptori membranari.

Alte molecule semnal sunt capabile sa isi exercite actiunea prin modificarea expresiei
genelor. In general, aceste molecule sunt mai putin solubile in solutii apoase, fiind insa
liposolubile. Ele produc in celulele tinta un raspuns lent si de durata. Asemenea efecte sunt
cruciale pentru influentarea cresterii celulare si a diferentierii.

44.RECEPTORII CARE ACTIVEAZA ADENILAT-CICLAZA

Adenilat-ciclaza este o enzima membranara care are un situs de legare a ATP pe fata
citoplasmatica a membranei.Activata de receptor, enzima sintetizeaza din ATP, pe fata
citoplasmatica, molecule de AMPc.Activarea nu se face direct de catre complexul ligand-

27
receptor, ci prin intermediul unei a treia proteine membranare, numita proteina reglatoare ce
leaga GTP sau proteina Gs.

In forma sa inactiva, proteina Gs exista ca heterotrimer, cu o molecula de GDP legata de

lantul alfa.Cand este activata, isi pierde GDP, legand in locul sau o molecula de GTP.Prin
legarea proteinei Gs cu GTP, se permite interactiunea cu adelinat-ciclaza, care este astfel
activata pentru a produce AMPc.

45.MESAGERI SECUNZI IN SEMNALIZAREA CELULARA

Alaturi de AMPc, ionii de Ca2+ reprezinta cel mai raspandit mesager secund implicat in
semnalizarea celulara.Diferenta intre concentratia ionica a calciului in mediul extracelular si
citosol este mentinuta de ATPaze, care pompeaza ionii de calciu, din citosol la exteriorul
celulei.

In celulele secretoare, cum sunt celulele beta din insulele Langerhans, cresterea
concentratiei Ca2+ declanseaza exocitoza veziculelor secretorii si eliberarea insulinei.In
celulele musculare netede, cresterea concentratiei Ca2+ declanseaza contractia iar in celulele
musculare striate, Ca2+ determina activarea degradarii glicogenului.

Inozitol-trifosfatul este un alt mesager secund si are rolul de a cupla activarea unor
receptori membranari cu eliberea calciului din veziculele intracelulare.Un alt mesager secund
rezultat din acelasi precursor ca si inozitol-trifosfatul este diacil-glicerolul, care este utilizat in
alte circuite de reglare a functiilor celulare.

46.RECEPTORII INTRACELULARI PENTRU HORMONII LIPOSOLUBILI

Principalii hormoni liposolubili sunt hormonii steroizi, tiroxina si acidul

retinoic.Receptorii pentru hormonii steroizi sunt reprezentati de proteine citoplasmatice sau
nucleare.In general, acesti receptori se afla in stare inactiva, fiind asociati cu proteine
inhibitoare care blocheaza situsul specific de legare a sa la o secventa specifica de
ADN.Legarea hormonului la receptor determina disocierea proteinei inhibitoare si activarea la
situsul de legare la ADN.

28
 Receptorii pentru hormonii liposolubili au in molecula lor 3 situsuri specifice:situsul de
legare al hormonului, situsul de legare a ADN si situsul de activare a genei.

47.RETICULUL ENDOPLASMATIC

Toate celulele poseda reticul endoplasmatic.El este format din membrane, care
delimiteaza o retea de canalicule extrem de ramificata.Spatiul marginit de aceste membrane
formeaza lumenul RE.

RE are un rol central in biosintezele celulare. Proteinele si lipidele din RE, aparatul
Golgi, lizozomii, se sintetizeaza la nivelul RE.

Deoarece proteinele sunt translocate in timpul sintezei lor, ribozomii responsabili pentru
aceasta sinteza trebuie atasati pe membrana RE. Acesti ribozomi legati la membrana formeaza
RE rugos.

Proteinele destinate insertiei in RE rugos contin la capatul amino-terminal o secventa de

AA, numita peptid semnal.

Peptidul semnal e ghidat spre membrana RE rugos de catre:

• particula de recunoastere a semnalului (SRP)

• receptorul pt SRP, ce leaga specific particulele SRP(=macromolecule complexe,
formate din proteine si ARN).

48.APARATUL GOLGI

Este un organit format din vezicule aplatizate sau sferice si dispus intre RE si membrana
plasmatica, respectiv intre RE si alte organite/lizozomi.

E format din 3 regiuni functionale:

• fata cis(de intrare):orientata spre elementele tranzitionale ale RE

• fata trans(de iesire):orientata spre periferia celulei
• fata mediala:formata din vezicule aplatizate, intre fetele cis si trans.

29
 Proteinele si lipidele ajung prin intermediul veziculelor, de la nivelul RE, la fata cis a
aparatului Golgi; de aici, trec pana pe fata trans, de unde se desprind de vezicule care transporta
moleculele catre alte destinatii.

Proteinele pot avea diferite destinatii:

• Destinatia secretiei celulare

• parte vor intra in structura membranei celulare periferice
• parte reprezinta enzime hidrolitice care vor fi impachetate in vezicule numite
lizozomi.

49.MITOCONDRIA

In celulele eucariote, catabolismul glucozei incepe in citosol, unde este convertita la

piruvat pe calea glicolizei.Rezultatul acestei reactii este formarea a 2 molecule de ATP si
reducerea a 2 NAD la NADH+H+. In celulele anaerobe, piruvatul poate fi metabolizat mai
departe pana la lactat sau etanol, plus CO2 concomitent cu reducerea NADH.

Cea mai mare parte a ATP-ului din mitocondrii este generat prin oxidarea piruvatului la
CO2.La inceput este convertit la acetilcoA.

NADH+H+ si FADH2 sunt obtinuti prin oxidarea in continuare a acetilcoA la

CO2.Oxidarea acetilcoA are loc pe parcursul unor reactii ciclice.

Mitocondria are forma cilindrica cu un diametru de 0,5-1 um. Este mobila si are
capacitatea de a-si modifica continuu forma.

Are 4 elemente structurale:

Membrana externa:foarte permeabila pentru moleculelecu greutate moleculara <10.000,

deoarece contine numeroase proteine canal.Alte proteine din aceasta membrana formeaza
enzimele implicate in sinteza lipidelor mitocondriale si enzime care convertesc lipidele in
produsii care sunt ulterior metabolizati in matrice.
Spatiul intermembranar:contine enzime care folosesc ATP-ul produs in matrice pentru
a fosforila alte molecule.
Membrana interna:plicaturata, formand creste care ii maresc suprafata.Aici se afla
inserate numeroase proteine, care au 3 functii:

30
 • Proteine care formeaza lantul respirator-asigura reactiile oxidative
• Complexul enzimatic numit ATP sintetaza-care produce ATP
• Proteine specifice de transport-asigura transportul metabolitilor in si din matrice.
Matricea:contine sute de enzime, dintre care cele mai caracteristice sunt cele necesare
pentru oxidarea piruvatului si a acizilor grasi, respectiv enzimele ciclului Krebs.
Contine si cateva molecule de ADN cu cateva copii identice ale genomului mitocondrial,
ribozomi de tip mitocondrial, ARN de transport si diferite enzime necesare expresiei genomului
mitocondrial.

50.CENTRIOLII SI CORPII BAZALI

Centriolii si corpii bazali sunt parte componenta a centrozomului, de forma unei structuri
microtubulare. Centriolii si corpii bazali sunt alcatuiti din 9 grupuri de cate 3 microtubuli,
aranjati sub forma de cilindru. Fiecare celula are 2 centrioli.

Fiecaretriplet de microtubuli contine:un microtubul complet subfibrila A, la care este

fuzionata o subfibrila B incompleta care fuzioneaza cu subfibrila C incompleta.

Centriolii si corpii bazali nu contin dubletul central de microtubuli care exista in structura
cililor si flagelilor.

Centriolii sunt dispusi perpendiculari unul fata de celalalt.

Corpii bazali sunt dispusi la baza fiecarui cil sau flagel.

Ciclul de replicare a centriolilor

Replicarea centriolilor se desfasoara in mai multe faze distincte, in functie de fazele

ciclului celular pe care le parcurge celula.

Centriolii noi cresc perpendicular pe fiecare membru al perechii vechi de centrioli, iar
procesul se termina in momentul in care celula intra intr-o noua mitoza.In mitoza, cele doua
perechi de centrioli formeaza cei doi poli ai fusului mitotic.

La fel ca si in replicarea centriolilor, corpii bazali se formeaza prin cresterea in unghi

drept pe corpii bazali vechi.Ulterior, corpii bazali nou formati se separa pentru a genera un nou
cil sau flagel.

ADN-ul centriolar

31
 Atat corpii bazali, cat si centriolii contin o mica molecula de ADN care codifica o serie
de proteine proprii structurii lor.Acest ADN a fost identificat prin studiul unor mutante, la care
cei doi flageli nu se puteau dezvolta.

Corpii bazali, ca si mitocondriile, contin un ADN ce controleaza functii importante ale

organitului.Centriolii apar mai tarziu in dezvoltarea embrionara, ceea ce dovedeste ca ei se pot
forma de novo.

51.LIZOZOMII

Lizozomii sunt vezicule membranare care contin o serie de enzime hidrolitice implicate
in digestia celulara a macromoleculelor.

Enzimele lizozomale, aproximativ 40 la numar, sunt hidrolaze acide, avand o activitate

optima la pH 5.Ele sunt proteaze, nucleaze, glicozidaze, lipaze, fosfataze.

Membranele lizozomale contin:

• proteine transportoare, pentru produsii care rezulta in urma digestiei

• pompa de protoni (H+), care utilizeaza energia ATP pentru a pompa H+ in
interiorul lizozomilor, mentinand pH-ul la 5
• proteine membranare glicozilate, ce asigura protectia membranei impotriva
autodigestiei.

52.MICROTUBULII

Se gasesc in citoplasma tuturor celulelor eucariotelor, exceptie in eritrocite.

Structura microtubulilor

Microtubulii sunt strucuri formate in urma asamblarii, polimerizarii, unor molecule

proteice numite tubuline.Tubulina este un dimer format din 2 polipeptide globulare. Cand
tubulinele se dispun in microtubuli, ele formeaza protofilamente.Un numar de 13
protofilamente, dispuse alaturat in jurul unui ax central, formeaza un microtubul.

32
 Asamblarea tubulinei in structura microtubulilor este un proces dinamic, care se face
polarizat:la un capat (+) se face polimerizarea, iar la celalalt capat (-), depolimerizarea.

Microtubulii sunt structuri stabile care apar in celula in functie de cantitatea de tubulina
sintetizata.

Polimerizarea si depolimerizarea

In vitro, tubulina formeaza microtubuli la 37 grade Celsius in prezenta GTP. Acest proces
necesita existenta unor microtubuli cu functie de ”primeri”. Tubulina se adauga progresiv la
capetele microtubulului preexistent.Aditia tubulinei se face preferential la capatul (+) cu o
viteza de doua ori mai mare fata de capatul (-); la fel si disocierea.La o anumita concentratie,
numita concentratie critica, se atinge un echilibru intre aditie si disociere.

In celule, cresterea si descresterea microtubulilor nu se poate face decat la capatul (+),

capetele (-) fiind orientate catre o zona din citoplasma, numit centrul de organizare al
microtubulilor. Acesta cuprinde centriolii si centrozomul.

53.CILI SI FLAGELI

Cilii si flagelii la majoritatea eucariotelor au o structura identica, ei difera prin lungime si

prin modul in care bat.Axul lor, care contine un manunchi de microtubuli, formeaza axonema,
ce este invelita de o extensie a membranei plasmatice.La baza, axonema se conecteaza cu
corpul bazal, care sunt formati tot din microtubuli si au un rol important in initierea cresterii
axonemei.

In axonema, microtubulii formeaza o pereche de microtubuli centrali (C1, C2), fiecare

format din 13 protofilamente, precum si 9 dublete de microtubuli periferici.Fiecare dublet se
conecteaza la perechea centrala de microtubuli prin molecule proteice care formeaza spitele
radiare.

Miscarea cililor si flagelilor este determinata de atasarea la fiecare dublet periferic a unei
proteine numite dineina.

Perechea de microtubuli centrali are rolul de a regla modul in care bat cilii si flagelii,
deoarece se conecteaza la proteine specifice cu care formeaza teaca interna.Fiecare dublet

33
periferic este conectat cu dubletul invecinat prin intermediul nexinei, a carei molecula prezinta
o elasticitate remarcabila.

Mecanismul moleculelor al miscarii cililor si flagelilor

”Motorul” care asigura bataia cililor si flagelilor nu se afla la baza acestora, ci in

axonema.Forta care produce miscarile ondulatorii provin din alunecarea unul fata de altul, a
dubletelor de microtubuli din axonema.

Forta care determina alunecarea microtublilor din axonema este determinata de

interactiunea dintre molecule de dineina asociate la subfibrila A a unui dublet, cu moleculele de
tubulina din structura subfibrinei B din dubletul invecinat.

54.MICROFILAMENTELE DE ACTINA

In toate celulele exista un al doilea tip de microfilamente, numite microfilamente de

actina, polimeri al caror monomer este actina.

Microfilamentele de actina, denumite actina F, sunt polimeri formati dintr-o proteina

globulara, actina G.

...prea multa informatie, vezi paginile 226-242.

55.PEROXIZOMII

Peroxizomii sunt organite celulare, delimitate de o singura membrana, prezente in toate

celulele eucariote.Proteinele peroxizomilor sunt sintetizate in citosol. Peroxizomii nu poseda
genom propriu si nici ribozomi.

Peroxizomii contin enzime oxidative, cum sunt catalaza si urat-oxidaza, in concentratii

atat de mari, incat pot cristaliza.Sunt principalul consumator de oxigen molecular, alaturi de
mitocondrii, si contin enzime care utilizeaza oxigenul molecular pentru a extrage atomii de
hidrogen din diferite substraturi organice, intr-o reactie oxidativa care produce peroxid de
hidrogen(H2O2).

Una din functiile importante este aceea de a degrada moleculele de acizi grasi prin reactia
de beta-oxidare.

34
 56.LANTUL TRANSPORTOR DE ELECTRONI

Deplasarea electronilor de la NAHD+H+ si FADH2, la O2 este catalizata de o serie de

proteine purtatoare de electroni organizate in trei complexe macromoleculare pe membrana
interna mitocondriala.

1. NADH-dehidrogenaza este cel mai mare complex enzimatic respirator si are rolul
de a accepta electronii de la NADH si de a-i transfera, cu ajutorul unei flavine si a
unei grupari prostetice, la ubiquinona, o molecula liposolubila mobila, care preia
electronii.
2. Complexul b-c1, care accepta electronii de la ubiquinona si ii transfera la
citocromul c, o proteina membranara mobila, care transporta electronii la al treilea
complex.
3. Citocrom oxidaza, accepta electronii de la citocromul c si ii transfera la O2.

57.SINDROMUL ZELLWEGER

Este o boala ereditara umana in care se manifesta o deficienta de peroxizomi, prin

lipsa aportului de proteine peroxizomale.La indivizii afectati, peroxizomii sunt lipsiti de
proteine specifice, ceea ce duce la afectiuni cerebrale, hepatice si renale, incompatibile cu
supravietuirea.Bolnavii mor la cateva zile de la nastere.Sindromul se datoreaza mutatiei genei
care codifica o proteina peroxizomala membranara, numita factorul 1 de asamblare a
peroxizomilor.

58.BOALA INCLUZIUNILOR CELULARE(boala celulelor I)

Enzimele lizozomilor din fibroblaste lipsesc in totalitate, astfel ca substraturile nedigerate

se acumuleaza sub forma de mari incluziuni.Cu toate ca in lizozomi lipsesc toate enzimele
hidrolitice, boala celulelor I este consecinta mutatiei unei singure gene.Mai mult, toate
hidrolazele care lipsesc din lizozomi pot fi gasite in sange in forma lor activa, ceea ce indica
faptul ca genele structurale care le codifica sunt neafectate.Anomalia isi are originea intr-un
defect de sortare la nivelul aparatului Golgi, ceea ce face ca hidrolazele, in loc sa fie incorporate

35
in lizozomi, sunt secretate.Hidrolazele nu pot fi impachetate in lizozomi deoarece le lipseste
manozo-6-fosfatul.

59.SINDROMUL KARTAGENER

Este o anomalie numita si sindromul cililor imobili.

Se manifesta prin sterilitate la barbati, afectiuni pulmonare si respiratorii cronice,

deoarece cilii celulelor mucoasei bronsice sunt imobili si nu pot curata caile respiratorii.Acesta
demonstreaza ca functia normala a cililor si flagelilor are un rol important in dezvoltarea
timpurie a embrionului.

In 50% din cazuri, indivizii prezinta o afectiune extrem de rara numita situs inversus in
care asimetria normala a corpului, adica pozitia viscerelor, este inversata.

60.HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIALA

Este o boala ereditara in care persoanele afectate prezinta valori mari ale colesterolului
sanguin.Aceste persoane poseda forme mutante ale receptorilor pt LDL.

Monozigotii pt alelele mutante mor la varsta tanara, de atac de cord cauzat de

ateroscleroza, ca urmare a formarii depozitelor de colesterol care obtureaza in cele din urma
arterele.

Heterozigotii poseda o alela mutanta pentru receptorul LDL si una normala, astfel ca
celulele lor contin jumatate din numarul receptorilor normali. Aceste persoane sunt mai expuse
la ateroscleroza, fata de indivizii normali.

Un om din 500 este heterozigot pt aceste alele, ceea ce face aceasta sa fie una din cele
mai comune afectiuni genetice.

R.Țui

36
37
 LP1. GLOSAR

1. Procariote: microorganisme uni/multi-celulare ce nu prezintă nucleu şi organite

delimitate de membrane. Domenii: bacteria şi archaea.
2. Eucariote: organisme cu celule având organizare internă complexă, cu citoschelet şi
organite delimitate de membrane. Structura caracteristică eucariotelor este nucleul
delimitat de o membrană dublă.
3. Nucleotid (sinonim mononucleotid): unitate constitutivă a acizilor nucleici formată
dintr-o bază azotată purinică (Guanina - G şi adenina - A) sau pirimidinică (Citozina
- C, timina - T, şi uracilul- U), pentoză (riboză/deoxiriboză), radical fosforic.
4. Acizii nucleici: polimeri mono/bicatenari lungi în care subunităţile sunt reprezentate
de nucleotide. Tipuri: acid deoxiribonucleic (ADN) sau ribonucleic (ARN).
Biomolecule informaţionale cu rol în stocarea, transmiterea şi transferul informaţiei
genetice.
5. ADN: acid dezoxiribonucleic - polimer lung, neramificat, format din patru tipuri de
subunităţi: A, C, G şi T. Nucleotidele sunt legate între ele prin legături fosfodiesterice
covalente stabilite între carbonul 5' al unei dezoxiriboze, cu carbonul 3' al celei
următoare. Acidul dezoxiribonucleic deţine, în secvenţa de nucleotide, informaţia
genetică pentru structura şi funcţia organismelor vii, o exprimă prin sinteza unui
ARNm şi a unei proteine specifice şi o transmite în succesiunea generaţiilor de celule
şi organisme. ADN este alcătuit din două catene polinucleotidice, spiralizate într-o
elice dublă. ADN intră în alcătuirea cromozomilor.
6. ARN: acid ribonucleic. Polimer lung, neramificat, format din patru tipuri de
subunităţi: A, C, G şi U. Spre deosebire de ADN scheletul zaharido-fosforic al ARN
conţine riboză în loc de dezoxiriboză. Tipuri: ARN mesager, ARN ribozomal şi ARN
transport.
7. Gena: a fost considerată de geneticienii clasici drept unitatea funcţională a eredităţii.
Sunt descrise 3 tipuri: I. gene transcrise în ARNmesager şi translatate în polipeptide
(stucturale). II. gene doar transcrise în ARN nu şi translatate (ex: genele pentru ARNr
şi ARNt). III. gene ce funcţionează ca reglatori ai expresiei primelor 2 tipuri (gene
reglatoare). În organismele diploide genele pot avea forme alternative – alele.
8. Fibra de cromatină: fibre rezultate din interacţiunea moleculelor ADN din celula
eucariotă cu proteine histonice şi ne-histonice. Intră în alcătuirea cromozomilor.
9. Cromozom: structură nucleoproteică cu localizare nucleară ce poartă informaţia
ereditară. Este format dintr-un filament foarte lung de cromatină de 30 nm, organizat
prin împachetare într-o serie de bucle. Numărul de cromozomi este o caracteristică de
specie. Număr de cromozomi per nucleu celulă somatică umană: 46.
10. Genom: totalitatea informaţiei genetice a unui organism. La om genom-ul total este
reprezentat de genomul nuclear şi cel mitocondrial.
11. Exoni (eucariote): secvenţe informaţionale ADN cu localizare intragenică ce se vor
exprima în ARN-ul matur. Denumirea lor se bazează pe faptul că sunt secvenţe ce se -
exprimă şi părăsesc – exit – nucleul. Sunt regiunile funcţionale din structura genei,
care, de obicei, codifică anumite părţi structurale şi/sau funcţionale distincte ale
proteinei, numite domenii. Numărul exonilor variază de la o genă la alta (intre 2 şi mai
mult de 50).
12. Introni: secvenţe neinformaţionale ADN cu localizare intragenică ce nu se vor regăsi
în ARN-ul matur. Numiţi şi “intervening sequences/IVS” (intercalate pentru că se
interpun între exoni). Numărul intronilor este cu unul mai mic decât cel al exonilor, iar
lungimea lor este variabilă, neconcordantă cu a exonilor, de obicei mai mare. Ei pot
lipsi la anumite gene (ADN mitocondrial, genele pentru histone, angiotensină,
receptori beta-adrenergici)
13. Codon: unitate de codificare ce foloseşte 3 nucleotide din ADN sau ARNm. Există 61
de codoni pentru cei 20 de aminoacizi, 3 codoni fiind de stop informaţional.
14. Replicare: Procesul de copiere fidelă a succesiunii de nucleotide din moleculele de
ADN, deci a informaţiei genetice, în scopul transmiterii acesteia de-a lungul
generaţiilor celulare, se numeşte replicare ADN.
15. Transcripţie: copierea secvenţei ADN într-o secvenţă de baze complementare de
ARN.
16. Translaţie: este procesul prin care mesajul genetic, reprezentat de secvenţa de baze
azotate a ARN mesager, este tradus într-o secvenţă de aminoacizi corespunzătoare.
Procesul are loc în citoplasmă, la nivelul ribozomilor şi reprezintă sinteza proteinelor.
17. Vector: acid nucleic care este capabil de autoreplicare şi menţinere într-o celulă gazdă
şi care poate fi utilizat pentru clonarea unei gene sau a unui fragment ADN.
18. Clonă: populaţie de celule identice rezultată prin mitoze succesive dintr-o singură
celulă diploidă ancestrală.
19. Sondă ADN: o secvenţă de ADN marcată fluorescent sau radioactiv folosită pentru
identificarea unei gene.
20. Enzimă de restricţie: endonucleaze de origine bacteriană care secţionează moleculele
de ADN dublu catenar la nivelul unor situsuri de recunoaştere specifice.
 LP 02. Principiile microscopiei optice. Tipuri speciale de microscopie optica.
Microscopul electronic. Principii. Interpretarea imaginilor de ME.

Un rol important in studiul tesuturilor si celulelor il are microscopia. Microscopul optic este
acel tip de microscop care utilizeaza lumina vizibila si un sistem de lentile pentru a mari imaginea.
Microscoapele optice sunt cele mai vechi si mai simple microscoape i pot fi folosite in medicina
pentru analize sau pentru cercetare in diferite discipline: microbiologie, hematologie, dermatologie,
stomatologie, etc.

Baz:orne PIIIChete
Eozlnofile sanguine

Umtoclte
Neutrof1le Monocite
Celulele
sanguine rolJll

Fig. 1 Tipuri de celule existente in sange

COMPONENTELE MICROSCOPULUI OPTIC

Microscopul optic binocular, cel mai utilizat tip de microscop optic, este alcatuit din
sistemul mecanic, sistemul optic si sistemul de iluminare.
1. Sistemul mecanic cuprinde:
Talpa (piciorul) – la nivelul ei se gaseste sursa de lumina si diafragma; are rol in
stabilitatea microscopului;
Coloana (manerul)

1
 Platina (masuta) – are rol in sustinerea preparatului, fixat cu ajutorul a doua piese metalice
numite valeti sau cavaleri. Platina poate fi deplasata anterior-posterior, latero-lateral cu
ajutorul unui dispozitiv numit car mobil. In centru prezinta o deschidere care permite razelor
luminoase emise de sursa sa ajunga la preparat.
Tubul microscopului – poarta ocularele
Revolverul – este alcatuit din doua calote metalice suprapuse, cea superioara este fixa, iar
cea inferioara poarta obiectivele.
Dispozitivul de reglare a imaginii – alcatuit din viza macrometrica (macroviza) cu rol in
prinderea imaginii de ansamblu si in ridicarea si coborarea coloanei microscopului; viza
micrometrica (microviza) cu rol in clarificarea imaginii.

2. Sistemul optic cuprinde:

Obiectivele – alcatuite dintr-un sistem de lentile, din care numai cea frontala (inferioara)
serveste la formarea imaginii, celalalte lentile ale obiectivului avand rolul de a corecta
greselile optice ale lentilei frontale. Distanta dintre lentila frontala si preparat se numeste
distanta frontala. Diferenta esentiala intre obiectivele microscopului este data de puterea de
marire a fiecaruia. Obiectivele sunt de doua tipuri:
obiective uscate – au puterea de marire de 6X, 10X, 20X, 40X
obiective cu imersie – au puterea de marire de 60X, 90X, 100X. Sunt denumite
astfel deoarece intre lentila frontala si preparat se afla un lichid (ulei de cedru, ulei
de parafina) care are un indice de refractie apropiat de cel al sticlei, eliminandu-se
astfel refractia.
Ocularele – se afla in partea superioara a tubului microscopului. Ocularul este alcatuit din
doua lentile plan-convexe, orientate cu fata plana in sus. Puterea de marire a ocularelor este
de 7X, 10X.
Puterea de marire a microscopului optic este data de produsul dintre puterea de marire a
ocularului si cea a obiectivului folosit.
Sistemul de iluminare – situat in talpa microscopului. Cuprinde un bec de 6 sau 12 V, o
oglinda plana, diafragma si condensatorul.

2
 oculAr
ocular___.-----:
t ub
l lonllla observatorul

Itbulon focu• fin

c.ondtln• • t 0tul - - - -....;;

di•fragma
oporturll

Fig2

Fig. 2 Microscopul optic

PUTEREA DE REZOLUTIE

Cu ajutorul microscopului optic pot fi vizualizate entitati distincte, aflate la o distanta de

0,2 m. Limita fundamentala a tuturor microscoapelor este aceea ca un anumit tip de radiatie nu
poate oferi detalii structurale mai mici decat lungimea sa de unda. Limita rezolutiei microscoapelor
optice este determinata de lungimea de unda a luminii vizibile, intre 400nm (violet) si 700nm
(rosu). Astfel, bacteriile si mitocondriile (care au o dimensiune de aprox. 500 nm) sunt cele mai
mici structuri a caror forma poate fi distinsa clar cu ajutorul microscopului optic. Figura 3 reda
marimea structurilor celulare si subcelulare si intervalul dimensiunilor vizualizate cu fiecare tip de
microscop.

3
 1cm

plant
cell
animal
cell

bacterium

virus
ribosome

globular
protein

small
molecule
atom
0 .1 nm
11 A)
Figure g.2 Molecular Biology of the Cell S/e (Cl Gariand Science 2008)

Fig. 3. Dimensiunile celulelor si componentelor celulelor redate pe o scara logaritmica, indicand

intervalele obiectelor care pot fi vizualizate de catre ochi, microscop optic si microscop electronic.

Rezolutia unui sistem optic reprezinta distanta minima la care pot fi percepute separat doua
entitati distincte. Puterea de rezolutie depinde atat de lungimea de unda a luminii utilizate, cat si de
apertura numerica a sistemului de lentile utilizat. Apertura numerica este o masura a deschiderii
“pupilei” microscopului.

Legea lui Abbe:

d0=0,6 /nsin
d0 = rezolutia (d0ochi = 100µ m, d0microscop optic=0,2 µ.m, d0microscop
electronic=1-2Å)
= lungimea de unda a luminii
n = indice de refractie (naer=1, nsticla-1,52, nulei de imersie=1,52)
a = unghiul de apertura
nsina = NA=apertura numerica

4
 LENSES RESOLUTION: the resolving power of the
minoscope depends on the width of the
cone of illumination and the.refore on both
the conden,er and the objective lens. It is

....,.......
IMAGE
calculated using the formula
resolution = · ~
0 61
~ collects a corne of, n sin 9
light rays to create where:
spec an image 8 = half the angular width of the cone of
rays collected by the objective lens
~ the condenser lens from a typical point in the specimen
focuses a cone of (since the maximum width is 180°,
light rays onto sin 8 has a maximum value of 1)
each point of the n = the refractive index of the medium
LIGHT specimen (usually air or oil) separating the
specimen from the objective and
condenHr lenses
X :!!!I the wavelength of light used {for white
light a figure of 0.S3 µmis commonly
assumed)

NUMERICAL APERTURE: n sin 8 in the
equation above Is called the numerical aperture
of the lens (NA) and is a function of its light•
collecting ability. For dry lenses this cannot be
more than 1, but for oil-immersion lenses it can
be as high as 1.4. The higher the numerical
aperture, the greater the resolution and the
brighter the image (brightness is important in
fluorescence microscopy). However, this ad van•
tage Is obtained at the expense of very short
working dis tances and a very small depth
Offield.

Fig.4. Legea lui Abbe.

PRINDEREA IMAGINII LA MO

Se aduce obiectivul de 4X in axul optic;

Se ridica obiectivul la punctul maxim cu ajutorul macrovizei;
Se fixeaza preparatul microscopic pe platina cu ajutorul valetilor;
Se ridica condensatorul la punctul maxim;
Se aduce in axul optic o portiune de tesut cu ajutorul carului mobil;
Se coboara condensatorul;
Se regleaza distanta pupilara privind in microscop;
Se coboara obiectivul pana la punctul minim cu ajutorul macrovizei;
Se ridica obiectivul pana in momentul prinderii imaginii;
Se clarifica imaginea cu ajutorul microvizei;
Se aduce in centrul campului microscopic portiunea de tesut care prezinta interes, dupa care, prin
rotirea revolverului de deplaseaza, pe rand, obiectivele cu putere de marire mai mare in axul optic;
Examinarea cu imersie presupune punerea unei picaturi de ulei pe suprafata preparatului
microscopic si aducerea in axul optic a obiectivului cu imersie, dupa care se clarifica imaginea;
Dupa terminarea examinarii, obiectivul de 4X se aduce in axul microscopului, se inlatura preparatul
microscopic, se coboara condensatorul.

5
VARIANTE DE MICROSCOPIE (MO, MF, ME); VARIANTE DE ME
(transmisie, scanare)

Microscopul optic

Acesta este cel mai comun tip de microscop. Puterea de marire variaza intre 10 si 1000 de
ori dar poate merge pana la 1500x sau 2000x.

In cazul acestui tip de microscoape, pentru a obtine o imagine marita, lumina are un traseu
unic care trece printr-o serie de lentile – in linie – fiecare lentila marind imaginea deja marita de
lentila care a precedat-o. Pe scurt: un singur traseu al luminii si mai multe lentile.

10tl%
plasma

element
f%"9g
GI) f. ,
figurat

Fig. 5 Frotiu de sange periferic

Procesare si analizarea imaginilor cu ajutorul tehnicilor digitale

Procesarea imaginilor a avut un impact major asupra tehnicilor de microscopie optica.

Utilizarea sistemelor electronice a permis depasirea a doua limitari majore ale ochiului uman:
imposibilitatea de a vedea clar in lumina obscura si imposibilitatea de a percepe diferente mici ale
intensitatii luminii atunci cand fundalul este luminos. Pentru a creste abilitatea de a observa celulele
in conditii de iluminare slaba, o camera CCD (charge-coupled device) poate fi atasata

6
microscopului. Asemenea camere sunt deosebit de importante pentru a vizualiza molecule
fluorescente in celule vii.
Deoarece imaginile preluate de camerele CCD sunt in forma electronica, ele pot fi cu
usurinta procesate pentru a se obtine o cantitate foarte mare de informatii.

Microscopia cu fluorescenta

Moleculele fluorecente absorb lumina cu o anumita lungime de unda si emit lumina cu o

lungime de unda mai mare decat cea absorbita. Daca un astfel de component este iluminat cu o
lumina pe care o absoarbe, si apoi este vizualizat utilizand un filtru care permite doar trecerea
luminii emise, aceasta lumina va straluci pe un camp intunecat. Deoarece campul este intunecat,
chiar si o cantitate infima de lumina emisa va fi detectata.
Colorantii fluorescenti utilizati pentru a colora celulele sunt vizualizati cu ajutorul
microscopului cu fluorescenta. Acest microscop este similar cu un microscop optic obisnuit, cu
exceptia faptului ca lumina, emisa de o sursa foarte puternica, este trecuta prin doua seturi de filtre -
unul pentru a filtra lumina inainte ca aceasta sa ajunga la specimen, celalalt pentru a filtra lumina
emisa de specimen. Primul filtru permite doar trecerea luminii cu lungimea de unda care excita
colorantul utilizat, iar cel de-al doilea blocheaza lumina, permitand trecerea doar a luminii cu
lungime de unda corespunzatoare celei emise de colorant (Fig. 5).

eyepiece ---m
3 3 second barrier filter: cuts out
unwanted fluorescent signals,
passing the specific green
fluorescein emission between
LIGHT 520 and 560 nm
SOURCE

2 beam-splitting mirror: reflects

light below 510 nm but
transmits light above 510 nm
1 first barrier filter: lets through
only blue light with a wavelength objective lens
between 450 and 490 nm
object

Fig. 6 Sistemul optic al microscopului cu fluorescenta

7
 Microscopia cu fluorescenta este utilizata pentru a detecta proteine specifice sau alte
molecule din celule sau tesuturi. O tehnica foarte utilizata presupune atasarea unui colorant
fluorescent unui anticorp, care se va lega foarte specific de macromoleculele impotriva carora a fost
produs. Doi coloranti fluorescenti sunt frecvent utilizati pentru acest scop: fluoresceina, care emite
o lumina verde intensa atunci cand este stimulata cu lumina albastru deschis, si rodamina, care
emite o lumina rosie atunci cand este stimulata cu lumina galben-verzuie. Prin atasarea
fluoresceinei la un anticorp si a rodaminei la alt anticorp, distributia diferitelor molecule poate fi
urmarita in aceeasi celula; cele doua molecule sunt vizualizate separat, prin schimbarea seturilor de
filtre, fiecare specific pentru fiecare colorant. In figura 6 se observa utilizarea a trei tipuri de
coloranti, in acelasi mod descris mai sus, pentru a distinge diferite tipuri de molecule in aceeasi
celula.

lOµm
figure 9·1 S Mole,cul•r 8iology of the Celt 5/e IC Garland Science 20081

Fig. 7. Microscopie fluorescenta cu utilizarea a trei coloranti diferiti

8
Microscopia Electronica
Principial, microscopia electronica (ME) este identica cu cea optica, dar diferenta majora
consta in natura sursei de iluminare a preparatului, ME foloseste pentru iluminarea preparatului un
fascicul de electroni in loc de radiatii fotonice (lunina), iar in loc de lentile optice, foloseste lentile
electromagnetice.
Microscopul electronic este un tip de microscop care utilizeaza electroni pentru a ilumina un
preparat si a crea o imagine marita. Spre deosebire de microscoapele optice, microscoapele
electronice au o rezolutie mult mai mare (pana la 1Å) si o putere de marire de pana la 2.000.000x.
Aplicatii: Cu ajutorul microscopului electronic se pot obtine informatii despre conformatia
moleculelor proteice, transportul la nivelul membranelor celulare, configuratia acizilor nucleici,
structura virusurilor etc.
Principiul de functionare se bazeaza pe folosirea unui fascicul de electroni generati de un tun
electronic. Electronii sunt supusi unor tensiuni de accelerare, fiind focalizati la trecerea lor prin
campuri electromagnetice pentru a forma imaginea.
Microscopia electronica de transmisie (TEM)
Utilizeaza un fascicul de electroni care traverseaza preparatul, iar prin intermediul
sistemului de formare a imaginii se obtine pe ecranul fluorescent imaginea preparatului examinat.
Elementele unui microscop tip TEM sunt urmatoarele: sistemul electrono-optic (coloana
Si
microscopului), sistemul electronic i consola de comand
s i respectiv, sistemul de vid (Figura 8).
TEM utilizeaza un fascicul de electroni care trece prin preparat. Electronii sunt emisi de un
catod din tungsten incalzit pana la incandescenta. Intre acesta si anod se genereaza o diferenta de
potential (tensiune de accelerare) de 50.000-100.000 V. Aceasta tensiune de accelerare determina
formarea unui fascicul de electroni care se propaga dinspre catod spre anod si de aici in sistemul
electrono-optic al microscopului. O serie de lentile electromagnetice condensor focalizeaza
electronii pe preparat. Lentilele electromagnetice obiectiv si proiector focalizeaza in continuare
electronii care au trecut prin preparat, asigurand formarea imaginii pe un ecran fluorescent.
9
 electron
gun
- - light source

specimen

objective lens

viewing
screen or
photographic
film
Figure9-42 part 1 of2 MolecularBiologyotihe Celt 51• {O G.1.t.ndSden<.el008)

Figura 8. Principalele componente ale microscopului optic obisnuit si ale TEM

10
 Microscopia electronica de baleiaj (Scanning Electron Microscopy - SEM)

Observarea sectiunilor prin TEM permite doar aprecierea bidimemsionala a structurii unei
celule.
Un microscop electronic de baleiaj (SEM) poate produce direct o imagine tridimensionala a
structurii suprafetei unui specimen. In timp ce TEM utilizeaza electronii care au trecut prin
specimen pentru a produce o imagine, SEM utilizeaza electronii care sunt emisi de la suprafata
specimenului. Specimenul care urmeaza sa fie examinat este fixat, uscat si acoperit cu un strat
subtire dintr-un metal greu. (Figura 9, 10). Microscopul de tip SEM foloseste un fascicul de
electroni care parcurge fiecare punct al replicii suprafetei preparatului (scaneaza). Moleculele
bombardate cu astfel de electroni produc reflectia acestora, sau emit electronii secundari, care sunt

electron
gun

condenser
lens

objective
lens

electrons from
specimen

specimen

apoi captati de un detector de scintilatie si formeaza un semnal pe un tub catodic (ecran video).

CYTOSOL

Figura 9. Microscopul electronic de baleiaj

Figura 10. Porul nuclear vizualizat cu ajutorul microscopului electronic de baleiaj

11
Pregl tirea probelor pentru analizi

Pentru a obtine maximum de informatii furnizate de un preparat, acesta trebuie sa

indeplineasca urmatoarele conditii:
- Celulele sa-si pastreze caracteristicile cat mai aproape de aspectul ‘’in-vivo’’
(prcesul se numeste ‘fixare’)
- Preparatul sa fie transparent pentru a permite trecerea fascicululuiluminos/ de
electroni
- Preparatul sa fie expus intr-un strat cat mai subtire astfel incat sa fie present un
singur strat de cellule
- Preparatul sa fie colorat corespunzator pentru a permite identificarea diferitelor
elemente componente.

Fixation and embedding in

parafflll

Microtome sections
(standard, supcrfrosi, RNAsc free section, serial sections, ... )

Slide staining automate (discovcryXT)

for immunobistochemistry
and in si tu hybridization

Fig. 11 pregatirea probelor pentru evaluarea microscopica

12
Intrebari

Enumeratie componentele MO.

Definiti legea lui Abbe.
Enumerati tipuri de microscopie si prezentati principiul de functionare.
Enumerate diferentele intre MO si ME.

13
 LP.3 Tehnici de evaluare structurali tji functionali a
organitelor celulare.

Citoplasma este formata din doua compartimente:

l .Citoplasma nestructurata sau hialoplasma (substanta fundamentala a
citoplasmei),
2.Citoplasma structurata sau morfoplasma, reprezentata de organitele celulare.
in afara de organitele celulare, in citoplasma se pot gasi incluziunile celulare,
produ~i de secretie ~i acumulari de produ~i exogeni.

Clasificarea organitelor celulare dupi functia lor in celuli:

A. Organitele sintezei $i secretiei

celulare: D. Organitele motilitiitii celulare:
-reticulul endoplasmic, -microfilamentele,
-ribozomii, -microtubulii,
-complexul Golgi. -centrul celular.

B. Organitele generatoare de energie: E. Incluziuni celulare

- mitocondriile. - substante proteice, de exemplu
hemoglo bina;
C. Organitele digestiei celulare: - lipide, sub forma de picaturi sferice
-lizozomii, - glicogen-
. ..
-perox1zom11. - substantele minerale - fier, siliciu

1
A. ORGANITELE SINTEZEI SI SECRETIEI CELULARE:

1. RETICOLUL ENDOPLASMIC

Definitie Este un organit membranar, reprezentat de un sistem de canalicule §i

cisteme delimitate de endomembrane trilaminate cu o grosime de 5-6
nm.
Localizare Comun tuturor celulelor cu exceptia hematiei adulte
Numir Este prezent in numar mare in celulele angajate in sinteze de proteine,
glucide §i lipide, fiind bine dezvoltat in celulele secretorii exo- §i
endocrine.

Tipuri: - RE neted - RE rugos (granular)

Reprezentare in REN este bine reprezentat in RER este bine reprezentat in

celule celulele care sintetizeaza hormoni celulele glandulare (pancreatice),
steroizi (glanda SU prarenala, in hepatocite (unde formeaza
celulele)nterstiµale din testicul §i corpii Berg), in celulele nervoase
ovar), glicogen (hepatocite) §i (unde formeaza corpii lui Nissl).
pigmenti (melanocite).

Forma , dimensiuni Este un sistem de canalicule §i Este un ansamblu de structuri

cisteme delimitate de canaliculare §i veziculare
endomembrane trilaminate cu 0 membranare, cu diametru de
grosime de 5-6 nm. aproximativ 20 nm, pe suprafata
carora se gasesc ata§ati ribozomi,
prin subunitatea mare §i care
sintetizeaza proteine de export.

Organizare Nu este vizibil la microscopul Este vizibil la microscopul fotonic

structurala -MO fotonic. datorita prezentei ribozomilor

Organizare Apare ca un labirint de canalicule Apare sub forma de saci aplatizati

ultrastructurala- care comunica cu sacii RER §i la sau vezicule delimitate de
ME nivelul carora nu se ata§eaza membrane trilamelate care
ribozomi. Membranele REN au delimiteaza un lumen.
aceeasi structura ca si a RER Membranele REG se continua cu
doar ca din loc in loc prezinta membrana externa a inveli§ului
fenestrari asemanatoare porilor nuclear, iar lumenul, cu cistema
nucleari. oerinucleara. (forurile 1, 2}
Evidentiere In celula musculara striata, REN, cu hemalaun picro-indigo-carmin
poarta numele de reticul (culoare bruna), tricromul lui
sarcoplasmatic. Ramony Cajal (tenta ro§ie),
RER se evidenµaza bine in
celulele glandulare (acinii
pancreatici), unde ocupa o pozitie
bazala, in celulele nervoase
(corpii Nissl), in hepatocite (corpii
Berg)

2
Reticul endoplasmic
rugos

Reticul endoplasmic
neted
rugos

Figura 1. Localizarea RER si REN in celulii in raport cu nucleul.

a.

REN citosol h11 in~~EN

Ribozomi Membrane

b.

c.

Figura 2. Reticul endoplasmic neted si rugos, schema si ME

3
2. RIBOZOMII sau corpusculii lui Palade (1953)

Definitie Ribozomii sunt organite celulare submicroscopice, nemembranare,

formate din ribonucleoproteine (ARNr) avand rol in procesele de
sinteza a proteinelor.
Localizare sunt prezenti in citoplasma tuturor celulelor, cu exceptia eritrocitelor
Tipuri Pot fi de doua tipuri:
- ribozomi liberi in citoplasma
-izolati
- grupati in poliribozomi (polizomi)
-ata,ati de membranele reticulului endoplasmic i;;i de fata
citoplasmatica a invelii;;ului nuclear

Numar Numarul ribozomilor variaza in functie de tipul de celula.

Astfel, ei se gasesc in numar foarte mare in celulele secretorii
angajate in sinteza de proteine.

Dimensiuni diametrul este cuprins intre 15 - 30 nm.

Organizare ribozomii nu pot fi observati datorita dimensiunilor foarte mici, sub
structurala -MO limita puterii de rezolutie. In celulele in care se desfai;;oara procese
intense de proteogeneza (celulele foliculare din ovar), ribozomii
formeaza zone intens bazofile in citoplasma.
Organizare apar sub forma de granule ovalare sau elipsoidale cu diametrul mare
ultrastructurala- ME de 20-30 nm i;;i diametrul mic de 16-17 nm. Prezinta doua subunitati
inegale ca dimensiune i;;i diferite ca structura morfologica i;;i
biochimica, (figura 3, 4).
- subunitatea mica, cu coeficient de sedimentare de 40SV;
- subunitatea mare de 60SV, prevazuta cu un canal prin care trece
lantul peptidic sintetizat

subunitate
mare~ / Ribozom
Figura 3. Poliribozomii . Formarea lanturilor sinuoase in care ~ ',,. · '
mRNA
ribozomii sunt uniti intre ei printr-o molecula de ARNmcare are
forma unui filament gros.
subunitate
mica
/

Figura 4. Ribozomi atasati reticulului endoplasmic,

ME.
La nivelul poliribozomilor liberi se sintetizeaza
proteinele de structura (procese de diviziune ~i cre~tere),
iar la nivelul ribozomi !or ata~ati membranelor RE se
sintetizeaza proteine de export (enzime, hormoni,
anticorpi).

4
3. APARATUL GOLGI

Defini\ie Este un sistem intracitoplasmatic de cavitati limitate de citomembrane,

Localizare Este prezent atat in celulele vegetale cat i;;i in celulele animale, cu
exceptia hematiei adulte. Este diferita in functie de tipul i;;i activitatea
celulei - in neuroni este plasat perinuclear, in celulele secretorii
exocrine se afla supranuclear, iar in celulele tiroidiene se deplaseaza
intre cei doi poli ai celulei
Organizare Retea de canalicule anastomozate si de vacuole de diferite marimi,
dictiozomi(formatiuni izolate sau grupate sub forma de tubuli
structurala -MO
anastomozati intre ei sau sub forma de cisterne)
Organizare « Corpii Golgi » se caracterizeaza ultrastructural prin :
-saci turtiti formati din unitatea membranara aranjati paralel cu
ultrastructurala- '
extremitatile mai dilatate ce prezinta o fata proximala, de formare,
ME orientata catre nucleu (cis) si o fata distala, de maturare, orientata
catre plasmalema (trans) (figura 5).
-vezicule, situate 1n extremitatea sacilor in raport cu fata de
maturare, cu diametrul de 25-50 nm '
-vacuole de 0,5-lmicron situate langa fata de formare (pe fata concava)
a sacilor paraleli (figurile 6,7,8,9)
Evidentiere Poate fi evidentiat in celula proaspata cu colorantul rosu-neutru, iar in
celula fixata prin colorare cu saruri de osmiu unde apare ca o retea
filamentoasa anastomozata, situata peri sau paranuclear.

vezicule l uzionate cu membrana plasmatica

corpi Golgi, dictiozomi

Fata

Fata trans
\\, ~ P erete celular

Figura 5. Aparatul Golgi - dictiozomi - formati din cisterne aplatizate ~i vezicule delimitate de membrane lipoproteice
Au rot in formarea de endomembrane, sinteza complexelor de hidrati de carbon, formarea proteoglicanilor ~i a
glicoproteinelor, maturarea lipoproteinelor , formarea lizozomi lor primari.

5
 APARAT GOLGI

Figura 6. Aparat Golgi, adenohipofiza, ME

Figura 7. Aparat Golgi, capsula Bowmann Figura 8. Aparat Golgi, epididim, ME

rinichi, ME

Figura 9. Aparat Golgi, Limfocit, ME

6
B. ORGANITELE GENERATOARE DE ENERGIE:

1. MITOCONDRIILE

Defini\ie Mitocondriile sunt organite membranare ce contin sisteme enzimatice

necesare oxidarii materialelor nutritive, sintezei moleculelor de ATP §i
cuplarea acestor doua procese (fosforilarea oxidativa).
Localizare Prezente in toate celulele cu metabolism aerob, cu exceptia
eritrocitului adult. Sunt raspandite in intreaga citoplasma, cu
predilectie la polii celulei sau perinuclear in momentele de intensa
activitate de sinteza.
Numir Depinde de gradul activitatii celulare, fiind mai numeroase in celulele
in care activitatea functionala este intensa (ex. hepatocite).
Dimensiuni Lungimea este de aprox. 7µm, iar grosimea de 0,5 µm; cu cat o celula
este mai activa cu atat mitocondriile sunt mai mari.
Forma - au o mare plasticitate
- alungita in celulele pancreasului exocrin
- granulara in hepatocite
Organizare la microscopul fotonic in contrast de faza: sub forma de granule izolate
structurala -MO in citoplasma, granule in§iruite ca margelele sau filamente,
(figura 10).
Organizare Forma sferica, formate din doua membrane trilamelare: membrana
ultrastructurala- externa §i membrana interna care trimite in interior prelungiri ce
ME formeaza crestele mitocondriale.
Spatiul dintre cele doua membrane se nume§te camera externa, iar
intre membrana interna §i crestele mitocondriale se afla camera
interna sau matricea mitocondriala
Membrana interna este alcatuita din particule elementare - unitatile
tripartite care sunt alcatuite dintr-un cap sferic, o tija cilindrica §i o
baza patrulatera (figurile 11, 12, 13)
Evidentiere Coloratii supravitale cu verde Janus B pentru celulele nefixate §i
hematoxilina ferica Regaud pentru celulele fixate

' m itoc,ondrriali
tubuli

Figura 10. Structura mitocondriei, schema. 1. Membrana externa, 2. Membrana interna ce trimite in interior
prelungiri, 3. Cristele mitocondriale, 4. Matricea mitocondriala

7
Figura 11. Criste mitocondriale, ME Figura 12. Tubuli mitocondriali, ME

Figura 13. Mitocondrii intermediare, ME

8
 Metode de studiu ale biologiei celulare
Fractionarea celulari

Fractionarea celulara este o tehnica de « rupere » a tesuturilor ~i celulelor

intr-un mod controlat. Se realizeaza astfel omogenizarea sau destructia legaturilor
celulare prin diferite procedee, separarea fractiunilor celulare facandu-se in
functie de densitate ~i volum.

Tehnica de fractionarea celulari are doui aplicatii majore:

-extragerea organitelor celulare, separarea lor de mediul normal celular, intr-
o cantitate suficienta ~i de o mare puritate, pentru a putea fi studiate compozitia
chimica ~i functiile lor; de exemplu: fractionarea celulara a fost folosita pentru
intelegerea mecanismului fosforilarii oxidative desfa~urat in mitocodrii, sau a
evenimentelor care rezulta ca urmare a legarii ribozomilor la reticulul
endoplasmatic.
-identificarea localizarii intracelulare a unor molecule specifice, alaturi de
celelalte tehnici de citochimie.
Deoarece, morfologia multora dintre organite se modifica dupa dezbinarea
celulei, tehnica fractionarii celulare necesita folosirea unor procedee analitice
pentru identificarea fractiunilor celulare, nu doar dupa morfologia organitelor din
care ele provin, ci ~i de asemenea, dupa constituentii chimiei ~i enzimatici.

Principiile fractionirii celulare

Primul pas in extragerea unor cantitati suficiente de organite celulare, il
reprezinta ruperea membranelor plasmatice, prin diferite procedee mecanice ~i
chimice, urmata de separarea fractiunilor celulare prin centrifugare, in functie de
volum ~i densitate.
Centrifugarea se folose~te, pentru o rezolutie cat mai buna a diferentierii
organitelor celulare, de diferentele dintre proprietatile lor fizice, din care cele mai

9
importante sunt marimea ~i densitatea. Exista numeroase similitudini intre
organite atat in ceea ce prive~te marimea cat ~i densitatea lor, insa in general
structuri care au un volum asemanator au densitati diferite.
Centrifugarea diferentiata presupune separarea fractiuni lor celulare fie doar
in functie de marimea particulelor subcelulare, fie doar dupa densitatea lor.
Pentru ruperea membrane lor plasmatice, celulele sunt suspendate intr-o
solutie ce contine o sare cu un pH apropiat cu al mediului intracelular, de ex.
sucroza- izotonica. Ulterior este necesara agitarea suspensiei celulare la o viteza
foarte mare (variaza in functie de tipul organitului celular care trebuie separat),
prin centrifugare, sau prin plasarea sa intr-un camp sonie de inalta frecventa
(ultrasonare) .

Izolarea organitelor celulare

Procesul de separare a organitelor celulare presupune parcurgere a
urmatoarelor etape:
-ruperea membranelor celulare, de obicei prin tehnici mecanice;
-fractiunile concentrate de organite sunt apoi pregatite pentru separarea prin
centrifugarea diferentiata;
-purificarea tipurilor de organite celulare, bazata pe diferenta gradientelor de
densitate.
Prima etapa consta in distrugerea membranei celulare, in conditii care sa
produca afectarea minima a organitelor celulare, se realizeaza folosind un
omogenizator mecanic.
in functie de tipul de celule, se cunosc tehnici diferite pentru fragmentarea
membranei celulare (omogenizatorul Dounce este de obicei utilizat pentru
culturile de celule, omogenizatorul Potter-Elvehjem pentru tesuturile fragile -ficat).
Omogenizarea celulelor sau a tesuturilor cauzeaza de obicei distrugerea
partiala a unor organite.
Dupa fractionarea peretelui celular, suspensiile respective sunt centrifugate
pentru separarea diferitelor tipuri de organite. Viteza de centrifugare este initial
foarte mare (4000 rot. / min.), pentru cateva ore), timp in care fiecare particula
10
subcelulara migreaza la o pozitie de echilibru; in functie de marimea lor ~i de
densitate, acestea sunt redistribuite in sediment dupa centrifugare, astfel: nuclei,
mitocondrii, lizozomi ~i peroxizomi, RE ~i aparatul Golgi, ~i in final ribozomii
liberi.
in urma centrifugarii fiecare oragnit va ramane la un anumit nivel in
eprubeta, in functie de densitatea lui de echilibru, cu formarea unor benzi (faze),
ce reprezinta fiecare fractiune celulara separata.
Lizozomii ~i peroxizomii, care au marimi ~i densitati asemanatoare, sunt mai
greu de separat. De asemenea, fragmentele membranare derivate din REN,
complexul Golgi, endozomi ~i membranele plasmatice sunt recunoscute prin
formarea de vezicule cu suprafete netede, dar care frecvent sunt greu de separat.
Izolarea unui anumit organit celular poate fi facilitata prin cre~terea
numarului lor. De exemplu, cand cobaii sunt tratati cu clofibrat, numarul
peroxizomilor in celulele hepatice cre~te considerabil. Cre~terea numarului de
organite celulare, care apare dupa administrarea diver~ilor compu~i chimici, are
ca rezultat imbunatatirea purificarii pe tipuri de organite.

11
 LP4. Tehnici de evaluare structurală şi funcţională a celulelor si organitelor celulare.
Metode de analiză a acizilor nucleici. Principii

Termenul de ADN recombinant se referă la combinațiile noi de ADN, obținute între

anumite secvențe de ADN uman (sau de la alte organisme) și molecule de ADN bacterian (sau
de la alte specii), capabile să se replice indefinit (formând clone moleculare) sau să exprime,
într-o celulă gazdă, informația genetică pe care o conțin.
Tehnicile de ADN recombinant au inaugurat “era ingineriei moleculare” devenind posibilă
trecerea de la observarea proceselor genetice la manipulare genică. Au fost înregistrate
succese remarcabile în descifrarea structurii și funcției genelor cu aplicații în medicină
(diagnosticul și tratamentul unor maladii), industria farmaceutică (obținerea unor proteine
terapeutice și noi vaccinuri), agricultură și zootehnie (utilizarea unor biotehnologii în
ameliorarea plantelor și animalelor).
Tehnicile ADN recombinant se pot grupa în două mari categorii:
A. Clonarea ADN sau amplificarea selectivă a unei gene/secvențe de ADN, bazată în esență
pe mai multe runde de replicare a ADN care vor produce un număr mare de copii ale
fragmentului respectiv:
a) celulară, in vivo, când se folosește mecanismul natural al replicării ADN.
Implică patru etape majore:
I. formarea ADN recombinant prin ataşarea in vitro a fragmentelor de ADN uman la “un
vector sau replicon” capabil de replicare independentă;
II. transformarea: transferarea moleculelor în celule-gazdă în care vectorul recombinant se
replică independent de cromozomul celulei gazdă;
III. Amplificarea sau producerea de clone celulare multiple;
IV. Izolarea clonelor de ADN recombinant prin oprirea culturilor şi izolarea selectivă a ADN
recombinant.
b) acelulară, in vitro, bazată pe reacția de polimerizare în lanț (PCR);
Cu această metodă se poate amplifica selectiv o secvenţă scurtă de ADN sau ARN a cărei
structură nucleotidică este parţial cunoscută. Amplificarea este considerabilă (de miliarde de
ori) şi rapidă (câteva ore), permiţând obţinerea unei cantităţi suficiente de material genetic
necesar pentru analiză. Amplificarea selectivă in vitro se bazează pe principiul extensiei unei
amorse ce declanşează sinteza ADN după matriţa fragmentului ADN iniţial (de amplificat).

1
Avantajele clonării acelulare a ADN prin PCR sunt determinate în primul rând de simplitatea
sa (nu necesită nici o altă manipulare în afara variaţiilor termice necesare diferitelor etape ale
reacţiei, pretându-se astfel la automatizare) şi rapiditatea cu care se obţine multiplicarea
secvenţelor de interes. Prin acest tip de clonare, plecând de la o cantitate infimă de ADN
(chiar de la o singură celulă) se poate obţine, prin PCR, o cantitate suficientă de ADN ţintă
care poate fi vizualizată prin fluorescenţă în UV (după o colorare cu bromură de etidium)
şi/sau analizată direct.
B. Analiza sau detecţia specifică a unei secvenţe de ADN sau ARN
B1. Hibridizarea moleculară (prin complementaritate) cu o sondă de acid nucleic
marcată. Metodele se bazează pe capacitatea unor molecule monocatenare de acid nucleic de
a forma, pe bază de complementaritate, molecule bicatenare. Tehnicile standard folosesc o
sondă monocatenară de acid nucleic (cu o structură cunoscută), pentru a identifica o structură
similară într-un amestec complex şi heterogen de molecule de acid nucleic ţintă (de obicei
imobilizat pe un suport solid). Sonda este marcată cu un trasor radioactiv sau cu un compus
florescent. Marcarea permite detectarea secvenţei/genei ce posedă o secvenţă omoloagă
sondei folosite.
a) Analiza ADN genomic prin metoda de transfer Southern.
Obiectivul principal al metodei este de a evidenţia, cu ajutorul unei sonde specifice, prezenţa
sau absenţa unui fragment de ADN omolog (“ţintă”), obţinut din ADN genomic, cu o anumită
enzimă de restricţie. Pentru aceasta, ADN extras din nucleii celulari este digerat cu una sau
mai multe enzime de restricţie, fragmentele separate după marime prin electroforeză în gel de
agaroză, denaturate şi apoi transferate (prin “sugere”/blotting) şi imobilizate pe o membrană
solidă de nitroceluloză pentru a fi hibridizate cu o sondă monocatenară specifică, marcată
radioactiv. Sonda se va fixa numai pe secvenţa omoloagă de ADN (dacă este prezentă) iar
poziţia sa pe membrană va permite evaluarea mărimii sale;

b) Analiza cu sonde oligonucleotidice specifice unei alele (ASO)

Metoda foloseşte sonde ce corespund unei secvenţe mici (20pb) din structura genei, permiţând
depistarea unor mutaţii specifice, cunoscute deja într-o anumită boală genetică.

c) Analiza ARN mesager prin Northern blot

Obiectivul principal al metodei este obţinerea de informaţii privind profilurile de expresie
(tipul celular, abundenţa transcriptului) a unei gene deja clonată. Punerea în evidenţă a unui

2
anumit ARNm se bazează pe hibridizarea moleculară a ARN cu o sondă complementară
monocatenară.

d) Hibridizarea in situ a ADN/ARN

- pe preparate cromozomice în pro-metafază folosind sonde marcate (radioactiv sau
molecule fluorescente - FISH) alese în funcție de obiectivul urmărit;
- pe secțiuni histologice pentru evidențierea unui anumit ARNm folosind ribosonde
marcate;

e) Identificarea ADN/ARN al organismelor exogene

Permite depistarea oricărei infectări sau infestări printr-un microorganism bacterian, viral,
fungic sau parazitar prin folosirea unor sonde corespunzătoare genomului acelui organism.

B2. Analiza secvenței nucleotidelor din ADN – secvențierea ADN

După izolarea și amplificarea unui fragment ADN principala etapă de analiză genotipică este
determinarea secvenței nucleotidice, deci a informației genetice a fragmentului respectiv.
Această acțiune poate stabili structura genei precum și a secvenței de aminoacizi a proteinei
codificată de genă. Metodele de secvențiere sunt:
- tehnica de degradare chimică descoperită de Walter Gilbert;
- tehnica de sinteză enzimatică elaborată de Fred Sanger;

3
 LP. 4 Culturi de celule. Diviziunea celulara. Ciclul celular.
Controlul activitatii celulare.

Desi organitele celulare s1 macromoleculele marl pot fi vizualizate pnn tehnici de

microscopie, intelegerea functiilor acestor structuri presupune analize biochimice detaliate.
Numeroase proceduri biochimice se efectueaza pornind de la un numar mare de celule de acelasi tip
care sunt dezintegrate pentru a avea acces la diferite structuri. Daca specimenul studiat este un tesut,
compus din diferite tipuri de celule, un amestec heterogen de tipuri celulare participa la realizarea
respectivului tesut. Pentru a obtine maximul de informatie despre un tip particular de celule, exista
metode care permit disocierea celulelor din tesuturi si separarea lor in functie de tip. Aceste metode
permit obtinerea unor populatii omogene de celule care vor putea fi analizate: fie direct, fie dupa ce
au proliferat in cultura.

Prima etapa pentru separararea unui anumit tip celular dintr-un tesut i1 reprezinta disociarea
celulelor. Disocierea consta din :
"digerarea" matricei extracelulare cu enzime proteolitice (tripsina, colageneza},
tratamentul fragmentelor de tesut cu anumiti agenti chelatori (EDTA) care leaga ionii de
calciu, de care depinde foarte mult adeziunea intercelulara.
Pentru anumite analize biochimice, proteina de interes poate fi obtinuta intr-o cantitate
suficienta fara a fi nevoie de separarea tesutului in tipurile celulare componente. Exemplu: izolarea
histonelor din timus, izolarea actinei din muschiul de iepure. In alte cazuri, izolarea proteinei de
interes presupune separarea celulelor din tesut. Cele mai generale metode de separare utilizeaza
anticorpi cuplati cu un colorant fluorescent care marcheaza celulele specifice. Anticorpul este ales
astfel incat sa se lege doar la suprafata unui anumit tip de celule. Celulele marcate pot fi apoi
separate de cele nemarcate cu ajutorul sortatorului de celule activate fluorescent (fluorescent-
activated cell sorter - FACS). In acest aparat, celulele strabat un capilar subtire, trecand prin fata
unui fascicul laser; fluorescenta emisa de fiecare celula este apoi rapid masurata. Sunt generate mici
picaturi de lichid, majoritatea continand eel mult o celula. Picaturile care contin o celula sunt
incarcate pozitiv sau negativ, in functie de celula pe care o contin (marcata sau nu fluorescent};
aceste picaturi sunt apoi colectate in container-ul corespunzator. Picaturile care contin mai multe
celule nu sunt incarcate electric si vor fi colectate separat. Un asemenea aparat poate selecta o
singura celula activata fluorescent dintr-un amestec de 1000 de celule si poate sorta cateva mii de
celule per secunda (Fig. 1).

ultrasonic nozzle vibrator

.
.

analyzer

small groups of drops · - -(- -

drop-charging
negatively charged due - ( : •
signal
to detection of single
fluorescent cell small groups of drops
1----- positively charged due
to detection of single
• n_ nonfluorescent cell
+u -2000V

flask for undeflected droplets

Figure 8-2 Molecular Biology of the Cell 5/e (© Garla nd Science 2008)

Figura 1. Sortatorul de celule activate fluorescent.

Anumite celule pot fi obtinute prin disecarea atenta a lor de pe sectiuni de tesut preparate
pentru examinarea la microscopul optic. Sectiunea de tesut este acoperita cu o pelicula foarte
subtire de plastic, iar regiunea ce contine celulele de interes este iradiata cu un fascicul produs de un
laser infrarosu; acest fascicul topeste un cerc mic din pelicula, celulele ramanand lipite de aceasta
pelicula. Aceasta tehnica, numita microdisectie cu laser, poate fi utilizata pentru a analuza diferite
tipuri de celule dintr-o arie tumorala, permitand compararea proprietatilor acestor celule tumorale
cu celulele normale din vecinatate (Fig. 2).

2
 laser beam cuts around
region of interest
thin section of

glass microscope slide

Figure8-3 Molecular Biologyofth eCell 5/e (© Ga rlan dScien ce2008)

Figura 2. Microdisectia cu laser pentru a selecta anumite celule dintr-o sectiune de tesut

Multiplicarea celulelor de un anumit tip in culturi celulare

0 caracteristica importanta a majoritatii celulelor este aceea ca o singura celula poate creste
si se poate divide in conditii experimentale, proces numit clonare.
Celulele crescute in culturi ofera avantaje experimentale deosebite; acestea se pot constitui
intr-o populatie celulara omogena din care se poate izola un anumit tip de macromolecula sau
organit celular. Celulele dintr-o cultura pot fi monitorizate la microscop sau analizate biochimic;
efectele adaugarii sau indepartarii unor molecule specifice, precum hormoni, factori de crestere, pot
fi analizate in culturi de celule. In plus, prin cultivarea impreuna a doua tipuri celulare diferite, pot
fi studiate interactiunile intre cele doua tipuri.
Primele culturi de celule se realizau din tesuturi, purtand denumirea de exp/ante. Astazi,
majoritatea culturilor se realizeaza din suspensii de celule. Celulele cultivate, cu originea dintr-o
singura celula formeaza colonii vizibile, atasate pe suportul de cultura (sticla sau plastic), dupa
10-14 zile. Exista insa si celule care cresc in suspensie, acestea oferind avantaje experimentale
considerabile.
0 populatie de celule pure din punct de vedere genetic, perfect identice intre ele si care
provin din diviziunea unei singure celule mama, formeaza o clona celulara.
Celulele animale, pentru a cre~te in cultura, au anumite necesitati bine definite:
@'aminoacizii esentiali (arginina, histidina, izoleucina, lizina, metionina, fenilalanina,
treonina, triptofanul si valina) din mediul in care traiesc deoarece nu si-i pot sintetiza
@'cisteina, glutamina si tirozina, deoarece acesti aminoacizi pot fi sintetizati doar de celule
specializate din organismul animal (tirozina - ficat, glutamina - ficat si rinichi)
@'vitaminele
@'sarurile
@'glucoza
3
 fi!serul (componenta necelulara a sangelui, o solutie formata din diverse proteine). Rolul
serului este de a suplimenta mediile nutritive cu factori proteici de crestere.

Culturile realizate direct din celule ce provin dintr-un tesut prelevat dintr-un organism poarta
numele de culturi primare. Acestea pot fi realizate cu sau fara o etapa prealabila de separare a
diferitelor tipuri celulare. In majoritatea cazurilor, aceste culturi pot fi indepartate din vasul initial
de cultura si recultivate de mai multe ori, realizand asa-numitele culturi secundare; astfel, o cultura
poate fi subcultivata (pasata) de mai multe ori pentru cateva saptamani sau luni. In cultura, celulele
isi pot pastra unele proprietati particulare ale tesutului din care provin (Figura 3):
fibroblastele continua sa secrete colagen,
celulele derivate din muschiul scheletic embrionar fuzioneaza pentru a forma fibrele
musculare care se contracta spontan in flacoanele de cultura,
celulele nervoase isi extind axonii care isi pastreaza excitabilitatea electrica si intra in
sinapsa cu celulele vecine;
celulele epiteliale formeaza un strat cu proprietati similare epiteliului intact.

SOµm
Figure 8-4 Molecular Bio logy of the Cell 5/e (© Garland Science 2008)

Figura 3. (A) Fibroblasti de soarece. (B) Mioblasti de pui fuzionand pentru a forma celule
musculare multinucleate. (C) Celule nervoase purificate de sobolan. (D) Celule de tutun in cultura in
suspensie

4
 Celulele din asemenea culturi sunt predominant fibroblaste, care se gasesc in tesuturile
conjunctive din orice parte a organismului. Fibroblastele produc colagen, precum si materiale care
formeaza substanta fundamentala a tesutului conjunctiv.
Celulele din culturile primare cresc bine cand sunt plasate in flacoane de cultura,
multiplicandu-se timp de 50-100 de generatii, dupa care intra in "criza", cand isi incetinesc
cresterea, pentru ca in cele din urma sa se opreasca din diviziune si sa moara. Fibroblastele
provenite de la organisme tinere rezista in cultura mai multe generatii decat cele provenite de la un
organism adult.
Capacitatea limitata de proliferare este rezultatul unei scurtari progresive a telomerelor
(secvente repetitive de ADN si proteine situate la capetele cromozomilor). Celulele somatice umane
diferentiate si-au pierdut capacitatea de a produce enzima telomeraza care mentine integritatea
telomerelor; din acest motiv telomerele se scurteaza la fiecare diviziune celulara.
Fibroblastele pot fi adesea modificate astfel incat sa prolifereze nelimitat prin introducerea
genei care codifica subunitatea catalitica a telomerazei; in acest caz, ele por fi propagate ca si linii
celulare "imortalizate". Alte tipuri celulare nu pot fi imortalizate astfel. La acestea din urma, desi nu
se mai scurteza telomerele, diviziunile celulare inceteaza dupa un anumit interval deoarece se
activeaza mecanismele de control a ciclului celular (cell cycle check-point mechanisms). Pentru
imortalizarea acestor culturi este deci necesar, pe langa introducerea telomerazei, si de inactivarea
acestor mecanisme de control a ciclului celular. Acest lucru poate fi realizat prin introducerea unor
oncogene, precum cele derivate din virusurile tumorale.
Liniile celulare pot fi mai usor generate din celule canceroase; aceste culturi difera esential
de cele generate din celule normale si sunt denumite culturi transformate. Liniile celulare
transformate cresc adesea fara a se atasa de suprafata vasului de cultura, si pot prolifera pana la o
densitate celulara superioara comparativ cu celulele normale. Proprietati similare pot fi induse
experimental intr-o cultura normala prin transformarea acesteia prin adaugarea unui virus tumoral
sau a unei substante chimice. Liniile celulare transformate pot produce tumori daca sunt injectate la
un animal de experienta susceptibil.
Atat culturile celulare primare, cat si cele transformate pot fi stocate timp nelimitat in azot
lichid, la -196°C si raman viabile atunci cand sunt dezghetate, putand fi cultivate din nou.

5
 In tabelul 1 sunt redate liniile celulare eel mai frecvent utilizate in cercetare.

Linia celulara Tipul celular si originea

3T3 fibroblast (soarece)

BHK21 fibroblast (hamster sirian)

MOCK celule epiteliale (caine)

Hela celule epiteliale (om)

L6 mioblasti (sobolan)

cos rinichi (maimuta)

CHO ovar (hamster chinezesc)

H1, H9 celule stem embrionare (om)

S2 celule macrofag-like (Drosophila)

Culturile de celule stem

Din punct de vedere medical, eel mai promitator domeniu al culturilor de celule este acela al
cultivarii celulelor stem embrionare (ES). Aceste celule, prima data recoltate din masa intema de
celule a embrionului de soarece, pot prolifera nelimitat in cultura. Daca aceste celule din cultura
sunt replasate in mediul embrionar, ele pot da nastere oricarui tip celular din organism, inclusiv
celule ale liniei germinale (Figura 4).

fat cell

cells of inner cell mass

~ -
cultured ES cells macrophage
early embryo
(blastocyst)

smooth muscle cell

Figure 8-5 Molecular Biology of the Cell 5/e (© Garland Science 2008)

Figura 4. Celule stem embrionare

6
 Celule cu proprietati similare cu celulele ES de soarece pot fi derivate si din embrioni
umani, generand o rezerva potential nelimitata de celule care pot fi utilizate pentru a repara sau
inlocui tesuturi umane mature. Experimentele pe celule ES de soarece sugereaza faptul ca va fi
posibila utilizarea celulelor ES pentru a genera celule specializate utilizate pentru terapie: pentru
inlocuirea fibrelor musculare degenerate la pacientii cu distrofie musculara, a celulelor nervoase la
pacienti cu boala Parkinson, celulelor producatoare de insulina la pacientii cu diabet zaharat de tip I,
sau a miocardului la pacientii care au suferit un infarct. Celulele ES nu se transplanteaza ca atare in
organismele adulte, deoarece pot produce un tip particular de tumori denumite teratoame.

7
 CICLUL CELULAR. CONTROLULACTIVITATII CELULARE

Celulele se multiplica prin realizarea unei secvente ordonate de evenimente in care isi
duplica continutul si apoi i1 imparte in doua parti egale. Acest ciclu de duplicatie si diviziune,
denumit ciclu celular, este mecanismul esential prin care toate entitatile vii se reproduc. La speciile
unicelulare, precum bacteriile si drojdiile, fiecare diviziune celulara produce un organism complet
nou. La speciile multicelulare, sunt necesare secvente lungi si complexe de diviziuni celulare pentru
a produce un nou organism. In organismul adult, diviziunile celulare sunt necesare pentru a inlocui
celulele care mor. Principalele procese desfasurate in timpul ciclului celular de catre celula sunt
acelea care ii permit sa isi indeplineasca functia cea mai importanta: transmiterea informatiei
genetice la generatiile celulare urmatoare. Pentru a se obtine doua celule identice din punct de
vedere genetic, ADN-ul din fiecare cromozom trebuie sa fie fidel replicat, iar cromozomii replicati
trebuie sa fie precis distribuiti (segregati) in cele doua celule fiice, astfel incat fiecare celula fiica sa
primeasca o copie a intregului genom (Fig. 5).

~ daughte, <ells

1 CELL GROWTH
3 CELL
AND CHROMOSOME
DIVISION
REPLICATION

2 CHROMOSOME
SEGREGATION

Fig ure 17-1 Molec ular Bio logy of t he Cel l S/e (O Garla nd Science 2008)

Figura 5. Ciclul celular

8
 Etapele ciclului celular
Functia esentiala a ciclului celular este duplicarea cantitatii de ADN din cromozomi si apoi
segregarea precisa a copiilor in cele doua celule fiice identice. Aceste procese definesc cele doua
etape principale ale ciclului celular. Duplicatia cromozilor se produce in faza S (S de la sinteza
ADN), etapa care se realizeaza in 10-12 ore si reprezinta aproximativ 50% din durata ciclului
celular la o celula tipica de mamifer. Dupa faza S, segregarea cromozomilor si diviziunea celulara
se realizeaza in faza M (M de la mitoza), care se realizeaza in mai putin de o ora la celulele de
mamifer. Faza M cuprinde doua evenimente majore: diviziunea nucleara, sau mitoza, in timpul
careia cromozomii sunt distribuiti celor doua celule fiice; si diviziunea citoplasmatica, sau
citokineza, care presupune impartirea celulei in doua (Fig. 6).

cytoplasm ~
nucleus ~ Ill
'ti
':I'
chromosome I Ill
duplication ♦ "'ID

@
MITOSIS I
s:

~
'ti
':I'
Ill
"'ID
CYTOKINESIS ~

®®
Fig ure 17-2 Molecula r Bio logy of the Cell 5/e (Cl Ga rland Science 2008)

Figura 6. Cele doua etape principale ale ciclului celular: faza S si faza M

La finalul fazei S, moleculele de ADN din fiecare cromozom bicromatidian sunt

intercorelate si mentinute impreuna prin anumite legaturi intre proteine specializate. La inceputul
mitozei, in etapa numita profaza, moleculele de ADN sunt desfacute si condensate in perechi de
cromatide surori, care sunt mentinute impreuna printr-un fenomem de coeziune. 0 data cu
dezasamblarea invelisului nuclear, cromatidele surori se ataseaza de .fusul mitotic, un aranjament
ordonat de microtubuli. Cromatidele surori sunt atasate la cei doi poli opusi ai fusului de diviziune,
si in cele din urma, toate cromatidele se atasaza in regiunea ecuatoriala a fusului, eveniment ce
defineste etapa mitozei numita metafaza. Indepartarea cromatidelor surori una de alta, in urma

9
dezintegrarii coeziunii dintre acestea, are loc in anafaza. Fusul este apoi dezansamblat, iar
cromozomii segregati sunt organizati in cei doi nuclei, in telofaza. Apoi, in citokineza, celula este
impartita in doua celule, astfel incat fiecare va primi unul din cei doi nuclei (Fig. 7.

cytokinesis
mitosis

;._.,. pmph.,. pn,=taphaH metaphaH

metaphase-to-anaphase transition

l anaphaH tolophaH

~ - ~ -- -~ -Q -~ -f }(j
M PHASE

INTERPHASE

DNA replication
Figu re 17-3 Molecular Biology of the Cell 5/ e (© Garland Science 2008)

Figura 7. Diviziunea celulara

Majoritatea celulelor au nevoie de mai mult timp pentru a creste si a-si dubla masa de
proteine si organite, fata de timpul de care au nevoie pentru a-si dubla informatia genetica si a se
divide. Pentru a asigura acest timp necesar pentru crestere, majoritatea ciclurilor celulare cuprind si
doua etape de pauza (gap) - o faza Gl, intre faza M si faza S, si o faza G2, intre faza S si faza M.
Astfel, ciclul celular pentru celulele eucariote este impartit in 4 etape: Gl, S, G2 si M. Fazele Gl,
S, G2 alcatuiesc interfaza (Fig. 8). Intr-o celula umana tipica, in cultura de celule, interfaza dureaza
aproximativ 23 de ore, iar faza M dureaza 1 ora. Cresterea celulara are loc pe toata durate ciclului
celular, cu exceptia mitozei.

' mitosis
, (nuclear
, division)

...
I

INTERPHASE

S PHASE
(DNA replication)
Figure 17-4 Molecular Biology of the Cell 5/e {© Garland Science 2008)

Figura 8. Etapele ciclului celular

10
 Cele doua etape gap sunt mai mult decat etape care intarzie ciclul celular pentru a permite
cresterea celulara. Aceste etape ofera de asemenea timpul necesar pentru ca celulele sa monitorizeze
mediul intern si extern pentru a se asigura ca sunt intrunite conditiile inainte ca celula sa intre in
faza S. Faza G 1 este in mod deosebit importanta pentru acest aspect. Durata fazei G 1 variaza in
functie de conditiile externe si de semnalele primite de la alte celule. In cazul in care conditiile
extracelulare sunt nefavorabile, celulele isi intarzie progresul prin faza G 1 si pot chiar intra intr-o
faza de repaus, denumita GO, in care pot ramane pentru zile, saptamani, sau chiar ani, inainte sa-si
continue proliferarea. Numeroase celule raman in faza GO pana in momentul in care survine
moartea celulara sau moartea organismului. In cazul in care conditiile extracelulare sunt favorabile
si sunt primite semnale pentru crestere si proliferare, celulele aflate la inceputul fazei G 1 sau in faza
GO tree printr-un punct ( aflat la finalul fazei G 1) denumit Start (la drojdii) sau punct de restrictie
(la celulele de mamifere). Dupa ce au trecut de acest punct, celulele vor fi directionate catre
replicatia ADN, chiar daca semnalele extracelulare nu mai sunt prezente.

Controlul ciclului celular

Ciclul celular este controlat in mai multe puncte. In cei mai simpli termeni, sistemul de
control al ciclului celular este asemenea unui timer foarte strict programat care aloca un anumit
interval de timp pentru fiecare eveniment al ciclului celular. Sistemul de control este independent de
evenimentele pe care le controleaza, astfel incat mecanismele de control continua sa functioneze
chiar si atunci cand evenimentele controlate esueaza. Cu toate acestea, in majoritatea celulelor,
sistemul de control raspunde la informatiile primite de la procele controlate. De exemplu, erorile
aparute in cadrul sintezei ADN sunt inregistrate si sunt trimise semnale care controleaza intarzierea
progresiei catre faza M a ciclului celular.
Sistemul de control al ciclului celular este bazat pe o serie de comutari biochimice, fiecare
initiind un eveniment specific. Acest sistem de comutari poseda numeroase caracteristici care ii
cresc acuratetea si siguranta progresiei ciclului celular.
La majoritatea celulelor eucariote, sistemul de control al ciclului celular dirijeaza progresia
ciclului celular in 3 puncte majore de tranzitie, denumite puncte de control (checkpoints) (Fig. 9).
Primul checkpoint este punctul de restrictie de la finalul fazei G 1, cand celula se dedica duplicarii
cromozomilor. Al doilea punct este punctul G2/M, unde sistemul de control dirijeaza evenimentele
precoce din mitoza care conduc la aranjarea cromozomilor la fusul de diviziune. Al treilea punct
este tranzitia metafaza-anafaza, cand sistemul de control stimuleaza separarea cromatidelor surori,
11
conducand la finalizarea mitozei si citokinezei. Sistemul de control blocheaza progresia prin fiecare
din aceste puncte daca sunt detectate probleme in interiorul sau in exteriorul celulei.

Are all chromosomes

Is all ONA replicated? attached to the spindle?

Is environment favorable? METAPHASE-TO-ANAPHASE

TRANSITION
G2/M CHECKPOINT

ENTER MITOSIS

CONTROLLER

ENTER CELL CYCLE AND PROCEED TO S PHASE

START CHECKPOINT

Is environment favorable?
Figure 17• 14 Molecular Biology of the Cell 5/e (© Garland Science 2008)

Figura 9. Controlul ciclului celular.

12
 LP5. Tehnici de evaluare structural i func ional a celulelor si organitelor celulare.
Metode de analiz a acizilor nucleici. Principii

Termenul de ADN recombinant se refera la combinatiile noi de ADN, obtinute între

anumite secven e de ADN uman (sau de la alte organisme) ~i molecule de ADN bacterian (sau
de la alte specii), capabile s a se replice indefinit (formând clone moleculare) sau sa exprime,
într-o celula gazda, informatia genetica pe care o contin.
Tehnicile de ADN recombinant au inaugurat “era ingineriei moleculare” devenind posibil a
trecerea de la observarea proceselor genetice la manipulare genica. Au fost înregistrate
succese remarcabile în descifrarea structurii ~i functiei genelor cu aplicatii în medicina
(diagnosticul ~i tratamentul unor maladii), industria farmaceutica (obtinerea unor proteine
terapeutice ~i noi vaccinuri), agricultura ~i zootehnie (utilizarea unor biotehnologii în
ameliorarea plantelor i animalelor).
Tehnicile ADN recombinant se pot grupa în dou a mari categorii:
A. Clonarea ADN sau amplificarea selectivii a unei gene/secven!e de ADN, bazata în esenta
pe mai multe runde de replicare a ADN care vor produce un numar mare de copii ale
fragmentului respectiv:
a) celularii, in vivo, când se folose te mecanismul natural al replicarii ADN.
Implica patru etape majore:
I. formarea ADN recombinant prin ata area in vitro a fragmentelor de ADN uman la “un
vector sau replicon” capabil de replicare independenta;
II. transformarea: transferarea moleculelor în celule-gazda în care vectorul recombinant se
replica independent de cromozomul celulei gazda;
III. Amplificarea sau producerea de clone celulare multiple;
IV. Izolarea clonelor de ADN recombinant prin oprirea culturilor i izolarea selectiva a ADN
recombinant.
b) acelularii, in vitro, bazata pe reactia de polimerizare în lan t (PCR);
Cu aceasta metod a se poate amplifica selectiv o secventa scurta de ADN sau ARN a carei
structura nucleotidica este partial cunoscuta. Amplificarea este considerabila (de miliarde de
ori) ~i rapid a (câteva ore), permitând obtinerea unei cantit ati suficiente de material genetic
necesar pentru analiz a. Amplificarea selectiva in vitro se bazeaza pe principiul extensiei unei
amorse ce declan ~eaza sinteza ADN dupa matriIa fragmentului ADN initial (de amplificat).

1
Avantajele clonarii acelulare a ADN prin PCR sunt determinate în primul rând de simplitatea
sa (nu necesita nici o alta manipulare în afara variatiilor termice necesare diferitelor etape ale
reactiei, pretându-se astfel la automatizare) ~i rapiditatea cu care se obtine multiplicarea
secventelor de interes. Prin acest tip de clonare, plecând de la o cantitate infima de ADN
(chiar de la o singur a celula) se poate obtine, prin PCR, o cantitate suficienta de ADN tinta
care poate fi vizualizata prin fluorescenta în UV (dupa o colorare cu bromura de etidium)
i/sau analizata direct.
B. Analiza sau detec1ia specificii a unei secven1e de ADN sau ARN
B1. Hibridizarea molecularii (prin complementaritate) cu o sondii de acid nucleic
marcata. Metodele se bazeaza pe capacitatea unor molecule monocatenare de acid nucleic de
a forma, pe baza de complementaritate, molecule bicatenare. Tehnicile standard folosesc o
sonda monocatenara de acid nucleic (cu o structur a cunoscuta), pentru a identifica o structura
similara într-un amestec complex i heterogen de molecule de acid nucleic tinta (de obicei
imobilizat pe un suport solid). Sonda este marcata cu un trasor radioactiv sau cu un compus
florescent. Marcarea permite detectarea secventei/genei ce poseda o secventa omoloaga
sondei folosite.
a) Analiza ADN genomic prin metoda de transfer Southern.
Obiectivul principal al metodei este de a evidentia, cu ajutorul unei sonde specifice, prezenta
sau absenta unui fragment de ADN omolog (“I inta”), obtinut din ADN genomic, cu o anumita
enzima de restricI ie. Pentru aceasta, ADN extras din nucleii celulari este digerat cu una sau
mai multe enzime de restric ie, fragmentele separate dupa marime prin electroforeza în gel de
agaroza, denaturate ~i apoi transferate (prin “sugere”/blotting) ~i imobilizate pe o membrana
solida de nitroceluloza pentru a fi hibridizate cu o sonda monocatenara specifica, marcata
radioactiv. Sonda se va fixa numai pe secventa omoloaga de ADN (daca este prezenta) iar
pozitia sa pe membrana va permite evaluarea marimii sale;

b) Analiza cu sonde oligonucleotidice specifice unei alele (ASO)

Metoda folose te sonde ce corespund unei secven e mici (20pb) din structura genei, permitând
depistarea unor mutatii specifice, cunoscute deja într-o anumita boala genetica.

c) Analiza ARN mesager prin Northern blot

Obiectivul principal al metodei este obtinerea de informatii privind profilurile de expresie
(tipul celular, abundenta transcriptului) a unei gene deja clonat a. Punerea în evidenta a unui

2
anumit ARNm se bazeaza pe hibridizarea molecular a a ARN cu o sonda complementara
monocatenara.

d) Hibridizarea in situ a ADN/ARN

- pe preparate cromozomice în pro-metafaza folosind sonde marcate (radioactiv sau
molecule fluorescente - FISH) alese în functie de obiectivul urmarit;
- pe sectiuni histologice pentru evidentierea unui anumit ARNm folosind ribosonde
marcate;

e) Identificarea ADN/ARN al organismelor exogene

Permite depistarea oric arei infectari sau infestari printr-un microorganism bacterian, viral,
fungic sau parazitar prin folosirea unor sonde corespunzatoare genomului acelui organism.

B2. Analiza secven ei nucleotidelor din ADN – secven ierea ADN

Dup a izolarea i amplificarea unui fragment ADN principala etap a de analiza genotipica este
determinarea secven ei nucleotidice, deci a informatiei genetice a fragmentului respectiv.
Aceasta actiune poate stabili structura genei precum i a secventei de aminoacizi a proteinei
codificata de gena. Metodele de secventiere sunt:
- tehnica de degradare chimica descoperita de Walter Gilbert;
- tehnica de sinteza enzimatica elaborata de Fred Sanger;

3
 LP6. Tehnici de izolare si purificare ADN i ARN.
Metode de evaluare a concentra1iei, purit ii i gradului de
fragmentare a acizilor nucleici anterior PCR

Multe dintre tehnicile de analiza a modalitatilor de stocare, transmitere ~i

exprimare a informa iei genetice se bazeaza pe posibilitatea obtinerii unor cantitati
relativ mari de ADN purificat. Izolarea materialului nuclear din celule este un
proces relativ simplu ce implica lizarea membranelor celulare, însa în prima faza
ADN-ul va fi contaminat atât cu ARN cât i cu proteine. De aceea metodele
folosite trebuie sa aib a în vedere eliminarea acestor molecule ~i implicit cre ~terea
fractiei de ADN purificat.

Izolarea ADN-ului genomic se desfa~oara, în general, urmând etapele:

✓ Lizarea membranei celulare. În alegerea metodei folosite pentru lizare
se tine cont de natura celulei. Spre exemplu, celulele bacteriene înainte de
a fi lizate cu ajutorul unor detergenti sunt frecvent tratate cu lizozim ce
destabilizeaza structura membranara prin hidrolizarea componentei
polizaharidice a acesteia.
✓ Înl aturarea fragmentelor celulare prin centrifugare.
✓ Precipitarea proteinelor, vizând înl aturarea lor, prin vortexarea
materialului solubil restant în faza apoasa în prezenta fenolului.
Cloroformul este adesea folosit împreun a cu fenolul (ca solutie
fenol/cloroform) având pe lânga proprietatea de denaturant proteic ~i
capacitatea de a stabiliza limita dintre faza apoas a~i stratul de fenol.
✓ Precipitarea acizilor nucleici în etanol. Dupa aditia etanolului ADN-ul
va forma un precipitat alb ce poate fi colectat prin centrifugare.
✓ Înl aturarea ARN-ului din amestec - prin tratarea cu RN-aze.

Pentru multe aplicatii ADN-ul trebuie supus ulterior unor procese

suplimentare de purificare. Centrifugarea izopicnic a1 poate fi folosita pentru separarea
ADN-ului de agenti contaminanti ~i de asemenea pentru separarea unor tipuri
individuale de molecule ADN. Proba ADN este amestecata cu o substanta (clorura de
cesiu, CsCl) capabila sa formeze în timpul procesului de centrifugare un gradient de
densitate uniform. Moleculele de ADN vor sedimenta numai în zona din tubul de
centrifuga cu a carei densitate intra în echilibru, formând o banda. Aceast a banda este
apoi transferata într-un alt tub, CsCl fiind înlaturat prin precipitarea ADN-ului în
etanol. Avantajul tehnicii: abilitatea de a separa diferite tipuri de molecule ce pot fi
analizate separat prin diferite tehnici (fig.1). Dezavantaj: centrifugarea izopicnica
necesita 36-48 ore pentru formarea gradientului de CsCl. Tehnica a pierdut teren în
fata kit-urilor3 oferite de diferite companii ce permit izolarea rapida, cu costuri reduse
~i expunere minima a investigatorului la actiunea unor agenti cu potential nociv
asupra sanatatii.

1
 c:, - Aroteine
CD
::,
CJ)

-n
- AON liniar
S"
CD
Q)

CJ)
AON
- •crestar 2
0
n - ADN superspirarat
000
- ARN

Fig. 1 Centrifugarea izopicnic a moleculelor ADN în gradient de clorur i de cesiu.

Izolarea ADN-ului genomic din sânge

Principiul metodei
Acest protocol este destinat izolarii ADN din leucocite, cantitatea ob1inut a fiind de
aproximativ 5-15µg. Purificarea ADN are loc în patru etape: (1) liz i celular i
i '
nuclearl - aceastl etapl implicl initial liza eritrocitelor în soluIia de liz a celular a
urmata de liza leucocitelor i a nucleilor acestora în soluIia de lizii nuclear ii; (1*)
'
digestia op1ionali a ARN-ului total cu ajutorul RN-azelor; (2) înlaturarea proteinelor
dupi o prealabili precipitare a acestora în solutie salini ce lasl în solu1ie ADN-ul cu
masl molecularI mare (soluIie de precipitare a proteinelor); (3) concentrarea ADN-
ului i eliminarea sarurilor din solutie prin precipitare în izopropanol; (4) spalarea cu
'
etanol, deshidratarea i rehidratarea ADN-ului (fig.2);
' Centtifu,,,orul!

i ,.,. ,-,. . . . J
fu:at celular
singe periferic lizi celulari

SoL lizi nw:lea:ci

Centrifu,.aare

-- ~
a proteiruolor

~ -···-
c~ADN

p,:c,tEine

supernatant(ADN)
tansfemtm
izopmpanol

Fig. 2 Schema general a izol rii ADN din sânge

2
Materiale necesare
✓ Microcentrifuga capabila sa dezvolte o forta centrifugala relativa (RCF) de
13.000 - 16.000g;
✓ Tuburi de 1.5ml pentru microcentrifuga;
✓ Vortex (agitator turbionar);
✓ Bloc de incubare uscata a tuburilor de 1.5ml;
✓ Micropipete;
✓ Baie de apa termostatata - *op ional;
✓ Sânge recoltat pe anticoagulant (EDTA);
✓ Kit de extractie ADN:
• solutie de liza celulara;
• solutie de liza nucleara;
• solutie de precipitare a proteinelor;
• solutie de rehidratare a ADN-ului;
✓ Izopropanol 100%;
✓ Etanol 70%;

Etapele izolarii ADN din 300 µl sânge

1. Într-un tub steril de microcentrifuga (1,5ml) se transfera 900 µl soluI ie de liza
celulara.
2. Se r astoarna u ~or recipientul în care s-a recoltat sângele (omogenizare) ~i apoi se
transfera un volum de 300 µ l în tubul con inând 900 µ l soluI ie de liza celulara. Se
inverseaza de 5-6 ori.
3. Incubare 10 minute la temperatura camerei. Rezultat - liza hematiilor.
4. Se centrifugheaza proba la 13.000 - 16.000g timp de 1 minut. Rezultat - sediment
leucocitar.
5. Se îndeparteaza supernatantul faa r a afecta sedimentul leucocitar. Cantitatea admisa
de lichid rezidual deasupra sedimentului - 10-20 µl.
6. Se vortexeaza intens tubul, pâna ce leucocitele sunt resuspendate (10-15 secunde).
7. Peste celulele resuspendate se adaug a 300 µl soluI ie de lizanucleara. Amestecul se
pipeteza de 5-6 ori pentru a produce atât liza leucocitelor cât ~i a nucleilor leucocitari.
În timpul acestei etape solutia devine foarte vâscoasa. Rezultat - eliberarea acizilor
nucleici din compartimentul nuclear.
8. Optional: Se adauga 1,5 µl solutie continând RN-aze peste lizatul nuclear ~i se
amesteca proba prin inversare de 2-5 de ori. Se incubeaza 15 minute la 37oC ~i apoi se
race ~te la temperatura camerei.
9. Se adauga 100 µ l de soluI ie de precipitare a proteinelor peste cei 300 µl de lizat
nuclear ~i se vortexeaza timp de 10-20 secunde. La final pot fi vizibile mici
precipitate proteice.
10. Se centrifugheaza proba la 13.000 - 16.000g timp de 3 minute. Se obtine un
sediment proteic brun-negricios.
11. Se transfera supernatantul continând ADN-ul aflat în stare solubila într-un nou tub
de 1,5 ml ce contine 300 µl izopropanol.
12. Se amesteca u ~or solutia prin inversie pâna ce devin vizibile filamente albe de
ADN ~i pâna ce acestea formeaza o masa compacta. Rezultat - precipitarea ADN.
13. Se centrifugheaza proba la 13.000 - 16.000g timp de 3 minute. La sfâr itul acestei
etape ADN-ul trebuie sa fie vizibil ca un mic sediment alb.
14. Se îndeparteaza supernatantul ~i se adauga un volum de 300 µl de etanol 70% la
temperatura camerei. Se inverseaza u ~or tubul de câteva ori pentru a spala sedimentul

3
de ADN ~i peretii tubului. Se centrifugheaza din nou în acelea ~i conditii ca la punctul
13.
15. Se înlatura etanolul evitându-se aspirarea sedimentului. Se r astoarna tubul pe o
hârtie de filtru absorbanta~i se permite evaporarea etanolului restant timp de 10-15
minute la temperatura camerei.
16. Se adauga 100 µ l soluIie de rehidratare a ADN-ului peste sediment i se
incubeaza proba peste noapte la temperatura camerei sau la 4oC. Alternativ, pentru
rehidratare se poate incuba tubul la 65oC timp de 1 ora.
17. ADN-ul în stare rehidratata se pastreaz a la 2-8oC.

Nota
Probele de sânge recoltate pe anticoagulant pot fi stocate la 2-8oC un interval de
maxim doua luni însa cantitatea de ADN obIinuta se va diminua pe masura ce cre te
timpul de stocare.

Concentratia, puritatea ADN. Evaluarea va fi efectuat a folosind

spectrofotometrul Eppendorf Biophotometer fiind posibil a masurarea în
volume de peste 50 µl.

Cuantificare ADN:
a. Masuratorile se vor efectua în 50 µl proba ADN;
b. Înregistrarea absorbantelor: 230, 260 & 280 nm;
c. Calculul concentratiei:
A260 x 40 x Factorul de dilu ie = Concentra ia µg/ml;
t t
d. Determinarea purit atii prin calcularea fractiilor 260/280 i 260/230.
Probele de o puritate acceptat a vor avea valori mai mari sau egale cu:
i. 260/280: 1.8;
(o valoare mai mica a raportului 260/280 indic a o posibila contaminare
cu proteine);
ii. 260/230 = 1.7
(o valoare mai mica a raportului 260/230 indic a o posibila contaminare
cu saruri, guanidin a, carbohidrati, peptide, fenoli sau alti compusi
aromatici).

Glosar
1. Izopicnic: având aceea i densitate.
2. ADN "crestat": ADN dublu-catenar cu secven e în care se remarca absenta
legaturilor fosfo-diesterice între doua nucleotide adiacente de pe aceea i catena ca
urmare a distrugerii sau actiunii unei enzime.
3. Kit: set de substante destinat unui anumit protocol de lucru.

4
 Biologie molecular a– LP 7
Reac tia de polimerizare în lan t (PCR - Polymerase Chain Reaction)
' '
Aplica tii. Tehnica de lucru
'
Reac tia de polimerizare în lan t a revolu tionat biologia molecular a prin capacitatea sa
de a amplifica ~i caracteriza cantit ati infime de acizi nucleici. Folosit a ini tial doar în
cercetare metoda este în prezent foarte utilizat a în medicin a pentru identificarea
muta tiilor în secven tele ADN precum ~i în depistarea, în probele biologice umane, a
ADN-ului micro-organismelor. Printre cele mai importante aplica tii ale PCR:
• clonare molecular a;
• secven tiere ADN;
• arheologie;
• medicin alegal a;
• amplificarea unor secven te necunoscute;
• patologie clinic a;
• diagnostic genetic;
• caracterizarea unor muta ii necunoscute;
• amprentare ADN/analiza populatiei;
• analiza genomului;
• analiza cantitativa a ADN i/sau ARN;

No,tiuni cheie
.
✓ PCR reprezinta amplificarea in vitro a secventelor ADN specifice
✓ PCR necesita doi primeri – cîte unul complementar pentru fiecare dintre cele

doua catene ADN – precum ~ i o ADN polimeraza

✓ Ciclarea termica repetata determina copierea i multiplicarea ADN-ului
~
dintre cele doua sit-uri de legare a primerilor

În cei mai simpli termeni, PCR reprezinta copierea repetitiva a unor regiuni din
ADN-ul dublucatenar. Procesul este schematizat în figura 1. Puterea acestei reactii deriva
din abilitatea sa de a replica, în cantitat i mari, într-o scurta perioada de timp, regiuni
specifice din ADN. Prin tehnica PCR este posibila multiplicarea in vitro rapida a unei
secvente ADN tinta. Pornindu-se de la o singura molecula de ADN se genereaza o
cantitate suficienta pentru clonare, secventiere, cartare cu enzime de restrictie, etc.
Impactul PCR a fost subliniat în anul 1993 prin acordarea Premiului Nobel pentru Chimie
profesorului Kary Mullis pentru contributia sa în dezvoltarea acestei tehnologii.

1
 5'
3'
i
had
Denaturare
3'
5'
Figura 1. Etapele unui experiment PCR.
Cele doua catene ale moleculei ADN 1int a
sunt denaturate (separate) prin înc alzire.
5' 52 C 3' Secventele ini iale ale fragmentului de
amplificat sunt recunoscute de primerii
3'
as 5' oligonucleotidici. Dupa etapa de denaturare
i Ata,are prlmerl
temperatura este diminuat pentru a
permite ata area fiecaruia dintre cele dou a
5' 3' tipuri de primeri la regiunile
3' 5' complementare de pe fiecare caten a.
Regiunea de amplificat este localizat a între
3'
as 5'
situsurile de ata§are a perechii de primeri.
..1ADN
Extensle prln actlunea
pollmerazel În ultima etapa a unui ciclu PCR
temperatura este crescut a pentru asigurarea
5'
◄
~
had 5'
3' conditiilor optime de functionare a ADN-
polimerazei ce va determina extensia
primerilor în prezenta deoxiribonucleotid-
3'
as 5'
trifosfatilor. Acest ciclu: denaturare, ata §are
i ~ i extensie este repetat de 20-30 ori
5'
3' -

3'
5'
~-.: 5'
3'

---- 3'
5'
determinând o amplificare masiv a a
segmentului ADN cuprins între perechea
de primeri.
■■
i
Repetare

PCR implica doi primeri oligonucleotidici, cu o lungime medie cuprins a. între 17-
30 nucleotide, ce flancheaza secventa ADN tinta ce urmeaza a fi copiata. Unul dintre
primeri are aceea~ i secventa de nucleotide cu una din catenele ADN (numit a catena sens),
în timp ce al doilea primer are aceea§ i secventa. cu cealalta catena (antisens). Primerul
catenei sens se va împerechea, prin intermediul unor interactiuni între bazele
complementare, cu catena antisens ~i va initia sinteza noii catene sens. Similar, primerul
antisens se va lega de catena sens a ADN-ului §i va ini1ia sinteza unei noi catene antisens.
Reactia PCR este împat r ita în trei faze separate, fiecare având loc la temperaturi diferite
figura 1.
Ciclul denaturare- ata~ are primeri – extensie este repetat de 20-30 ori în vederea
obtinerii unei amplificari satisfa.a c toare a secven ei ADN specifice. Cele trei etape ale
fiecarui ciclu PCR sunt urmatoarele:

• Denaturare. Cele doua catene ale moleculei ADN tinta sunt separate prin
înci lzire, cel mai frecvent la temperatura de 94°C. Aceasta energie determin a
ruperea leg turilor de hidrogen dintre bazele complementare, neafectând
legaturile fosfo-diesterice dintre nucleotidele de pe aceea §i catena.
• Atai are primeri. Cele doua catene 1inta sunt supuse unui proces de r cire în
prezenta unor primeri oligonucleotidici. Primul tip de primeri (sens) recunosc i
se leaga de catena tinta antisens, cel de-al doilea tip (primeri antisens) legându-se

2
 de catena sens. Cele doui tipuri de primeri sunt sintetiza i în a a fel încât capetele
lor 3’ sil fie în interiorul regiunii de amplificat. Temperatura de ata llare la
secven ele t intI depinde de secven1a §i lungimea primerilor. Tipic, aceast ll etap ll
'
se desf~ oar1 la valori ale temperaturii cuprinse între 45-60°C.
• Extensia. O ADN-polimeraz1 se leagi la capl tul 3’- liber al primerilor
oligonucleotidici ata a i i folosesc dNTPs (deoxiribonucleotid trifosfa i) pentru a
•t '
sintetiza o noull catenI ADN în directia 5’-3’. Primele experimente PCR au
utilizat drept enziml de replical ie fragmentul Klenow (fragment proteic de
dimensiuni mari rezultat în urma clivi rii ADN polimerazei I). Acest fragment era
însl degradat dupl etapa de denaturare astfel încât trebuia aditionat ll o nou
,,
cantitate dupI fiecare ciclu de amplificare. Un progres extrem de important a fost
cauzat de introducerea Taq ADN Polimerazei izolat i purificati de la bacteriile
Thermus aquaticus (Lawyer et al., 1989). Taq ADN polimeraza este stabil i la
temperaturi înalte – nu-f i modificl activitatea dupl ce trece prin etape de
denaturare termicI la 94°C. Aceasta înseamnI cI nu trebuie suplimentat mediul cu
enziml dupl fiecare ciclu PCR i cl ciclurile de încl lzire i r ii.cire a probelor
' '
poate fi complet automatizat în blocuri de incubare speciale. Mai mult, Taq ADN
.,
polimeraza are o temperaturl optiml de catalizare a procesului de replicare in
vitro la 72°C. Temperatura înaltl de desf urare a extensiei determin1 o ata are
specificl a primerilor de catenele tintl .
DupI un ciclu de replicare PCR se genereazl câte o noul copie a fiecl rei catene ADN
init iale, a§ a dupl cum se poate remarca din figura 1. Sit-ul de initiere a sintezei ADN este
ales prin legarea specificl a primerilor oligonucleotidici de catena matri11. Hibridizarea
specificl , prin formarea de leg1 turi de hidrogen între bazele complementare, va pozi tiona
specific fiecare nucleotid într-o secven complementarI cu matrita. Ceea ce nu este atât
de evident este modul în care sinteza ADN este încheiatll. În momentul în care se
evalueazl rezultatul unei reac ii PCR tipice printr-o electroforezl în gel de agaroz l
(figura 2), se observi formarea unei benzi singulare distincte. Aceasta sugereaz l c i

•
fragmentele ADN produse sunt omogene i cI ele încep fi se sfâr esc cu acelea fi
secven1e. •
_,.
Prlmer1

~:: r Gena J ;.' 3' Figura 2. Amplificarea PCR a unei gene

din ADN-ul genomic.
+-
Prlme,,r2
Doi primeri oligonucleotidici au fost
M PCR
sintetiza1i pentru flancarea unei gene
apartinând genomului uman. S-a efectuat o
reactie PCR având 25 cicluri. 1/10 din
cantitatea de ADN astfel obtinut il a fost
migratll în gel de agaroz I în paralel cu o
probl de ADN standard (M). Gelul a fost
marcat cu etidium bromid i fotografiat în
'
~ Pro<lls
PCR luminl UV.

3
 Pentru a întelege cum are loc acest proces trebuie s1 vedem cum se produc
fragmentele ADN pe parcursul unui numI r de cicluri PCR (figura 3). În timpul primului
ciclu PCR cele douI catene ADN tintI sunt separate, replicarea începând de la situsurile
de legare a primerilor. Cele doui catene ADN nou-sintetizate la sfâr itul ciclului 1 vor
avea fiecare un capl t 5' determinat de locul de ata are a primerului, însi un cap1t 3'
imprecis definit. Sinteza ADN nu se va încheia la nivelul unui anumit nucleotid din
'
secvenl a matril ei ci doar în momentul în care va începe etapa de denaturare a ciclului 2.
Fiecare dintre catenele ADN prezente la sfâr itul ciclului 2 va intra în urmii.torul ciclu
PCR devenind matri1e de care se vor lega noi primeri. În ciclul 2 primerii se vor lega atât
de cele doui catene originale cât i de cele sintetizate în timpul ciclului 1. Legarea
primerilor la catenele matri originale vor duce la formarea aceluia i tip de produs
generat în timpul ciclului 1. Oricum, legarea primerilor de catenele ADN produse în
ciclul 1, urmate de replicare vor determina formarea unor catene ADN cu ambele capete
5', respectiv 3', bine definite. Acest proces are loc datoritl faptului cI replicarea ADN se
va încheia în momentul în care nu mai este nici o secven1i de copiat. Astfel, la sfâr itul
ciclului 2 sunt generate dou catene precis "ti iate" la ambele capete. În acest moment
aceste doul catene sunt legate de dou1 catene "tii.iate" doar la capetele 5'. În ciclul
urmii.tor (3) catenele precis definite la ambele capete vor deveni la rândul lor matri e,
permii ând ata area unui nou set de primeri.
'
AON (inta
S'
3'
Figura 3. Produ ii formati în urma primelor
Cidul 1
S'
3' S'
3'
'
trei cicluri ale experimetului PCR
Molecula ADN lintii. contine secven e
complementare celor douI oligonucleotide.
3' S'S/ +
3'
S' Oligonucleotidele ac1ioneazI ca puncte de
Ciciul2 ini1iere a replicl rii ADN. Produ~ii fiec rui
S' 3' ciclu PCR vor deveni to ti matrite în replicarea
3' S'
+ ADN în ciclurile urmii.toare.
S' G;;;J 3'
3' c:::::::i S' La sfârI itul celui de-al treilea ciclu se
S' i;;:;J
+
. 3' formeazi1, alI turi de alte fragmente ADN,
3' 6'
duble catenl ce corespund exact tintei. În
3'
5•g +
3'
S'
ciclurile urmi toare se va observa o creIItere
exponen1iali a acestui tip de molecule.
Ciclul 3
6'
3' S'
+
S' i:;;:;::J 3'
3'
+
c:::::w
I r(;;;:J ~:I
+ 3'
S' uv,J
3'- · c::::w
+
S' 3'
3' c:::)6'
±
I ~:c;;;:;J ~:I
+
S' 3'
3' S'
+
S' 3'
3' S'
4
Dupa ciclul PCR numarul 3, repetarea ciclurilor: denaturare termic , ata are a primerilor
i extensie vor determina o acumulare exponentiala a fragmentelor ADN int (vezi
tabelul 1). Dupa 25 cicluri, numar tipic pentru multe experimente PCR, este a teptata o
amplificare de aproximativ 30 milioane de ori. Toate reactiile PCR sunt "contaminate" cu
un numar mic de fragmente ce au terminatii nedorite, însa amplificarea masiva a
fragmentelor ADN specifice le fac sa fie aproape nesemnificative.

Amplificarea unor secven te specifice din ADN

'
Echipamente ~i materiale necesare:
✓ termocicler (sistem de incubare a probelor respectând un program pre-
setat);
✓ micropipete;
✓ hota sterila cu flux laminar;
✓ gheata;
✓ tuburi de aplificare de 0,2ml;
✓ ADN izolat i purificat (0.01-0.1 µg);
✓ primer 1 (20pmol);
✓ primer 2 (20pmol);
✓ Tris-HCl (20mM, pH 8) - solutie tampon;
✓ MgCl2 (2mM) - pentru eliberarea Mg2+ (co-factor pentru ADN
polimeraze);
✓ KCl (25mM) sau KCl (10mM) ~i (NH4)2SO4 (10mM);
✓ deoxinucleotid trifosfa i (câte 50 µ g din dATP, dCTP, dGTP, dTTP);
✓ ADN polimeraza tremostabila (2 unitati);
✓ volumul de reactie total: 50-100 µL;

Mg2+ joaca un rol extrem de important, acest ion fiind necesar functionarii
ADN polimerazei (Fig.1). Specificitatea PCR depinde de concentra tia sa în
amestecul de reactie, aceasta variind între 1-5mM.

5
 mM Mg2+
M 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

◄Produs PCR
specific

Fig.1 Efectul concentratiei magneziului asupra eficientei ~i specificit atii unui

experiment PCR. În acest experiment s-au folosit concentratii diferite de
MgCl2. Dupa PCR produ~ii au fost separa i printr-o electroforeza în agaroz a
i apoi colorati cu etidium bromid. Dimensiunea produ ~ilor PCR a fost
evaluata prin compararea cu un set de ADN de dimensiuni standard (M).

Concentratia solu iei tampon ~i a sarurilor folosite este de obicei constant a, de ~i

unele protocoale reduc nivelul de KCl pentru a cre te durata de ata are a ADN
polimerazei la catena matrita, rezultatul fiind un produs cu o lungime (secventa) mai
mare. Dupa ce toate componentele PCR au fost pipetate în tubul de amplificare se
adauga un ulei mineral care sa previna evaporarea probei în timpul etapelor de
încalzire. O solut ie alternativa este reprezentata de folosirea unui termociler cu capac
încalzit. Parametrii obi~ nuiti ai unui ciclu de amplificare PCR pot fi:
► 940 C, 30s - Denaturare
0

► 600 C, 30s - Ata~are primeri

► 72 C, 1min- Extensie
Etapele de denaturare ~ i de ata are a primerilor sunt relativ scurte, însa suficiente pentru a
permite ruperea ~ i reformarea legaturilor de hidrogen dintre catenele de ADN.
Protocoalele initiale au inclus un pas initial de denaturare (94 0 C, 2min) pentru a se
asigura timpul necesar denaturarii tuturor fragmentelor ADN. Acest tip de protocol este
în prezent evitat pentru a se evita "crestarea" ADN-ului (ruperea leg aturilor fosfo-
diesterice dintre nucleotidele de pe aceea i caten ). Lungimea fragmentelor amplificate
dicteaza durata etapei de extensie. Marea majoritate a polimerazelor folosite în PCR au o
rata de replicare in vitro a ADN-ului de 500-1000bp min-1 (Tabel 1).

6
 Numarul total de cicluri depinde atât de cantitatea initiala de ADN cât i de
cantitatea de produ ~i de amplificare necesara dupa finalizarea PCR. În general, pentru a
evita erorile de replicare probele vor fi supuse unui numar cât mai mic de ciclari cuprin în
general între 17 ~i 25. Dupa ultima ciclare multe protocoale includ o etap a suplimentara
de extensie (72 0 C, 5min) pentru ca toate fragmentele existente sa se regaseasc a în forma
dublu-catenara~i astfel sa creasca eficienta reactiei.

Tabel 1. Propriet atile diferitelor tipuri de ADN polimeraze termostabile

Taq ADN Tfl ADN Pfu ADN Tli ADN Tgo ADN
polimeraza polimeraza polimeraza polimeraza polimeraza
Organism Thermus Thermus Pyrococus Thermococcus Thermococus
aquaticus flavus furiosis litoralis gorgonarius
Conditii PCR optime
Timpul de extensie/kb (min) 1 1 2 2 2
Temperatura de extensie ( 0 C) 70-75 70-74 70-75 70-75 70-75
[Mg2+] (mM) 1-4 1-4 2-4 2-4 2-4
pH@25 0 C 7.0-7.5 7.0-7.5 8.0-9.0 7.0-7.5 7.0-7.5
[dNTPs] (mM) 40-200 40-200 40-200 40-200 200
[primeri] (mM) 0.1-1.0 0.1-1.0 0.1-1.0 0.1-1.0 0.1-1.0
activitate 5'-3' exonucleazica da da nu nu nu
activitate 3'-5' exonucleazica nu nu Da da da
Rata de producere a erorilor 5.0x10-4 5.0x10-5 1.3x10-6 2.8x10-6 2.0x10-6
(numarul de erori/baze replicate )

ADN polimerazele termostabile

Bacteria Thermus aquaticus a fost pentru prima data descoperita în câteva izvoare
termale din Parcul National Yellowstone, Wyoming, SUA. Toleranta termica a acestui
organism este cuprinsa între 50-80 0 C cu o temperatura optima de cre ~tere în jurul a 70 0 C.
Taq polimeraza (izolata din aceste bacterii) este o enzima monomerica cu o greutate
moleculara de 94kDa. Enzima este ea îns a~i termostabila; replica ADN-ul la 74 0 C ~i
ramâne functionala dupa incubare la 94 0 C. Enzima are activitate 5'-3' polimerazic a~i 5'-
3' exonucleazica dar faa r capacitate 3'-5' exonucleazica (corectarea erorilor). Lipsa
activitatii 3'-5' exonucleazice se refer a la incapacitatea înlaturarii unei baze incorect
adaugate lantului în cre ~tere ~i astfel sinteza unui produs cu mutatii generate în timpul
PCR. Taq polimeraza incorporeaza gre ~it o baza la fiecare 104-105 baze replicate. În
cazul în care s-ar produce o eroare la 104 baze replicate o secventa tinta de 1kb
amplificata într-un proces de 25 cicluri cu Taq ar genera 10% din produ ~i cu mutatii.

ADN-ul t, inta
► situsurile de legare a primerilor, precum i secventa dintre aceste doua situsuri
trebuie sa fie intacte;
► Trebuie evitata contaminarea! Pentru aceasta se vor manipula cu grija probele,
micropipetele, tuburile de amplificare, solu tiile tampon, enzimele, etc.

7
Primerii
► au o lungime cuprinsa între 17-30 nucleotide, suficienta pentru a permite
recunoa ~terea unei secvente unice în genom;
► vor contine aproximativ 50% GC;
► Temperatura de ata ~are a perechii de primeri - calculata din ecuatia
2(AT)+4(GC)- folosita într-un experiment trebuie sa fie aproximativ egala;
► secventele cu regiuni lungi în care se gase ~te doar un singur tip de nucleotid
trebuie evitate pentru a preveni ata area primerului de secventele repetitive din
ADN-ul tinta;
► Pentru evitarea formarii primer-dimerilor un primer nu trebuie sa aiba secvente
complementare cu perechea sa;

Glosar:
Exonucleaze - enzime individuale sau p r i componente ale unui complex enzimatic ce
cliveaza secvential nucleotidele la un cap t al unui lant polinucleotidic. Aceste enzime
hidrolizeaza legaturile fosfo-diesterice atât la capatul 3' cât i la cel 5'.

8
LP 9. Electroforeza. Tipuri de electroforez a. Aplicatiile tehnicilor electroforetice
in biologia moleculara.

Electroforeza reprezinta una dintre metodele cele mai utilizate pentru

separarea, identificarea i purificarea acizilor nucleici. Termenul “electroforez a”
descrie procesul de migrare a particulelor ionizate într-un câmp electric. Nucleotidele,
acizii nucleici, proteinele, etc. posed a grupari ionizabile care sunt înc arcate negativ la
pH alcalin ~i în consecinta migreaza catre anod (+). Aceasta migrare este dependenta
de:
- încarcatura electrica~i dimensiunea moleculei;
- concentratia gelului;
- compozitia solutiei tampon(1);
- puterea aplicata;

Tipuri de electroforeze folosite:

- electroforeza în gel de agaroza;
- electroforeza în gel de poliacrilamida (PAAG);
- electroforeza în camp pulsatil (Pulse-Field Gel Electrophoresis - PFGE);
- electroforeza capilara

A. Electroforeza în gel de agaroza are o putere de rezolutie mai mica în

compara ie cu PAAG, dar poate separa fragmente ADN dintr-un domeniu de lungime
mai larg. Variind concentratia de agaroza se pot separa fragmente de la 100bp(2) pâna
la 50kb. Concentratia gelului se alege în func ie de lungimea fragmentelor vizate.
Acest tip de electroforez a se realizeaza în plan orizontal, gelul fiind imersat în solutia
tampon.

B. Electroforeza în gel de poliacrilamida este foarte eficienta în separarea

fragmentelor scurte de ADN (5-500 bp). Puterea de rezolutie este extrem de mare
putând fi separate fragmente ADN ce difera în dimensiune printr-o singur a baza.
PAAG se realizeaza în plan vertical, într-un câmp electric constant.

C. Electroforeza în camp pulsatil (Pulse-Field Gel Electrophoresis -

PFGE) - Fragmentele ADN cu o lungime de peste 15-20kb sunt separate printr-o
tehnica electroforetic a în care orientarea câmpului electric este modificata periodic (în
3 direc □ ii: axul central al gelului, 60° la stanga, 60° la dreapta).

D. Electroforeza capilara este cea mai moderna dintre metode. Dezvoltata in

paralel cu cea clasica, ea ofera avantajul automatizarii complete. Permite separarea
moleculelor incarcate electric functie de mobilitatea proprie intr-un tampon cu un pH
dat. Separarea are loc in capilare cu un diametru mai mic de 100 micrometri, înc arcate
cu un tampon format din diversi electroliti.

Avantajele electroforezei:
- este o metoda simpl i rapid a;
- permite vizualizarea directa a fragmentelor ADN folosind un colorant
intercalar (3) fluorescent (4) (etidium bromid);

1
 - daca este necesar, ADN-ul ce formeaza benzile poate fi recuperat din gel i
analizat suplimentar prin alte metode (clonare, amplificare, secventiere, etc.).

Electroforeza în gel de agaroza

Principiu: La pH alcalin sau neutru, acizii nucleici au sarcina electrica globala

negativa. Ca urmare, daca sunt plasate într-un câmp electric, moleculele de acizi
nucleici migreaza la anod (+), permitand astfel separarea, identificarea si purificarea
fragmentelor de ADN cu lungimi cuprinse intre 100pb si 50kb. Viteza de migrare este
limitata de fortele de frecare impuse de gel. In timp ce sarcina si/sau marimea pot
afecta viteza cu care moleculele traverseaza gelul, raportul sarcina/masa este acelasi
pentru molecule de ADN de diferite lungimi. De aceea, marimea moleculei va fi cea
care determina viteza cu care aceasta migreaza, determinand o separare foarte buna a
amestecurilor de ADN de diferite lungimi.

Tehnica parcurge trei etape:

1. Prepararea unui gel cu un continut adecvat de agaroza avand in vedere

fragmentele ce urmeaza sa fie separate;
2. Incarcarea probelor si migrarea la un voltaj si un timp optime separarii;
3. Vizualizarea gelului in lumina UV (daca ethidium bromide a fost inclus in
gel).

Mod de lucru

Prepararea gelului de agaroz a

Materiale necesare

- 1X tampon TAE:
-Solutia stoc 50X TAE, pH 7,2:
Tris base 242 g
Acid acetic glacial 57,1 ml
EDTA 0,5 M 100 ml
se adaug a Tris ~i EDTA la 500 ml de ap a distilata, apoi se
adauga acidul acetic. Se aduce totul la 1 L cu apa distilata.

-agaroza - este un polizaharid liniar extras dintr-o alga.

1. Se prepara gelul de agaroza 2% prin adaugarea a 2,0 g de agaroza la 100 ml

de Tampon TAE 1X. Se marcheaza nivelul lichidului pe vas i apoi se dizolva
agaroza. Dizolvarea agarozei se face la cald si cu agitare Se completeaza pâna

2
la semn cu apI distilat preîncI lzitIt la 60oC pentru a înlocui volumul evaporat
prin încI lzire.

2. Se r ce te agaroza pânI la 55oC.

l vizualizarea
- Pentru ' fragmentelor de ADN post-migrare se adauga in gelul in
curs de racire un volum de 3µl de bromura de ethidium.
- Se pregateste placa de electroforeza.
- Se aplica pieptenele care va forma in gel godeuri egale in care se vor aplica
probele.
- Se toarn gelul pe placa de electroforez . Placa trebuie s fie dispus perfect
'
orizontal. Dup turnare se lasl la rl cit/polimerizat 20-30 minute.

Pregatirea probelor ADN

Materiale necesare

-probe ADN ce urmeaza a fi migrate;

-solu ie de aplicare a probelor 5X:

Ficoll 400 5%
Bromphenol blue 0,1%
Xilene cyanol 0,1%
EDTA (Na2EDTA x 2H2O) 100 mM
Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM

3. Se preparIt probele prin amestecarea a 9 l din fiecare probl cu 2,5 l

solu ie de aplicare a probelor 10X (Figura 1).

2,5 l solu ie de aplicare a probelor 1X 10 l prob ADN amplificat

Figura 1. Prepararea probelor

4. Se preparl 1 L de tampon de migrare de TAE 1X.

5. Dupa ce a polimerizat gelul, se îndepl rteazI cu griji pieptenele si benzile

laterale. Se pune placa cu gelul în camera de electroforezI . Se toarnl
tamponul de migrare în cuvI . Tamponul trebuie sI acopere gelul cu un
strat de aprox. 0,65 cm.

3
6. Se transferl fiecare probl în godeul corespunzI tor (Figura 2).

7. Obligatoriu la fiecare migrare, intr-unul dintre godeuri, se pipeteaza un

Ladder, adica un amestec de fragmente de ADN cu lungimi cunoscute.
Acest ladder permite identificarea lungimii probelor de ADN migrate.

Figura 2. Transferul probelor în godeuri

electrozi. Se lasI la migrat timp de 2 ore.•

8. Se regleazii. voltajul la 5 volI i/cm (m surat ca distan dintre cei doi

• •
9. Dup electroforez si utilizând un transiluminator (302 nm), se fotografiaz l

••
gelul, se prelucreaz i analizeazl imaginea.

NotI : La analiza datelor, se pot observa benzi adiIionale pe lîngl banda ce

reprezintl allelele. Acestea nu trebuie sii. ne alarmeze deoarece ele reprezint ii.
heteroduplexuri de ADN ce se formeazii. la electroforeza în agarozl cu mediu
nedenaturant.

Factori care influen eazl migrarea fragmentelor ADN în gelul de

agarozI :
1

1. Dimensiunea moleculelor ADN. Viteza migrllrii fragmentelor ADN este

invers propor ionalI cu dimensiunea lor.
1
2. Concentra ia agarozei. Concentra ia agarozei determinl dimensiunea
1 1

•
1 •
porilor gelului care ac ioneaz ca o sitI molecularI . Astfel, la o
concentra ie mic a agarozei porii forma i au dimensiuni mari permi ând
1 1
trecerea unor molecule mai mari (Tabel 1).
1

4
 Tabel 1. Limitele separ rii în geluri de concentratii diferite
(%) agaroz Limitele de separare eficient a
în gel moleculelor liniare de ADN (kb)
0.3 5-60
0.6 1-20
0.7 0.8-10
0.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-3

2.0 0.1-2

Puterea de rezolu ie a gelului de

agaroz de concentratii diferite

3. Coloran ii intercalari. Etidium bromid este un colorant fluorescent folosit

pentru a detecta ADN-ul în agaroz (Figura 3). Acesta reduce mobilitatea
electroforeticl a ADN-ului cu aproximativ 15%. Colorantul se insinueaz
între perechile de baze blocate, extinzând lungimea moleculelor liniare de
ADN (Figura 4). Atentie! Etidium bromid este cancerigen i trebuie
manipulat cu grij .

Figura 3. Electroforeza în gel de agaroz i colorarea

acizilor nucleici cu etidium bromid

5
 Figura 4. Etidium bromid intercalat între dou baze perechi.

4. Compozi1ia solutiei tampon în electroforeza. Mobilitatea electroforetica a

ADN-ului este afectati de compozitia ~i ti ria ionici a tamponului. Când
concentratia tampon/ion este foarte sci zuti conductan1a electric i este
minimi iar ADN-ul migreazi foarte încet.

Sunt disponibile câteva tipuri de solu1ii tampon pentru electroforeza ADN

(Tabel 2). Cel mai folosit este Tris-Acetat (TAE) însi datoriti capacit atii sale de
tamponare mai degrabi sciizute tinde sii fie epuizat în timpul electroforezelor
prelungite. Atât Tris-Fosfatul (TPE) cât ~i Tris-Boratul (TBE) sunt mai
costisitoare decât TAE dar au o capacitate de tamponare semnificant crescuti .

Tabel 2. Cele mai folosite tipuri de solu □ ii tampon

Tampon Solu1ii de lucru Solutii stoc concentrate ( /litru)

Tris-acetate 1x : 0.04 M Tris-acetate 50x : 241 g baza Tris

(TAE) pH 8.0 0.001 M EDTA 57.1 ml acid acetic glacial
100 ml 0.5 m EDTA
Tris-phosphate 1x : 0.09 M Tris-phosphate 10x : 108 g bazi Tris
(TPE) pH 8.0 0.002 M EDTA 15.5 ml 85% acid
fosforic (1.679 g/ml)
40 ml 0.5 m EDTA
Tris-borate 0.5x : 0.045 M Tris-borate 5x : 54 g baz i Tris
(TBE) pH 8.0 0.001 M EDTA 27.5 g acid boric
20 ml 0.5 m EDTA

6
Concluzii:

- electroforeza acizilor nucleic este o etapa obligatorie in aproape orice protocol de

analiza a acizilor nucleici

Aplica □ ii:

1. analiza produ □ ilor de amplificare (ampliconi) ob □ inu □ i prin reac □ ia de

polimerizare in lan □ (PCR) - identificarea si/sau determinarea semicantitativa
a fragmentelor ADN având diferite lungimi;
2. detectia si determinarea semicantitativa a ADN-ului genomic obtinut in urma
extractiei din tesuturi;
3. separarea fragmentelor ADN rezultate in urma digestiei cu enzime de
restric □ ie.
4. evaluarea nivelelor de fragmentare a ARN-ului total purificat din diferite
probe biologice.

Glosar

(1) Solutie tampon - solu ie ce rezista schimbarilor concentra iilor ionilor hidroniu
(H3O+) i hidroxid (HO-) (consecutiv i modificarilor pH-ului) generate de aditia unor
mici cantit i de acid sau baze sau dup diluare.

(2) bp – perechi de baze (ex.: A=T, G=C).

(3) Intercalar ADN - clasa de molecule ce se inser a reversibil în spatiul dintre dou a
baze-pereche adiacente. Cele mai multe dintre aceste molecule sunt policilice,
aromatice, aceste caracteristici recomandându-le drept buni coloran ti ai acizilor
nucleici. Exemple: etidium, proflavin a, daunomicina, doxorubicina ~i talidomid a.
Intercalarii ADN sunt folositi în tratamentul chimioterapic actionând prin inhibarea
replicarii ~i transcriptiei ADN-ului celulelor canceroase cu rata rapida de multiplicare.
Intercalarii sunt agenti mutageni putând induce modific ari structurale în catena de
ADN pe care o despiralizeaza~i o alunge te.

(4) Fluorescenta - fenomen optic în care absorbtia moleculara a unui foton determina
emisia unui alt foton cu o lungime de und a mai mare. Diferenta energetica dintre
fotonii absorbiti ~i cei emi i este eliberata prin vibratii sau încalzire. Frecvent fotonul
absorbit este în domeniul ultraviolet [UV - radia tia electromagnetica cu o lungime de
und a mai mica decât lumina vizibila (400-700nm), dar mai mare decât razele X (10 -
0.01)] iar cel emis în spectrul vizibil.

7
LP10. Tehnici moleculare utilizate pentru detectarea muta tiilor

A. Detectarea muta iilor prin tehnici PCR.

Marea majoritate a metodelor de diagnostic folosite pentru detectia mutatiilor fi a
polimorfismelor mononucletidice (SNP – Single Nucleotide Polymorphism) necesit i
amplificarea unei secvent e prin PCR urmati de determinarea variantelor specifice prin
utilizarea unor sonde scurte de hibridizare sau a endonucleazelor de restric ie. Tehnicile
de hibridizare includ: ASO - Analiza muta iilor punctiforme folosind sonde
oligonucleotidice specifice unei alele (Allelic point mutation-Specific Oligonucleotidic
probe), TaqMan PCR, PCR-RFLP - Polimorfisme ale lungimii fragmentelor de
restric ie (RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism). Aceste metode sunt
frecvent folosite pentru diagnosticul molecular al tumorilor familiale.

a) ASO. Metoda folose te sonde ce corespund unei secven e mici (20pb) din structura
'
genei, permit ând depistarea unor mutatii specifice, cunoscute deja într-o anumit I.
boalI geneticI . Aceste sonde scurte sunt cu mult mai sensibile la alter il.rile minime ale
secvent ei genice, putând depista modificiiri ale unei singure perechi de baze.
În aceasti metodi , o solul ie apoasl de ADN genomic nefractionat este depusi , sub
forma unei pete, direct pe o membrani de nitrocelulozl (dot-blot) sau indirect, printr-
o fantii. (slot-blot); pici tura este uscati I i ADN imobilizat pe membran l este
denaturat (prin tratarea filtrului cu alcali) i expus la o solutie ce con tine sonda
'
monocatenar marcata; aceasta se va hibridiza, formându-se un heteroduplex tint i -

,
sondi ce va fi pus în evidenti autoradiografic.
Aplica ie. Utilizarea ASO în diagnosticul fibrozei chistice (Mucoviscidoza).
Mucoviscidoza este o boall geneticI cu transmitere autozomal-recesivI , determinând
afectarea glandelor exocrine care produc o secretie anormal de vâscoas ii., sarac l în ap i
substan e organice. Secretiile vâscoase obstrueazl lumenul bronsic, ductele pancreatice,
,,
•
cIi ile biliare, ductele organelor reproductive, iar glandele seroase, glandele sudoripare
produc o secret ie anormalI prin continutul crescut de electroliti. Cea mai comunl alell
pentru mucoviscidozl cont ine o deletie de 3pb a genei CF (ce codific l o protein l –
CFTR). Statusul pacientilor suspectal i a fi afectal i de aceastl boall poate fi evaluat
folosind 2 sonde ASO: normalii., respectiv mutantI (vezi fig.1).
Fig.1. Autoradiograml obj inutl prin Pacienti 1 2 3 4 5 6 7
hibridizarea sondelor oligonucleotidice
alele-specifice cu ADN genomic de la
7 pacient i suspec i de fibrozIi cistic .
Sondele ASO normale (ASOn) au
secvent a:
5’CACCAAAGATGATATTTTC3’.
ASOn
III II
Sondele ASO mutante (ASOm) au
secvent a:
5’CACCAATGATATTTTC3’.
ASOm
I 11111
1
Întrebare: Pornind de la aspectul autoradiogramei ce pute i spune despre statusul
pacien1ilor (homozigot/heterozigot/slnltos)?

b) TaqMan PCR este o metodl de evaluare în timp real a acizilor nucleici folosind
sonde dublu-marcate fluorogenic. Tehnica necesitAun termocicler similar celui folosit

.-
în reacl iile PCR obi nuite prezentând în plus un sistem de stimulare i detec tie a
fluorocromilor având diferite lungimi de undi . În timpul reac iei PCR, în momentul
init ierii sintezei ADN, activitatea 5 •
3'exonucleazicI a Taq polimerazei determin II.
degradarea sondei dublu-marcate ata ate la ADN 1intii. (de aici §i numele Taq
'
polymerase + PacMan). În plus fati de cei 2 primeri PCR conven tionali, P1 i P2,
care sunt specifici secven ei int , cel de-al treilea primer, P3, este destinat leg 1rii '
'
specifice la un situs din secven' f ai l intI în aval fati de situsul de legare P1. P3 este
marcat cu doi fluorofori, un colorant reporter (R), ata at la cap ii.tul 5’, i un colorant
'
fluorescent de anihilare a reporterului (Q - quencher) care are o lungime de und i de
emisie diferitA de cea a reporterului i care este ata at la cap II.tul 3’. Pentru c I are
'
capI tul 3’ blocat primerul P3 nu poate servi drept amors I în sinteza ADN, el fiind
degradat de Taq polimeraz în momentul extensiei P1 (vezi fig.2).

Fig.2. TaqMan PCR. În timpul reactiei PCR,

Taq ADN polimeraza sintetizeazil o noul
caten ADN pornind de la P1 iar în

-
momentul în care ajunge la nivelul P3
activitatea sa 5 3 exonucleazicI
determin degradarea progresivl a acestuia
începând de la capi tul 5’. La sfâr itul
~ Clivare 5' eKonudeazi<a

ciclului de amplificare catena de ADN nou '

sintetizatII. va cuprinde i secventa ocupatl
, __;j
................
5 '~3 1 '.,.'

'
inil ial de P3 iar cei doi coloranti R i Q nu se
'
vor mai gI si pe aceea i molecul1 . Rezultatul ~ Continuarea sintezei AON

' '
react iei este reprezentat de cre terea evidentI
a intensitll ii semnalului emis de reporterul ce
ij si divat'e 5' eKonudeazica

nu se va mai gi si în imediata vecinl tate a

quencher-ului. Trebuie subliniat faptul cI
învecinarea init ialA a reporterului cu
quencher-ul nu anihileazl complet semnalul,
Legenda:
observându-se un background fluorescent.
~ Reporter
f Quencher

c) PCR-RFLP reprezintI o metodI de detectare a polimorfismelor ADN ce implic ii.

utilizarea endonucleazelor de restric ie. Aceste enzime bacteriene taie specific ADN
la nivelul unor situsuri de recunoa tere determinând apari ia unui set caracteristic de
•
fragmente ce pot fi separate prin electroforezl în gel. Unele dintre polimorfisme
altereazI secven ele de recunoa tere, astfel enzimele fie nu recunosc un situs fie
t

2
recunosc o altl secven'II. Aceast fapt duce la apari ia unui nou set de fragmente ce pot
fi comparate cu secventele normale în vederea detecti rii diferentelor. Aceste diferente
sunt denumite polimorfisme ale lungimii fragmentelor de restriclie (RFLP –
Restriction Fragment Length Polymorphism). Procesul de identificare a
polimorfismelor genetice individuale este cunoscut sub numele de genotipare (fig.3).

~~ ~ MAf O
~ Mou.-.
~

l ...i -•
- • • <
-
•
-
A

l l
...
C

•
•

Fig.3. Polimorfismele lungimii fragmentelor de restric ie (RFLP) pot fi identificate

prin electroforezI în gel. Schimbarea unui singur nucleotid (A*C) poate determina
pierderea situsului de restrictie.

3
 LP11. Analiza ADN: utilizarea secven tiatorului ADN în analiza de fragmente
si secventa. Principii. Metode.

Secventierea ADN implica o serie de tehnici i metode utilizate pentru determinarea

succesiunii nucleotidelor intr-un fragment de ADN analizat. Procesul de secven tiere ADN
identifica specific semnalul nucleotidic pe care în converte te într-un format care poate fi
descifrat de speciali ti. Cartografierea secventei de nucleotide a permis oamenilor de ~tiinta sa
înteleaga mai bine genele i rolul lor în crearea corpului uman. Viteza rapida de dezvoltare a
tehnologiilor de secventiere a ADN-ul au avut un rol esen tial în descifrarea genomului uman
(Human Genome Project). Proiecte similare, vizând ADN-ul diferitelor specii de animale, plante,
precum cel al genomului microbian implica echipe de cercetatori de pe toate continentele.

O importanta perioada de timp detectarea variatiilor în secventa ADN fost strâns legata
de metodele electroforetice. Electroforeza a fost folosita înc a din anii ’50, începand cu
electroforeza pe hârtie (PE), urmata in anii ’60 de electroforeza în gel de amidon (SGE),
electroforeza în gel de agaroza (AE), electroforeza în gel de poliacrilamida (PAGE),
electroforeza prin focalizare izoelectric a (IEF), cromatografia în faza lichida de înalta
performanta (HPLC) si spectrometria de masa (Maldi TOF-MS).

Aparitia, în anii ’80 a tehniciilor PCR, PCR-RFLP, SSCP (polimorfismul de conforma tie
al fragmentelor de ADN monocatenare), RT-PCR (reactia în lant a polimerazei în timp real) ~i a
tehnicilor de secventiere a ADN-ului, au permis descifrarea polimorfismelor care apar în
structura genelor, care au repercusiuni asupra secventei/expresiei proteice. Metodele au evoluat
de la migrarea in gel de poliacrilamida si pana la cele moderne de detectie prin electroforeza
capilara, cu folosirea colorantilor fluorescenti.

Metodele folosite pentru determinarea secventei nucleotidice a unor fragmente ADN au

fost descoperite în anul 1970 de catre doua echipe independente conduse de catre Walter Gilbert
(tehnica de degradare chimica) si Frederick Sanger (tehnica de sinteza enzimatica). Ace tia au
primit impreuna premiul Nobel pentru Chimie in anul 1980.

Metoda cea mai folosita a fost tehnica de sinteza enzimatica a lui Sanger care foloseste
dideoxiribonucleotidele ca „terminatori” de catena nucleotid specifici, si cromatografia
bidimensionala. Ulterior au fost dezvoltate tehnici de secventiere automata bazate pe culoare
(fluorocromi), mult mai simple si mai rapide. De asemenea, au fost dezvoltate tehnologii
precum pirosecventierea si secventierea masiva paralela a unui numar foarte mare de
fragmente diferite de ADN.

1
 1. METODA DE SINTEZA ENZIMATICA (SANGER)

A. Secventierea ce folose te Primeri radiomarca i

'i analogi nucleotidici
(dideoxinucleotide) ' t

In aceasta metoda se sintetizeaza o catena noua de ADN, complementara segmentului cu

secventa necunoscuta (ce functioneaza ca matrita), utilizand ADN-polimeraza si un primer
radiomarcat (fixat la extremitatea 3’ a fragmentului). Reactia poate fi inhibata (stopata) in dreptul
unui anumit nucleotid, prin folosirea unor analogi nucleotidici de tipul dideoxinucleotidelor
(ddNTP – au pierdut gruparile 2’-OH si 3’-OH) (fig. 1). ADN-polimeraza poate adauga un astfel
de nucleotid, dar, dupa ce acesta a fost incorporat, reactia se opreste datorita absentei gruparii 3’-
OH din dideoxinucleotid, necesara polimerizarii (catena sintetizata este „terminata” de ultimul
ddNTP). Se obtin astfel fragmente cu o lungime egala distantei dintre primer si locul unde s-a
incorporat un anumit dideoxinucleotid.

grou11<mcnl.~
l'ho,;phatt

1P
g,·001.,menl OH nbsenl :
II
groupemeul OH prestnt :
(-------➔) dCSOX)'ribouuelt'ollde
dl~soxyrlbonudt'otklr ..
ddNTP dNTP

Figura 1

Initial, molecula de ADN ce trebuie secventiata este separata in cele doua catene. Fiecare
catena este clonata intr-un vector monocatenar (fagul M13), fiind inserata (cu capatul 3’) intr-un
anumit situs, dupa o secventa cunoscuta si marcata radioactiv, ce are rolul de primer. Aceste
monocatene de ADN servesc ca matrita pentru sinteza unei noi catene, complementara, folosind
ADN polimeraza si nucleotidele necesare sintezei. Reactia se desfasoara concomitent in patru
eprubete, in fiecare se va stabili localizarea unui anumit nucleotid folosind ca analog inhibitor un
anumit dideoxinucleotid (fig. 2).

2
 Primer for
replication

S trand to be sequenced

Prepare four reaction mi)Clures;

ll'tdude m eacn s different
repllcalion-stopping nucleotide

C G

~~
Pnmer
..j, RepUcation
products of
Separate
P,Oducts by
gel electrophoresis

Pr'irnet
~ IJ M
u ~
u • a '"C"'reaebOn

~ Read seqeno& as
,;ompJement of bands
contalmng labeled strands

Figura 2

De exemplu, in eprubeta ce va stabili localizarea C se va adauga dideoxiribonucleotidul

ddCTP; atunci cand ddCTP este incorporat in catena in curs de formare, sinteza se opreste.
Astfel se vor obtine fragmente ADN de diferite lungimi, fiecare avand la capatul terminal un
anumit ddNTP. Produ ii celor patru amestecuri de reac ie diferite sunt fractiona i in paralel prin
electroforeza in gel de poliacrilamida, in conditii de denaturare. Fragmentele sunt separate in
functie de marime.

Se observa o serie de benzi la pozitii ce corespund localizarii fiecarui nucleotid cu

A/T/G/C. Ansamblul celor patru reactii poate fi citit pe o „scara” pozitionala directionata de la
fragmentele cele mai mici la cele mai mari; astfel se poate determina secventa de nucleotide a
fragmentului analizat (fig. 3).

~ +ddGTP

fieilblQ @ D fs:@liii! R D .t!t

(C)
G

( D)
.
C

Figura 3

3
 B. Secventierea prin terminatori ddNTP marcati fluorescent

Intr-o etapa ulterioara a fost introdusa tehnica „dye – terminator sequencing” in care
ddNTP terminatori ai catenei sunt marcati fluorescent, fapt ce permite secventierea intr-o singura
reactie; fragmentele nou sintetizate migreaza in gel printr-un tub capilar lung si extrem de
subtire. La capatul capilarului o raza laser produce excitatia flurocromilor si un monitor
detecteaza semnalul fluorescent al fragmentului de ADN ce trece prin gel (fig. 4).

T C.A TTC A T C

Fluorescence
Migration of DNA
detector
fragments

Sample/
Buffer
+

Figura 4

Computerul inregistreaza si stocheaza un profil distinct pentru fiecare fluorocrom colorat

diferit, stabilind secventa nucleotidica determinata – cromatograma (electroferograma) (fig. 5).
z-~,--~-e ..s-qLL-E?l'E-~- -:r c:: .A. c;- .A. -:r c:: c:: c;- .A.
C : ' ~ ~ ~rTZ-1z.l!:tt2.ry .A. c;- -:r c:: -:r .A. c;- c;- c:: -:r

-- -:r
c· -:r
c::
-:r

c;-
c;-
c;-
.A.
.A.

A~ ~ n .I'- ~
Figura 5

Metoda de secventiere cu „terminatori marcati fluorescent” a permis realizarea

secventiatoarelor automate cu „debit inalt’’ care cresc enorm viteza si eficienta procesului de
secventiere si scad costurile (fig. 6).
10 20 30 40 50 60 70 80 90
CGATJG A TIB,. GC GGC CGCG AATTC GC CCTTTCTC T IC G /CG ATG AT TT/Cl'C G C ATG TG C TG AAAG T T GG C GG TG C C GG AG T GC GC TC AC CG C

Figura 6

4
 2. PIROSECVENTIEREA ITERATIVA

Metoda „clasica” a ddNTP, folosita timp de trei decenii, implica electroforeza in gel
pentru separarea fragmentelor de ADN nou sintetizate; aceasta etapa este laborioasa si face
tehnica putin eficienta (aprox. 30-60 kb/ciclu de 3-4 ore de electroforeza). In anul 2000 a fost
introdusa o tehnologie de secventiere a ADN complet diferita care nu necesita electroforeza in
gel si care permite inregistrarea secventei de ADN pe masura ce un nou nucleotid este incorporat
in catena nou sintetizata de catre ADN polimeraza. Aceasta metoda foloseste o serie de reactii
succesive de pirosecventiere: eliberare i detecfie a pirofosfafilor. Catenele noi de ADN sunt
sintetizate de catre o ADN polimeraza ce foloseste precursori dezoxinucleotidtrifosfat (dNTP) si
o matrita de ADN monocatenar. Cele patru tipuri de dNTP sunt furnizate secvential, nu toate
odata. Cand este furnizat dNTP-ul corect, complementar matritei, ADN polimeraza il
incorporeaza sub forma de dNMP (dezoxinucleotid monofosfat) si elibereaza un grup pirofosfat
(PPi). Urmeaza o serie de reactii prin care se elibereaza o cantitate de lumina vizibila, detectata
de o camera CCD (charge-coupled device). Acest semnal este proportional cu cantitatea de ATP
produsa. In cazul in care este furnizat un nucleotid incorect el este degradat de o enzima
(apiraza) si nu se produce semnalul luminos (fig. 7). Metoda, denumit i secven iere prin
sintezii, a fost introdus i optimizata de catre Pål Nyrén i Mostafa Ronaghi la Royal Institute of
Technology – Stockholm, in anul 1996.

ADN-ul monocatenar este hibridizat cu primer-ul de secven iere i incubat al turi de

enzimele: ADN polimerazii, ATP sulfurilazii, luciferazii 5i apiraz . Al turi de aceste
componente la reactie mai particip i Adenozin 5’ fosfosulfat (APS) i luciferinii.

Etape:

1. Aditia unuia dintre cele 4 tipuri de dNTPs (cu o singur a modificare: dATP este înlocuit
cu dATPaS ce nu este substrat pentru luciferaz a) initiaza pasul 2. În momentul incorpor arii
corecte a unui dNTP de c atre ADN polimeraza este eliberat un pirofosfat (PPi).

2. ATP sulfurilaza converte te PPi în ATP în prezenta Adenozin 5’ fosfosulfat. ATP-ul

este utilizat de catre luciferaza pentru convertirea luciferinei în oxiluciferina. Acest proces este
dependent de cantitatea de ATP prezent a. Semnalul luminos este detectat de camera CCD.

3. Nucleotidele neîncorporate sunt degradate de c atre apiraza, reac ia reîncepând cu un alt

nucleotid.

5
 Figura 7

3. SECVENTIEREA MASIVA PARALELA

Metoda de pirosecventiere iterativa a stat la baza tehnologiilor de secventiere masiva

paralela (simultana) a ADN de generatia a doua (care folosesc PCR pentru amplificarea ADN-
ului tinta), disponibile in 2007 si apoi a tehnicilor de secventiere de generatia a treia (2008) care
permit secventierea unei singure molecule de ADN fara sa fie nevoie de amplificarea ei.

A. Secventierea masiva paralela cu ADN amplificat

Primul val de tehnologii de secventiere bazate pe pirosecventiere utilizeaza PCR pentru

amplificarea secventelor ADN–tinta (in locul clonarii) si permit procesarea simultana a milioane
de secvente (tehnici de secventiere de generatia a doua). Metoda pirosecventierii masive paralele
permite citirea in paralel a cateva sute de mii de secvente, fiecare cu o lungime de 300 – 500pb
(in total >0.45 Gb pentru fiecare experiment ce dureaza circa 7 ore).

Pirosecventierea masiva paralela implica fragmentarea initiala a ADN in piese scurte de

300 – 500pb, urmata de legarea la capete a unor adaptori oligonucleotidici diferiti (unul din ei
avand o molecula de biotina). Fragmentele ADN cu adaptori legati sunt apoi denaturate si atasate
pe suprafata unor microsfere acoperite cu streptavidina (ce recunoaste cu mare afinitate biotina).
Microsferele sunt apoi separate individual cu ajutorul unei emulsii apa-ulei astfel incat fiecare
picatura apoasa contine o singura microsfera si toti componentii necesari pentru PCR. Dupa
amplificarea prin PCR fiecare microsfera are atasate pe suprafata circa 10 milioane copii ale
fragmentului de ADN initial, imobilizata prin legaturi biotina-streptavidina. Emulsia este apoi
dispersata, iar microsferele sunt depozitate in interiorul unei microcavitati “sapate” pe o lama de
fibra optica (ce contine 1,6 milioane de cavitati); aceste cavitati sunt apoi umplute cu alte
microsfere mult mai mici care au atasate pe suprafata ATP sulfurilaza si luciferaza (fig. 8).

6
 ....,..,,,..,
m
w
40CA T OCTJ. J.A0f C A
A.PS ~ltl"'IM

PP,

ATP l),s;r..;u
ONACllpl!JrtBHd
QOl'll•ng rnllllont of
Coplts ~ • tl'V•
-hp,,en, Ug.ht ,._ oayludfrc,rM

Figura 8

Placile care contin aceste microsfere sunt apoi spalate cu o succesiune precisa de
precursori dNTP (T, apoi A, apoi C, apoi G), iar lumina emisa in cadrul fiecarei reactii este
inregistrata corespunzator fiecarei cavitati (fig. 9).

Figura 9

O tehnologie alternativa este secventierea masiva prin ligare, sau tehnologia SOLID
(Sequencing by Oligonucleotide Ligation Detection). Aceasta tehnologie foloseste de asemenea
strategia PCR pentru amplificarea fragmentelor de ADN individuale. Produsii amplificati sunt
depozitati apoi aleatoriu pe suprafata unor micro-retele ce contin oligonucleotide marcate
fluorescent. Aceasta tehnologie permite citirea unor fragmente scurte (circa 50pb) cu o secventa
totala de 30 Gb (experiment de 7 zile) sau 50 Gb ( experiment de 14 zile).

7
 B. Secventierea masiva paralela fara amplificarea ADN-ului

Aceasta tehnologie de secventiere, cunoscuta si sub numele de secventiere de generatia

a treia, permite secventierea unor molecule unice i neamplificate de ADN. Aceast ametod a
permite eliminarea erorilor ce pot aparea in cursul amplificarii ADN, este mai simpla si are
proiectate preturi mai reduse. Prima tehnologie din aceasta categorie a fost introdusa in 2008
(HeliScope de catre compania Helicos Biosciences). Aceasta metoda presupune cicluri de aditie
a unor nucleotide urmate de spalare; de aceea lungimea unei secvente citite este de doar 30pb.
Deoarece reactiile sunt extrem de dens compactate spatial (circa 100 milioane molecule matrita /
1 cm2) tehnologia permite citirea a circa 40Gb pentru un experiment de 8 zile.

Exista alte cateva tehnologii in curs de dezvoltare si care au potentialul de a schimba

profund secventierea ADN, atat din punct de vedere al rapiditatii, cat si al costului. Cea mai
promitatoare dintre acestea este tehnologia SMRT (Single-Molecule Real-Time Sequencing), ce
va permite secventierea ADN la viteze ce circa 20000 ori mai mari decat tehnologiile de
generatia a doua aflate in prezent pe piata.

Secventierea masiva paralela a transformat radical genetica moleculara, fiind amplu

folosita in secventierea rapida a genomului uman, pentru determinarea genomului personal,
identificarea mutatiilor si variantelor polimorfice asociate cu bolile comune, analiza
transcriptomului si a interactiunilor dintre ADN si proteinele implicate in reglarea expresiei
genelor.

Aplicatii:

1. cartografierea genomului uman

2. diagnostic prenatal si postnatal
3. stabilirea profilului tumoral
4. afectiuni genetice ereditare si congenitale
5. afectiuni neurologice
6. farmcogenetica

8
 LP12. Expresia genica. Metode de evaluare a gradului de activare genica.

Informatia continuta in ADN-ul genomic nu este utilizata direct pentru sinteza proteinelor,
ci prin intermediul moleculelor de ARN. Atunci cand o celula trebuie sa sintetizeze o anumita
proteina, secventa de nucleotide ADN corespunzatoare acelei proteine este copiata in ARN
(transcriptie), iar ARN-ul este utilizat drept matrita pentru sinteza proteinei respective (translatie).
Astfel, transcriptia si translatia reprezinta procesele prin care o celula isi citeste, sau
exprima, instructiunile genetice de la nivelul genelor. Deoarece mai multe molecule de ARN
mesager (ARNm) identice pot fi transcrise de pe aceeasi gena (ADN), si fiecare molecula de
ARNm poate directiona sinteza mai multor molecule proteice identice, celulele isi pot sintetiza o
cantitate foarte mare de proteina foarte rapid. Dar fiecare gena poate fi transcrisa si translatata cu
eficiente diferite, permitand unei celule sa sintetizeze cantitati foarte mari dintr-o anumita proteina
si cantitati infime de alte proteine. In plus, o celula poate modifica (sau regla) expresia fiecarei gene
in functie de necesitatile celulei dintr-un anumit moment; cel mai frecvent aceasta reglare are loc
prin controlul productiei de ARNm.
Astfel, diferitele tipuri celulare ale unui organism multicelular se diferentiaza unele de altele
deoarece sintetizeaza si acumuleaza diferite seturi de molecule de ARNm si proteine, pastrandu-si
aceeasi informatie genetica la nivelul secventei de nucletide a ADN.

Controlul expresiei genice

Pentru a intelege mecanismele de diferentiere celulara si reglare a expresiei genice, trebuie

cunoscute cateva principii generale:
1. Multe procese celulare sunt comune tuturor tipurilor celulare, si astfel numeroase tipuri de
proteine sunt comune tuturor celulelor. Aceste proteine includ proteinele structurale
cromozomiale, ARN-polimerazele, enzimele de reparare a ADN, proteinele ribozomale,
enzimele implicate in reactiile metabolice, precum si multe din proteinele ce intra in
alcatuirea citoscheletului.
2. Unele proteine sunt abundente in celule specializate in care isi indeplinesc functiile si nu
pot fi detectate in alte celule; de exemplu hemoglobina poate fi detectata doar in hematii.
3. Studiul diferitelor molecule de ARNm sugereaza faptul ca o celula umana tipica exprima
simultan, in orice moment, aproximativ 30-60% din genele structurale. Prin compararea
modelelor de expresie genica in linii celulare diferite s-a demonstrat faptul ca nivelurile de
expresie pentru fiecare gena in parte difera intre variate tipuri celulare; doar o mica parte
din aceste diferente sunt foarte semnificative (vezi exemplul hemoglobinei), restul fiind
mult mai subtile. Modele ale expresiei ARNm pentru diferite gene (determinate utilizand
tehnologiile microarray) sunt atat de caracteristice si specifice pentru diferitele tipuri
celulare incat pot fi utilizate pentru a determina tipul unor celule canceroase cu origine
necunoscuta.
4. Desi diferentele intre nivelurile ARNm sunt cele mai semnificative, ele nu pot prezice cu
exactitate diferentele intre modelele de expresie a proteinei, existand numeroase etape post-
transcriptionale la nivelul carora expresia genica poate fi reglata.

1
 Semnalele din exteriorul celulei pot determina modificarea expresiei genice

Majoritatea celulelor specializate sunt capabile sa-si modifice modelul normal de expresie
genica drept raspuns la diferiti stimuli extracelulari. De exemplu, daca un hepatocit este expus la un
hormon glucocorticoid, productia unor proteine specifice este crescuta semnificativ.
Glucocorticoizii sunt eliberati in cursul perioadelor de infometare sau exercitiu fizic si au drept
efect productia de glucoza din aminoacizi si alte molecule mici, in hepatocite; proteinele implicate
in aceste procese sunt necesare astfel intr-o cantitate crescuta in hepatocite (de exemplu, tirozin-
aminotransferaza care participa la convertirea tirozinei in glucoza). Atunci cand hormonii nu mai
sunt prezenti la nivelul ficatului, productia acestor proteine de catre hepatocite revine la nivelul
normal. Alte tipuri de celule au un raspuns diferit la glucocorticoizi. Celulele adipoase isi reduc
productia de tirozin-aminotransferaza, iar alte tipuri de celule nu au niciun fel de raspuns la
glucocorticoizi.

Nivelurile de reglare a expresiei genice (de la ADN la proteine)

Exista numeroase etape necesare pentru ca informatia de la nivelul genelor (ADN) sa fie
tradusa in final intr-o proteina si fiecare din aceste etape poate fi controlata. Astfel, o celula poate
controla nivelul unei proteine sintetizate prin mai multe mecanisme:
1. controlul transcriptional - cand si de cate ori o gena este transcrisa;
2. controlul procesarii ARN - controlul splicing-ului si procesarii ARN;
3. controlul transportului si localizarii ARN - selectarea moleculelor de ARNm care sunt
transportate din nucleu in citoplasma, precum si localizarea moleculelor de ARNm in
citosol;
4. controlul translational - selectarea moleculelor de ARNm din citoplasma care vor fi
translatate in proteine la nivelul ribozomilor;
5. controlul degradarii ARNm - destabilizarea selectiva a anumitor molecule de ARNm in
citoplasma;
6. controlul activitatii proteinei - activarea, inactivarea, degradarea sau localizarea specifica a
anumitor molecule proteice dupa sinteza.

2
 inadive mRNA
NUCLEUS CYTOSOL mRNA
degradation 5
control
RNA
transcript mRNA mRNA
1 2 3
transcript ional RNA RNA
control processing transport translation protein
control 4
control and activity
localization control inact ive
control protein
6
~rotein
active ~
protein ~
Fig ure 7-5 Molecular Biolog y of t he Cell 5/e (© Ga rland Science 2008)
"

Fig. 1. Cele 6 etape la nivelul carora poate fi reglata expresia genica la eucariote.

Metode de evaluare a gradului de activare genica.

I. Analiza ARNm prin Northern blot.

Northern blot este o varianta a metodei Southern blot în care acidul nucleic tint a este
ARNm. Obiectivul principal al metodei este obtinerea de informatii privind profilurile de expresie
(tipul celular, abundenta transcriptului) unei anumite gene (deja clonata).
Punerea în evidenta a unui anumit ARN mesager se bazeaza pe hibridarea molecular a a
ARN cu o sond complementara monocatenar (ADN c denaturat; oligonucleotide ADN antisens).
Moleculele de ARNm, de diferite lungimi (în functie de gena transcris ), extrase din diferite
esuturi, sunt separate prin electroforeza în gel de agaroza denaturant (care suprima structura
secundar ce ar jena migrarea i hibridizarea). Apoi ele sunt transferate pe un filtru de nitroceluloz
~ i hibridate cu o sonda de ADN marcat . Pe autoradiogram se observa una sau mai multe benzi a
caror talie, numar ~ i intensitate sunt indicatii pretioase. Absenta unei benzi ce ar fi trebuit
evident iata de sonda ne indica faptul ca gena nu este exprimata / transcrisa datorit a unei mutatii.
Existent a unei mutat ii (de ex, delet ie) poate fi relevata printr-un fragment de ARNm cu talie
anormala.
Analiza ARN mesager este mult mai delicata~i mai dificila decât cea a ADN deoarece:
ARN este foarte vulnerabil la ARN-azele citoplasmatice; numeroase tipuri au o expresie celular a
variabila în funct ie de diferent ierea celulara (de ex. ARNm pentru fenilalanin-hidroxilaz a nu este
prezent decât în hepatocite, iar cel pentru tiroglobulin numai în celulele tiroidiene); ARNm se
gase~ te în cantitat i foarte mici.

3
 1'%,i;,.i ------"!!!.e;,,..
_:-E l
~::;:~= ""Ff'l'r1 z.-;,k::~• Lr,,,.1;.....11,._.1,~
..n.eu;, ulg.f.r,bo.~i,1uni-,
~(111{,!1.,,,.add~
AAIR.t,.A-,ITll'i.-.11,p-l 1"-l'itd""'•\'1 (....,., l"'lll"I' ~~An"-"1~11;1i11t1
••111"J'U•~~•,'4'11'1li>1Jltl t,cr..«,,t,,,,~op,).l"J~ t,,Y ori)luy .lalOCI
\I)( '1)•tl<f dt«rotM'fi•.. I

'"

(... . )

A
Normal liver FNH Liver cirrhosis HCC

Glyp•can-3

7S

B
Normal livor HCC

7S

Fig. 2. Tehnica Northern blot

4
 II. Testul de protectie la ribonucleaze (ribonuclease protection assay) - permite
evaluarea cantitativa a unor produsi de transcriptie specifici anumitor gene, identificati cu o sonda
de ARN complementara, dintr-un amestec de ARN total.
Tehnica consta in incubarea unei sonde ARN monocatenare marcate, antisens fata de gena
de interes, cu amestecul de ARN total, in conditii ce favorizeaza hibridizarea complementara a
genei tinta cu sonda. Dupa hibridizare, amestecul este tratat cu o ribonucelaza care digera toate
moleculele monocatenare de ARN, dar nu si pe cele de ARN bicatenar rezultate in urma
hibridizarii. ARN bicatenar este apoi separat prin electroforeza in gel denaturant de poliacrilamida.

Total RNA o, m.RNA L.abel.fd eRHA probe

+ O>---

1
--;dr!]IIiDiiiiDiiii::--
HybrktliaUon or ANA
With lt1 specific
pfobo
l '-
Dlgtttlon with RNfff 'Qiilllllll~ l

Tar9&1 Targ&t
~teetlon PfObo mRNA PrObO mRNA

S ing1t probing MultiJ>'O pi'Obing

Intensitatea semnalului obtinut corespunde cantitatii de transcript specific prezent in zona tinta.

Fig. 3. Ribonuclease protection assay

5
 III. Hibridizarea tisulara in situ - analizeaza in detaliu locul in care se exprima genele in
tesuturi (pe sectiuni histologice), folosind fie o sonda de ADN, fie o ribosonda antisens, marcate
radioactiv sau cu fluorocromi; metoda se poate aplica si la studiul expresiei genelor intr-un embrion
intact sau pe culturi de celule.
Metoda foloseste fie o sonda de ADN, fie o sonda de ARN (ribosonda), complementara
ARNm studiat. Marcarea sondei se realizeaza radioactiv (P33 sau S35), situatie in care vizualizarea
rezultatelor se face prin autoradiografie urmata de microscopie in camp intunecat (dark-field
microscopy), ori de microscopie in camp luminos (bright-field microscopy) sau, mai frecvent, cu
ajutorul unor fluorocromi, analiza rezultatelor fiind facuta prin microscopie cu fluorescenta.

cDN.t\ complcrnent.iry Colorless compound

~ t
/::::~i'~:h:,~::A
madc hy detag('nl
C)
~ that becomes purple
dye when phosphate
is rc:muv('d

~ ..
c,11
mt'mbran~
li
-
DigoOXJ{t:t'RIO
) tabd on uridmc
Wash
Wash_ .
mrhrlrr
m£i~n
ml\NA

I, Add digoxigcoin~lalx k-d ,,robe

J, Add chemical tha t becomes? d ark ,
purple dye when phosphate ,s removed,
d)'C <:())Ol'S 1hc ccU.

Fig. 4. In situ hybridisation

IV. React ia de polimerizare în lant în timp real cantitativI (qRT-PCR)

Reactia de polimerizare în lant cantitativi este cea mai avansati tehnologie pentru detec ia i
t '
cuantificarea ARNm, fiind suficient de sensibili pentru a evalua cantitativ transcriptii prezenti într-
o singuri celull .
Reactia presupune initial izolarea si purificarea ARN total (sau ARNm) dintr-un tesut sau
cultura de celule. Este foarte important sa nu existe ADN rezidual care sa contamineze ARN-ul
purificat; pentru a indeplini aceasta conditie, ADN-ul este degradat enzimatic (prin utilizarea DN-
aze-lor).

Etape:

6
 1. Revers-transcriptia ARN in ADN complementar monocatenar presupune utilizarea unui
amestec de reactie de contine: primeri, revers-transcriptaza, ADN polimeraza, dNTPs si
componente tampon.
Fig. 5. Etapele qRT-PCR

Extension of primer on mRNA

S' 3' mRNA
RT Random 5' cDNA
Step Primer
Synthesis of 1s t cDNA strand
3' 5' cDNA

Extension of primer on cDNA

3'
5' Forward
• S'
..
~

Primer Q)

Completion of 2nd cDNA strand ~

3' S' u
PCR
Step s 3'

PCR amplification of cDNA

3'
5'
Forward Primer
5'
.."'
Q)
u
s 3' iS ~
!2
Reverse
5' a:
Primer
"'
2. React ia de polimerizare în lant în timp real (Real-Time PCR)
În aceastI etapI produ ii PCR sunt sintetizati din ADNc utilizând un Master Mix spentru
expresie genica, precum si primeri si sonde TaqMan specifici pentru fiecare tint l .
Master Mix-ul pentru expresie genica contine ADN polimeraza, glicozilaza Uracil-ADN
(UDG), deoxiribonucleotid trifosfa i (dNTPs) cu deoxiuridin trifosfat (dUTP), referin ti pasiv l,

·-
precum i componente tampon optimizate pentru îmbun t irea sensibilit llii, preciziei, specificit itii
i reproductibilit ii.
Sondele TaqMan MGB sunt reprezentate de un oligonucleotid specific intei ce cuprinde:
- un colorant reporter legat la capI tul 5’ al sondei;
l
- un ligand ata at la scobitura micI a ADN (MGB – minor groove binder), care cre te
'
temperatura de topire (Tm) fIrI a cre te lungimea sondei;
I '
- un colorant non-fluorescent de anihilare a reporterului (nonfluorescent quencher) localizat
la capI tul 3’ al sondei.
Reac ia PCR utilizeazl activitatea 5’ exonucleazicI a Taq ADN polimerazei ce cliveaz I
t
sonda TaqMan în timpul PCR. În timpul reac iei, clivarea sondei separ I colorantul reporter de
t
colorantul de anihilare, producând o flurescen crescutl a reporterului. Acumularea produ ilor
is
PCR este detectatI direct prin monitorizarea cre terii fluorescen ei colorantului reporter. Atunci
'
când sonda este intactl , proximitatea colorantului reporter de colorantul anihilator se traduce în
7
 suprimarea fluorescentei colorantului reporter datoritil transferului de energie de tip Förster. În
timpul PCR, dacl este prezent11inta de interes, sonda se leagl specific la 1inti . Activitatea 5’ – 3’
exonucleazicil a ADN polimerazei AmpliTaq Gold determinil clivarea sondei între reporter i
anihilator numai dacl sonda este hibridizati la tintl . Fragmentele sondei sunt astfel îndepi rtate de
t intl , continuând polimerizarea catenei. CapI tul 3’ al sondei este blocat pentru a preveni extensia
sondei în timpul PCR. Acest proces are loc în fiecare ciclu i nu interferi cu acumularea
exponent ialI a produ ilor. Cre terea semnalului fluorescent este detectatI numai dac I secventa
' ' '
1intei este complementarl cu sonda i dacI este amplificatI în timpul PCR. Astfel, amplificarea
nespecificI nu este detectata.

Polymerization F«watd

s·
Pl'imer
0-► ~3'
8

3' 5'
5· 3'
---0 R....,.•
5·
PtimEW'

>!>
Strand displacement For,11ard l'eqMan
5· Pri.n'let' MGBprobe
~
3' 5·
5· 3'
---0 R....,.• 5'
Prim«

Cleavage FM-,•afd
s·Pri.met'

3·- - - - - - - - - - - - - - - - S'
5' 3'
---(vi-- - - - - 5·
Re-~e
Primet

Completion of R::nl.·ard
potymerization 5· Pr'lm«
3' - - - - - - - - - - - - - - - - - - S'
5' 3'
- - - - - - - - - - -- - -- s·

(fjg) = No.nfluorescent quencher

§ = Minor groove binder
® • Reporter
© " AmpliTaq Gold DNA Polymerase, UP

8
 e
a. Plateau phase
b. Linear phase
c. Exponential {geometric) phase
d. Background
e. Baseline

Fig. 6. Reac1ia de polimerizare în lan1 în timp real (Real-Time PCR)

V. Tehnicile microarray
Tehnologiile microarray oferl noi mijloace care reorganizeaz modul în care sunt conduse
experimentele tiin ifice. Principalul avantaj al tehnologiilor microarray comparativ cu metodele
' t
tradi ionale se referI la scara la care se analizeazI genele: în loc sl se desf oare experimente
bazate pe rezultatele obl inute în urma analizei unui num r mic de gene, tehnologiile microarray
permit analiza simultanl a sute sau mii de gene.
Tipul de microarray depinde de materia de pe suport: ADN - ADN-microarray; ARN -
ARN-microarray; proteina - proteina-microarray; tesut - tesut-microarray. Din moment ce probele
sunt aranjate într-o anumitii. ordine, datele obtinute în urma microarray pot fi reanalizate pentru
fiecare probA în parte. Acest lucru înseamnl cAgenele utilizate la microarray sunt direct accesibile.
NumI rul probelor ordonate într-un microarray este de sute de mii. Cel mai utilizat tip de microarray
este ADN-microarray.
Tehnica ADN-microarray func1ioneazA prin cercetarea abilit ii unei molecule de ARNm de
a se lega sau de a se hibridiza cu matrita de ADN din care a luat na tere. Prin realizarea unui array
care cont ine multe sonde de ADN se pot determina nivelurile expresiei unui numar mare de gene
prin mI surarea cantit ii de ARNm care se leagI la fiecare loc din array.
Microarray-urile ADN sunt suporturi solide, mici, pe care sunt ata ate în loca ii fixe
secven e ale miilor de gene. Suporturile pot fi reprezentate de lame de sticl l microscopice, chip-uri
de silicon sau membrane de nylon. ADN-ul este imprimat sau sintetizat direct pe suport.

9
 collection of gene-specific DNA molecules

'
PCR amplification

'
robotic 'printing' onto glass slide

'
mRNA from
sample 1 labeled
with red
fluorochrome
~
~:?f-:3-
~~~~
+ ~~
~~Y~
~~ ~
mRNA from
sample 2 labeled
with green
fluorochrome

HYBRIDIZE

WASH
'
'
SCAN RED AND GREEN SIGNALS
AND COMBINE IMAGES

small region of microarray representing

expression of 110 genes from yeast
Figure 8-73 Molecular Biology of the Cell 5/e (© Garland Science 2008)

Fig. 7. ADN-microarray utilizat pentru evaluarea expresiei a mii de gene simultan

ADN-microarray este utilizat pentru a determina:

- nivelurile expresiei genelor într-o proba (profilul expresiei);
- secven a genelor într-o prob , fenomen numit minisecventiere când sunt analizate secvente
scurte de nucleotide i analiza mutatiilor sau analiza SNP (single nucleotide
polymorphism) când se analizeaz un singur nucleotid.

Cea mai raspândita aplicatie a microarray-urilor este reprezentata de monitorizarea

nivelului de expresie al genelor. Acest tip de studiu, numit studiul profilului expresiei, poate fi
utilizat pentru a determina functia unor gene în timpul unui status particular, cum ar fi nutritia,
temperatura, mediul chimic. Rezultatele sunt notate ca up-regulation, down-regulation sau
nemodificate în timpul unor conditii particulare. Microarrayurile au fost utilizate pentru a realiza
harta localiz rii celulare, regionale sau tisulare a genelor i proteinele codificate de acestea.
Microarray-urile au fost utilizate: la nivel subcelular pentru cartografierea genelor care codific a
proteinele membranare sau citosolice; la nivel celular pentru cartografierea genelor care diferentiaza
diferitele tipuri de celule ale sistemului imun; la nivel tisular pentru identificarea genelor exprimate

10
în diverse tesuturi. Studiile farmacologice au utilizat microarray-uri pentru a diferentia mecanismele
de actiune ale agentilor terapeutici ~i ca un corolar pentru a obtine noi agen i terapeutici.
De asemenea tehnica microarray poate fi utilizat a pentru a monitoriza progresia replicatiei
ADN-ului în celula; când este utilizata impreuna cu imunoprecipitarea poate indica fiecare pozitie
din genom ocupata de o proteina reglatoare. Microarray-urile pot fi utilizate i pentru identificarea
agentilor microbieni prin hibridizarea ADN-ului din tesuturile infectate la un array ce contine
secvente din ADN-ul genomic al unui numar mare de agenti patogeni.
Una din cele mai interesante arii de aplicare a microarray-urilor este diagnosticul
afecIiunilor clinice. Capacitatea de a identifica celule canceroase bazat a pe expresia genelor
reprezinta o metoda care are beneficii reale. In cazurile dificile, în care un marker morfologic sau
antigenic nu este disponibil sau nu este suficient de sigur pentru a deosebi tipurile de celule
canceroase, studiul profilului expresiei genelor cu ajutorul microarray-ului poate fi extrem de
valoros. O aplicatie recenta a microarray-ului a fost aceea de a realiza analize genomice
comparative (arrayCGH). În aceste analize microarray-urile au fost utilizate atât pentru a
caracteriza genele unui organism (genomica structuralii) cât ~i pentru a determina daca acele gene
sunt exprimate într-un mod similar într-un anumit organism (genomica functionalii).
Microarray-urile SNP sunt realizate pentru a detecta prezenta unei diferente de un nucleotid
între probele genomice. Polimorfismul unui singur nucleotid apare cu o frecventa de aproximativ
1:1000 de baze i subliniaza diferentele genomice intre indivizi. Cartografierea ~i obtinerea
frecven elor SNP-urilor identificate ofera o baza genetica pentru identificarea genelor implicate în
aparitia bolilor, prezicerea efectelor mediului ~i raspunsul la agentii terapeutici. Minisecventierea,
extensia primerilor si hibridizarea diferentiala au fost dezvoltate pe o platforma de microarray.

Modalitati de blocare a translatiei. siRNA. Evidentierea rolului unei gene intr-o

linie celulara si modele animale.

Interferenta ARN are roluri deosebit de importante in biologia celulara, de la controlul

expresiei genelor pana la structura cromozomilor. Interferenta ARN a permis cercetatorilor sa
dezvolte experimente prin care este blocata aproape orice gena. Aceste tehnici, realizate in linii
celulare si uneori pe modele animale, au revolutionat abordarile genetice in biologia celulara si
moleculara. De asemenea, ARN de interferenta (RNAi) are un potential deosebit in tratarea unor
afectiuni. Deoarece numeroase boli sunt caracterizate de o expresie anormala a genelor, capacitatea
de a bloca aceste gene utilizand molecule de ARN de interferenta mic (siRNA) reprezinta o
abordare promitatoare a tratamentului acestor boli.

Moleculele de ARN necodant regleaza expresia genelor

Moleculele de ARN indeplinesc numeroase roluri in celule, in afara de acela de a servi drept
purtatori intermediari ai informatiei genetice (ARNm). Studiile recente au demonstrat faptul ca
moleculele de ARN necodificant sunt mult mai importante decat se preconiza in reglarea expresiei
genice.

11
 De o importanta deosebita sunt molecule mici de ARN necodant numite microARN
(miRNA). La om se exprima mai mult de 400 de tipuri diferite de miRNA, ce par sa regleze cel
putin o treime din toate genele structurale. Odata sintetizat, miRNA formeaza legaturi de hidrogen
intre bazele complementare cu ARNm si ii regleaza astfel stabilitatea si translatia. Precursorii
miRNA sunt sintetizati de catre ARN-polimeraza II si sufera apoi un proces de poliadenilare.
miRNA trece printr-o serie de etape speciale de procesare, dupa acre este asamblat cu un set de
proteine pentru a forma un complex de inducere a silentiozitatii (RNA - induced silencing complex -
RISC). In urma formarii, RISC isi cauta ARNm tinta prin cautarea secventei de nucleotide
complementare. Aceasta cautare este facilitata de proteina Argonaute, componenta a RISC, ce se
leaga la capatul 5’ al miRNA. Legaturile intre bazele complementare includ de obicei 7 perechi de
nucleotide si de obicei se realizeaza in regiunea 3’ UTR (untranslated region) a ARNm.
In urma legarii miRNA la ARNm doua evenimente devin posibile:
5. daca legarea complementara a miRNA la ARNm este realizata intre un numar mare de baze,
ARNm este degradat;
6. daca legarea complementara a miRNA la ARNm se realizeaza pe o distanta mai mica,
ARNm nu este degradat, in schimb translatia este represata si ARNm este destabilizat.
Anumite caracteristici ale miRNA le determina de fie reglatori utili ai expresiei genice. In
primul rand, o singura molecula de miRNA poate regla diferite molecule de ARNm deoarece
moleculele de ARNm au o secventa comuna in regiunile UTR. In al doilea rand, reglarea expresiei
genice de catre miRNA poate fi combinatorica; atunci cand legarea complementara a miRNA la
ARNm nu reuseste sa declanseze degradare ARNm, legarea suplimentara a altor molecule de
miRNA la acelasi ARNm conduce la reduceri suplimentare ale translatiei. In al treilea rand, miRNA
ocupa relativ putin “spatiu” in genom comparativ cu o proteine; acesta este si motivul pentru care
miRNA au fost descoperite recent.

12
 CLEAVAGE

"CROPPING"

NUCLEUS

CYTOSOL

"DICING"

7~
Argonaute and
otherproteins 3' --1----i s' RISC

extensive~ensivematch

mRNA mRNA

! "SLICING"

m7
ADPr RISC released
- - - - -AAAAA

TRANSLATION REDUCED
transfer of mRNA into
rapid mRNA DEGRADATION P-bodies and eventual degradation
Figure 7-112 Molecular Biology of the Cell Ste(© Garland Science 2008)

Fig. 1. Procesarea si mecanismul de actiune al miRNA

ARN de interferenta

Numeroase proteine care participa la mecanismele de reglare prin miRNA au si un rol de

aparare: ele participa la degradarea ARNm non-self, in special daca acesta este prezent in forma
dublu-catenara. Numit interferenta ARN (RNAi), acest mecanism este intalnit la o varietate de
organisme, incluzand fungii, plantele si viermii, sugerand faptul ca este un mecanism ancestral.
Numeroase elemente genetice transposabile si virusuri produc ARN dublu-catenar cel putin
tranzitor in ciclul de viata, iar RNAi ajuta la controlul acestor invadatori potential daunatori. Dar
RNAi sta totodata la baza unor tehnici experimentale de blocare a expresiei genelor individuale.
Prezenta ARN-ului dublu catenar in celule declanseaza RNAi prin atragerea unui complex
proteic (ce contine Dicer, aceeasi nucleaza care proceseaza miRNA). Acest complex proteic
cliveaza ARN-ul dublu-catenar in fragmente mici (aproximativ 23 de nucleotide pereche) numite
ARN de interferenta mic (siRNA). Aceste molecule de siRNA sunt apoi legate de Argonaute si alte
componente ale RISC si o catena a siRNA este degradata. siRNA monocatenar ramas directioneaza
RISC catre moleculele de ARN produse de virus sau elementele transpozabile, conducand la
distrugerea sa rapida.
De fiecare data cand RISC cliveaza o noua molecula de ARN, este eliberat; astfel, ca si in
cazul miRNA, o singura molecula de ARN poate actiona catalitic pentru a distruge mai multe
molecule complementare de RNAi.
13
 double-stranded RNA
111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111

ii1i10iiif hii1iiiiiii11i0 111 'fl'''i10i111101i111'fl'''iOlll 1

------7. . . .,
::OliiiiiiilhiiiiilliO"
Argonaute and siRNAs ::IIOiitjjjj jjjjjjjjjjj jl' Argonaute and
other RISC proteins ,rlOiiliiiOOOIOOlh"

~
RISC
- - - RITS

l
PATHWAY NOW FOLLOWS ONE OF
THOSE SHOWN IN Figure 7 - 112 l
l
RNA polymerase

HISTONE METH YLATION

DNA METHYLATION
TRANSCRIPTIONAL REPRESSION
Figure 7-11S Molecular Biology of t he Cell S/e (0 Garland Science 2008)

Fig. 2. Formarea heterocromateinei mediata de siRNA

RNAi poate directiona formare heterocromatinei

Nu intotdeauna mecanismul de interferenta descris conduce la degradarea unei molecule de

ARN tinta. In unele cazuri, sistemul de interferenta ARN poate conduce la blocarea sintezei ARN-
ului tinta. Pentru ca acest mecanism sa se produca, siRNA produse de proteina Dicer sunt asamblate
cu un grup de proteine (inclusiv Argonaute) pentru a forma complexul RITS (RNA-induced
transcriptional silencing). Prin utilizarea siRNA monocatenar drept secventa de ghidare, acest
complex leaga transcriptii ARN complementari imediat ce acestia sunt generati de catre ARN-
polimeraza II. Astfel complexul RITS atrage proteine care modifica histonele si directioneaza
formarea heterocromatinei pentru a preveni initierea transcriptiei. In unele cazuri, complexul RITS
induce metilarea ADN care represeaza si mai mult expresia genica. Deoarece formarea
heterocromatinei si metilarea ADN se pot auto-propaga, un semnal interferential initial continua sa
supreseze expresia genica mult timp dupa evenimentul initial.
Acest mecanism este important pentru mentinerea heterocromatinei in jurul centromerilor.
Secventele de ADN centromerice sunt transcrise in ambele directii, producand transcripti ARN
complementari care pot forma ARN dublu catenar prin complementaritatea bazelor. Aceste
molecule de ARN dublu catenar initiaza mecanismul de interferenta ARN si stimuleaza formarea

14
cromatinei la nivelul centromerilor; heterocromatina este necesara pentru segregarea precisa a
cromozomilor in mitoza.

Utilizarea RNAi pentru testarea functiilor genelor

Interferenta ARN (RNAi) exploateaza mecanismul natural utilizat de plante, animale, fungi
si protozoare de a se proteja impotriva unor virusuri si elemente genetice transpozabile. In aceste
tehnici se introduce intr-o celula sau organism o molecula de ARN dublu catenar a carui secventa
de nucleotide este complementara cu o regiune a genei ce se doreste a fi inactivata.
Dupa procesarea ARN, acesta hibridizeaza cu ARNm produs de gena tinta si ii directioneaza
degradarea. Ca urmare, celula utilizeaza fragmente mici de ARN degradat pentru a produce mai
mult ARN dublu catenar, care directioneaza inlaturarea continua a ARNm tinta. Deoarece aceste
fragmente scurte de ARN pot fi transmise generatiilor urmatoare, RNAi poate determina modificari
transmisibile ale expresiei genice.
Exista si un al doilea mecanism prin care RNAi poate inactiva stabil genele. Fragmente de
ARN produse prin degradare in citosol pot patrunde in nucleu si interactiona cu gena tinta,
directionandu-i impachetarea intr-o forma a cromatinei ce reprima transcriptia (heterocromatina).
Existenta acestor doua mecanisme de control al expresiei genice fac din RNAi o unealta
utila de a bloca genele.
RNAi este frecvent utilizat pentru a inactiva genele la Drosophila si in culturi de celule
mamifere. RNAi este de asemenea utilizat pentru studierea functiei genelor la nematodul
Caenorhabditis elegans (C. elegans); pentru introducerea ARN-ului dublu catenar in animal, acesta
poate fi fie direct injectat in intestinul viermelui, sau viermele poate fi hranit cu Escherichia coli (E.
coli) care a fost modificat pentru a produce ARN. Recent, o tehnica similara a fost utilizata la
soareci. In acest caz sunt utilizate tehnologiile ADN recombinant pentru a genera animale
transgenice care sa exprime RNAi de la un promotor indus. Adesea acesta este un ARN special
creat pentru a forma regiuni dublu-catenare intre secvente nucleotidice din aceeasi molecula, care sa
fie recunoscut de catre sistemul RNAi. Acest proces inactiveaza doar genele care corespund perfect
secventei de RNAi. In functie de promotorul utilizat, RNAi poate fi produs doar de anumite tesuturi
sau doar in anumite momente ale dezvoltarii, permitand analiza detaliata a functiilor unor gene
tinta.

15