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OCDE/OCDE 407
Adotado:
3 de outubro de 2008

DIRETRIZES DA OCDE PARA ENSAIOS DE PRODUTOS QUÍMICOS

Estudo de toxicidade oral de dose repetida de 28 dias em roedores

INTRODUÇÃO

1 As Diretrizes da OCDE para Ensaios de Produtos Químicos são revistas periodicamente à luz do progresso científico. O
Test Guideline 407 original foi adotado em 1981. Em 1995 foi adotada uma versão revisada, para obter informações
adicionais do animal utilizado no estudo, em particular sobre neurotoxicidade e imunotoxicidade.

2 Em 1998, a OCDE iniciou uma actividade de alta prioridade para rever as Directrizes de Ensaio existentes e desenvolver
novas Directrizes de Ensaio para o rastreio e ensaio de potenciais desreguladores endócrinos (8). Um elemento da
actividade consistiu em actualizar as directrizes existentes da OCDE para “estudo de toxicidade oral de dose repetida de 28
dias em roedores” (TG 407) através de parâmetros adequados para detectar a actividade endócrina das substâncias de
teste. Este procedimento foi submetido a um extenso programa internacional para testar a relevância e praticabilidade dos
parâmetros adicionais, o desempenho destes parâmetros para produtos químicos com atividade (anti)estrogênica,
(anti)androgênica e (anti)tireoidiana, a reprodutibilidade intra e interlaboratorial , e a interferência dos novos parâmetros com
os exigidos pelo anterior TG 407. A grande quantidade de dados assim obtidos foi compilada e avaliada detalhadamente
num relatório abrangente da OCDE (9). Esta Diretriz de Teste 407 atualizada é o resultado da experiência e dos resultados
obtidos durante o programa de teste internacional. Este TG 407 permite que certos efeitos mediados pelo sistema endócrino
sejam contextualizados com outros efeitos toxicológicos.

CONSIDERAÇÕES E LIMITAÇÕES INICIAIS

3 Na avaliação e avaliação das características tóxicas de um produto químico, a determinação da toxicidade oral utilizando
doses repetidas poderá ser realizada após a obtenção de informações iniciais sobre a toxicidade por meio de testes de
toxicidade aguda. Este TG destina-se a investigar efeitos sobre uma ampla variedade de potenciais alvos de toxicidade.
Fornece informações sobre os possíveis riscos para a saúde que podem surgir da exposição repetida durante um período
de tempo relativamente limitado, incluindo efeitos nos sistemas nervoso, imunitário e endócrino. No que diz respeito a estes
parâmetros específicos, deverá identificar produtos químicos com potencial neurotóxico, o que pode justificar uma
investigação mais aprofundada deste aspecto, e produtos químicos que interferem na fisiologia da tiróide. Pode também
fornecer dados sobre produtos químicos que afetam os órgãos reprodutivos masculinos e/ou femininos em animais adultos
jovens e pode fornecer uma indicação dos efeitos imunológicos.

4 Os resultados do TG 407 devem ser utilizados para identificação de perigos e avaliação de riscos. Os resultados obtidos
pelos parâmetros relacionados com o sistema endócrino devem ser vistos no contexto do “Quadro Conceptual da OCDE
para Testes e Avaliação de Produtos Químicos Desreguladores Endócrinos” (11). O método compreende o estudo básico
de toxicidade por dose repetida que pode ser utilizado para produtos químicos para os quais não se justifica um estudo de
90 dias (por exemplo, quando o volume de produção não excede determinados limites) ou como preliminar de um estudo
de longo prazo. A duração da exposição deve ser de 28 dias.

5 O programa internacional conduzido para a validação de parâmetros adequados para detectar potencialmente a atividade
endócrina da substância teste mostrou que a qualidade dos dados obtidos por este TG 407 dependerá muito da experiência
do laboratório de teste. Isto refere-se especificamente à determinação histopatológica de alterações cíclicas nos órgãos
reprodutivos femininos e à determinação do peso do © OCDE, (2008)

Você é livre para usar este material para fins pessoais e não comerciais, sem necessidade de consentimento prévio
da OCDE, desde que a fonte seja devidamente mencionada. Qualquer uso comercial deste material está sujeito à
permissão por escrito da OCDE.
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407 OCDE/OCDE

pequenos órgãos dependentes de hormônios que são difíceis de dissecar. Foi desenvolvida uma orientação sobre histopatologia
(19). Está disponível no site público da OCDE em Diretrizes de Teste. Destina-se a auxiliar os patologistas em seus exames e ajudar
a aumentar a sensibilidade do ensaio. Descobriu-se que vários parâmetros eram indicativos de toxicidade endócrina e foram
incorporados no TG. Os parâmetros para os quais não existiam dados suficientes para provar a sua utilidade ou que revelaram
apenas fracas evidências no programa de validação da sua capacidade para ajudar na detecção de desreguladores endócrinos são
propostos como parâmetros opcionais (ver anexo 2).

6 Com base nos dados gerados no processo de validação, deve-se enfatizar que a sensibilidade deste ensaio não é suficiente para
identificar todas as substâncias com modos de ação (anti)androgênicos ou (anti)estrogênicos (9). O GT não é realizado numa fase
da vida mais sensível à desregulação endócrina. No entanto, o GT, durante o processo de validação, identificou compostos que
afetam fraca e fortemente a função tiroideia, e substâncias ativas endócrinas fortes e moderadas que atuam através de estrogénio
ou recetores de androgénio, mas na maioria dos casos não conseguiu identificar substâncias ativas endócrinas que afetam
fracamente os recetores de estrogénio ou androgénio. Portanto, não pode ser descrito como um ensaio de triagem para atividade
endócrina.

7 Consequentemente, a falta de efeitos relacionados com estes modos de ação não pode ser tomada como evidência da falta de
efeitos no sistema endócrino. No que diz respeito aos efeitos mediados pelo sistema endócrino, a caracterização dos compostos
não deve, portanto, basear-se apenas nos resultados deste TG, mas deve ser utilizada numa abordagem de suficiência de prova
que incorpore todos os dados existentes sobre um produto químico para caracterizar a potencial atividade endócrina. Por esta razão,
a tomada de decisões regulamentares sobre a actividade endócrina (caracterização do composto) deve ser uma abordagem ampla,
e não apenas dependente dos resultados da aplicação deste TG.

8 É reconhecido que todos os procedimentos baseados em animais estarão em conformidade com os padrões locais de cuidados
com animais; as descrições de cuidados e tratamento estabelecidas abaixo são padrões mínimos de desempenho e serão
substituídas por regulamentações locais, quando mais rigorosas. Orientações adicionais sobre o tratamento humano dos animais
são fornecidas pela OCDE (14).

9 As definições utilizadas são fornecidas no Anexo 1.

PRINCÍPIO DO TESTE

10 A substância teste é administrada diariamente por via oral em doses graduadas a vários grupos de animais experimentais, um
nível de dose por grupo, por um período de 28 dias. Durante o período de administração, os animais são observados de perto, todos
os dias, quanto a sinais de toxicidade. Os animais que morrem ou são sacrificados durante o teste são necropsiados e, no final do
teste, os animais sobreviventes são sacrificados e necropsiados. Um estudo de 28 dias fornece informações sobre os efeitos da
exposição oral repetida e pode indicar a necessidade de estudos adicionais de longo prazo. Também pode fornecer informações
sobre a seleção de concentrações para estudos de longo prazo. Os dados derivados da utilização do TG deverão permitir a
caracterização da toxicidade da substância em estudo, a indicação da relação dose-resposta e a determinação do nível de efeitos
adversos não observados (NOAEL).

DESCRIÇÃO DO MÉTODO

Seleção de espécies animais

11 A espécie de roedor preferida é o rato, embora outras espécies de roedores possam ser utilizadas. Se os parâmetros
especificados nesta TG 407 forem investigados noutras espécies de roedores, deverá ser fornecida uma justificação detalhada.
Embora seja biologicamente plausível que outras espécies respondam a substâncias tóxicas de forma semelhante ao rato, a
utilização de espécies mais pequenas pode resultar num aumento da variabilidade devido a alterações técnicas.

© OCDE, (2008) 2
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OCDE/OCDE 407
desafios de dissecar órgãos menores. No programa de validação internacional para detecção de desreguladores endócrinos, o
rato foi a única espécie utilizada. Devem ser utilizados animais adultos jovens e saudáveis de estirpes laboratoriais habitualmente
utilizadas. As fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas. A dosagem deve começar assim que possível após o desmame e, em
qualquer caso, antes dos animais completarem nove semanas de idade. No início do estudo a variação de peso dos animais
utilizados deve ser mínima e não exceder ± 20% do peso médio de cada sexo. Quando uma dose oral repetida é conduzida como
preliminar a um estudo de longo prazo, é preferível que animais da mesma estirpe e origem sejam utilizados em ambos os estudos.

Alojamento e alimentação

12 Todos os procedimentos devem estar em conformidade com os padrões locais de cuidados com animais de laboratório.
A temperatura na sala dos animais experimentais deve ser de 22°C (± 3°C). Embora a umidade relativa deva ser de pelo menos
30% e, de preferência, não exceder 70%, exceto durante a limpeza do ambiente, o objetivo deve ser de 50-60%. A iluminação
deve ser artificial, sendo o fotoperíodo de 12 horas claro e 12 horas escuro. Para a alimentação, podem ser utilizadas dietas
laboratoriais convencionais com fornecimento ilimitado de água potável. A escolha da dieta pode ser influenciada pela necessidade
de garantir uma mistura adequada de uma substância em estudo quando administrada por este método. Os animais devem ser
alojados em pequenos grupos do mesmo sexo; os animais podem ser alojados individualmente se cientificamente justificado. Para
o enjaulamento em grupo, não devem ser alojados mais de cinco animais por gaiola.

13 A ração deve ser analisada regularmente quanto a contaminantes. Uma amostra da dieta deve ser retida
até finalização do relatório.

Preparação de animais

14 Animais adultos jovens e saudáveis são aleatoriamente designados para os grupos de controle e de tratamento. As gaiolas
devem ser dispostas de tal forma que os possíveis efeitos decorrentes da colocação das gaiolas sejam minimizados. Os animais
são identificados de forma única e mantidos nas suas gaiolas durante pelo menos cinco dias antes do início do estudo de
tratamento para permitir a aclimatação às condições laboratoriais.

Preparação de doses

15 O composto de teste é administrado por gavagem ou através da dieta ou água potável. O método de administração oral
depende do objetivo do estudo e das propriedades físicas/químicas/toxicocinéticas do material de teste.

16 Quando necessário, a substância teste é dissolvida ou suspensa em um veículo adequado. Recomenda-se que, sempre que
possível, seja considerada primeiro a utilização de uma solução/suspensão aquosa, seguida pela consideração de uma solução/
suspensão em óleo (por exemplo, óleo de milho) e depois por uma possível solução noutros veículos. Para veículos que não
sejam aquáticos, as características tóxicas do veículo devem ser conhecidas. Deve ser determinada a estabilidade da substância
em estudo no veículo.

PROCEDIMENTO

Número e sexo dos animais

17 Devem ser utilizados pelo menos 10 animais (cinco fêmeas e cinco machos) em cada nível de dose. Se for planeada uma
eutanásia provisória, o número deve ser aumentado pelo número de animais programados para serem sacrificados antes da
conclusão do estudo. Deve ser considerado um grupo satélite adicional de dez animais (cinco por sexo) no grupo de controlo e no
grupo de dose máxima para observação da reversibilidade, persistência ou ocorrência retardada de efeitos tóxicos, durante pelo
menos 14 dias após o tratamento.

3 © OCDE, (2008)
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407 OCDE/OCDE

Dosagem

Geralmente, devem ser utilizados pelo menos três grupos de teste e um grupo de controlo, mas se, a partir da avaliação de 18 outros
dados, não forem esperados efeitos com uma dose de 1000 mg/kg de peso corporal/dia, pode ser realizado um teste limite. Se não existirem dados
adequados disponíveis, pode ser realizado um estudo de determinação da gama (animais da mesma estirpe e origem) para auxiliar na determinação
das doses a utilizar. Com exceção do tratamento com a substância em estudo, os animais do grupo de controlo devem ser manuseados de forma
idêntica à dos indivíduos do grupo de ensaio. Se um veículo for utilizado na administração da substância teste, o grupo controle deverá receber o
veículo no maior volume utilizado.

19 Os níveis de dose devem ser selecionados levando em consideração qualquer toxicidade existente e dados (toxico)cinéticos disponíveis para o

composto de teste ou materiais relacionados. O nível de dose mais elevado deve ser escolhido com o objectivo de induzir efeitos tóxicos, mas não morte
ou sofrimento grave. Posteriormente, uma sequência decrescente de níveis de dose deve ser selecionada com vista a demonstrar qualquer resposta
relacionada com a dosagem e nenhum efeito adverso observado no nível de dose mais baixo (NOAEL). Intervalos de duas a quatro vezes são
frequentemente ideais para definir os níveis de dose decrescentes e a adição de um quarto grupo de teste é muitas vezes preferível à utilização de
intervalos muito grandes (por exemplo, mais do que um factor de 10) entre dosagens.

20 Na presença de toxicidade geral observada (por exemplo, redução do peso corporal, efeitos hepáticos, cardíacos, pulmonares ou renais, etc.) ou

outras alterações que possam não ser respostas tóxicas (por exemplo, redução da ingestão de alimentos, aumento do fígado), efeitos observados no
sistema imunológico, Os parâmetros neurológicos ou endócrinos sensíveis devem ser interpretados com cautela.

Teste de limite

Se um teste em um nível de dose de pelo menos 1.000 mg/kg de peso corporal/dia ou, para administração na dieta ou água potável 21,
uma porcentagem equivalente na dieta ou água potável (com base nas determinações do peso corporal), usando os procedimentos descritos para este
estudo, não produz efeitos tóxicos observáveis e se a toxicidade não for esperada com base em dados de compostos estruturalmente relacionados,
então um estudo completo utilizando três níveis de dose pode não ser considerado necessário. O teste de limite aplica-se exceto quando a exposição
humana indica a necessidade de utilização de um nível de dose mais elevado.

Administração de doses

22 Os animais recebem a substância teste diariamente, 7 dias por semana, durante um período de 28 dias. Quando a substância em estudo é

administrada por gavagem, tal deve ser feito numa dose única aos animais, utilizando um tubo gástrico ou uma cânula de intubação adequada. O
volume máximo de líquido que pode ser administrado de uma só vez depende do tamanho do animal testado. O volume não deve exceder 1 ml/100g
de peso corporal, exceto no caso de soluções aquosas onde podem ser utilizados 2 ml/100 g de peso corporal. Exceto no caso de substâncias irritantes
ou corrosivas, que normalmente revelam efeitos exacerbados com concentrações mais elevadas, a variabilidade no volume de teste deve ser minimizada
ajustando a concentração para garantir um volume constante em todos os níveis de dose.

23 No caso de substâncias administradas através da dieta ou da água potável, é importante assegurar que as quantidades da substância em estudo

envolvidas não interferem com a nutrição normal ou com o equilíbrio hídrico. Quando a substância em estudo é administrada na dieta, pode ser utilizada
uma concentração dietética constante (ppm) ou um nível de dose constante em termos do peso corporal dos animais; a alternativa utilizada deve ser
especificada. Para uma substância administrada por gavagem, a dose deve ser administrada em horários semelhantes todos os dias e ajustada
conforme necessário para manter um nível de dose constante em termos de peso corporal do animal. Quando um estudo de dose repetida for utilizado
como preliminar para um estudo de longo prazo, uma dieta semelhante deverá ser utilizada em ambos os estudos.

© OCDE, (2008) 4
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OCDE/OCDE 407
Observações

O período de observação deve ser de 28 dias. Os animais de um grupo satélite agendado para 24 observações de
acompanhamento devem ser mantidos durante pelo menos 14 dias sem tratamento para detectar a ocorrência retardada, ou a persistência,
ou a recuperação dos efeitos tóxicos.

25 As observações clínicas gerais devem ser feitas pelo menos uma vez por dia, de preferência à(s) mesma(s) hora(s) todos os dias e
considerando o período de pico dos efeitos esperados após a administração. O estado de saúde dos animais deve ser registado. Pelo
menos duas vezes por dia, todos os animais são observados quanto à morbilidade e mortalidade.

26 Uma vez antes da primeira exposição (para permitir comparações entre indivíduos) e pelo menos uma vez por semana depois disso,
devem ser feitas observações clínicas detalhadas em todos os animais. Estas observações devem ser feitas fora da gaiola, em uma arena
padrão e, de preferência, no mesmo horário do dia em cada ocasião. Devem ser cuidadosamente registados, de preferência utilizando
sistemas de pontuação, explicitamente definidos pelo laboratório de ensaio.
Devem ser feitos esforços para garantir que as variações nas condições de teste sejam mínimas e que as observações sejam
preferencialmente conduzidas por observadores que desconhecem o tratamento. Os sinais observados devem incluir, entre outros,
alterações na pele, pêlo, olhos, membranas mucosas, ocorrência de secreções e excreções e atividade autonômica (por exemplo,
lacrimejamento, piloereção, tamanho da pupila, padrão respiratório incomum). Mudanças na marcha, postura e resposta ao manejo, bem
como a presença de movimentos clônicos ou tônicos, estereotipias (por exemplo, higiene excessiva, movimentos repetitivos em círculos)
ou comportamentos bizarros (por exemplo, automutilação, andar para trás) também devem ser registradas (2).

e Na quarta semana de exposição a reatividade sensorial a estímulos de diferentes tipos (2) (ex. estímulos auditivos, visuais 27
proprioceptivos) (3)(4)(5), avaliação da força de preensão (6) e avaliação da atividade motora (7) devem ser conduzido. Mais detalhes
sobre os procedimentos que poderiam ser seguidos são fornecidos nas respectivas referências.
No entanto, poderiam ser utilizados procedimentos alternativos aos mencionados.

28 As observações funcionais realizadas na quarta semana de exposição podem ser omitidas quando o estudo é conduzido como um
estudo preliminar para um estudo subcrônico subsequente (90 dias). Nesse caso, as observações funcionais devem ser incluídas neste
estudo de acompanhamento. Por outro lado, a disponibilidade de dados sobre observações funcionais do estudo de dose repetida pode
aumentar a capacidade de selecionar níveis de dose para um estudo subcrónico subsequente.

29 Como exceção, as observações funcionais também podem ser omitidas para grupos que de outra forma revelem sinais
de toxicidade numa extensão que possa interferir significativamente no desempenho do teste funcional.

Na necropsia, o ciclo estral de todas as fêmeas pode ser determinado (opcional) através de 30 esfregaços vaginais. Estas
observações fornecerão informações sobre o estágio do ciclo estral no momento do sacrifício e auxiliarão na avaliação histológica de
tecidos sensíveis ao estrogênio (ver orientação sobre histopatologia
(19)).

Peso corporal e consumo de alimentos/água

31 Todos os animais devem ser pesados pelo menos uma vez por semana. As medições do consumo alimentar devem ser feitas pelo
menos semanalmente. Se a substância em estudo for administrada através da água potável, o consumo de água também deverá ser
medido pelo menos uma vez por semana.

5 © OCDE, (2008)
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407 OCDE/OCDE

Hematologia

de Os seguintes exames hematológicos devem ser realizados no final do período de teste: hematócrito, concentrações
hemoglobina, contagem de eritrócitos, reticulócitos, contagem total e diferencial de leucócitos, contagem de plaquetas e uma
medida do tempo/potencial de coagulação do sangue. Outras determinações que devem ser realizadas, caso a substância em
estudo ou os seus supostos metabolitos tenham ou se suspeite que tenham propriedades oxidantes incluem a concentração
de metahemoglobina e os corpos de Heinz.

33 As amostras de sangue devem ser colhidas de um local designado imediatamente antes ou como parte do procedimento de
eutanásia dos animais e armazenadas em condições apropriadas. Os animais devem estar em jejum durante a noite antes da
1.
eutanásia

Bioquímica clínica

34 As determinações bioquímicas clínicas para investigar os principais efeitos tóxicos nos tecidos e, especificamente, os efeitos
nos rins e no fígado, devem ser realizadas em amostras de sangue obtidas de todos os animais imediatamente antes ou como
parte do procedimento de eutanásia dos animais (exceto aquelas encontradas moribundo e/ou sacrificado antes do término do
estudo). As investigações do plasma ou soro devem incluir sódio, potássio, glicose, colesterol total, ureia, creatinina, proteínas
totais e albumina, pelo menos duas enzimas indicativas de efeitos hepatocelulares (tais como alanina aminotransferase,
aspartato aminotransferase, fosfatase alcalina, ÿ-glutamil trans- peptidase e glutamato desidrogenase) e ácidos biliares. As
medições de enzimas adicionais (de origem hepática ou de outra origem) e da bilirrubina podem fornecer informações úteis em
determinadas circunstâncias.

35 Opcionalmente, as seguintes determinações de urinálise poderiam ser realizadas durante a última semana do estudo
usando coleta cronometrada do volume de urina; aparência, volume, osmolalidade ou gravidade específica, pH, proteína,
glicose e sangue/células sanguíneas.

36 Além disso, estudos para investigar marcadores plasmáticos ou séricos de danos teciduais gerais devem ser considerados.
Outras determinações que devem ser realizadas, se as propriedades conhecidas da substância em estudo puderem, ou houver
suspeita de que afetem, perfis metabólicos relacionados incluem cálcio, fosfato, triglicerídeos, hormônios específicos e
colinesterase. Estes devem ser identificados para produtos químicos em determinadas classes ou caso a caso.

37 Embora na avaliação internacional dos parâmetros endócrinos não tenha sido demonstrada uma vantagem clara para a
determinação das hormonas tiroideias (T3, T4) e TSH, pode ser útil reter amostras de plasma ou soro para medir T3, T4 e TSH
( opcional) se houver indicação de efeito no eixo hipófise-tireoide. Estas amostras podem ser congeladas a -20° para
armazenamento. Os seguintes fatores podem influenciar a variabilidade e as concentrações absolutas das determinações
hormonais:
– momento do sacrifício devido à variação diurna das concentrações hormonais – método
de sacrifício para evitar estresse indevido aos animais que possa afetar as concentrações hormonais – kits de teste
para determinações hormonais que podem diferir em suas curvas padrão.

1
Para uma série de medições no soro e no plasma, principalmente para a glicose, o jejum durante a noite seria preferível. A
principal razão para esta preferência é que o aumento da variabilidade que resultaria inevitavelmente do não jejum tenderia a
mascarar efeitos mais sutis e dificultaria a interpretação. Por outro lado, contudo, o jejum durante a noite pode interferir com o
metabolismo geral dos animais e, particularmente em estudos de alimentação, pode perturbar a exposição diária à substância
em estudo. Se for adotado o jejum noturno, as determinações bioquímicas clínicas deverão ser realizadas após a realização
das observações funcionais na semana 4 do estudo.

© OCDE, (2008) 6
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OCDE/OCDE 407
A identificação definitiva de substâncias químicas ativas na tireoide é mais confiável pela análise histopatológica do que
pelos níveis hormonais.

38 As amostras de plasma destinadas especificamente à determinação hormonal devem ser obtidas em um horário
comparável do dia. Recomenda-se que sejam consideradas as determinações de T3, T4 e TSH desencadeadas com base
em alterações da histopatologia da tireoide. Os valores numéricos obtidos ao analisar as concentrações hormonais diferem
com vários kits de ensaio comerciais. Consequentemente, poderá não ser possível fornecer critérios de desempenho
baseados em dados históricos uniformes. Alternativamente, os laboratórios devem esforçar-se por manter os coeficientes
de variação de controlo abaixo de 25 para T3 e T4 e abaixo de 35 para TSH. Todas as concentrações devem ser registadas
em ng/ml.

Se os dados históricos de base forem inadequados, deve considerar-se a determinação de 39 variáveis

hematológicas e bioquímicas clínicas antes do início da dosagem ou, de preferência, num conjunto de animais não
incluídos nos grupos experimentais.

PATOLOGIA

Necropsia macroscópica

Todos os animais do estudo serão submetidos a uma necropsia macroscópica completa e detalhada, que inclui
um exame cuidadoso da superfície externa do corpo, de todos os orifícios, das cavidades craniana, torácica e abdominal
e do seu conteúdo. O fígado, rins, supra-renais, testículos, epidídimos, próstata + vesículas seminais com glândulas
coagulantes como um todo, timo, baço, cérebro e coração de todos os animais (exceto aqueles encontrados moribundos
e/ou sacrificados antes do término do estudo) devem ser aparados de qualquer tecido aderente, conforme apropriado, e
seu peso úmido deve ser medido o mais rápido possível após a dissecção para evitar ressecamento. Deve-se ter cuidado
ao aparar o complexo da próstata para evitar a perfuração das vesículas seminais cheias de líquido.
Alternativamente, as vesículas seminais e a próstata podem ser aparadas e pesadas após a fixação.

41 Além disso, dois outros tecidos poderiam ser opcionalmente pesados o mais rápido possível após a dissecção, para
evitar a secagem: ovários pares (peso úmido) e útero, incluindo colo do útero (orientações sobre remoção e preparação
dos tecidos uterinos para medição de peso são fornecidas em TG 440 (18)).

42 O peso da tireoide (opcional) pode ser determinado após a fixação. O corte também deve ser feito com muito cuidado
e somente após a fixação para evitar danos aos tecidos. Danos nos tecidos podem comprometer a análise histopatológica.

43 Os seguintes tecidos devem ser preservados no meio de fixação mais adequado tanto para o tipo de tecido como para
o exame histopatológico subsequente pretendido (ver parágrafo 47): todas as lesões macroscópicas, cérebro (regiões
representativas incluindo cérebro, cerebelo e ponte), medula espinhal, olho, estômago, intestinos delgado e grosso
(incluindo placas de Peyer), fígado, rins, supra-renais, baço, coração, timo, tireóide, traquéia e pulmões (preservados por
inflação com fixador e depois imersão), gônadas (testículos e ovários), acessórios órgãos sexuais (útero e colo do útero,
epidídimos, próstata + vesículas seminais com glândulas coagulantes), vagina, bexiga urinária, gânglios linfáticos (além
do gânglio de drenagem mais proximal, outro gânglio linfático deve ser retirado de acordo com a experiência do laboratório
(15)), nervo periférico (ciático ou tibial), de preferência próximo ao músculo, músculo esquelético e osso, com medula
óssea (seção ou, alternativamente, um aspirado de medula óssea recém-montado). Recomenda-se que os testículos sejam
fixados por imersão em fixador de Bouin ou fixador de Davidson modificado (16) (17). A túnica albugínea deve ser
puncionada suave e superficialmente em ambos os pólos do órgão com uma agulha para permitir a penetração rápida do
fixador. Os achados clínicos e outros podem sugerir a necessidade de examinar tecidos adicionais. Além disso, quaisquer
órgãos considerados suscetíveis de serem órgãos-alvo com base nas propriedades conhecidas da substância em estudo
devem ser preservados.

7 © OCDE, (2008)
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407 OCDE/OCDE
44 Os seguintes tecidos podem fornecer indicações valiosas sobre efeitos endócrinos: Gônadas (ovários e testículos), órgãos
sexuais acessórios (útero incluindo colo do útero, epidídimos, vesículas seminais com glândulas de coagulação, próstata dorsolateral
e ventral), vagina, hipófise, glândula mamária masculina , a tireóide e a glândula adrenal. As alterações nas glândulas mamárias
masculinas não foram suficientemente documentadas, mas este parâmetro pode ser muito sensível a substâncias com ação
estrogênica. A observação de órgãos/tecidos não listados no parágrafo 43 é opcional (ver Anexo 2).

45 O Guia sobre histopatologia (19) detalha informações extras sobre dissecção, fixação, seccionamento e histopatologia de tecidos
endócrinos.

46 No programa de testes internacional, foram obtidas algumas evidências de que efeitos endócrinos sutis de produtos químicos
com baixa potência para afetar a homeostase dos hormônios sexuais podem ser identificados pela perturbação da sincronização do
ciclo estral em diferentes tecidos e não tanto por alterações histopatológicas francas nas fêmeas. órgãos sexuais. Embora nenhuma
prova definitiva tenha sido obtida para tais efeitos, recomenda-se que evidências de possível assincronia do ciclo estral sejam
levadas em consideração na interpretação da histopatologia dos ovários (células foliculares, tecais e da granulosa), útero, colo do
útero e vagina. . Se avaliado, o estágio do ciclo determinado pelos esfregaços vaginais também poderia ser incluído nesta
comparação.

Histopatologia

47 Deve ser realizada histopatologia completa nos órgãos e tecidos preservados de todos os animais nos grupos de controlo e de
dose elevada. Estes exames devem ser alargados a animais de todos os outros grupos de dosagem, se forem observadas alterações
relacionadas com o tratamento no grupo de dose elevada.

48 Todas as lesões macroscópicas devem ser examinadas.

49 Quando for utilizado um grupo satélite, a histopatologia deve ser realizada em tecidos e órgãos identificados como apresentando
efeitos nos grupos tratados.

DADOS E RELATÓRIOS

Dados

50 Devem ser fornecidos dados individuais. Além disso, todos os dados devem ser resumidos em forma tabular
mostrando, para cada grupo de teste, o número de animais no início do teste, o número de animais encontrados
mortos durante o teste ou sacrificados por razões humanas e a hora de qualquer morte ou eutanásia, o número que mostra sinais
de toxicidade, uma descrição de os sinais de toxicidade observados, incluindo o momento do início, a duração e a gravidade de
quaisquer efeitos tóxicos, o número de animais que apresentam lesões, o tipo de lesões, a sua gravidade e a percentagem de
animais que apresentam cada tipo de lesão.

51 Sempre que possível, os resultados numéricos devem ser avaliados por um método estatístico apropriado e geralmente aceitável.
As comparações do efeito ao longo de um intervalo de doses devem evitar o uso de múltiplos testes t. Os métodos estatísticos
devem ser selecionados durante o desenho do estudo.

52 Para o controle de qualidade, propõe-se que sejam coletados dados históricos de controle e que, para dados numéricos, sejam
calculados coeficientes de variação, especialmente para os parâmetros relacionados à detecção de desreguladores endócrinos.
Esses dados podem ser usados para fins de comparação quando estudos reais são avaliados.

© OCDE, (2008) 8
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OCDE/OCDE 407
Relatório de teste

53 O relatório de teste deve incluir as seguintes informações:

Substância de teste:

- natureza física, pureza e propriedades físico-químicas; - dados de identificação.

Veículo (se apropriado):

- justificação da escolha do veículo, se não for aquático.

Animais de teste:

- espécie/estirpe utilizada; -
número, idade e sexo dos animais; - procedência,
condições de moradia, alimentação, etc.; - pesos
individuais dos animais no início do ensaio. - justificativa para espécie, se
não rato

Condições de teste:

-justificativa para seleção do nível de dose; -

detalhes da formulação da substância teste/preparação da dieta, concentração alcançada, estabilidade e
homogeneidade da preparação; - detalhes
da administração da substância em estudo; -conversão da concentração
da substância em estudo na dieta/água potável (ppm) para a dose real (mg/kg de peso corporal/dia), se aplicável;

- detalhes sobre a qualidade dos alimentos e da água.

Endpoints opcionais investigados

- lista de endpoints opcionais investigados

Resultados:

- alterações no peso corporal/peso corporal; -

consumo de alimentos e consumo de água, se aplicável; - dados de resposta
tóxica por sexo e nível de dose, incluindo sinais de toxicidade; - natureza, gravidade e duração
das observações clínicas (reversíveis ou não); - avaliações de atividade sensorial, força de preensão e atividade
motora; - testes hematológicos com valores basais relevantes; - testes bioquímicos
clínicos com valores basais relevantes; - peso corporal no momento da
eutanásia e dados de peso dos órgãos; - achados de necropsia; - uma descrição
detalhada de todos os achados histopatológicos; - dados de absorção,
se disponíveis; - tratamento
estatístico dos resultados, quando apropriado.

Discussão dos resultados.

Conclusões.

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407 OCDE/OCDE

ANEXO 1

DEFINIÇÕES

Dose é a quantidade de substância de teste administrada. A dose é expressa como peso da substância em estudo por unidade de peso
corporal do animal em estudo por dia (por exemplo, mg/kg de peso corporal/dia), ou como uma concentração dietética constante.

Dosagem é um termo geral que compreende a dose, a sua frequência e a duração da dosagem.

Toxicidade evidente é um termo geral que descreve sinais claros de toxicidade após a administração da substância em estudo. Estes
devem ser suficientes para a avaliação do perigo e devem ser tais que um aumento na dose administrada possa resultar no desenvolvimento
de sinais tóxicos graves e provável mortalidade.

NOAEL é a abreviatura de nível sem efeito adverso observado. Este é o nível de dose mais elevado em que não são observados resultados
adversos relacionados com o tratamento devido ao tratamento.

A estrogenicidade é a capacidade de um produto químico actuar como uma hormona estrogénica natural (por exemplo, estradiol 17ß) num
organismo mamífero.

Androgenicidade é a capacidade de um produto químico agir como um hormônio androgênico natural (por exemplo, testosterona) em um
organismo mamífero.

A atividade da tireoide é a capacidade de uma substância química agir como um hormônio tireoidiano natural (por exemplo, T3) em um
organismo mamífero.

A antiestrogenicidade é a capacidade de um produto químico suprimir a acção de uma hormona estrogénica natural (por exemplo, estradiol
17ß) num organismo mamífero.

Antiandrogenicidade é a capacidade de um produto químico suprimir a ação de um hormônio androgênico natural (por exemplo,
testosterona) em um organismo mamífero.

A atividade antitireoidiana é a capacidade de uma substância química de suprimir a ação de um hormônio tireoidiano natural (por exemplo,
T3) em um organismo mamífero.

A validação é um processo científico concebido para caracterizar os requisitos operacionais e as limitações de um método de teste e para
demonstrar a sua fiabilidade e relevância para um fim específico.

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OCDE/OCDE 407
ANEXO 2

Endpoints recomendados para a detecção de desreguladores endócrinos (DEs) em TG 407

Pontos de extremidade obrigatórios Pontos de extremidade opcionais

Peso
- Testes - Ovários
- Epidídimos - Útero, incluindo colo do útero
- Adrenais - Tireoide
- Próstata + vesículas seminais com glândulas coagulantes

Histopatologia
- Gônadas: - Esfregaços vaginais
- Testes e - Glândulas mamárias masculinas
- Ovários - Hipófise
- Órgãos sexuais acessórios:
- Epidídimos,
- Próstata + vesícula seminal com
glândulas coagulantes
- Útero, incluindo colo do útero
- Adrenal
- Tireoide
- Vagina
Medição de hormônios
- Níveis circulantes de T3, T4
- Níveis circulantes de TSH

11 © OCDE, (2008)
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407 OCDE/OCDE

LITERATURA

(1) OCDE (Paris, 1992). Relatório do Presidente da Reunião do Grupo de Trabalho ad hoc de Especialistas em Neurotoxicidade
Sistêmica de Curto Prazo e (Retardada).

(2) IPCS (1986). Princípios e Métodos para Avaliação da Neurotoxicidade Associada à Exposição a Produtos Químicos.
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(3) Tupper, DE, Wallace, RB (1980). Utilidade do Exame Neurológico em Ratos. Acta Neurobiol.
Exp., 40, 999-1003.

(4) Gad, SC (1982). Uma tela neuromuscular para uso em toxicologia industrial. J. Toxicol Ambiente. Saúde, 9, 691-704.

(5) Moser, VC, McDaniel, KM, Phillips, PM (1991). Comparações de cepas e estoques de ratos usando uma bateria
observacional funcional: valores basais e efeitos do amitraz. Toxicol. Apl. Pharmacol., 108, 267-283.

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anteriores e posteriores de ratos e camundongos. Neurocomportamento. Toxicol., 1, 233-236.

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Comparação Interlaboratorial de Experimentos de Atividade Motora: Implicações para Avaliações Neurotoxicológicas.
Neurotoxicol. Teratol. 13, 599-609.

(8) OCDE (1998). Relatório da Primeira Reunião do Grupo de Trabalho da OCDE para Testes e Avaliação de Desreguladores
Endócrinos (EDTA), 10-11 de Março de 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

(9) OCDE. (2006). Relatório da Validação da Diretriz de Teste Atualizada 407: Estudo de Toxicidade Oral de Dose Repetida
de 28 Dias em Ratos de Laboratório. Série sobre testes e avaliações n.º 59, ENV/JM/MONO(2006)26.

(10) OCDE. (2002). Artigo de revisão detalhada sobre a avaliação de métodos de teste para produtos químicos que desregulam
os hormônios sexuais. Série sobre Testes e Avaliação No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.

(11) OCDE (2002). Quadro conceptual para testes e avaliação de produtos químicos desreguladores
endócrinos. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html

(12) OCDE (2006). Relatório resumido final da reunião do Grupo de Gestão de Validação para testes em mamíferos. ENV/JM/
TG/EDTA/M(2006)2.

(13) OCDE (2006). Projeto de ata resumida da reunião do Grupo de Trabalho sobre Teste e Avaliação de Desreguladores
Endócrinos. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.

(14) OCDE (2000) Documento de orientação sobre o reconhecimento, avaliação e utilização de sinais clínicos como parâmetros
humanos para animais experimentais utilizados na avaliação de segurança. Série sobre Testes e Avaliação No 19.
ENV/JM/MONO(2000)7.

(15) P. Haley, R. Perry, D. Ennulat, S. Frame, C. Johnson, J.-M. Lapointe, A. Nyska, PW Snyder, D.
Walker e G. Walter (2005). Documento de Posição de STP: Diretrizes de Melhores Práticas para a Avaliação Patológica de
Rotina do Sistema Imunológico. Toxicol Pathol 2005 33:404-407.

© OCDE, (2008) 12
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OCDE/OCDE 407

(16) Hess RA, Moore BJ. (1993) Métodos Histológicos para Avaliação do Testículo. In: Métodos em Toxicologia Reprodutiva,
Chapin RE e Heindel JJ (eds). Imprensa Acadêmica: San Diego, CA, pp.

(17) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixação de testículos e olhos usando fluido de Davidson
modificado: comparação com fluido de Bouin e fluido de Davidson convencional. Toxicol. Patol. 30, 524-533.

(18) OCDE. (2007). Diretriz da OCDE para Testes de Produtos Químicos N°440: Bioensaio Uterotrófico em Roedores: Um
teste de triagem de curto prazo para propriedades estrogênicas.

(19) OCDE. (2008). Documento Orientador sobre Histopatologia. Disrupção endócrina: Diretrizes para avaliação histológica
(rascunho). Série sobre testes e avaliação.

13 © OCDE, (2008)