Francis Noël

111 073 188

Rôle des protéines S100A16 et Annexine A4 dans le maintien de l’intégrité

membranaire

CUO Recherche – Hôpital St-Sacrement

Rapport présenté à

Élodie Boisselier
Christian Salesse
Charles Calmettes

Dans le cadre du cours

Projet de maîtrise
BCM-6000

Superviseur Dre Élodie Boisselier

(418) 682-7511 #84429
Elodie.Boisselier@fmed.ulaval.ca

16 août 2018

©
Francis Noël, 2018-08-16
Table des matières
Liste des figures et des tableaux ...................................................................................................... iii
Liste des abréviations ..................................................................................................................... iv
Résumé ............................................................................................................................................ 1
1 - Introduction ................................................................................................................................ 1
1.1 - Mise en contexte ................................................................................................................... 1
1.1.1 Maintien de l’intégrité membranaire ............................................................................... 1
1.1.2 Les protéines S100A16 et Annexine A4 ............................................................................ 2
1.2 – La protéine S100A16............................................................................................................ 3
1.2.1 La famille S100................................................................................................................. 3
1.2.2 La protéine S100A16 ........................................................................................................ 3
1.2.3 La liaison membranaire de la protéine ............................................................................. 4
1.3 – L’Annexine A4..................................................................................................................... 4
1.3.1 Les Annexines .................................................................................................................. 4
1.3.2 L’Annexine A4 ................................................................................................................. 5
1.3.3 La liaison membranaire de la protéine ............................................................................. 5
1.4 – Le complexe protéique ......................................................................................................... 6
1.4.1 Le complexe S100A16-ANXA4 ......................................................................................... 6
2 - Hypothèse et objectifs spécifiques ............................................................................................... 6
3 – Méthodologie.............................................................................................................................. 7
3.1 Objectif I : obtention des protéines S100A16 et ANXA4 ......................................................... 7
3.1.1 Purification des protéines ................................................................................................. 7
3.1.2 Étude de stabilité.............................................................................................................. 7
3.2 Objectif II : étude membranaire des protéines S100A16 et ANXA4........................................ 8
3.2.1 Détermination des paramètres de liaison membranaire ................................................... 8
3.2.2 Méthode de spectroscopie infrarouge ............................................................................... 9
4- Résultats préliminaires ................................................................................................................ 9
5 - Pertinence du travail et conclusion ........................................................................................... 10
6 – Échéancier................................................................................................................................ 10
7 - Annexe ...................................................................................................................................... 11
7.1 Figures.................................................................................................................................. 11
7.2 Tableau................................................................................................................................. 22
8 - Références................................................................................................................................. 23

ii
Liste des figures et des tableaux
Figure 1 : Schéma d'une membrane............................................................................................... 11
Figure 2 : Schéma des fonctions intracellulaires et extracellulaires des protéines S100 dans le
maintien de l’intégrité membranaire ............................................................................................. 11
Figure 3 : Présentation de la structure du bâtonnet et du cône ...................................................... 12
Figure 4 : Diagramme des étapes de purifications du segment externe des bâtonnet chez la vache 13
Figure 5 : Structure de la S100A16-Apo homodimérique............................................................... 14
Figure 6 : Structure de la S100A16 homodimérique lié à des ions calcium..................................... 14
Figure 7 : Présentation d’une partie du segment externe du bâtonnet ........................................... 15
Figure 8 : Séquence de 103 acides aminés de la protéine S100A16 ................................................. 15
Figure 9 : Graphique de l’interaction membranaire entre la protéine S100A16 et différents
phospholipides ............................................................................................................................... 16
Figure 10 : Graphique de la synergie entre la protéine S100A16 et différents phospholipides ....... 16
Figure 11 : Structure de l’Annexine A4 se liant à 4 ions Ca2+ par monomère ................................. 17
Figure 12 : Séquences de 319 acides aminés de l’annexine A4 humaine ......................................... 18
Figure 13 : Séquence de la protéine de fusion ................................................................................ 19
Figure 14 : Analyse de différentes conditions de clivage................................................................. 19
Figure 15 : Analyse des fractions de la purification de la protéine de fusion S100A16 par
électrophorèse sur gel SDS-PAGE 18% en condition dénaturante ................................................. 20
Figure 16 : Graphique de la différence de pression en fonction de la concentration. ...................... 20
Figure 17 : Graphique de pression (mN/m) en fonction du temps (s) ................................................ 21
Figure 18 : Graphique de la pression initiale en fonction de la pression de surface. ....................... 21

Tableau 1 : Composition des lipides des SEB chez les humains .......................................................... 22
Tableau 2 : Composition lipidique du segment ..................................................................................... 22

iii
Liste des abréviations
ANXA4 : Annexine A4
DMPC : 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (14:0 PC)
DMPE : 1,2- Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (14:0 PE)
DMPS : 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (14:0 PS)
DPPC : 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (16:0 PC)
DPPE : 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0 PE)
DPPS : 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (16:0 PS)
DSPC : 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (18:0 PC)
DSPE : 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (18:0 PE)
DSPS : 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (18:0 PS)
DOPC : 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (18:1 PC)
DOPE : 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (18:1 PE)
DOPS : 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (18:1 PS)
DDPC : 1,2-Didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (22:6 PC)
DDPE : 1,2-Didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (22:6 PE)
DDPS : 1,2-Didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (22:6 PS)
MCF7 : Michigan Cancer Foundation-7
PIM : Pression d’insertion maximale
PM-IRRAS : Spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption par modulation de la polarisation
SEB : Segment externe des bâtonnets
Πi : Pression initiale (mN/m)
Πe : Pression à l’équilibre (mN/m)

iv
Résumé
Le maintien de l’intégrité structurale et fonctionnelle des membranes est essentiel au bon
fonctionnement des cellules. Une étude protéomique récente suggère que la protéine S100A16 et
l’annexine A4 (ANXA4) participent au maintien de l’intégrité membranaire dans le segment
externe des photorécepteurs de l’œil. La protéine S100A16, récemment découverte, fait partie des
protéines de la famille S100 pour laquelle aucune interaction protéique et membranaire n’a encore
été identifiée. ANXA4 est impliquée dans la réparation membranaire. De plus, le maintien de
l’intégrité membranaire est un processus sensible au calcium. L’objectif consiste à étudier les
interactions membranaires des protéines S100A16 et ANXA4 afin de mieux comprendre leur
fonction dans le maintien de l’intégrité membranaire. Ces protéines seront donc purifiées et leur
liaison membranaire sera étudiée à l’aide du modèle membranaire des monocouches de Langmuir.
La protéine S100A16 a été obtenue avec une pureté supérieure à 99% et l’étude biophysique est
actuellement en cours.

1 - Introduction
1.1 - Mise en contexte
Les cellules humaines sont constituées d’une membrane permettant de réguler ce qui entre et sort
de la cellule. Comme on peut le voir dans la Figure 1, la membrane est composée d’une bicouche
de phospholipides dans laquelle il y a des protéines périphériques, transmembranaires et même
des glycoprotéines, des glucides, des glycolipides et du cholestérol. Dans cette membrane, les
protéines jouent différents rôles. L’étude biophysique des protéines permet de mieux comprendre
leurs interactions avec la membrane plasmique.
1.1.1 Maintien de l’intégrité membranaire
Il a été démontré que la concentration en ions calcium externe des cellules a un impact sur le
maintien de l’intégrité membranaire.(1) Les protéines de la famille S100 et les annexines sont
deux grands groupes de protéines distincts. Cependant, ils sont dépendants du calcium c’est-à-
dire qu’ils lient le calcium pour être fonctionnels. Le fait qu’ils lient les ions calcium leur permet
par la suite d’interagir avec les phospholipides de la membrane plasmique.(2) Pour qu’il y est un
maintien de l’intégrité membranaire, il est essentiel que la membrane soit capable de se réparer en
cas de blessures.(3) Ainsi, certaines protéines dépendantes des ions calcium déclenchent la
réparation cellulaire en présence de stimuli (une blessure). L’équipe de Theresa et al. a montré
que les annexines A4 et A6 sont impliquées dans la réparation membranaire chez les cellules
Michigan Cancer Foundation-7(MCF7) et ce mécanisme est déclenché lorsque la membrane subit
une blessure. D’abord, l’annexine A6 est recrutée pour former des constrictions autour de la
blessure. Ensuite, l’annexine A4 monomérique est recrutée, s’autoassemble en trimère et se joint
pour créer des courbes jusqu’à ce que le trou se referme. Huit annexines ont été identifiées et
seraient impliquées dans la réparation membranaire chez les cellules MCF7.(3)
De plus, plusieurs protéines de la famille des S100 exercent différentes fonctions intracellulaires
et extracellulaires qui influencent le maintien de l’intégrité membranaire. À l’intérieur, les S100
régulent la prolifération, la différenciation, la migration cellulaire, le métabolisme énergétique,
les ions calcium, l’homéostasie, l’inflammation et la mort cellulaire. Lorsqu’elles sont libérées
dans l’espace extracellulaire, elles agissent comme des alarmants pour la membrane en
interagissant avec différents récepteurs pour la réponse immunitaire, la migration cellulaire, la

1
chimiotaxie, dans le développement et la réparation tissulaire (Figure 2).(4) La S100A16 n’a
encore aucune fonction d’attribuée. Il est donc possible qu’elle joue également un rôle dans le
maintien de l’intégrité membranaire comme les autres membres de sa famille. Lorsque les
protéines S100 lient le calcium, il y a un réarrangement conformationnel. Ce changement expose
une surface hydrophobe de la protéine qui lui permet de se lier à la membrane ou à d’autres
protéines.(5) Les S100 peuvent se lier à d’autres protéines de façon calcium dépendante ou
indépendante.(5) Ainsi, des recherches ont démontré que les S100 et les annexines peuvent former
des complexes protéiques. De plus, certaines annexines, comme l’annexine A6 se lie à la S100A1,
S100A6, S100A11 et S100B. De même, certaines S100 peuvent également se lier à plusieurs
annexines comme la S100A6 qui se lie avec l’annexine A2, A6 et A11.(2)
Pour ce projet, on va étudier l’intégrité membranaire des photorécepteurs de l’œil, plus
spécifiquement les membranes du segment externe des bâtonnets (SEB). La lumière est captée par
la rétine de l’œil et se rend jusqu’au photorécepteurs composés de bâtonnets et de cônes
schématisés dans la Figure 3. Les bâtonnets sont composés de 4 grandes parties, soit le segment
externe, le segment interne, le noyau et la terminaison synaptique. La composition en têtes polaires
des phospholipides du SEB chez l’humain est de 32,5% de phosphatidylcholine (PC), 37,6% de
phosphatidyléthanolamine (PE) et 12,1% de phosphatidylsérine (PS) (Tableau 1).(6) Les PE et les
PC ont une tête polaire neutre, alors que les PS ont une tête polaire chargée négativement. De plus,
les chaînes polyinsaturées constituent entre 50-60% de la fraction lipidique totale (Tableau 2).(6)
De surcroît, les SEB sont composés de disques membranaires. Le cholestérol correspond à 9,9%
de la fraction lipidique totale.(6) La concentration en cholestérol des disques diffère entre la base
et le sommet (apex) du SEB. Cette concentration varie de 5 à 30%.(7)
1.1.2 Les protéines S100A16 et Annexine A4
Une étude a démontré que la protéine S100A16 se retrouve dans le SEB des photorécepteurs. On
y retrouve également les annexines A2, A4, A5, A6 et A7.(8) L’annexine A4 (ANXA4), étant
celle qui est le plus fortement exprimée, sera celle qui sera utilisée pour débuter notre étude. La
Figure 4 décrit les étapes de purifications du SEB chez la vache. Selon leur étude, la protéine
S100A16 est localisée seulement dans la fraction de la membrane plasmique. Pour l’ANXA4, elle
a été identifiée dans le SEB purifié, la fraction membranaire, la fraction soluble ainsi que dans les
disques membranaires.(8) De plus, aucune interaction membranaire n’a été démontrée à ce jour
pour la protéine S100A16, l’ANXA4 et le complexe S100A16-AnnexineA4, hormis pour
l’ANXA4 dont il y a une étude en présence de DOPS, DOPC et DOPA.(3) Contrairement aux
multiples complexes S100-Annexines connus, il n’existe aucune étude protéine-protéine sur le
complexe S100A16-AnnexineA4. Cependant, il y a une interaction protéine-protéine entre la
S100A16 et la S100A14.(9) Aussi, la S100A16 interagirait dans la signalisation avec les protéines
ERK et AKT ainsi qu’avec les suppresseurs de tumeurs p21 et p27.(10) De plus, L’ANXA4
interagit avec l’adelynyl cyclase de type 5.(11) Cette étude montre que l’ANXA4 serait donc un
modulateur du signal biochimique pour l’AMPc. Les annexines A4 et A6 interagissent ensemble
pour la rép0aration membranaire des cellules MCF7. Il n’existe que très peu d’études connues
jusqu’à ce jour sur les interactions de ces deux protéines.
À la lumière de ces informations, on sait que plusieurs annexines sont impliquées dans la
réparation membranaire, ce qui contribue à l’intégrité membranaire. De plus, certains complexes
S100-Annexines sont plus favorables que l’annexine seule. Donc, l’étude biophysique de la

2
S100A16, de l’ANXA4 et du complexe S100A16-AnnexineA4 permettra de déterminer si ces
protéines sont impliquées dans le maintien de l’intégrité membranaire du SEB.
1.2 – La protéine S100A16
1.2.1 La famille S100
Les protéines S100 font partie de la plus grande sous-famille de protéines du type main-EF, qui
sont des protéines de structure hélice-boucle-hélice. La famille est composée d’au moins 25
membres jusqu’à présent chez l’humain. Elles se retrouvent d’ailleurs seulement chez les
vertébrés et 21 d’entre elles sont situées sur le chromosome 1q21.(5) De plus, elles lient le calcium
ce qui leur permet de changer de conformation et ainsi d’être fonctionnelle soit en se liant avec
d’autres molécules ou avec les phospholipides. Les S100 portent leur nom dû au fait qu’elles sont
solubles à 100% dans une solution saturée de sulfate d’ammonium à pH neutre.(12) Les protéines
S100 jouent un rôle dans l’homéostasie, la prolifération cellulaire, la migration, la différenciation,
l’apoptose(13) la régulation de l’actine et du réseau des microtubules, de promouvoir la survie
cellulaire, l’homéostasie calcique et comme médiateur de la contraction musculaire.(14) De
surcroît, les protéines S100 sont exprimées dans différents tissus de manière ubiquitaire.
Cependant, chaque protéine a une expression préférentielle pour un type de tissus ou un type de
cellule.(5)
1.2.2 La protéine S100A16
Contrairement aux autres protéines de la famille S100, la S100A16 n’aurait qu’un seul site de
liaison pour le calcium par monomère. Il y a possiblement 1 site de liaison par monomère pour le
Zn2+.(13) Autant chez la S100A16 de l’humain que de la souris, on retrouve l’acide aminé Trp-80
situé sur la seconde hélice en position C-terminal de la main-EF.(13) D’ailleurs, la protéine
S100A16 n’a qu’un seul site fonctionnel pour la liaison avec le calcium et elle se trouve en C-
terminal de la main-EF. Cependant, en position N-terminale de la main-EF, la protéine S100A16
diffère de ceux de la famille S100, puisqu’elle n’a pas de site de liaison pour le calcium.
Cependant, une étude plus récente a démontré que chaque sous-unité lie 2 molécules de calcium.
La S100A16, dans leur condition d’étude, est capable de lier un ion calcium en N-terminal, malgré
le fait qu’elle n’a pas l’acide aminé glutamate en position 14, qui permet une forte affinité pour la
liaison. Son affinité pour l’ion calcium en N-terminal est cependant faible.(15)
Pour finir, la S100A16 forme un homodimère covalent comme la plupart des protéines de la
famille S100.(13, 15) C’est également une très petite protéine dont la masse moléculaire est de
11,8 kDa.(10)
Structure de la S100A16
La S100A16 est composée de 4 hélices α reliées par des boucles. Il y a présence d’interactions
hydrophobiques plus forte que chez les autres S100. Elle est composée de deux mains-EF. La
première se situe en N-terminal composée de l’hélice I, la boucle I et l’hélice II. La seconde se
situe en C-terminal et est composée de l’hélice III, boucle II et de l’hélice IV. Les deux domaines
sont connectés par un lien appelé la boucle charnière.(15) Il est possible de voir la structure de la
S100A16 non liée dans la Figure 5 et liée avec les ions calcium dans la Figure 6.
Influence des ions calcium
Lorsque la protéine S100A16 se lie avec des ions calcium, celle-ci subit des changements
conformationnels qui exposent des parties hydrophobes de la protéine.(13)

3
Contrairement aux autres protéines S100, lorsque la S100A16 se lie avec le calcium, il y a un
changement conformationnel entre l’hélice II et III de 15 à 20°, alors que le changement
conformationnel de la protéine S100A13, qui se rapproche le plus de la S100A16, est de 40°.(15)
Le changement conformationnel est donc plus subtil chez la S100A16 que chez les autres
membres de la famille S100.
L’équipe de Bambini(15) a également démontré que l’oxygène des acides aminés (Val-23, Tyr-
26, Leu-28 et Lys-32) lie le calcium en N-terminal et les acides aminés (Asp-67, Asn-69, Asp-71,
Arg-73 et Glu-78) lient le calcium en C-terminal.
Localisation
La S100A16 est exprimée dans plusieurs tissus, mais plus spécifiquement dans les astrocytes
réactifs qui sont des cellules du système nerveux.(13) Une étude sur la localisation de S100A16
réalisée sur les cellules du glioblastome a démontré la présence de la protéine dans le noyau et le
cytoplasme des cellules astrocytes.
La concentration d’ions calcium régule la localisation cellulaire. Une concentration élevée
intracellulaire entraine chez S100A16 une sortie nucléaire et un transport cytoplasmique. D’un
autre côté, une faible concentration intracellulaire engendre une translocation de S100A16 et une
accumulation dans des régions spécifiques du nucléole.(13) Le fait que S100A16 est fortement
associée au nucléole, cela laisse penser que la protéine S100A16 pourrait jouer un rôle dans le
traitement des complexes ribonucléoprotéines, dans le silençage génique ou dans la progression
du cycle cellulaire.(13)
Pour le projet, on s’attarde plus spécifiquement à la S100A16 qui se trouve dans le SEB. Comme
on peut le voir dans la Figure 7, le SEB est composé de disques membranaires et d’une membrane
plasmique tout autour des disques. Selon une étude effectuée sur la S100A16 chez la vache et chez
la souris, les segments d’acides aminés AVVVLVENFYK et LIQNLDANHDGR ont été
identifiés à l’aide d’une banque de données et en utilisant un spectromètre de masse. Ils ont ainsi
obtenu plusieurs petites séquences qu’ils ont identifiées à l’aide de la banque de données. Leur
analyse a permis de démontrer que la S100A16 se trouve dans la membrane plasmique des
SEB.(8) De plus, dans la Figure 8, on retrouve les séquences d’acide aminé de la S100A16 de
l’humain et de la vache. Une analyse a été faite pour montrer la similitude et la différence entre
les deux séquences.
1.2.3 La liaison membranaire de la protéine
Aucune étude d’interactions membranaires n’a été faite pour la protéine S100A16. La protéine
S100A16 a été découverte assez récemment soit en 2006 (13) et il y a peu d’informations connues
sur celle-ci. Cependant, des résultats sont en cours pour la protéine S100A16 en présence de
différents phospholipides que l’on peut voir dans les Figures 9 et 10. Ces résultats seront détaillés
dans la section résultats préliminaires.

1.3 – L’Annexine A4
1.3.1 Les Annexines
Plus de 100 annexines ont été identifiées dans différents spécimens, dont 12 de ces protéines chez
l’humain. Elles sont distribuées majoritairement chez les eucaryotes et très peu chez les
procaryotes et les levures.(14) De plus, les annexines sont localisées dans différents types de
cellules et de tissus. Les annexines portant le code A, comme l’ANXA4, proviennent des
vertébrés.(14) Les annexines sont des protéines qui se lient aux phospholipides chargés

4
négativement de façon calcique dépendante.(16) Elles sont construites de 4 domaines, sauf
l’annexine A6 qui est composée de 8 domaines. Le cœur des annexines en C-terminal est
composés de 4 domaines hautement conservés d’environ 70 acides aminés, mais distinct qui se
répètent.(17) C’est plutôt le N-terminal des annexines qui diffère entre 12 et 169 résidus et qui
leur confère une fonction différente pour chacune.(17) Ce sont également des protéines que l’on
retrouve dans le cytosol. Elles participent à plusieurs fonctions cellulaires comme l’endocytose,
l’exocytose, la configuration de l’actine, le signalement et la réparation de la membrane
plasmique.(18) Ce sont avant tout des récepteurs de calcium qui facilite l’association avec des
granules autant qu’avec la membrane plasmique avant la sécrétion.(14) Presque toutes les
annexines ont la capacité de se lier aux phospholipides chargés négativement de façon calcium
dépendante.(18)
1.3.2 L’Annexine A4
L’ANXA4 se retrouve dans plusieurs processus cellulaires tels que l’agrégation membranaire,
l’exocytose synaptique et la régulation négative de la transcription pour le facteur NF-kB.(18) Elle
est également impliquée dans le transport et l’organisation membranaire.(19) De plus, l’altération
de l’ANXA4 est associée à certains types de cancer et contribuerait à la résistance contre la
chimiothérapie.(18) L’ANXA4 possède une masse moléculaire de 35 kDa.(20)
Structure de l’Annexine A4
L’ANXA4 possède 4 domaines répétés. Chaque domaine à un site de liaison pour le calcium.(16)
Toutes les annexines démontrent une conservation pour le domaine C-terminal.(14) Chaque
monomère lie quatre ions calcium (Figure 11).
Influence des ions calcium
L’ANXA4 est formée de 4 domaines chacun liant le calcium. Cependant, les domaines I et IV
font de fortes interactions avec le calcium, alors que les domaines II et III font des interactions
faibles.(16)
Localisation
L’ANXA4 est localisée dans le cytosol de différentes cellules incluant les cellules épithéliales, les
cellules sécrétoires, dans le foie, le cerveau, le pancréas, l’intestin, la médullosurrénale et le
rein.(16) Elle se retrouve principalement et plus précisément dans la région apicale de la
membrane des cellules épithéliales.(18-20) Une étude démontre que l’ANXA4 est l’annexine la
plus exprimée dans le SEB des photorécepteurs.(8) L’équipe de Kwok à analyser par
spectrométrie de masse et avec l’aide d’une banque de données plusieurs segments d’acide aminé.
14 segments ont permis de déterminer que l’ANXA4 est présent dans le SEB. Elle serait retrouvée
autant dans le segment externe de l’œil, dans la fraction membranaire, dans la fraction soluble et
dans la fraction des disques membranaires. Cependant, elle ne serait pas dans la membrane
plasmique. D’ailleurs, dans la Figure 12, on retrouve la séquence de l’ANXA4 humaine, de la
vache et les 14 segments identifiés par spectrométrie de masse Comme c’est une protéine qui se
déplace, il serait également possible de la retrouver la membrane plasmique.
1.3.3 La liaison membranaire de la protéine
Une étude de l’interaction de l’ANXA4 avec des membranes artificielles composées de
phospholipides a été effectuée par l’équipe de Theresa.(3) Dans cette étude, ils ont étudié la liaison
de l’annexine A4-GFP en l’ajoutant à des liposomes géants, en présence d’ions calcium, composés
de phospholipides. Ils ont comparé la protéine se liant avec un liposome composé uniquement de

5
de DOPC et de liposome composé de 90% de DOPC et 10% de DOPS ou de DOPA. Ils ont analysé
l’intensité de fluorescence de 10 régions différentes des liposomes. Leur analyse montre qu’il y a
une plus forte intensité de fluorescence lorsque l’ANXA4 se lie au liposome avec 10% de DOPA,
suivi du liposome avec 10% DOPS et celui avec 100% de DOPC. L’ANXA4 aurait donc une
préférence pour les phospholipides chargé négativement comme la majorité des annexines.(18).
Il n’y a aucune autre étude d’interactions avec des phospholipides jusqu’à maintenant. Les
interactions fortes de l’ANXA4 se brisent en présence d’une concentration de 200 mM de sodium,
alors que le potassium et le magnésium n’ont pas d’effet sur cette interaction. Les interactions
faibles se brisent à partir de 50 mM de sodium ou de magnésium, et à partir de 100 mM de
potassium.(16)
1.4 – Le complexe protéique
Les protéines S100 et les annexines sont réputées pour former des complexes et travailler en
synergie. Certains complexes permettent de diminuer la concentration calcique nécessaire pour
que les annexines accomplissent leur fonction, ce qui n’est pas le cas de tous les complexes S100-
annexines.(21) D’ailleurs, les acétylations en N-terminal sont essentielles pour les interactions
S100-annexines.(2) De ce fait, les interactions hydrophobiques entre le N-terminal de l’annexine
et la S100 jouent un rôle majeur pour leurs interactions.(2) De plus, pour la plupart des complexes,
la liaison du calcium à la S100 est un prérequis pour faciliter l’interaction protéine-protéine avec
l’annexine.(2) Les protéines S100 peuvent se lier à d’autres molécules ou même d’autres protéines
comme les annexines de façon calcique dépendante ou calcique indépendante.(5) Lorsqu’elle se
lie de façon calcique dépendante, la protéine S100 subit un changement conformationnel qui lui
permet par la suite d’exposer un site plus réceptif pour se lier aux autres molécules. Comme c’est
le cas pour la S100A11 avec l’annexine A1. La majorité des liaisons S100 sont calciques
dépendantes, mais certaines S100 font également des liaisons sans la dépendance au calcium pour
se lier. La majorité de ces liaisons calciques indépendantes se font avec des enzymes.(5) De ce
fait, la protéine S100A10 et l’annexine A2 se lie de façon calcique indépendante. Au contraire, il
existe des liaisons S100-annexines non favorables. Un exemple est celle de l’annexine A6 qui une
fois liée à des phospholipides est par la suite non favorable aux liaisons avec des protéines
S100.(21) Il existe une variété de modes d’interaction entre la famille S100 et la famille des
annexines.(21)
1.4.1 Le complexe S100A16-ANXA4
Une seule étude démontre la présence de la S100A16 et de l’ANXA4 dans le SEB.(8) Le fait qu’il
existe plusieurs complexes S100-annexines, on suppose qu’il serait possible que la S100A16
forme un complexe avec l’ANXA4. Cependant, aucune étude protéine-protéine n’a été faite sur
le complexe. La présence des annexines A2, A5, A6 et A7 dans le SEB, pourrait également être
une possibilité de complexe avec la S100A16. Comme l’explique l’équipe de Rintala, certains
S100 peuvent se lier à plusieurs annexines.(2)

2 - Hypothèse et objectifs spécifiques

L’hypothèse est que les protéine S100A16 et ANXA4 interagissent avec la membrane et
interviennent dans le maintien de l’intégrité membranaire. Pour y parvenir, l’objectif général
consistera à étudier l’interaction membranaire des protéines S100A16, de l’ANXA4 ainsi que de
leur complexe afin de mieux comprendre leurs fonctions dans le maintien de l’intégrité
membranaire. Les objectifs spécifiques seront de i) réaliser le clonage, la surexpression, la

6
purification et vérifier la stabilité des protéines S100A16 et ANXA4, ii) obtenir des informations
sur l’interaction membranaire à l’aide du modèle des monocouches de Langmuir.

3 – Méthodologie
3.1 Objectif I : obtention des protéines S100A16 et ANXA4
3.1.1 Purification des protéines
Concernant la protéine S100A16, la protéine humaine a été fournie en protéine de fusion par le
Dr. Stefan Vetter (North Dakota State University). La protéine de fusion a été clivée et purifiée
tel que décrit dans les sections suivantes.
Protéine de fusion
La séquence de la protéine de fusion est décrite dans la Figure 13. La protéine dans son tampon
est reçue sous forme lyophilisée. Une fois la protéine resolubilisée dans 1 mL d’eau de grade milli-
Q, elle est hydratée et retrouve les concentrations initiales de tampon.
Clivage
Le clivage de la protéine de fusion se fait avec la protéase TEV (27 kDa) qui reconnaît
spécifiquement la séquence de sept acides aminés Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly et coupe entre
Gln-Gly.
Spectrophotométrie
On utilise un spectrophotomètre (BioPhotometer) pour vérifier l’absorbance en protéines à 260 et
280 nm. La formule suivante (22) permet de calculer la concentration en protéines :
[Protéine](mg/mL) = 1.55 A280 – 0.76 A260
Purification
Pour la purification, on a utilisé une colonne de chromatographie His-trap HP. C’est une colonne
préchargée d’un milieu sépharose Ni2+. Elle a donc une affinité pour les histidines, ce qui est idéal
pour purifier une protéine de fusion avec une étiquette histidine.
Électrophorèse
Pour observer la pureté de la protéine, on utilise des gels d’agarose SDS-PAGE 18% en condition
dénaturante. L’appareil utilisé est un Mini-Protean (Bio-Rad Laboratories) et un PowerPac (Bio-
Rad Laboratories).

Concernant l’ANXA4, un plasmide contenant le gène codant pour l’ANXA4 humain sera
commandé (Sino Biological, HG18477-U). La surexpression et la purification de l’ANXA4 seront
réalisées selon un protocole adapté de Butsushita et al.(23) Une limitation serait que le protocole
ne fonctionne pas ou que la protéine ne soit pas assez pure. Nous avons cependant l’expérience
dans le laboratoire pour optimiser les conditions de ces expériences.
3.1.2 Étude de stabilité
Pour l’étude de la stabilité des protéines, l’utilisation d’un spectropolarimètre de dichroïsme
circulaire (CD) permet de voir la structure secondaire de la protéine. Pour la protéine S100A16
des analyses sont actuellement en cours dans plusieurs conditions.
L’analyse par spectrométrie de masse (MS) et l’immunobuvardage de type Western permettront
de confirmer l’identité de la protéine pure obtenue. Une analyse MS a été faite pour la protéine
S100A16 permettant de confirmer que c’est bien la protéine humaine. Une limite pour le CD serait
le tampon utilisé, qui peut causer du bruit de fond ou même créer une saturation. Pour corriger
cette limite, il est possible de diminuer la concentration de la protéine ou d’utiliser des parcours
optiques plus petits. L’immunobuvardage de type Western peut être limité par l’utilisation

7
d’anticorps monoclonaux qui ne seraient pas assez spécifiques. Pour remédier à ce problème, il
serait alors possible de comparer l’efficacité et la spécificité de différents anticorps monoclonaux.

3.2 Objectif II : étude membranaire des protéines S100A16 et ANXA4

Le modèle des monocouches de Langmuir sera utilisé afin d’étudier les interactions des protéines
avec les phospholipides. Ce modèle sera couplé à un tensiomètre de surface pour déterminer les
paramètres de liaison membranaire et à la spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption par
modulation de la polarisation (PM-IRRAS).
3.2.1 Détermination des paramètres de liaison membranaire
Pour les analyses biophysiques, on utilise un tensiomètre de surface et le modèle des monocouches
de Langmuir (Kibron). Une plaque contenant des puits en téflon est utilisée pour mettre le tampon
imitant le cytosol et pour déposer les phospholipides à la surface du tampon. Un trou est présent
devant chaque puits permettant d’insérer une seringue et d’ainsi aller dans la sous-phase du
tampon pour injecter la protéine. L’appareil est également muni de sondes permettant d’observer
la pression de surface en mN/m. Le logiciel DeltaGraph4x est utilisé pour récolter les données
lors des expériences et permet de tracer des graphiques pour voir le changement de pression en
fonction du temps.
Des résultats ont été obtenus pour la protéine S100A16 tel que présentés dans les Figures 9 et 10.
Ces résultats seront détaillés dans la section résultats préliminaires. La méthodologie sera la même
pour l’ANXA4.

Détermination de la concentration saturante de la S100A16

Cette étape permet de connaitre la concentration de protéines qu’il faut utiliser par la suite pour
déterminer la pression d’insertion maximale (PIM) en présence de différents phospholipides. Dans
les puits de la plaque, du tampon est déposé. Une fois que l’appareil obtient une valeur constante
soir le zéro, alors la protéine est injectée en utilisant différentes concentrations de la protéine. Une
fois que la protéine est en équilibre avec le tampon, il forme alors un plateau. Il faut ensuite faire
l’analyse des résultats. Pour calculer la pression d’insertion, la formule suivante est utilisée :
Δπ = πe - πi
Δπ est la différence de pression entre le tampon en équilibre en présence et en absence de la
protéine. La πi est pression de surface initiale du tampon stabilisé sans la protéine. La πe est la
pression de surface à l’équilibre suite à l’injection de la protéine. Les Δπ en fonction de la
concentration injectée sont alors comparés et donnent une tendance de saturation.

Pression d’insertion maximale

Une fois que la concentration saturante est déterminée, il est alors possible de faire l’étude
d’interaction de la protéine en présence de différents phospholipides. D’abord, il faut savoir que
cette expérience permet de déterminer la pression d’insertion maximale (PIM) de la protéine avec
le phospholipide étudié. La pression latérale de la membrane estimée est entre 30-35 mN/m.(24)
De plus, la synergie, qui est un autre paramètre de liaison, peut également être déterminée. Une
synergie positive traduit une affinité entre la protéine et le lipide, alors qu’une synergie négative
indique une répulsion.
Il faut d’abord déposer du tampon dans le puits. Par la suite on dépose le lipide pour obtenir la
pression de surface initiale (πi). Une fois celle-ci stable, on peut injecter la protéine dans la sous-
phase (0,5 µM). Lorsque la protéine et le lipide sont stables, la pression à l’équilibre (πe) peut être
déterminée. En utilisant différentes pressions initiales on peut déterminer différentes différences

8
de pression (Δπ) et tracer la régression linéaire de Δπ en fonction de πi. À l’aide d’un logiciel de
calcul (25) il est alors possible de connaitre la PIM, qui est l’ordonnée à l’origine, et son incertitude
ainsi que la synergie et son incertitude. La limite pour le modèle des monocouches de Langmuir
est qu’il se limite aux monocouches et qu’on ne peut pas observer l’interaction en bicouche qui se
rapprocherait plus d’une vraie membrane. Si les cinétiques des monocouches sont trop lentes, il
est possible de jouer sur les sels contenus dans le tampon pour améliorer les cinétiques.(26)
Le complexe S100A16-AnnexineA4
Suite à l’étude de l’interaction membranaire pour les deux protéines seules, l’étude de liaison
membranaire sera également réalisée avec le complexe en présence de différents phospholipides.
Une étude montre que les annexines liées au ions calcium se lient plus difficilement aux protéines
S100.(21) Cette étude sera donc réalisée en présence et en absence de calcium pour déterminer
son influence sur la liaison membranaire de ces protéines.
Dans le cas où il n’y aurait pas de complexe S100A16-annexineA4, il serait possible de vérifier
l’interaction de la protéine S100A16 avec l’annexine A6 qui est la seconde plus exprimée dans le
SEB. De plus, l’annexine A6 contribue aussi à l’intégrité membranaire avec l’ANXA4.(3) Par la
suite, on peut vérifier les complexes avec les annexines A2, A5 et A7 dont on ne connaît pas le
niveau d’expression dans le SEB.(8)
3.2.2 Méthode de spectroscopie infrarouge
Le PM-IRRAS est une technique de spectroscopie infrarouge réalisée sur une monocouche de
protéines et de lipides, permettant d’observer les bandes amide I et II de la protéine, et d’avoir
ainsi des informations sur sa structure secondaire. Cette technique permet de voir l’influence des
lipides sur la structure secondaire des protéines en interaction avec les monocouches. De plus, le
rapport amide I et II combiné à des spectres théoriques peut donner des informations sur
l’orientation de la protéine dans la monocouche. Cette technique sera utilisée tel que vu dans la
littérature et les données seront comparées avec ceux des spectres de la littérature.(27-29)

4- Résultats préliminaires
Le clivage de la protéine avec la protéase TEV a été réalisé. Comme on peut le voir dans la Figure
14, la protéine de fusion se clive en présence de TEV et le clivage est plus optimum en présence
de β-mercaptoéthanol. La protéine est ensuite purifiée à l’aide d’une colonne His-Trap HP avec
différentes concentrations d’imidazole (Figure 15). La purification avec 20 mM d’imidazole est
optimale pour la protéine. Par la suite, les fractions collectées ont été concentrées. La protéine a
été déposée sur SDS-PAGE et analysée avec le logiciel ImageJ, qui a permis de déterminer une
pureté de plus de 99%. Dans la Figure 16, la pression surface atteint un plateau entre 0,25 µM et
1 µM à une pression de surface de 24 mN/m. La concentration saturante de la protéine S100A16
est donc déterminée à 0,5 µM. Cette concentration est utilisée afin de faire les injections pour
déterminer la PIM et la synergie de la protéine en présence de différents phospholipides. La Figure
17 est un exemple de graphique que l’on observe lors d’une expérience de la protéine S100A16
avec le lipide DSPS en monocouche. Pour analyser cet exemple, il y a une πi de 5,4 mN/m et une
πe de 29,3 mN/m. Le Δπ calculé est donc de 23,9 mN/m. Par la suite, on peut tracer une droite de
régression des Δπ en fonction des πi, à partir de laquelle les paramètres de liaisons de la S100A16
peuvent être déterminés (Figure 18). L’ordonnée à l’origine donne la valeur de la PIM, alors que
la valeur de la pente plus 1 donne la valeur de la synergie. Les Figures 9 et 10 montrent les résultats
de la PIM et de la synergie de la protéine en présence de phospholipides. Les DP et les DS sont
les lipides saturés avec une chaîne de 16 et 18 carbones respectivement. Les DO et les DD sont

9
des lipides insaturés d’une longueur de 18 et 22 carbones et possédant 1 et 6 insaturations
respectivement. On observe une forte corrélation entre les PIM et la synergie. Pour les
phospholipides saturés, la protéine semble avoir une préférence pour les chaînes plus courtes et
surtout pour les têtes polaires neutres (PC et PE). En présence de lipide insaturé, la protéine semble
indifférente de la charge de la tête polaire. Cependant, la protéine a moins d’affinité pour les DD
que pour les DO. C’est surement dû au plus grand nombre d’insaturations, mais les DD sont
également plus longs que les DO. Comme la valeur d’insertion latérale biologique est de 30-35
mN/m, il serait possible que physiologiquement la S100A16 s’insère avec le DPPC et PE, le DSPC
et PE et le DOPE et PS. L’étude avec les DM (chaîne de 14 carbones) est actuellement en cours.

5 - Pertinence du travail et conclusion

Aucune information n’est connue sur le complexe protéique S100A16-AnnexineA4. De plus, il
n’y a pas de littérature sur l’interaction protéine-membrane pour les deux protéines ainsi que le
complexe. Ce travail est ainsi pertinent pour démontrer fondamentalement l’interaction entre ces
deux protéines et la membrane ainsi que de mieux comprendre le complexe et voir son rôle dans
le maintien de l’intégrité membranaire. Les résultats préliminaires démontrent la faisabilité du
projet. En perspective, si les protéines pures sont obtenues et qu’il est possible d’observer
l’interaction membranaire avec un modèle de monocouche, il sera alors intéressant d’obtenir des
informations sur les protéines en présence de modèle en bicouche ou avec des liposomes. Ces
informations permettraient d’avoir une meilleure compréhension avec des modèles similaires à
ceux physiologiques.

6 – Échéancier

Étapes/session E18 A18 H19 E19 A19 H20

Étude de stabilité de la S100A16
Monocouche S100A16 avec et sans ions Ca2+
Monocouche S100A16 avec cholestérol
Surexpression et purification Annexine A4
Étude de stabilité de l'annexine A4
Monocouche annexine A4 avec et sans Ca2+
Monocouche annexine A4 avec cholestérol
Étude complexe S100A16-annexine A4
Rédaction et publication sur S100A16
Rédaction et publication sur annexine A4
Rédaction et publication sur le complexe S100A16-annexine A4
Séminaire Maitrise
Rédaction du mémoire de Maitrise
Autre modele membranaire (Bicouche et caractérisation)
Cours 1 BIF-7001 Détermination de la structure des protéines
Cours 2 BMO-7042 Biologie cellulaire et moléculaire de la vision
Cours 3 MMO-7019 Technique courante en médecine moléculaire

10
7 - Annexe
7.1 Figures

Figure 1 : Schéma d'une membrane. (30)

Figure 2 : Schéma des fonctions intracellulaires et extracellulaires des protéines S100 dans le
maintien de l’intégrité membranaire. Fonctions intracellulaires : rôle comme régulateur du
calcium (1), fonction dans la régulation transcriptionnelle et la réparation d’ADN (2), dans le
transport et le recrutement de protéines membranaires (3) et dans l’assemblage du cytosquelette
(4). Fonctions extracellulaires : Sécrétion extracellulaire passive en cas de dommage ou active
après une activation cellulaire (5), interagissent avec des récepteurs tel que RAGE et TLR4 (6),
dans la migration, la prolifération et la différenciation cellulaire (7), dans la chimiotaxie et le
remodelage tissulaire (8) et dans la prévention de stress oxydatif (9).

11
Figure 3 : Présentation de la structure du bâtonnet et du cône.(28)

12
Figure 4 : Diagramme des étapes de purifications du segment externe des bâtonnet chez la
vache. (9)

13
Figure 5 : Structure de la S100A16-Apo homodimérique (2L50 PDB)(15)

Figure 6 : Structure de la S100A16 homodimérique liée à des ions calciums (2L51 PDB)(15)

14
Figure 7 : Présentation d’une partie du segment externe du bâtonnet. Visualisation plus proche
des disques du bâtonnet de la membrane plasmique entourant les disques. (29)
Séquence Q96FQ6 :

10 20 30 40 50
MSDCYTELEK AVIVLVENFY KYVSKYSLVK NKISKSSFRE MLQKELNHML
60 70 80 90 100
SDTGNRKAAD KLIQNLDANH DGRISFDEYW TLIGGITGPI AKLIHEQEQQ

SSS

A
Q0VCM0-1

10 20 30 40 50
MADSYTELEK AVVVLVENFY KYVSKHSLVK NKISKSSFRK MLQKELNHML
60 70 80 90 100
TDTGNRKAAD KLIQNLDANH DGRISFDEYW TLIGGITSPI ANLIRQQEQQ

SSS

B
Figure 8 : Séquence de 103 acides aminés de la protéine S100A16 humaine pour la figure A et
de la vache pour la figure B. Les parties surlignées en jaune sont les parties reconnues par
spectrométrie de masse Les acides aminés en vert sont ceux qui diffèrent de l’humain et la vache

15
Figure 9 : Graphique de l’interaction membranaire entre la protéine S100A16 et différents
phospholipides (projet en cours Noël.F).

Figure 10 : Graphique de la synergie entre la protéine S100A16 et différents phospholipides

(Projet en cours Noël.F).

16
Figure 11 : Structure de l’Annexine A4 se liant à 4 ions Ca2+ par monomère (2ZOC PDB). (24)

P09525-1 (Humain)

10 20 30 40 50
MATKGGTVKA ASGFNAMEDA QTLRKAMKGL GTDEDAIISV LAYRNTAQRQ
60 70 80 90 100
EIRTAYKSTI GRDLIDDLKS ELSGNFEQVI VGMMTPTVLY DVQELRRAMK
110 120 130 140 150
GAGTDEGCLI EILASRTPEE IRRISQTYQQ QYGRSLEDDI RSDTSFMFQR
160 170 180 190 200
VLVSLSAGGR DEGNYLDDAL VRQDAQDLYE AGEKKWGTDE VKFLTVLCSR
210 220 230 240 250
NRNHLLHVFD EYKRISQKDI EQSIKSETSG SFEDALLAIV KCMRNKSAYF
260 270 280 290 300
AEKLYKSMKG LGTDDNTLIR VMVSRAEIDM LDIRAHFKRL YGKSLYSFIK
310
GDTSGDYRKV LLVLCGGDD

17
P13214-1 (VACHE)

10 20 30 40 50
MAAKGGTVKA ASGFNAAEDA QTLRKAMKGL GTDEDAIINV LAYRSTAQRQ
60 70 80 90 100
EIRTAYKTTI GRDLMDDLKS ELSGNFEQVI LGMMTPTVLY DVQELRKAMK
110 120 130 140 150
GAGTDEGCLI EILASRTPEE IRRINQTYQL QYGRSLEDDI RSDTSFMFQR
160 170 180 190 200
VLVSLSAGGR DESNYLDDAL MRQDAQDLYE AGEKKWGTDE VKFLTVLCSR
210 220 230 240 250
NRNHLLHVFD EYKRIAQKDI EQSIKSETSG SFEDALLAIV KCMRNKSAYF
260 270 280 290 300
AERLYKSMKG LGTDDDTLIR VMVSRAEIDM LDIRANFKRL YGKSLYSFIK
310
GDTSGDYRKV LLILCGGDD

SLEDDIRSDTSFMFQR
AEIDMLDIR
INQTYQLQYGR
GAGTDEGCLIEILASR
VLVSLSAGGR
AASGFNAAEDAQTLRK
IAQKDIEQSIK
VLLILCGGDD
GLGTDEDAIINVLAYR
GLGTDDDTLIR
SETSGSFEDALLAIVK
AASGFNAAEDAQTLR
FLTVLCSR
SDTSFMFQR
C
Figure 12 : Séquences de 319 acides aminés de l’annexine A4 humaine (A) et de la vache (B).
Les 14 segments identifiés par spectrométrie de masse chez la vache (C). Les segments d’acides
aminés retrouvés intégralement sont surlignés en jaune ou en vert (pour différencier deux
séquences collés) en A et B. Les séquences surlignées en rouge dans la figure C sont des séquences
similaires chez l’humain, mais pas identique de ceux de la vache.

18
His6 – GST – TEV – AIA(espaceur) – S100A16

MHHHHHHAGMSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFEL
GLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVS
RIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLY
MDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDIIPT
TENLYFQGAIAMSDCYTELEKAVIVLVENFYKYVSKYSLVKNKISKSSFREMLQKELNH
MLSDTGNRKAADKLIQNLDANHDGRISFDEYWTLIGGITGPIAKLIHEQEQQSSS

Figure 13 : Séquence de la protéine de fusion : étiquette de six histidines (rouge), étiquette

Gluthation S-transférase (GST) (turquoise), acides aminés reconnue par la protéase TEV pour le
clivage (jaune), espaceur de trois acides aminés (vert), protéine S100A16.

Figure 14 : Analyse de différentes conditions de clivage de la protéine de fusion par

électrophorèse sur gel SDS-PAGE 18% en condition dénaturante. Puits 1, Marqueur SeeBlue
Pre-stained Standard (Novex) ; Puits 2, Protéine de fusion avec TEV ; Puits 3, protéine de fusion
; Puits 4, protéine de fusion avec TEV et 5 mM mercaptoéthanol ; Puits 5, culot resolubilisé de la
protéine de fusion.

19
Figure 15 : Analyse des fractions de la purification de la protéine de fusion S100A16 par
électrophorèse sur gel SDS-PAGE 18% en condition dénaturante. Puits 1, Marqueur SeeBlue
Pre-Stained Standard (Novex) ; Puits 2, protéine de fusion clivée avec TEV et mercaptoéthanol
avant la purification ; Puits 3, fraction de la purification sans imidazole ; Puits 4 à 10, fractions 2
à 8 respectivement avec 20 mM d’imidazole ; Puits 11, fraction purifiée avec 40 mM d’imidazole
; Puits 12 à 15, fractions 1 à 4 respectivement d’élution avec 500 mM d’imidazole.

Concentration saturante de la protéine S100A16 avec

agitation
30

25

20
Δπ (mN/m)

15

10

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Concentration (µM)

Figure 16 : Graphique de la différence de pression en fonction de la concentration. Chaque

point correspond à une concentration (µM) en fonction de la différence de pression de surface
(mN/m). L’alignement de tous les points tend vers un plateau qui correspond à la pression
maximale de la protéine et permet de déterminer la concentration minimum requise.

20
Figure 17 : Graphique de pression (mN/m) en fonction du temps (s) de la protéine S100A16 se
liant au lipide DSPS. Le premier plateau autour de 0 mN/m correspond au tampon stabilisé. Par
la suite il y a un pic qui correspond au dépôt du phospholipide DSPS. Le deuxième plateau
correspond au lipide qui est stable à 5,4 mN/m. Il y a ensuite l’injection de la protéine S100A16
qui se termine par un plateau autour de 29,3 mN/m.

Figure 18 : Graphique de la pression initiale en fonction de la pression de surface.

21
7.2 Tableau

Tableau 1 : Composition des lipides des SEB chez les humains(6)

Types de lipide %
PC 32,5
PE 37,6
PS 12,1
Cholestérol 9,9
Autres 7,9

Tableau 2 : Composition lipidique du segment externe des bâtonnets de l’œil.

PE PC PS
14;0 0,1 0,8 0,5
15;0 0 0 0,1
16;0 10,1 32,5 2,6
16;1ω7 1 3,9 0,5
17;0 0 0 0
18;0 36,7 16,9 28,2
18;1ω9 6,2 14,9 5,9
18;2ω6 0,3 1,1 0,4
18;3ω3 0 0 0
18;4 0 0 0
20;0 0,8 0,9 1,2
20;1ω9 0,6 0,6 1,2
20;2ω6 0 0 0,1
20;3ω9 1,3 1,2 0,8
20;4ω6 3,5 4,7 1,6
20;4ω3 0 0 0
20;5ω3 0 0 0
22;3 0 0 0
22;4ω6 1,2 0,4 6,8
22;5ω6 2 0,9 2,2
22;5ω3 0,8 0,6 2,7
22;6ω3 34,2 19,5 34,1
24;4 0,1 0 10,1
Total 98,9 98,9 99

22
8 - Références

1. Orlov SN, Aksentsev SL, Kotelevtsev SV. 2005. Extracellular calcium is required for the
maintenance of plasma membrane integrity in nucleated cells. Cell calcium 38:53-7.
2. Rintala-Dempsey AC, Rezvanpour A, Shaw GS. 2008. S100-annexin complexes--
structural insights. The FEBS journal 275:4956-66.
3. Boye TL, Maeda K, Pezeshkian W, Sonder SL, Haeger SC, Gerke V, Simonsen AC,
Nylandsted J. 2017. Annexin A4 and A6 induce membrane curvature and constriction
during cell membrane repair. Nature Communications 8:11.
4. Bertheloot D, Latz E. 2017. HMGB1, IL-1 alpha, IL-33 and S100 proteins: dual-function
alarmins. Cellular & Molecular Immunology 14:43-64.
5. Santamaria-Kisiel L, Rintala-Dempsey AC, Shaw GS. 2006. Calcium-dependent and -
independent interactions of the S100 protein family. Biochemical Journal 396:201-214.
6. Fliesler SJ, Anderson RE. 1983. CHEMISTRY AND METABOLISM OF LIPIDS IN
THE VERTEBRATE RETINA. Progress in Lipid Research 22:79-131.
7. Albert AD, Boesze-Battaglia K. 2005. The role of cholesterol in rod outer segment
membranes. Progress in Lipid Research 44:99-124.
8. Kwok MCM, Holopainen JM, Molday LL, Foster LJ, Molday RS. 2008. Proteomics of
photoreceptor outer segments identifies a subset of SNARE and Rab proteins implicated
in membrane vesicle trafficking and fusion. Molecular & cellular proteomics : MCP
7:1053-66.
9. Sapkota D, Costea DE, Ibrahim SO, Johannessen AC, Bruland O. 2013. S100A14
Interacts with S100A16 and Regulates Its Expression in Human Cancer Cells. Plos One
8:10.
10. Zhu WD, Xue Y, Liang C, Zhang RH, Zhang ZH, Li HY, Su DM, Liang XB, Zhang YY,
Huang Q, Liu ML, Li L, Li D, Zhao A, Liu Y. 2016. S100A16 promotes cell
proliferation and metastasis via AKT and ERK cell signaling pathways in human
prostate cancer. Tumor Biology 37:12241-12250.
11. Heinick A, Husser X, Himmler K, Kirchhefer U, Nunes F, Schulte JS, Seidl MD, Rolfes
C, Dedman JR, Kaetzel MA, Gerke V, Schmitz W, Muller FU. 2015. Annexin A4 is a
novel direct regulator of adenylyl cyclase type 5. Faseb Journal 29:3773-3787.
12. Sedaghat F, Notopoulos A. 2008. S100 protein family and its application in clinical
practice. Hippokratia 12:198-204.
13. Sturchler E, Cox JA, Durussel I, Weibel M, Heizmann CW. 2006. S100A16, a novel
calcium-binding protein of the EF-hand superfamily. Journal of Biological Chemistry
281:38905-38917.
14. Mirsaeidi M, Gidfar S, Vu A, Schraufnagel D. 2016. Annexins family: insights into their
functions and potential role in pathogenesis of sarcoidosis. Journal of Translational
Medicine 14:9.
15. Babini E, Bertini I, Borsi V, Calderone V, Hu XY, Luchinat C, Parigi G. 2011.
Structural characterization of human S100A16, a low-affinity calcium binder. Journal of
Biological Inorganic Chemistry 16:243-256.
16. Arii Y, Butsusihta K, Fukuoka S-I. 2015. Role of calcium-binding sites in calcium-
dependent membrane association of annexin A4. Bioscience, biotechnology, and
biochemistry 79:978-85.

23
17. Liemann S. 1995. ANNEXINS - A NOVEL FAMILY OF CALCIUM-BINDING AND
MEMBRANE-BINDING PROTEINS IN SEARCH OF A FUNCTION. Structure 3:233-
237.
18. Crosby KC, Postma M, Hink MA, Zeelenberg CHC, Adjobo-Hermans MJW, Gadella
TWJ. 2013. Quantitative Analysis of Self-Association and Mobility of Annexin A4 at the
Plasma Membrane. Biophysical Journal 104:1875-1885.
19. Hill WG, Kaetzel MA, Kishore BK, Dedman JR, Zeidel ML. 2003. Annexin A4 reduces
water and proton permeability of model membranes but does not alter aquaporin 2-
mediated water transport in isolated endosomes. Journal of General Physiology 121:413-
425.
20. Kaetzel MA, Mo YD, Mealy TR, Campos B, Bergsma-Schutter W, Brisson A, Dedman
JR, Seaton BA. 2001. Phosphorylation mutants elucidate the mechanism of annexin IV-
mediated membrane aggregation. Biochemistry 40:4192-4199.
21. Garbuglia M, Verzini M, Hofmann A, Huber R, Donato R. 2000. S100A1 and S100B
interactions with annexins. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research
1498:192-206.
22. Stoscheck CM. 1990. Quantitation of protein. Methods in Enzymology 182:50-68.
23. Butsushita K, Fukuoka SI, Ida K, Arii Y. 2009. Crystal Structures of Sodium-Bound
Annexin A4. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 73:2274-2280.
24. Marsh D. 1996. Lateral pressure in membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Reviews
on Biomembranes 1286:183-223.
25. Boisselier E, Salesse C. 2012.
http://www.crchudequebec.ulaval.ca/BindingParametersCalculator/. Accessed
26. Boisselier E, Demers E, Cantin L, Salesse C. 2017. How to gather useful and valuable
information from protein binding measurements using Langmuir lipid monolayers.
Advances in colloid and interface science 243:60-76.
27. Barth A, Zscherp C. 2002. What vibrations tell us about proteins. Quarterly Reviews of
Biophysics 35:369-430.
28. Mendelsohn R, Mao GR, Flach CR. 2010. Infrared reflection-absorption spectroscopy:
Principles and applications to lipid-protein interaction in Langmuir films. Biochimica Et
Biophysica Acta-Biomembranes 1798:788-800.
29. Ludlam CFC, Arkin IT, Liu XM, Rothman MS, Rath P, Aimoto S, Smith SO, Engelman
DM, Rothschild KJ. 1996. Fourier transform infrared spectroscopy and site-directed
isotope labeling as a probe of local secondary structure in the transmembrane domain of
phospholamban. Biophysical Journal 70:1728-1736.
30. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Morgan D, Raff M, Roberts K, Walter P (ed). 2015.
Molecular Biology of the Cell. Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC, an
informa business, New York, US.

24