COURS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ISFA Félix NIMBONA, DVM, MSC+ Objectifs d’apprentissage Ala in de ce cours I’étudiant sera capable de : Détaller la constitution de la molécule c'ADN ou ARN ainsi que les dférents types de Talsons chimiques impliquées Expliquer le processus de biosynthase des macromolécules Distinguer la ditférence entre les étapes de transcription ot de traduction chez les eucaryotes et chez les procaryotes Pouvoir identifier et quantifier les organ'smes ou microorganismes par les methodes danalyse moléculaire (PCR, RT-PCR, gPCR, gRT-PCR} + Plan du Cours Rappel sur a structure cellulaire Structure des acides nucléiques & relations structure / fonction Biosynthése des macromoléoules (processus de transcription, traduction, replication et réparation du materiel génétique) - Méthodes d’analyse du matériel génétique au laboratoire |-GENERALITES Rappel sur le niveau d'organisation des tres vivants et leurs diversités : Un élre vivant est un systéme organisé de matiére et d' gle gouverné par une information génétique (cugénome) permettant le développement de caractéristiques propre a la vie Capacité d'auto-organisation en puisant les ressources extérieures. Cette capacité est basée sur un ensemble de réaction chimique (appelé métabolisme) catalysée par des protéines (appelées enzymes) Capagité de reproduction assurant la transmission du matériel génétique, Cette transmission peut se faire a lidentique ou impliquer des processus assurant |'évolution du matériel génetique. Capacité (variable celons les &tres vivants) d'adaptation 4 environnement dans une gamme restreinte par les capacités du materiel génétique.rt par la molécule Le génome est le materiel génétique transmis de génération en génération et porté par la mol6cu GADN. C'est done le matériel héréditaire des organismes vivants : 'ADN posséde donc des proprictes permet aussi de Qui assurent sa transmission au cours des générations cellulaires. Sa structure lui Contenit des informations (appelés gdnes) permetiant Ie fonctionnement de Forganisme vivant transmission et expression du patiimoine génétque, mise on place de organisation cellulaire adaptation au milieu Les organismes des étres vivants ont une organisation générale complexe allant d'une forme de vie Monocellulaire 4 une forme pluricellulaite pour about |'élaboration dorganismes constitués de it en communication millions de cellules organisées en differents organes bien aistincts, mais Permanente entre eux. nis niveaux d’organisation : Le corps des organismes évolués résulte de l'intégration de di 1, Niveau chimique : encore dit niveau primaire, c'est a ce niveau que les aiomes qui sont les plus petites unités de la matitre qui présentent des propriétés d'un élément. lls se combinent par des liaisons covalentes pour former des molécules tel que l'oxygéne moléculaire (02), le glucose (C6H1206), ou du méthane (CHA). Les propridtts des différents produits chimiques ont une influence majeure sur la physiologie. Par exemple, & un faible pH, un produit chimique peut ne pas étre ionisé et peut donc traverser une membrane cellulaire alors quau-dala dlun certain pH, la méme molécule peut devenir ionisé et donc incapables de traverser une bicouche lipidique. 2 Niveau cellulaire. Commo la plus petite unite do vie, les cellules ont diférentes tailles, formes et propriétés leur permettent cetfectuer des fonctons spéciaisées, Certaines cellules ont des oils qui leur permettent de déplacer des materiaux a travers leurs surfaces (@ savoir, le tapissement épithslial des bronchioles ou les cellules qui tapissent oviducie), tandis que d'autres cellules sont aptes a stocker les lipides, produire du collagéne, ou d'une contraction lorsqu'elles sont stimulées. 3 Le niveau des tissus. Un tissu est un groupe de cellules ayant une structure et une fonction communes. Les quatre types de tissus comprennent les muscles, les épithéliums, tissus nerveux et tissu conjonctif. 5.4 Le " niveau d'organes. Deux ou plusieurs tissus travaillant ensemble pour une fonction donnée forment un org: ane. Tous les quatre types de tissus se combinent pour former le plus grand organe du con pert eesiait PS quest la peau, ou la cochlée de loreille, la plus petite un organe du corps: * niveau du systéme d'organes. Les organes peuvent travaller ensemble pour une fonction pour commune. Par exemple, le canal digestif fonctionne avec le foie, la vésicule bliaire, et le panoré former une partie du systéme digestit. Le pancréas fonctionne également dans le cadre du syst8me endocrinien & cause des ilots pancréatiques qui produisent de Finsuline et le glucagon. Les systémes GTorganes incluent le tegument, les systémes squeletique, musculaire, nerveux, endoorinien, esplratoire, digestif, ymphatiqua, urinaites et de reproduction, 5 Niveau organismal. Le niveau organismal, ou animal entier, comprend fous les organes et systémes gui travaillent ensemble pour mainteni !homéostasie. Classification : Les données biologiques et moléculaires récentes conduisent actuellement a divi monde du vivant en trois grands groupes : - Les Bactéries caractérisées par 'absence de noyeu - Les Archées de formes analogues a celles des bacteries. - Les Eucaryotes qui regroupent tous les organismes vivants formés d'une ou plusieurs cellules de type animal, végétal ou champignon, Les Bactéries Les bactéties ont des dimensions de ordre de 1 & 3 microns, et, lexception des mycoplasmes, elas possédent une paro rigid qu défint our forme. Elles présentent en général un ou plusieurs flageles et des cils, Les cellules bactériannes n/ont pas de nayaux figurés mais possédent un grand ADN circulaire qui porte l'essentiel de information génétique et de petits ADN circulaires complémentaires (piasmides) facilement échangeables entre individus ou intégrables dans le genome, Elles renferment des ribosomes contenant en particulier un ARN 16S (Svedberg) trés_utilisé dans les caractérisations phylogénetiques. (Les ribosome: partir de [information apportée par les Al rmultiolient en trés grand nombre par scissiparité. Elles peuvent aussi varier car leur génome mute tres (ex :systéme SOS qui déclenche un aux de mutation acoélré en cas de stress subi) et is mécanismes pour transférer facilement des genes entre espdces différentes 15 sant des organites cellulaires qui servent a fabriquer des protéines 4 (RN messagers). En conditions favorables, les bactéries se facilement posséde plusiet (transfert latéral de genes). Dans les années 1960, on ne connaissait que quelques milliers d’espécesbatterie de milieux sélectifs de bactéries identifiées grace leurs formes et @ leurs reactions sur lors de ley »s nouvalles techniques mokéculaires (métagénomique, sequengag? mise en culture , espe cultivable ARN 168) montrent que des centaines de miller, et peut-tre des milons, dlespeces non cual dans la nature. par les techniques conventionnelles existen' Les Archées Les Archaea ou archéobactéries ou archées ont été décttes par Carl WOESE et George FOX en 1977. Comme les bactéres, les Archaea ont des formes sans noyau figuré. Elles présentent des genes et des structures de génome différents des bactéries qui conduisent a les considerer comme un regne a part entire, Elles se muliplient par scissipanté et renferment des ribosomes de type bacterien. Leur génome peut contenir des portions proches du génome des bactéries et autres proches des eucaryotes. Elles peuvent présenler des criginalités métaboiques : croissance & plus de 100°C, méthanogenése... Le tégne ne comprend actuelle ment que quatre phylums : Crenarchaeota, Euryarchaeota, Korarchaeota, Nanoarchaeota recenses dans le « BERGEY's Manual », Les Archaea, dlorigine trés ancienne mais de découverte recente, colonisent le plus souvent des milieux extremes (sources chaudes, geysers, fureurs sous-marins, écoulements toxiques de mines et de zones industrielles, etc.) mais elles sont aussi présentes dans des sols classiques. Les Eucaryotes Les eucaryotes regroupent les organismes vivants constiués dune ou de plusieurs cellules possédant en particulier un noyau limité par une membrane ponctuée. Les chromosomes sont constitués par 'ADN enroulé autour de protéines (histones). La division de la cellule se fait par un mécanisme équationnel (mitose) ou réductionnel (méiase) permettant la formation de gametes et une reproduction sexuée qui peut assurer une cartaine diversification. Le cyloplasme contient des ribosomes responsables de la fabrication des protéines codées par le génome nucléaire. Le séquengage dun ARN ribosomal 18S est tres utilisé pour la différenciation des espéces, Le cytoplasme contient aussi des organites (mitochondries et chloroplastes) qui sont des vestiges de bactéries absorbées par la cellule au cours de Vévolution. Ces organites renferment encore un peu d'ADN et des ribosomes de type bactérien. Les mitochondries assurent lalimentation en energie de \a cellule (cycle de Krebs) et, chez les algues et les cellules végétales, les chloroplastes sont le lieu de la photosynthase, La classification phylogénétique réunit chez les eucaryotes la majorité des étres vivants repertoriés : protozoaires, champignons, algues, planes, arthropodes, vertébrés,‘ar exemple, ont seulement inactives (non allatante glande mammaire) ou au repos Iymphooytes, Pi ‘quelques-unes, v RIBOSOMES jasse d/ARN appelé sont composées des protsines et une Ges petits organites de coloration for ies basée sur la taille de 18 ARN ribosomal, Chacun des ribosomes comporte deux sous-unites identifi at 28¢ ARN. Los rbosomes peuvant epparaitre comme des structures incividuellement lib le long des bouclas en spirale GARNm appelés polyribosomes. res dans le cytaplasme ou parfois dispos Altoralivement, en portiouler dans les cellules qui assurent la synthdse do quantites abondantes de tSine pour la séerétion, les ribosomes sont souvent associées 4 des membranes pour créer réticulum endoplasmique rugueux (RER). Comme i sera discute, les rfoosomes sont les sites de synthése des protéines. En raison de la relation entre ER el l'appareil de Golgi (Fig. 2.10), des ribosomes du RER permettent aux protéines nouvellement fabriquées d’étre emballés dans des vésicules de sécrétion pour la sdcrétion a partir de Ia cellule, Rivosomes libres dans ceuvrent dans le cytoplasme pour synthétisor des protéines dastinées & agir au sein de la cellule, VLE RETICULUM ENDOPLASMIQUE ET L'APPAREIL DE GOLGI Le reticulum endoplasmique [RE) est un réseau interconnecté dans le cytoplasme de la callule, C’est un ssystéme qui interconnects les tubes a membranes ou feuilles qui enferment des espaces remplis de liquide et apparat sous deux variantes ER lisse ou rugueuse. La synthése des protéines dépend de trois formes d'ARN : (1) 'ARN de transfert (ARN), (2) un ARN nbosomal (ARN‘), et (3) ARN (ARNm) messager. Lorsque d/ARNm mature dans le oytoplasme, il se le a une petite sous-unité ibosomique par apoarement de bases & TARNT. L'ARNE Transfere les atides aminé aux rbosomes, v LES LYSOSOMES ET LES PEROXYSOMES. Les peroxysomes sont des vésicules Inracelulaires contenant un mélange d'eneymes, & savoir les onrdases et catalases. Les 8Oxydases dependent de la présence doxygéne pour détoxifer diverses Substances nocives, par exemple, des alcools et des aldehydes. lls convertissent également les os - ‘oxiques en peroxyde dhycrogéne par la catalase par neutralisation, Les aaa libres pel S ae Connues qui modifent la structure et ia fonction dune variété de de YSones sont essentiels pour imiter faccumulation de radicaux libres,18 nes reconnus pour leur Peroxysomes sont abondants dans les cellules hépatiques et rénales, deux organes p ‘acité détoxifier les substances nuisibles. Lysosomes contiennent également des enzymes capacité a détoxifier le ances nuisibles. Lysosomes contiennent égalemen! yl hydroly st a igérer de nombreuses protéines cellulaires. Connu comme sacs ot ydrolytiques qui sont le de digér i protéines cellulai 1 i fait s suicide, une diffusion inappropriée du contenu de ces organites pourrait détruire la cellule. En idee impliqué ins as| mort la rupture des lysosomes actifs est considérée comme impliqué dans certains aspects de la cellulaire programmée ou l'apoptose. Lysosomes sont presents dans tous les types cellulaires, mais ils sont particuliérement abondants dans les neutrophiles, les macrophages et d'autres globules blancs. v MICROFILAMENTS, MICROTUBULES ET INTERMEDIAIRE FILAMENTS \l.a €té longtemps supposé que le cytoplasme de la cellule était essentiellement un espace rempli d'eau avec de multiples substances dissoutes. Toutefois, la fixation appropriée et les techniques Genfoulssement dans du paraffine pour les microscopes électroniques @ conduit A la constatation que le cytoplasme contient un tableau de structures élaborées qui composent le eytosquelette de la cellule. Cela ne signfie pas que les cellules sont rigide, mais les microtubules, microfilaments, et filaments Interméciake cu cytosquelette fournissent uno structure et lorganisation particulére au cytoplasme cellulaire, Certains de ces organites servent pour la communication entre la surface de la cellule et lintérieur, pour le transport des vésicules destinées a étte sécretées. pour la division cellulaire, ou adhésion cellulaire. Les microtubules sont les plus latges de ces organites et comme son nom Tindique sont des tubes creuses composes des Sous-unités de la protéine globulaire a et & tubuline. y CENTRIOLES Ces structures sont compasées de microtubules disposées en court-oylindras, IIs apparaissent comme v STRUCTURE NUCLEAIRE SsieS:¥ Ledéroulement de fa mitoso La mitose se déroule en quatre étepes caractatisliques qui sont la prophase, la mélaphase, Tenaphaso ot la télophase, La mitose dure entre 1 et houres Prophase: dure 20 & 30 minutes, et est caractérisée par: > La condensation de la chromatine en structures 1rés ordonnées et individualisées appelees chromosomes, suite & un enroulement accru de la fibre chromatinienne qui semble se “condenser” > Le deuxieme organite important de la prophase est le centrosome, composé initialement de deux contriofas. Comme pour les chromosomes, le centrosome s'est dupliqué avant le debut de la prophase, durant la phase S (en 4 centrioles), Les 4 centrioles se séparent durant la prophase, formant deux centrosomes qui migrent chacun vers un pole de fa cellule > Le nuclécle diminue de tale et disparait. > Le cytosquelette de microtubules se réorganise pour former le fuseau mitotique, structure bipolaire qui s'élend entre les deux centrosomes. * Dispanition de lenveloppe nucléaire, Promstaphase: Certains auteurs considérent la prométaphase comme une partie de la prophase, plutdt que comme une phase distincte. Elle dure 6 10 minutes. > Débute par I rupture de Venveloppe nucléaire, qui se disperse sous forme de vésicules dans le oytoplasme. Cette rupture est lié2 a une dispartion du réseau de lamines nucleaires. > Des complexes protéiques spécialisés : les kinétochores, se forment au niveau des centromeres. Le fuseau mitotique entre en contact avec les chromosomes, qui se fixent sur les microtubules par lintermédiaire du kinétochore (deux kinétochores par chromosomes donc un par chromatide), Ces microtubules sont appelés : microtubules Kinétochoriens, > Les microtubules du fuseau qui ne sont pas en contact avec les chromosomes sont appelés microtubules polaires : > Les microtubules qui ne font pas partie du fuseau forment ''Aster, sont les microtubules astrauxLa Métaphase : cure 20 a 30 minutes, caraclérisée par. -Un rassemblement de tous les lule) fixes par leurs chromosomes sur la plaque équatoriale (partie moyenne de la cell Kinetochores, a distance égale des deux pOles, -Condensation maximale des chromosomes. Le chromosome metaphasique: est au maximum de sa condensation, et est conslitue de deux chromatides reliés par un centromére. = Anaphase : dure 5 8 minutes, Clivage du centromere, les chromatides deviennent Indépendants. Raccourcissament des microtubules kinétochoriens, et ascension polaire des chromatides qui deviennent ces chromosomes indépendants, partagés en deux lots identiques dans chaque pole. Elongation des microtubules polaires entrainant un allongement de la calle - elophase: Dure 20 minutes, +” Artét de migration des chromosomes regroupés en éventail aux péles cellulaires. Les chromatides commencent 4 se décondenser. ¥ Reconstitution de lenveloppe nuciéaire, et réapparition du nuciéole, Cycle | celttiaire Mitose Division coliuiaira Croissance et preparation de, a mitose Réplication ‘de TADN.Il, BIOLOGIE MOLECULAIRE W.4 . Introduction La biologle moléculaire est une discipline scientifique au croisement de Ja génétique, de la biochimie et de la physique dont fobjet est la comprehension des mécanismes Ce fonctionnement de la cellule au riveau moléculaire qui permettentla conservation et la perpétuation de la structure vivante au niveeu du genotype. Le terme Bio mol uiilisé pour la premiére fois en 1938 par Warren Weaver, designe également ensemble des techniques de manipulation d'acides nucliques (ADN, ARN), eppelée aussi techniques de gérie génétique, Pour cala, les techniques détude et de modification des gbnes et de leur expressian font patie intécrante de la biologie moléculaire. La biologie moiéculare est une discipline scientifque qui décit la maniére dont information génétique est conservée, transmise et exprimee, Le ique est un censemble do techniques permettant didentifier et disoler, de modifier et de génie gén transférer de facon controlée cu matériel génétiquen. | s'agit donc dun outil aux applications extrémement variges et qui permet en particulier c'intervenir avec précision sur le patrimoine génétique des étres vivants, Pratiquement, cette méthodologie permet didentifier un gene specifique parmi les rombreux genes d'un organisme. Dabord ampliié afin quil sot plus facile daccés, le géne peut ensuite tre découpé et isolé des autres molécules d'ADN. li peut enfin étre réinséré dans une molecule d'ADN lorigine différente, permettant ainsi de transferer de l'information génétique d'une cellule vers une autre. Le resultat obtenu est un ADN recombiné. Le génie génétique permet également d'apporter des modifications a des genes (mutagenése dirigée) qui, par conséquent, produiront des protéines modifiées. Le succes de la BM a entrainé Vappartion ou le développement de nouvelles disciplines = La Genomique structurale (séquence et compare les génomes entiers) La Génomique fonctionnelle qui détermine la fonction et lexpression des gines a travers I'stude du transcriptone qui siinteresse aux divers ARN présents dans {a cellule et a leurs réles. et au travers du proteome qui identifi les protéines codes par le génome et détermine leurs rales ; La métabolique qui relie génome et métabolisme La phylogénie moléculaire qui situe les organismes vivants les uns Par rapport aux autres en se basant sur la comparaison des séquences ADN;lécologie ou épidémiologie moléculaire qui étudie en conditions naturelles ou par modélisation le comportement des composants des populations naturelles La transoénése qui vise & modifier des fonctions biologiques par action sur /ADN La biologie do synthase qui cherche @ concevoir des étres vivants adaptés aux nouvelles fonctions, La découverte de 'ADN comme support de l'information génétique information génétique est transmise sous deux formes d'une génération a autre Soit sous la forme d'un cout fécondé (reproduction sexuée) qui regolt un exemplaire de chaque gene parental Scit sous la forme dune cellule fille (reproduction asexuée) qui reprodut & ridentique la cellule mere, Le trevail pionnier de Fred Grif, en 1928 sure transfert de la virulence du pathogéne Streptococcus Pneumoniae, communément eppeler pneumocog.ie est Vexpérience qui prouva que l/ADN était bien le materel génétique : Grifit decouvrit que sil faisait boullir des bactéries virulentes et les injectait a des sours, celles-ci n’6taient pas infectées et quion ne pouvait retrowver aucun pneumocoque chez les animaux. Quand il injectait un méiange de bactéries virulentes tuées et de bactéries non virulentes tuees et de bactéries non virulentes vivantes, les sourls mouraiont. De plus, on pouvait isoler des baciéries virulentes de ces souris martes. Grifit donna a ce changement de bactéries non virulentes en Palhogene virulents, le nom de transformation. - Ceci suggére done quil existe chez les bactéries Lun "facteur ou principe transformant", * Propablement resistant et livéré par la chaleur, + Susceptible d'étre inlegré par dautres bactories comme les bactéries R * Et qui leur confere de fagon héréditare de nowvelles propriétés génétiques (comme la virulence). + Nature de ce matérie! Oswald Avery et ses collégues déterminérent par la suite quel constituant des pneumocoques tués par la chaleur était responsable de la transformation de Grit. Ces chercheurs détnisirent sélectvement les constituanis d'extraits purifiés de Pneumocoques virulents (cellules s), ay moyen d'enzymes hydrolysant |'ADN, !ARN ou les protéines. Ils expasérent par la suite des ‘Souches non virulentes Ho — mmm maaGroupement phosphate phosphates donne un anhyeride avec une son ts riche en énergie. et Jaison entre le groupemert acide du phosphate et Thydroxyle du suere 4 cre et la base est une liaison osidique de type 6-N glycosidique La liaison formée entre det fonne une liester. La liaison formée ante le sut Liaison anhydride Aciae a 9 9 Ue a _ 0 es o-F—or + “oP —OH a a o o o iS foorsonraas a oi Acie _ nkoopecrinale 6 1 i 1 ‘a —S—OH + HOF —O" sa as San es oe o Liaison ester Formes du phosphate et les liaisons formées Nucléosides et Nucléctides : % Nucléosides Le carbone 1’ du sucre se lie 4 azote de la base (N1 ou N9) pour former un nuclé i est eppelée N-alycosidique, Un ou plusieurs groupements phosphate (P) Hiss si a carbone 5° pour former un nucleoside phosphate, On établit une eae Bis 2 ae de la structure de a molécule, Sile sucre est le ribose (ARN), on a la nomenel: ae ee fonction du nombre de groupements phosphate. a ile suore est un désoxyrbose (ADN), on a la méme nomenclature précédée di connatire la position des groupements P partir du CS": ter P en a, 2e P ean | 2e Pen B, 3e P en y. Cette fk2am M ou Monit ° r ! Yer aw we bb Nee $2 Fe wriale OLA Guanine sie ys | Cytosine 9 1 oe y ‘apparie qu'avec la thymine Somme non een tee > Propriétés physico-chimiques de ADN les fasons hydrogéne et ls interactions hydrophobes qui maint ‘sont des forces faibles et des quantités relativement petites d'ér UN processus appelé dénaturation, ~ La Solubilits77\<&> ADN denature ADN nati chauffage 100% =» J A nim Tm temperature Specire Wabsorption CADN Courbe de fusion @ADN Figure : Propriétés spectrales de 'ADN natif et dénaturé. ARN Chaine d’ARN simple brin L’ARN est conslitué d'un polymare de nucléotides, Les nucléctides sont lies par une liaison phosphodiester. Dans catte liaison, le groupemant phosphate entre les deux nucléotides est relié d'un cété par une liaison ester au carbone 5’ et de lautre coté par une seconde liaison ester au carbone 3'. Cette chaine polynudléoiidique est orientée et posséde deux extrémités, Vextrémité 5'P et Vextrémité 3'0H Structures secondaires de I'ARN Selon les types dARN, la chaine peut étre simple brin (ARNm) ou partiellement double brin (ARNr at ARN), On observe des associations doubles brins si deux séquences sont complémentaires au sein dune méme chaine JARN. Ces associations se font comme dans 'ADN, entre A et U (2 liaisons hydrogéne) et ante C et G ( alsons hycragne). Les structures les plus communes sont f« épingle & cheveux »etla «ge toucle » (Figure 2.2), La diffrence vent seulement de a tale de la région entre les deux séquencas appariées. || existe d'autres structures ‘secondaires plus complexes comme le « pseudo-noeud »1. Initiation de la réplication Chez E. Coli, il n'y a qu'un seul chromosome, et environ 4,6 .106 paires de bases. II existe une seule origine de réplication (appelée ori : environ 245 pb], contenant des séquences répétées richas on A ot T. C'est ici que se fixent les protéines d'amorcage, qui intient la réplication par ouverture locale de la double hélice d/ADN. Localement on va avoir le passage @ la forme simple brin, c'est loeil de réplication, A patir de a se propage la réplication. C'est une propagation bidirectionnelie. On a deux fourches de réplications : une a droite et lautre a gauche du point d'initiation. Les deux fourches progressent jusqu’a avoir deux molecules d'ADN double brin. On obtient donc un chromosome pour chaque cellule filles (donc deux au total), le plus fidéle possible au chromosome bactérien de la cellule mere. Chacune des deux cellules filles posséde un chromosome a deux brins, qui correspondent a un brin synthétisé et un brin parental Fixation de protéines d’amorcage Origine de répticatior . cece ere = Gil de réplication Chromosome d’E. coll i (4.6 10° pb) 3 ‘i Propagation bi-directionnelle Figure : Mécanisme de réplication bidirectionnelle Réplication des 2 brins d’DN parentaux La synthése des brins fils se fait y é zymatique par 'ADN polymérase Ill. L’activité en; i i dans le sens 5'- 3° eeeaires suivies dune série dluridines sont des terminateurs efficaces de la Ces structures second tes ‘ipfion, Des séquences riches en GC suivie par autres riche en AT sont aussi des si sitent pas de facteurs additionnels sont nommées transer e terminaison. Ces régions qui ne néces spécifiques “terminateurs intrinseques". Diautres types de terminateurs nécessitent des facteurs protéiques specifiques. Chez E. colila proteine Rho se fixe for'ement a ARN (mais pas nia enzyme nia 'ADN), elle parcourt alors la chaine jusqu’au complexe ARN polymérase-ADN. Dés que ARN polymérase slarréte a un site de terminaison Rho dépendant. Le facteur Rho favorise la libération de IARN et de lenzyme positionnée sur !ADN, terminant ainsi la transcription, La transcription chez les eucaryotes La transcription chez les eucaryotes est prise en charge par des ARN polymérases trés appareniées & celles présentent chez les procaryotes. Mais c'est un processus beaucoup plus complexe et il existe plusieurs diférences notables La transcription chez les eucaryotes est prise en charge par 3 ARN polymérases (Pol |, Il, et Ill) trs apparentées & celles présentes chez les procaryotes. + La transcription au contraire de la traduction se fait au niveau du noyau, + Elle nécessite plusieurs facteurs diinitiation (facteurs généraux de ‘transcription (FGT: TFIl A, TFIIB, TFIl D (TBP, TAF), TFIE, TFIIH). + Remodelage de la chromatine par des protéines régulatrices et des enzymes de modification de la chromatine double hélice de DN : changement de conformation lors de l'ouverture de la double hélice d’ADN (ADN inclus dans les nucléosomes). * En plus des éléments cis (ex: TATA Box) il existe en plus du Promoteur des autres séquences ou unités de contrdle : Activateurs : Enhancers + Extincteurs : Silencers, Ces sequences peuvent étre localisées dans la région régulatrice en §', en amont du dinitiation, mais ussi parfois a lintérieur du géne ou méme dans la région 3' en aval de la ‘séquence codante,Factor Tria TBP Tro THD. THO Te Bae TATA Ww Bee, ber, Boe bce, Consensus Sequence Les composants d'un promoteur eucaryote Comme chez les procaryotes, la trancsription se fait en trois étapes : I'initiation, lélongation et la terminaison. Alnitiation La reconnaissance du promoteur et la mise en place du complexe de pre initiation cher la plupart des Pol I déoute au niveau du TATA box. ce demiar est reconnu par TFl plus précisément par la Sous unité TEP (TATA box Binding Protein). D'autres sous unités de ce complexe sont appelées TAF(TBP sociated factors) reconnaissent dlautres éléments duu promoteur, tele Inr, DPE et DCE, bien que la liaison la plus forte soit celle entre TBT et TATA, Le complexe TBP-TATA attire sur le Promoteur d'autres facteurs généraux de transcription [TFA entrainant la liaison du Pol Il au promoteur (upstream), TFIIB : liaison du Pol Il au promoteur (downstream), TFIIF : accompagne Pol Il dés quelle se fixe sur le promoteur, TFIIE essentiel pour "elongation et la libération du Pol Il du Promoteur, et TFIIH quia un réle dans la Phosphorylation du CTD du Pol Il et ii a aussi un réle dans l'élongation et la polymérase elle méme. La double hélice 4 ce niveau Se sépare par lintermédiaire du TFIIH en hydrolysant la liaison anhydride de ATP, La grande sous unité de pol II posséde sur lextrémité C-terminale une série de Séquence répétée de 7 acides amines (heptapeptide: Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser) appelée domaine arboxy terminal (CTD) ou la queue. Le nombre de répetitions dépond des espaces: 27 fois chez les levures, 45 fois chez la mouche Drosophila, et 52 fois chez homme. Chaque motif repété contient des sites de phosphorylation par des kinases spécifiques notamment une qui est une sous unité de TFIIH, La régulation du niveau de phosphorylation du CTD de Pol II controle aussi les étapes ultérieures (longation, Maturation).