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Jornal Árabe de Química (2022) 15, 103632

Universidade King Saud

Jornal Árabe de Química

www.ksu.edu.sa
www.sciencedirect.com

ARTIGO ORIGINAL

Prospecção fitoquímica, avaliação de

atividade antibacteriana e toxicidade de extratos de
Libidibia ferrea (Mart. ex Tul.) L.P. Queiroz
Nair Silva Macedo a , Cristina Rodrigues Barbosa dos Santos b ,
Raimundo Luiz Silva Pereira c , Suieny Rodrigues Bezerra b ,
Jackelyne Roberta Scherf d , Thiago Sampaio Freitas c , Alisson Maca´rio de Oliveira , e

Magda Rhayanny Assunção Ferreira f , Luiz Alberto Lira Soaresf ,

Valdir de Queiroz Balbino a , Henrique Douglas Melo Coutinho c, *,
Abolghasem Siyadatpanah g, *, Polrat Wilairatana h, *,
Francisco Assis Bezerra da Cunha b , Marcia Vanusa da Silva a

a
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, Recife, PE, Brasil
bLaboratório de Bioprospecção do Semiárido (LABSEMA), Departamento de Química Biológica - URCA, Crato, CE, Brasil
c
Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular (LMBM), Departamento de Química Biológica - URCA, Crato, CE, Brasil
d
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, Recife, PE, Brasil
e
Laboratório de Bioquímica de Proteínas, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, Recife, PE, Brasil
f
Laboratório de Farmacognosia da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, Recife, PE, Brasil

g Ferdows School of Paramedical and Health, Birjand University of Medical Sciences, Birjand, Irã
h
Departamento de Medicina Tropical Clínica, Faculdade de Medicina Tropical, Universidade Mahidol, Bangkok, Tailândia

Recebido em 18 de outubro de 2021; aceito em 7 de dezembro de 2021

Disponível on-line em 11 de dezembro de 2021

PALAVRAS-CHAVE Resumo Libidibia ferrea (Mart. ex Tul.) LP Queiroz é uma espécie arbórea encontrada na Caatinga
do Nordeste do Brasil que tem sido utilizado na medicina popular como antiinflamatório, cicatrizante,
Luxúria de ferro;
Microrganismos;
analgésico e para o tratamento de distúrbios do sistema respiratório. Portanto, o objetivo deste trabalho
Ácidos fenólicos; teve como objetivo avaliar a composição dos extratos etanólicos das folhas e casca interna de Libidibia
Atividade antibacteriana; fer-rea, bem como verificar sua atividade antibacteriana e como potencial inibidor da bomba de efluxo TetK

*
Autores correspondentes.
E-mail: luiz.albertosoares@ufpe.br (LAL Soares), hdmcoutinho@gmail.com, hdmcoutinho@urca.br (HDM Coutinho),
asiyadatpanah@yahoo.com (A. Siyadatpanah), polrat.wil@mahidol.ac.th (P. Wilairatana), marcia.vanusa@ufpe.br (MV da Silva).
Revisão por pares sob responsabilidade da King Saud University.

Produção e hospedagem da Elsevier

https://doi.org/10.1016/j.arabjc.2021.103632
1878-5352 2021 O(s) Autor(es). Publicado pela Elsevier BV em nome da King Saud University.
Este é um artigo de acesso aberto sob a licença CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
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2 NS Macedo et al.

Toxicidade; em cepas de Staphylococcus aureus, além de investigar a toxicidade dos extratos em modelo de Droso-
HPLC phila melanogaster. A análise e quantificação dos extratos marcadores foram realizadas por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foram
realizados testes de microdiluição em caldo. A avaliação da inibição da bomba de efluxo foi realizada
através da modificação da CIM dos antibióticos e do brometo de etídio. Testes de mortalidade e geotaxia
negativa foram utilizados para verificar a toxicidade dos extratos sobre D. melanogaster. Taninos
hidrolisáveis (ácido gálico e ácido elágico) e flavonóides foram encontrados na análise por HPLC. Os
extratos não apresentaram atividade antibacteriana, demonstrando uma CIM de 1024 mg/mL, porém o
extrato etanólico das folhas diminuiu a CIM do antibiótico de 64 mg/mL para 16 mg/mL, mas este efeito
não está associado à inibição de a bomba de efluxo. Os extratos não apresentaram toxicidade no modelo
de D. mela-nogaster. Este é o primeiro estudo a avaliar a atividade antibacteriana de extratos de L. ferrea
na cepa IS-58 de S. aureus, bem como o primeiro a investigar sua toxicidade utilizando D. melanogaster.
A partir dos resultados, são necessários mais estudos para determinar os mecanismos de ação do extrato
com outros antibióticos.

2021 O(s) Autor(es). Publicado pela Elsevier BV em nome da King Saud University. Este é um artigo
de acesso aberto sob a licença CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

1. Introdução Um modelo muito utilizado para traçar o perfil toxicológico de substâncias é a

Há uma variedade de espécies de Caatinga que têm sido relatadas na literatura
devido ao seu uso na medicina popular e na implementação para formulação
de medicamentos fitoterápicos, porém, estudos que comprovem as propriedades
farmacológicas dessas espécies ainda são escassos (Luna et. al., 2020). Entre
estas espécies Libidibia ferrea (Mart. ex Tul.) L.
P. Queiroz, popularmente conhecido como Juca´ ou Pau-ferro, pertencente à
família Fabaceae, é uma espécie endêmica do Brasil (Flora do Brasil, 2020).
O uso de L. ferrea na medicina popular tem sido documentado na literatura,
com importantes propriedades biológicas relatadas como atividades: anti-
inflamatória, antioxidante, antiproliferativa, cicatrizante, antifúngica e
antibacteriana (Falcão et al., 2019a ; Guerra et al., 2017; Jozala et al., 2020;
Kobayashi et al., 2015; Nascimento et al., 2017; Soares et al., 2018). No
entanto, não existem estudos que avaliem os efeitos dos extratos de L. ferrea
em cepas que carregam mecanismos específicos de resistência a antibióticos,
como bombas de efluxo.
Bombas de efluxo são proteínas que estão inseridas na membrana
citoplasmática das células e podem estar presentes em bactérias Gram-
positivas e Gram-negativas, sendo capazes de expulsar ativamente antibióticos
e substâncias tóxicas para fora da célula (Bambeke et al., 2003). Além disso,
sabe-se que a resistência aos medicamentos mediada por bombas de efluxo
pode ocorrer por vias de resistência intrínseca, adquirida ou fenotípica
(Hernando-Amado et al., 2016), sendo frequentemente expressa por cepas de
Staphylococcus aureus.
S. aureus é uma bactéria Gram-positiva, presente na microbiota natural
dos seres humanos. Contudo, esse patógeno pode atuar de forma oportunista
e afetar pessoas imunocomprometidas, principalmente em ambientes
nosocomiais, desencadeando processos inflamatórios graves como endocardite,
sepse e pneumonia necrosante ( Haaber et al., 2017; Spaulding et al., 2013).
Além disso, o S. aureus tornou-se resistente a uma ampla gama de antibióticos
utilizados na clínica, devido a práticas como o uso incorreto e negligente desses
medicamentos, levando ao surgimento de Microrganismos Multirresistentes
(MDR) (Davies e Behroozian, 2020; Wang et al., 2021).
Portanto, os produtos naturais constituem uma importante fonte para a
descoberta e desenvolvimento de novos produtos ou substâncias ativas, que
em associação com substâncias sintéticas e/ou biológicas, bem como,
isoladamente, apresentam-se como uma alternativa para a formulação de
produtos eficientes. medicamentos em várias doenças humanas (Newman e
Cragg, 2020).
No processo de descoberta de novos agentes antibacterianos, a avaliação
da toxicidade do produto natural é uma etapa crucial para determinar o perfil
toxicológico e a segurança em células eucarióticas (Li et al., 2021).
mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster, devido à sua semelhança na
fisiologia com os mamíferos, pois também é um organismo com ciclo de vida
curto, os processos de criação e manutenção são simples, além à necessidade
de baixos custos de manutenção (Ng et al., 2019; Ong et al., 2017).
Nesse sentido, o presente estudo teve como objetivo avaliar a composição
fitoquímica dos extratos etanólicos das folhas e casca interna de L. ferrea, bem
como verificar seu potencial antibacteriano e potencial inibidor da bomba de
efluxo na cepa IS-58 de S. aureus. transportador da bomba de efluxo TetK,
além de investigar a toxicidade de extratos em modelo de D. melanogaster.
2. Materiais e métodos
2.1. Coleta e preparação de extratos
O material vegetal das folhas foi coletado na região do Cariri, no
município de Crato, Ceará, Brasil com coordenadas geográficas 7
140 19,3600 latitude Sul e 39 240 53,7100 longitude Oeste de
Greenwich. As cascas internas foram coletadas na Fazenda Cantinho,
localizada na cidade de Exu, Pernambuco, Brasil com as seguintes
coordenadas geográficas: 7 300 50.200 de latitude Sul e 39 500
42.700 de longitude Oeste de Greenwich.
As folhas foram coletadas em 12 de novembro de 2021, enquanto a
casca foi coletada em 12 de fevereiro de 2021. A espécie vegetal foi
identificada pela Prof. Dra. Maria Arlene Pessoa da Silva e um
exemplar voucher foi depositado no Caririense Da´r-dano Herbário
de Andrade Lima - HCDAL da Universidade Regional do Cariri - URCA,
catalogado sob o número de registro #13905.
As partes coletadas foram trituradas e submersas em solvente
etanol PA, separadamente, em temperatura ambiente, por 72 horas.
Após esse período, a solução obtida foi filtrada e submetida à
destilação solvente em aparelho rotaevaporador a vácuo (Fisatom
Scientific Equipment Ltd., Brasil), onde o produto obtido foi levado ao
banho-maria (Quimis Scientific Equip-ment Ltd. , Brasil) para
evaporação do excesso de etanol. O rendimento do extrato obtido foi
de 13,69% para as folhas e 5,33% para a casca interna. O Extrato
Etanol das Folhas de L. ferrea foi denominado EEFLF e o Extrato
Etanol da Casca Interna de L. ferrea foi denominado EEELF.
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Prospecção fitoquímica, avaliação da atividade antibacteriana
2.2. Preparação de amostras e cromatografia líquida de alta eficiência
Foram pesados 20 mg dos extratos (EEFLF e EEELF) e posteriormente esse
volume foi transferido para um balão volumétrico de 10 mL e solubilizado em
10 mL de etanol. Alíquotas de 5 mL das soluções obtidas foram transferidas
para balões volumétricos de 10 mL e o volume foi medido com água ultrapura
(Purelab Classic UV, Elga).
Posteriormente foram filtrados em frascos com auxílio de filtro PVDF (0,45
mm; Chromafil). Condições cromatográficas: A análise por HPLC foi realizada
em um sistema de HPLC Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific, EUA),
acoplado a um detector de arranjo de fotodiodos (DAD; Thermo Fisher
Scientific) e equipado com uma bomba binária (HPG-3x00RS, Thermo Fisher
Scientific). ), desgaseificador e amostrador automático equipado com loop de
20 mL (ACC-3000, Thermo Fisher Scientific). O comprimento de onda foi
fixado em 270 nm. As separações cromatográficas foram obtidas com uma
coluna C18 (250 mm, 4,6 mm de diâmetro interno, 5 mm)
Supelco equipada com coluna de guarda (4 mm 3,9 mm C18; Phenomenex).
As separações foram realizadas a uma temperatura de 25 ± 1 C. A fase móvel
consistiu de água ultrapura (A) e metanol (B), ambos acidificados com ácido
trifluoroacético a 0,05%, e fluxo ajustado para 0,9 mL/min. . Um programa de
gradiente foi aplicado da seguinte forma: 0–10 min, 12,5–25% B; 10–15 min,
25–40% B; 15–25 min, 40–75% B; 25–30 min, 75–75% B; 30–33 min, 75–
12,5% B (Ferreira et al., 2016a, 2016b). Os dados foram analisados, após
injeção em triplicata, e processados utilizando o software Chromeleon 6.8
(Dionex/Thermo Fisher Scientific). Os padrões ácido elágico (95% de pureza)
e ácido gálico (pureza analítica) foram utilizados para confirmar a presença de
compostos nos extratos por espectros de UV e tempo de retenção, e para
calcular o teor de cada composto nos extratos. Ambos foram adquiridos da
Sigma-Aldrich.
2.3. Testes microbiológicos
2.3.1. Cepas bacterianas
A cepa de Staphylococcus aureus utilizada foi a IS-58 codificada pelo
plasmídeo pT181, que carrega o gene que expressa a proteína de efluxo de
tetraciclina - TetK. A cepa foi fornecida pelo Prof.
S. Gibbons (Universidade de Londres), sendo mantido em ágar sangue
(Laboratório Difco Ltda., Brasil) e, antes dos experimentos, foi cultivado por
24 h a 37 C em infusão sólida de cérebro e coração (BHI). -Ágar (BHI,
Acumedia Fabricantes Inc.).
2.3.2. Mídia cultural
Para a realização dos testes microbiológicos foram utilizados os seguintes
meios de cultura: Brain Heart Infusion Agar (BHIA) (BHI, Acumedia
Manufacturers Inc.), preparado de acordo com o fabricante, e Brain Heart
Infusion (BHI, Acumedia Manufacturers Inc.) preparado no próprio local.
mesma concentração de 10%.
2.3.3. Produtos químicos e reagentes
O antibiótico (Tetraciclina), brometo de etídio (EtBr), carbonilcianeto m-
clorofenilhidrazona (CCCP) foram obtidos da Sigma Aldrich Co.
3
enquanto a Clorpromazina (CPMZ) foi obtida no Ache´ Pharmaceuticals
Laboratories (Pernambuco, Brasil). O antibiótico Norfloxacina, bem como
EEFLF e EEELF, foram diluídos em Dimetilsulfóxido (DMSO) e em água
estéril. A proporção de DMSO utilizada foi inferior a 5%. CPMZ e EtBr foram
dissolvidos em água destilada estéril, enquanto CCCP foi dissolvido em
metanol/água (1:3, v/v). Todas as substâncias foram diluídas até uma
concentração padrão de 1.024 mg/mL.
2.3.4. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
A CIM foi determinada para os compostos EEFLF e EEELF de acordo com o
Método de Microdiluição em Caldo proposto por (Javadpour et al., 1996) com
adaptações. As cepas utilizadas nos testes foram semeadas 24 horas antes
dos experimentos. Após esse período, o inóculo bacteriano foi suspenso em
solução salina, correspondendo a 0,5 da escala de McFarland,
aproximadamente 108 (UFC)/mL. Os Eppendorfs foram então preenchidos
com 1,5 900 mL de BHI e 100 mL do inóculo e as placas foram
preenchidas com 100 mL da solução final. A microdiluição foi realizada com
100 mL em diluições seriadas até o penúltimo poço da placa (1:1), sendo este
último utilizado como controle de crescimento.
As concentrações dos compostos variaram de 512 mg/mL a 8,0 mg/mL. Após
24 horas de incubação, foram realizadas leituras com adição de 20 mL de
Resazurina (7-hidroxi-10-oxidophe noxazin-10-ium-3-ona) (Exodo, Brasil). A
resazurina foi oxidada na presença do meio ácido causado pelo crescimento
bacteriano, promovendo a mudança de cor do azul para rosa (Elshikh et al.,
2016). O MIC foi definido como a concentração mais baixa em que nenhum
crescimento pode ser observado (Andrews, 2001). Os testes foram realizados
em triplicata.
2.3.5. Avaliação da inibição da bomba de efluxo pela modificação da CIM de
antibióticos e brometo de etídio Para observar se
EEFLF e EEELF atuam como potenciais inibidores da Bomba de Efluxo TetK,
foi utilizado um estudo comparativo entre os efeitos dos inibidores padrão da
Bomba de Efluxo, avaliando a capacidade de ambos de diminuir a CIM do EtBr
e do antibiótico Tetraciclina. Os inibidores padrão CCCP e Clorpromazina
foram usados para fornecer a expressão da bomba TetK pelas cepas
testadas. A inibição da Bomba de Efluxo foi testada utilizando uma
Concentração Subinibitória (MIC/8) de inibidores e EEFLF e EEELF. Nos
testes, 170 mL de cada inóculo bacteriano suspenso em solução salina,
correspondente a 0,5 da escala de McFarland, aproximadamente 108 (UFC)/
mL, foram adicionados juntamente com os inibidores 1,5 e EEFLF e EEELF
(MIC/8) e completados com BHI .
Estes foram então transferidos para placas de microdiluição de 96 poços, às
quais foram adicionados 100 mL de antibiótico ou EtBr em diluições seriadas
(1:1) variando de 512 a 0,25 mg/mL. As placas foram incubadas a 37°C por
24 horas e o crescimento bacteriano foi avaliado com resazurina (7-hidroxi-10-
oxidofenoxazin-10-io-3-ona).
A resazurina foi oxidada na presença de meio ácido causado pelo crescimento
bacteriano, causando a mudança de cor de azul para rosa (Elshikh et al.,
2016). A MIC foi definida como a concentração mais baixa na qual nenhum
crescimento pode ser observado (Andrews, 2001). A CIM dos controles foi
avaliada utilizando apenas placas com antibiótico Tetraciclina e com EtBr e os
testes foram realizados em triplicata.
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4 NS Macedo et al.
2.3.6. Controle negativo
Para o controle negativo foram utilizadas as últimas fileiras de cavidades da
placa de microdiluição, onde foram utilizados apenas o meio de cultura e bactérias.
inóculo foram adicionados sem a adição do sub-testado
posturas, tendo em vista a formação máxima do número de
colônias bacterianas, além de comprovar que o inóculo
foi devidamente adicionado aos eppendorfs. Porém, esses números não
foram acrescentados aos gráficos dos resultados devido à impossibilidade
de mensurar o número de colônias formadas em um
período de 24 horas após os testes microbiológicos. A metodologia utilizada
não permite a contagem de colônias bacterianas,
no entanto, usamos Resazurina como corante para identificar bactérias
crescimento através da redução da oxidação.
2.4. Testes de toxicidade
2.4.1. Estoque de Drosophila melanogaster
Drosophila melanogaster (cepa Harwich) foi obtida de
o Centro Nacional de Estoque de Espécies, Bowling Green, OH. Moscas
foram acondicionados em potes de vidro de 340 mL (15 cm de altura e 6,5 cm de
diâmetro) cultivado com o meio contendo: (83% milho
massa, 4% açúcar, 4% leite liofilizado, 4% farelo de soja, 4%
farelo de trigo ou aveia e 1% de sal). Quando a mistura foi
cozido, foi adicionado 1 g de Nipagin (Metilparabeno). Depois
esfriando nos frascos de crescimento, foi adicionado 1 mL de solução
contendo Sac-charomyces cerevisiae. As moscas foram criadas em BOD
estufas fotoperiódicas a uma temperatura de 25 C±1 C
e uma umidade relativa do ar de 60%.
2.4.2. Testes de sobrevivência
O método de bioensaio de ingestão proposto (Da Cunha et al.,
2015) foi utilizado para avaliar a toxicidade de EEFLF e EEELF.
Onde moscas adultas (machos e fêmeas com aproximadamente 4 dias),
em número de 20, foram acondicionadas em frascos de 130 mL, previamente
preparados com 1 mL de solução de sacarose em água destilada, na
concentração de 20%, permitindo que as moscas fossem alimentadas ad libitum. O outro
os tratamentos receberam volumes de 25, 50 e 100 mg/mL de extrato
etanólico das folhas e casca interna de L. ferrea, e
esses volumes foram diluídos em solução de sacarose a 20%. Todos
Os bioensaios foram conduzidos em estufa tipo BOD com
ciclo claro e escuro a cada 12 horas, temperatura controlada em
26 C±1 C e 60% de umidade relativa do ar. Os testes
foram realizadas em triplicata e as leituras das taxas de mortalidade
foram realizadas aos 3,6, 9, 12, 24 e 48 h (Da Cunha et al., 2015).
2.4.3. Teste de geotaxia negativo
O dano ao aparelho locomotor foi determinado pelo
teste de geotaxia negativo, conforme descrito por (Coulom e Birman,
2004). Resumidamente, logo após contar a mortalidade das moscas
a cada 3, 6, 9, 12, 24 e 48 horas. O teste de geotaxia negativo foi
realizada concomitantemente com as moscas sobreviventes, que consiste
na contagem do número de moscas que sobem na coluna
do próprio vidro do experimento, acima de 5 cm, num intervalo de tempo de
5 seg. Os ensaios foram repetidos duas vezes em intervalos de 1 min. Os resultados foram
apresentado como o(s) tempo(s) médio(s) ± EP obtido em dois experimentos
independentes.
2.5. Análise estatística
Os dados centrais e desvios padrão de microbiológicos
os ensaios foram obtidos de acordo com a metodologia de
(Freitas et al., 2021), sobre análise microbiológica em placas de
microdiluição. Os dados foram analisados no programa estatístico GraphPad
Prisma 6.01 por meio de ANOVA unidirecional.
teste. Posteriormente, foi realizado um teste post hoc de Bonferroni
(onde p < 0,05 foi considerado significativo e p > 0,05
não significativo). Para analisar os dados de toxicidade, foi utilizado um método bidirecional
Foi realizado o teste ANOVA, seguido de teste múltiplo de Tukey
teste de comparação. Não há diferença estatística com o mesmo
concentração versus tempo.
3. Resultados
3.1. Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC)
Neste estudo, o método HPLC-DAD baseado em Ferreira et al.
(2016a, 2016b) foi avaliado para obter um sistema cromatográfico capaz
de eluir e fornecer resolução na separação de compostos nas amostras de
Libidibia ferrea. Por
analisando o perfil cromatográfico da amostra EEELF
(Fig. 1), é possível observar a presença de 7 compostos principais, não
sendo possível identificar todas as substâncias. No entanto,
os picos observados em tempos de retenção de 6,27 min (pico 1) e
23,68 min (pico 7) indicam a presença de monômeros taninos hidrolisáveis,
ácido gálico e ácido elágico, respectivamente. Picos
4, 5 e 6 correspondem à presença de taninos hidrolisáveis
(derivado do ácido elágico) de acordo com os espectros de varredura.
Os picos 2 e 3 indicam a presença de taninos condensados
(derivado da catequina) de acordo com os espectros de varredura com
máximos em 200 e 279 nm aproximadamente.
Quanto ao perfil cromatográfico da amostra EEFLF
(Fig. 2), pode-se observar a presença de 6 compostos principais.
Os picos observados nos tempos de retenção 6,10 min (pico 1) e
23,89 min (pico 3) indicam a presença de monômeros taninos hidrolisáveis,
ácido gálico e ácido elágico, respectivamente. Picos
2, 4, 5 e 6 correspondem à presença de flavonóides, e
embora não seja possível identificar quais são, segundo
aos espectros de varredura é possível inferir que eles pertencem a
a classe (com máximos de absorção em 268 e 350 nm
aproximadamente).
Além disso, a Tabela 1 mostrou o teor de ácido gálico e
ácido elágico que foram calculados de acordo com a calibração
curvas dos padrões e os resultados foram obtidos em triplicado e expressos
como média ± desvio padrão (relativo
desvio padrão).
3.2. Testes microbiológicos
Os ensaios para obtenção do MIC da EEFLF e da EEELF
contra a cepa de S. aureus carregando a bomba de efluxo TetK
demonstrou uma atividade antibacteriana irrelevante, com um MIC
valor 1024 mg/mL para ambos os extratos. A CIM do antibiótico Tetraciclina
foi de 64 mg/mL.
Comparado aos ensaios de associação entre Tetraciclina
e EEFLF, houve redução na CIM do antibiótico de
64 mg/mL a 16 mg/mL, caracterizado como efeito potencializador da
a eficácia dos antibióticos (Fig. 3). Quanto à associação da Tetraciclina
com a EEELF, não houve diferença estatística.
Na avaliação da inibição da bomba de efluxo por
diminuindo a CIM do brometo de etídio, verificou-se que
a associação de ambos os extratos não teve efeito na função
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Prospecção fitoquímica, avaliação da atividade antibacteriana
Figura 1 Cromatograma da amostra EEELF e espectro de varredura dos picos observados em 270 nm.1 – Ácido gálico; 2 e 3 – Derivados da catequina; 4, 5
e 6 – Derivados elágicos; 7 –Ácido elágico.
da bomba de efluxo, pois os valores não diferiram estatisticamente do
controle (Fig. 4).
3.3. Testes toxicológicos
Os testes toxicológicos utilizando o artrópode modelo D. melano-gaster
demonstraram que ambos os extratos não apresentaram toxicidade
em todas as concentrações testadas de 25, 50 e 100 mg/mL, uma vez que
não houve mortalidade nos grupos de tratamento, razão pela qual
a CE50 não foi calculada.
Os dados de geotaxia negativa demonstram a capacidade de
EEFLF e EEELF causarão danos ao sistema locomotor das moscas
sistema. Nesse sentido, foi possível observar que a EEFLF
causou danos ao aparelho locomotor de moscas a partir das 12h
exposição nas concentrações de 50 e 100 mg/mL, com diferença estatística
em relação ao controle, Figura 5A. Após um
Período de exposição de 24 horas ao EEFLF, a concentração de
5
25 mg/mL também causou danos ao aparelho locomotor de
as moscas.
Quanto ao EEELF, foi demonstrado que apenas a concentração de
100 mg/mL diferiu estatisticamente do controle após
24 horas de exposição, enquanto a concentração de 50 mg/mL apenas
diferiu do controle positivo na última leitura de 48 h
de exposição ao extrato (Fig. 5B).
4. Discussão
Diversos estudos na literatura sobre a composição fitoquímica de extratos
da casca e das folhas de L. ferrea demonstram a presença de ácido
elágico, gálico e cafeico, em
além de catequina, epicatequina, quercertina e kaempferol
(Andrade et al., 2019; Da Silva et al., 2018; Indriani et al.,
2018; Pedrosa et al., 2016). Classes químicas como taninos,
flavonóides, cumarinas, saponinas, esteróides, terpenóides também foram
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6 NS Macedo et al.

Fig. 2 Cromatograma de amostra EEFLF e espectro de varredura de picos observados em 270 nm. 1– Ácido gálico; 3 – Ácido elágico; 4, 5 e 6 –
Derivado de flavonóides.

Tabela 1 Níveis de ácido gálico e ácido elágico dos extratos de L. ferrea. análise química de extratos etanólicos das folhas e
Amostra de ácido gálico Ácido elágico A casca interna do pau-ferro através do HPLC mostrou a presença de
taninos hidrolisáveis, flavonóides, ácido gálico e elágico.
EEFLF 0,224 ± 0,0021 g% 0,339±0,0014g% ácido.
(0,94%) (0,42%)
Compostos bioativos, como aqueles incluídos em produtos químicos
EEELF 0,097 ± 0,0017 g% 0,162 ± 0,0020 g%
(1,75%) (1,26%)
classes como flavonóides, alcalóides, terpenóides e esteróides,
bem como outros compostos fenólicos são utilizados para a formulação
e desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento de
distúrbios respiratórios, doenças do trato urinário e da pele
infecções causadas por microrganismos (Mayekar et al., 2021).
identificado na triagem fitoquímica da casca e folha de L. ferrea Na literatura há relatos da atividade antibacteriana de folhas de L.
extratos (Falcão et al., 2019b; Leandro et al., 2019; Luna et al., ferrea contra Bacillus subtilis, Escherichia coli,
2020). Esses estudos corroboram nossos resultados, uma vez que o fito- Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa e S. aureus com
Machine Translated by Google

Prospecção fitoquímica, avaliação da atividade antibacteriana 7

Fig. 3 Efeito da combinação de EEFLF e EEELF com o antibiótico tetraciclina na cepa IS-58 de S. aureus portadora da bomba de efluxo TetK. O
cianeto de carbonila m-clorofenilhidrazona (CCCP) e a clorpromazina são inibidores padrão.

É-58

150
ns ns Brometo de etídio (EtBr)
Clorpromazina + EtBr
100 CCCP + EtBr
Média
EEFLF + EtBr
**** EEELF + EtBr
50
Significância Estatística
****
**** p < 0,0001 =
0

Fig. 4 Efeito da combinação de EEFLF e EEELF com brometo de etídio na cepa IS-58 de S. aureus portadora da bomba de efluxo TetK. O
cianeto de carbonila m-clorofenilhidrazona (CCCP) é um inibidor padrão.

CIM variando de 0,039 a 25 mg/mL (Luna et al., 2020).
Existem também estudos avaliando a atividade antibacteriana da casca
interna contra cepas padrão e multirresistentes de E. coli, P. aeruginosa
e S. aureus, que verificaram não haver inibição do crescimento
bacteriano através da determinação da CIM 1024 mg/mL (Ferreira et
al., 2016a, 2016b). A MIC é definida como a menor concentração da
substância capaz
de inibição do crescimento bacteriano, e uma redução de três pontos
na MIC é necessária para indicar a inibição do crescimento bacteriano
(Davies e Wright, 1997; Davies e Behroozian, 2020).
Os resultados do presente estudo demonstraram que EEFLF e
EEELF não apresentaram atividade antibacteriana contra a cepa
IS-58 de S. aureus, que carrega a bomba de efluxo TetK e não inibiu
o funcionamento da bomba de efluxo quando avaliada.

Figura 5 Ensaios de geotaxia negativa utilizando o modelo de D. melanogaster. (A) e (B) Dados de geotaxia negativa usando o modelo D.
melanogaster contra EEFLF e EEELF, respectivamente;**** representa significância em relação ao controle.
Machine Translated by Google
8 NS Macedo et al.
com brometo de etídio. Porém, o extrato da folha do pau-ferro, quando
associado ao antibiótico, reduz sua CIM duas vezes, caracterizando-se como
uma ação potencializadora da eficácia do antibiótico, podendo estar atuando
em outro mecanismo de resistência. Não há estudos avaliando a atividade
antibacteriana dos extratos de L. ferrea na cepa IS-58 de S. aureus, e este
estudo é o primeiro relato.
A Bomba de Efluxo TetK presente em S. aureus está inserida na
Superfamília Facilitadora Principal – MFS que utiliza a força motriz do gradiente
de prótons para expelir ativamente a Tetraciclina para o exterior da célula
bacteriana, reduzindo sua concentração no ambiente intracelular e tornando-a
dificultando sua ação para inibir o funcionamento dos ribossomos (Chopra e
Roberts, 2001; Hobson et al., 2021; Kumar et al., 2020).
Além de investigar o potencial antibacteriano das substâncias naturais, é
fundamental analisar o seu perfil tóxico, uma vez que a atividade terapêutica
de uma substância natural é considerada segura quando não há toxicidade
nas células animais (Li et al., 2021). O presente estudo demonstrou que
ambos os extratos não apresentaram toxicidade em relação ao modelo
alternativo de D. melanogaster.
D. melanogaster é considerado um importante modelo alternativo para
avaliar a toxicidade de produtos naturais in vivo devido à sua rapidez na
obtenção de resultados em comparação com modelos tradicionais, como
roedores (Pandey e Nichols, 2011). Além disso, D. melanogaster possui mais
de 75% de genes de doenças homólogos aos humanos, além de ser
altamente sensível a baixas concentrações de compostos (Chifiriuc et al.,
2016). Aqui está o primeiro relatório sobre a toxicidade dos extratos de L.
ferrea no modelo alternativo de D. melanogaster.
5. Conclusão
Neste estudo, a análise fitoquímica dos extratos de folhas e cascas
internas de L. ferrea por HPLC demonstrou a presença de taninos
hidrolisáveis, flavonóides, ácido gálico e ácido elágico. No entanto, ambos
os extratos não apresentaram atividade antibacteriana direta contra a
cepa IS-58 de S. aureus, nem atuaram como inibidores da bomba de
efluxo. Entretanto, a associação do extrato etanólico da folha de L. ferrea
com a Tetraciclina resultou em uma associação sinérgica. Além disso, os
extratos não apresentaram toxicidade no modelo de D. melanogaster.
Conclui-se que o extrato etanólico da folha de L. ferrea potencializou o
efeito do antibiótico tetraciclina, mas este efeito não se deve à reversão
da bomba de efluxo. Novos estudos devem ser realizados para identificar
esse mecanismo de ação.
Declaração de interesse concorrente
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes ou
relações pessoais conhecidas que possam ter influenciado o trabalho relatado
neste artigo.
Reconhecimentos
Os autores agradecem à Universidade Federal de Pernambuco – UFPE;
Universidade Regional do Cariri – URCA; Geop-arca Araripe.
Formatação das fontes de financiamento
Fundac¸a˜o Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientÿ´fico e Tecnolo
´gico - FUNCAP (BPI 02/2020 NU´ MERO: BP4-0172- 00168.01.00/20 SPU N:
09673071/2020); Coordenac¸a˜o de
Aperfeic¸oamento de Pessoal de Nÿ´vel Superior - CAPES; Con-selho
Nacional de Desenvolvimento Cientÿ´fico e Tecnolo´gico - CNPq.
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