TÉCNICAS DE INOCULACIÓN, AISLAMIENTO Y TINCIÓN
Antonio Garcia Brian Javier, Arcos Roblero Cristian Eduardo, Castellanos Maldonado Pilar, Grajales Cundapí Yukary
Guadalupe.
Tecnológico Nacional de México, Campus Tuxtla Gutiérrez; Chiapas, México.
Palabras clave: Aislamiento, Medios de cultivo, Microorganismos, Tinción.
Introducción. Para efectuar el estudio de los
microorganismos, se han diseñado diversos métodos que
permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es
posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar
un solo tipo de microorganismos. En la naturaleza, la mayoría
de los microorganismos no se encuentran aislados, sino
integrados en poblaciones mixtas. Sembrar o inocular es
introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en
un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano.
El primer paso para proceder a su estudio es el aislamiento, es
decir la separación de cada uno de los posibles integrantes
microbianos de la muestra. Existen diversos métodos para
conseguir esta separación, la mayoría de ellos basados en la
inmovilización de las células microbianas en la superficie de
los medios de cultivo sólidos. Al depositar una célula
bacteriana o una levadura en un punto del medio de cultivo,
ésta quedará inmovilizada en ese punto y en él se reproducirá
por absorción de los nutrientes del medio.
Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo con el medio
utilizado y los requerimientos del microorganismo a estudiar. En
medios sólidos, la técnica de inoculación masiva constituye un
medio adecuado para el cultivo de microorganismos aerobios y
aerobios facultativos, mientras la técnica por estría cruzada o
agotamiento se obtienen colonias aisladas en las últimas estrías,
separadas unas de otras, permitiendo a partir de las mismas la
obtención de cultivos puros mediante resiembra en otro medio
de cultivo. La técnica agar en tubo inclinado es utilizado para la
conservación de cepas. En medios líquidos el método en
picadura permite conocer el comportamiento de los
microorganismos frente al oxígeno y su movilidad. La
inoculación de tubos con medio líquido (suspensión) no tiene
lugar la formación de colonias, por lo tanto, no sirven como
técnica de aislamiento. La utilización de medios de cultivo
líquidos permite la obtención de una población microbiana
grande, con un elevado número de microorganismos, para ser
utilizados posteriormente. En estos cultivos se examinará la
existencia de enturbiamiento más o menos intenso, la formación
de una película o velo sobre la superficie o la aparición de
sedimento en el fondo del tubo.
En general, las tinciones se pueden clasificar como simples
cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza un
sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción
diferencial, cuando se visualiza más de un color porque se utiliza
más de un colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tinción específica,
cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molécula
fluorescente para identificar una estructura celular en particular
(inmunocitoquímico).
El control de calidad de las técnicas tintoriales es importante, ya
que así se asegura que la preparación de la muestra haya sido
adecuada, por lo que se recomienda realizar al mismo tiempo de
la evaluación de la muestra clínica, la tinción de un agente
infeccioso ya identificado mediante esa tinción, el cual
funcionará como un control positivo.
El objetivo de la práctica fue conocer y aprender diferentes
técnicas de inoculación, aislamiento y tinción de
microorganismos.
Materiales y métodos
Esterilización del material. Se utilizaron las 2 varillas
acodadas que se esterilizaron (previamente en la práctica
anterior) por calor seco en horno durante 2 horas y que se
almacenaron hasta su uso.
Preparación de medios de cultivo. Para el desarrollo de la
práctica se prepararon de medios de cultivo, el medio TSA,
agar nutritivo, caldo verde brillante al 2%, agar verde brillante,
agar de bilis verde brillante, agar bilis y rojo violeta, agar con
eosina y azul de metileno, agar de sal y manitol y agar dextrosa
y papa, así como también agua peptonada, los cuales estaban
compuestos principalmente de fuentes de carbohidratos (como
glucosa y extractos de levadura/carne), fuente de lípidos, así
como de fuentes de nitrógeno (peptona y urea).
Esterilización de los medios de cultivo y caldo. Los medios
de cultivo se llevaron a ebullición y posteriormente se
esterilizaron. El caldo verde brillante se concentró al 2%, en 4
tubos con 9ml cada uno, del agar nutritivo se colocó en 4 tubos
con 8ml cada uno, el agua peptonada se distribuyó en 6 tubos
con 8ml aproximadamente, para posteriormente meterlos a
esterilizar.
Preparación de la zona de trabajo. Alrededor del mechero
en un perímetro de 30 cm se limpió con benzal toda la zona de
trabajo y la zona circundante, así como también el material que
se utilizó con alcohol al 70%.
Vaciado en la caja. De los matraces se distribuyó entre cajas
Petri los medios de cultivo con agar (sólidos), adicionando 20
ml aproximadamente a cada caja y se dejaron en reposo hasta
solidificar, para finalmente llevarlos a incubación por 24 horas
a 35ºC (como prueba de esterilidad), para luego almacenar los
medios en refrigeración hasta su uso.
Toma de muestras e inoculación. Después de rectificar que los
medios de cultivo no fueron contaminados por el crecimiento de
microorganismos del ambiente, se procedió a realizar la toma de
las muestras y posterior inoculación de estas, los
microorganismos fueron dispuestos en los medios de cultivo
correspondientes como se indica en la Tabla 1.
Tabla 1.- Distribución de microorganismos. Preparación de los microorganismos a evaluar.
Medio Microorganismo/Muestra Posteriormente, después de haberse realizado una preparación
TSA Bacillus subtilis fija de los microorganismos a evaluar, se realizaron las tinciones
Agar nutritivo Saccharomyces cerevisiae de acuerdo a lo indicado en la Tabla 3.
Caldo verde brillante Escherichia coli
Agar de Bilis y Verde Brillante Escherichia coli Tabla 3.- Tipo de tinciones en microorganismos.
Escherichia coli, agua de Tinción Microorganismo
Agar de Bilis y rojo violeta
pozol
Tinción simple (con azul de Saccharomyces cerevisiae
Agar con eosina y azul de metileno E.coli metileno)
Staphylococcus epidermidis Tinción de Gram Escherichia coli, Staphylococcus
Agar sal y manitol
y Staphylococcus aureus epidermidis y Bacillus subtilis
Agar papa dextrosa Aspergillus niger Tinción de azul de algodón Aspergillus niger
Agua peptonada Agua de pozol Tinción de esporas con verde Bacillus subtilis
de malaquita
Mientras que las técnicas utilizadas para cada uno de los medios
de cultivo se pueden observar en la Tabla 2. Tinción simple. Una vez fijada la muestra se colocó el
portaobjetos sobre el puente de tinción y se añadió azul de
Tabla 2.- Distribución de técnicas. metileno dejando actuar durante 5 minutos. Después de ese
Medio Técnica de inoculación tiempo, se lavó el portaobjetos en posición diagonal, se le
TSA Método masivo. adicionó alcohol-acetona en la superficie aceitosa que deja el
Método de estría por
Agar nutritivo azul de metileno, se dejó reposar durante 2 minutos, y se repitió
inclinación.
Caldo verde brillante Método de suspensión.
otro lavado.
Agar de Bilis y Verde Brillante Tinción de Gram. Fijada la muestra se agregó cristal violeta, el
Agar de Bilis y rojo violeta Método de estría frotis fue lavado, posteriormente se añadió yodo lugol, con un
Agar con eosina y azul de metileno cruzada/agotamiento. periodo de acción de 1 minuto entre cada uno de los colorantes,
Agar sal y manitol quitando exceso con agua destilada. Se lavó el frotis con alcohol-
Agar papa dextrosa Método de picadura. acetona y luego con agua destilada, para finalmente teñir con
Método de diluciones safranina, esperar 1 minuto y lavar nuevamente con agua
Agua peptonada
seriadas. destilada.
Tinción de hongos. La muestra fue tomada con ayuda de una
Incubación de material. Las cajas se cubrieron con película cinta adhesiva, extrayendo con su ayuda parte del micelio
plástica y se encubaron en posición invertida para evitar que el presente en el medio. Posteriormente esta fue pegada a un
agua de condensación gotee sobre la superficie de crecimiento, portaobjetos limpio al cual se le añadió una gota de colorante.
ya que la condensación puede dispersar y mezclar los Tinción de esporas. Se tomó la muestra y se cubrió la extensión
organismos haciendo imposible el aislamiento de colonias. con papel de filtro, añadiendo verde de malaquita y se esperó un
Incubando las cajas y tubos a 35°C durante 24 horas. En el caso minuto. Se fijo en calor pasando el portaobjetos en la llama con
de los hongos filamentosos se incubaron durante 5 días a movimientos rápidos y solamente segundos, lavando con agua y
temperatura ambiente. dejando secar. Se agrego safranina, se lavó con agua y secó.
Análisis de resultados. Se evaluaron los resultados obtenidos Análisis de resultados. Después de haber preparado todas y
cualitativamente de acuerdo con el crecimiento microbiano, cada una de las tinciones como lo indicaba la Tabla 3, las
indicando el aislamiento del microorganismo, su descripción tinciones fueron leídas y analizadas con ayuda de un
morfológica, tomando en cuenta las características de forma, microscopio óptico, haciendo uso de los objetivos de 10X, 40X
borde, elevación, color de la colonia, consistencia, cambios de y 100X.
color en el medio de cultivo, etc.
Preparación del frotis. De los medios de cultivo se seleccionó Resultados. Después de todo el trabajo experimental realizado
la colonia que se encuentra más aislada para una fácil durante tres semanas, los resultados que se obtuvieron fueron
identificación. Con ayuda de un gotero se colocaron unas gotas hasta cierto punto favorables.
de agua sobre el centro de un portaobjetos limpio. Con el asa Desde el inicio, se puede énfasis en la preparación de los
flameada se tomó, en condiciones asépticas, la colonia medios de cultivo, los cuales estaban ocasión fueron
seleccionada anteriormente y se transfiere a la gota del agua. preparados de manera inadecuada, presentando si buen un
Removiendo hasta la formación de una suspensión homogénea. buen color y aspecto, su consistencia no fue la mejor, viendo
Fijación de las bacterias al portaobjetos. Del portaobjetos se que algunos no estaban gelatinizados.
tiene que evaporar el agua para fijar el microorganismo. Por Por otra parte, el trabajo realizado en el aspecto de aislamiento
calor se paso tres veces el portaobjetos por la llama del mechero fue uno muy bien hecho, en su mayoría, pudiendo observar la
con movimientos rápidos solamente durante unos segundos, proliferación y crecimiento colonial muy bueno en los medios
dejando enfriar el portaobjetos entre los pases. de cultivo con bacterias (Figura 1), crecimiento muy bueno de
conidios en el medio de cultivo con hongo (Figura 2) y un nivel
de turbidez casi nulo en los caldos que fueron suspendidos
(Figura 3).
Figura 1. Crecimiento de Bacillus subtilis en medio TSA,
inoculado por el método masivo.
Figura 2. Crecimiento de Aspergillus niger en medio PDA,
inoculado por el método de picadura.
Figura 3. Crecimiento de Escherichia coli en caldo verde
brillante, inoculado por el método de suspensión.
Como se mencionó con anterioridad, el trabajo de inoculación,
en su mayoría, fue un trabajo muy bien hecho, sin embargo, en
el caso de la suspensión, se puede discutir que su nulo
crecimiento bacteriano se debe a una mala ejecución de la
técnica, eso junto con el hecho de que para el momento en el
que se realizó la suspensión, el tubo con el microorganismo de
muestra ya estaba bastante “maltratado".
Algunos otros aspectos de la práctica que son muy importantes
de resaltar, es el cambio de la coloración del medio ASM
(Figura 4) y de igual manera, el crecimiento que se fue dando
en el medio AByRV con el método de las diluciones seriadas
y extensión en la superficie (Figura 5).
Figura 4. Crecimiento de Staphylococcus aureus en medio
ASM, inoculado por el método de estría cruzada; en el que se
puede apreciar el cambio de color del medio por la acción
fermentadora del microorganismo.
Figura 5. Crecimiento nulo (en la dilución 10-6) del
microorganismo encontrado en la muestra de agua de pozol,
inoculado por el método de extensión en la superficie en el
medio AByRV.
El medio Agar Sal y Manitol cambió de su coloración rosada
original a una amarilla, todo esto gracias a la presencia del
microorganismo Staphylococcus aureus y su acción
fermentadora de manitol, una cualidad característica de los
estafilococos coagulasa-positivos.
El crecimiento nulo del microorganismo que se muestra en la
Figura 5, ya que este método se basa en la disminución de la
concentración bacteriana, haciendo que conforme avancen las
diluciones se espere un crecimiento de UFC mucho más
contable. Al ser la dilución 10-6, era esperable que ya no se
espere ningún UFC, gracias a la concentración dilución, sin
embargo, en las otras diluciones (como 10-5, 10-3 y sobre todo
10-1) se presentó crecimiento microbiano, incluso mucho más
notable (Figura 6).
Figura 8. Aspergillus niger en tinción de hongos (azul de
algodón) observado a 10X.

Figura 6. Crecimientos (en las diluciones 10-5, 10-4, 10-3, 10-2

y 10-1) del microorganismo encontrado en la muestra de agua
de pozol, inoculado por el método de extensión en la
superficie en el medio AByRV.
Figura 9. Bacillus subtilis en tinción esporas (verde
Por parte de las tinciones, el trabajo realizado también fue malaquita) observado a 100X.
bueno, pudiendo realizar todas las lecturas interesantes de cada
uno de los métodos descritos en la Tabla 3.
Haciendo uso de las diferentes graduaciones con las que cuenta
el microscopio óptico se pudieron obtener hasta 3 tipos de
resultados (Figuras 7, 8, 9 y 10).

Figura 10. Saccharomyces cerevisiae en tinción simple (azul

de metileno) observado a 100X.
Figura 7. Escherichia coli en tinción de Gram observada a
100X.
Conclusiones. El aislamiento de microorganismos permite http://revista.microbiologos.cr/wp
analizar y visualizar poblaciones concretas o específicas, por content/uploads/2022/08/Volumen-27N%C2%BA2-
lo cual es fundamental identificar los medios de desarrollo Arti%CC%81culo-3-89-98.pdf
necesarios para conocer las condiciones adecuadas de
desarrollo del microorganismo que permita saber en qué
momento es su punto máximo de producción y así obtener
estudios más detallado de su metabolismo, morfología y
características específicas mediante pruebas bioquímicas; y
saber cómo afectan o benefician el entorno. La inoculación y
aislamiento de bacterias debe desarrollarse en condiciones que
minimicen la incidencia de errores los cuales por la naturaleza
del procedimiento son difíciles de detectar. Conocer las
técnicas y procedimientos correctos permite obtener
reproducibilidad en los resultados e interpretaciones, de esta
forma, se puede hacer conciencia de las posibles fuentes de
error para así evitar su incidencia y mantener un aislamiento
de bacterias para resultados óptimos. Las tinciones de bacterias
permiten cambiar el color de las células de los
microorganismos y poder realizar la observación en
microscopio óptico. Su importancia radica en que, dado que
las bacterias son casi incoloras no presentan contraste con el
medio en el cual se encuentran suspendidas y por lo tanto no
pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo,
por lo cual, las tinciones permiten hacer visibles a los objetos
microscópicos y transparentes, revelar su forma y tamaño, así
como hacer evidente la presencia de estructuras internas y
externas. Una correcta ejecución de esta tinción es clave para
una correcta interpretación de los resultados, con
implicaciones importantes en la industria farmacéutica y a
nivel clínico. Las tinciones son herramientas elementales,
vigentes y de uso universal que contribuyen al diagnóstico
microbiológico.

Referencias.
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