UNIWERSYTET MEDYCZNY

W LUBLINIE

Weronika Domerecka

„WYKŁADNIKI MOLEKULARNE NETOZY W CHOROBACH

AUTOIMMUNIZACYJNYCH”

Rozprawa doktorska na podstawie cyklu publikacji

Promotor: Prof. dr hab. n. med. Teresa Małecka-Massalska

Promotor pomocniczy: Dr n. med. Iwona Homa-Mlak

Katedra i Zakład Fizjologii Człowieka Uniwersytetu Medycznego

w Lublinie
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Teresa Małecka-Massalska

Lublin, 2022
 Składam serdeczne podziękowania Promotorowi - Pani Profesor

Teresie Małeckiej-Massalskiej - za opiekę, udzielone wskazówki związane z moimi

badaniami oraz możliwość wykonania pracy doktorskiej.

Pani Doktor Iwonie Homie-Mlak oraz Panu Profesorowi Radosławowi Mlak -

dziękuję za cierpliwość i poświęcony czas.

Pani Profesor Halinie Cichoż-Lach i Pani Doktor Agacie Michalak z Kliniki

Gastroenterologii z Pracownią Endoskopową Uniwersytetu Medycznego w Lublinie dziękuję

za życzliwość oraz pomoc w uzyskaniu materiału do badań.

Pani Doktor Agnieszce Wilińskiej podczas pracy w Zakładzie Genetyki Klinicznej

Uniwersytetu Medycznego w Lublinie dziękuję za pomoc w wykonaniu części doświadczalnej

pracy.

Niniejszą pracę dedykuję mojemu Mężowi i Rodzicom.

Spis treści
1. Wykaz publikacji stanowiących rozprawę doktorską ......................................................... 5

2. Czynny udział w konferencjach naukowych ...................................................................... 6

3. Wykaz stosowanych skrótów .............................................................................................. 7

4. Streszczenie po polsku ...................................................................................................... 10

5. Streszczenie po angielsku ................................................................................................. 15

6. Wstęp ................................................................................................................................ 19

6.1. Proces NETozy ................................................................................................................. 19

6.2. Autoimmunologiczne zapalenie wątroby.......................................................................... 21

6.3. Zwłóknienie wątroby w AIH (ang. autoimmune heptitis) ................................................ 22

6.4. Neutrofile o obniżonej gęstości – LDG (ang. low density granulocytes) ......................... 23

6.5. Rozszerzone parametry stanu zapalnego – EIP (ang. extended inflammation parameters)
24

7. Cel pracy ........................................................................................................................... 26

8. Materiały i metody ............................................................................................................ 26

9. Analiza statystyczna.......................................................................................................... 29

Zgoda Komisji Bioetycznej ...................................................................................................... 29

10. Opis publikacji stanowiących rozprawę doktorską ........................................................... 30

10.1. Artykuł I (A.1) ........................................................................................................... 30

10.2. Artykuł II (A.2).......................................................................................................... 30

10.3. Artykuł III (A.3) ........................................................................................................ 31

10.4. Artykuł IV (A.4) ........................................................................................................ 32

11. Wnioski ............................................................................................................................. 34

12. Bibliografia ....................................................................................................................... 36

13. Kopie opublikowanych prac ............................................................................................. 41

Artykuł A.1............................................................................................................................... 42

Artykuł A.2............................................................................................................................... 50

3
Artykuł A.3............................................................................................................................... 66

Artykuł A.4............................................................................................................................... 82

14. Oświadczenia współautorów publikacji.......................................................................... 101

4
1. Wykaz publikacji stanowiących rozprawę doktorską

ARTYKUŁ I
Kasprzycka W*, Homa-Mlak I, Mlak R, Małecka-Massalska T. Direct and
indirect methods of evaluating the NETosis process
Journal of Pre-Clinical and Clinical Research 2019;13(1):50–56
Wskaźnik Impact Factor ISI: 0, Punktacja MNiSW: 40,0

ARTYKUŁ II
Domerecka W*, Kowalska-Kępczyńska A, Michalak A, Homa-Mlak I, Mlak R,
Cichoż-Lach H, Małecka-Massalska T. Etiopathogenesis and diagnostics strategies
in autoimmune hepatitis
Diagnostics 2021; 11: 1-16
Wskaźnik Impact Factor ISI: 3,706, Punktacja MNiSW: 70,0

ARTYKUŁ III
Domerecka W*, Homa-Mlak I, Mlak R, Michalak A, Wilińska A, Kowalska-
Kępczyńska A, Dreher P, Cichoż-Lach H, Małecka-Massalska T. Indicator of
inflammation and NETosis-low-density granulocytes as a biomarker of autoimmune
hepatitis
Journal of Clinical Medicine 2022; 11: 1-15
Wskaźnik Impact Factor ISI: 4,242, Punktacja MNiSW: 140,0

ARTYKUŁ IV
Domerecka W*, Kowalska-Kępczyńska A, Homa-Mlak I, Michalak A, Mlak R,
Mazurek M, Cichoż-Lach H, Małecka-Massalska T. The usefulness of Extended
Inflammation Parameters and systemic inflammatory response markers in the
diagnostics of autoimmune hepatitis
Cells 2022, 11(16), 2554
Wskaźnik Impact Factor ISI: 7,666, Punktacja MNiSW: 140,0

SUMARYCZNA PUNKTACJA CYKLU PUBLIKACJI:

IF = 15,614; MNiSW = 390 punktów

5
 2. Czynny udział w konferencjach naukowych

Domerecka W*, Homa-Mlak I, Małecka-Massalska T. Proces NETozy oraz NETs,

aktualny stan wiedzy, perspektywy badań. W: XII Interdyscyplinarna Konferencja
Naukowa TYGIEL 2020 "Interdyscyplinarność kluczem do rozwoju". Lublin, 24-27
września 2020 [online].

Domerecka W*, Homa-Mlak I, Małecka-Massalska T. Diagnostyka

autoimmunologicznego zapalenia wątroby. (Diagnostics of autoimmune hepatitis).W: IV
Ogólnopolska Konferencja Naukowa: Choroby rzadkie w XXI wieku. Lublin, 19 lutego
2021 [online].

Domerecka W*, Homa-Mlak I, Mlak R, Wilińska A, Małecka-Massalska T. The role of

low-density granulocytes cells as a potential factor in the development and intensity of
inflammation in psoriasis.W: XXVIII Congress Polish Physiological Society. Gdańsk, 15-
17 September 2021 [online].

Domerecka W*, Kowalska-Kępczyńska A, Michalak A, Homa-Mlak I, Mlak R, Mazurek

M, Cichoż-Lach H, Małecka-Massalska T. Użyteczność rozszerzonych parametrów
zapalnych i wyliczanych wskaźników hematologicznych w diagnostyce
autoimmunologicznego zapalenia wątroby.W: XI Konferencja Adeptów Fizjologii pt.
„Adepci Fizjologii - Łączy Nas Pasja”. Olsztyn, 27-28 czerwca 2022.

Domerecka W*, Homa-Mlak I, Mlak R, Michalak A,Wilińska A, Kowalska-Kępczyńska

A, Dreher P, Cichoż-Lach H, Małecka-Massalska T. Wykładniki stanu zapalnego i netozy
- granulocyty o niskiej gęstości (LDG) jako biomarkery w autoimmunologicznym
zapaleniu wątroby.W: XI Konferencja Adeptów Fizjologii pt. „Adepci Fizjologii - Łączy
Nas Pasja”. Olsztyn, 27-28 czerwca 2022.

6
3. Wykaz stosowanych skrótów:

AAR (ang. aspartate aminotransferase-to-alanine aminotransferase ratio) – stosunek

aminotransferazy asparaginianowej do aminotransferazy alaninowej
AIH (ang. autoimmune heptitis) – autoimmunologiczne zapalenie wątroby
ALP (ang. alkaline phosphatise) – fosfataza zasadowa
ALT (ang. alanine aminotransferase) – transaminaza alaninowa
ANA (ang. anti-nuclear antibodies) – przeciwciała przeciwjądrowe
anty-LKM1 (ang. anti-liver kidney microsomal type 1) – przeciwciała przeciwko
mikrosomom wątrobowym/nerkowym typu 1
anty-SLA (ang. antibodies against soluble liver / pancreas antygen) – przeciwciała
przeciwko rozpuszczalnemu antygenowi wątroby/trzustki
APRI (ang. aspartate aminotransferase-to-platelet ratio index) – stosunek
aminotransferazy asparaginianowej do płytek krwi
AS-LYMP (ang. antibody-secreting reactive lymphocytes) – limfocyty aktywowane
wytwarzające przeciwciała
ASMA/ SMA (ang. anti-smooth muscle antibodies) – przeciwciała przeciw mięśniom
gładkim
AST (ang. aspartate aminotransferase) – transaminaza asparaginianowa
Białko BPI (ang. bactericidal/permeability-increasing protein) – białko
o właściwościach bakteriobójczych zwiększające przepuszczalność
CAP-18 (ang. cathelicidin antimicrobial peptide) – katelicydyna dla peptydu
przeciwdrobnoustrojowego
CathG (ang. cathepsin G) – katepsyna G
CD (ang. cluster of differentiation) – antygen różnicowanina
CLD (ang. chronic liver disease) - przewlekła choroba wątroby
CRP (ang. c-reactive protein) – białko C-rekatywne
CSF virus (ang. classical swine fever virus) – wirus klasycznego pomoru świń
DPI (ang. diphenyleneiodonium) – difenylenodiod
ECT (ang. eosinophils extracellular traps) – zewnątrzkomórkowe pułapki
eozynofilowe
EIP (ang. extended inflammation parameters) – rozszerzone parametry stanu
zapalnego
ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) – test immunoenzymatyczny

7
FIB-4 (ang. fibrosis-4) – wskaźnik włóknienia wątroby
GGTP (ang. gamma-glutamyl-transpeptidase) – ɣ-glutamylotranspeptydaza
GPR (ang. gamma-glutamyl-transpeptidase-to-plateletratio) – stosunek
ɣ-glutamylotranspeptydazy do płytek krwi
HBV (ang. hepatitis B virus) – wirus zapalenia wątroby typu B
HCC (ang. hepatocellular carcinoma) – rak wątrobowokomórkowy
HCV (ang. hepatitis C virus) – wirus zapalenia wątroby typu C
HEV (ang. hepatitis E virus) – wirus zapalenia wątroby typu E
HIV (ang. human immunodeficiency virus) – ludzki wirus niedoboru odporności
IFN (ang. interferon) – interferon typu I i II
IG (ang. immature granulocytes) – niedojrzałe granulocyty
IgG (ang. immunoglobulin G) – immunoglobulina G
K3EDTA (ang. tripotassium ethylenediaminetetraacetic acid) – sól kwasu
etylenodiaminotetraoctowego
LC (ang. liver cirhosis) – zwłóknienie wątroby
LDG (ang. low density granulocytes) – granulocyty o obniżonej gęstości
LL-37 (ang. cathelicidin -37) – katelicydyna 37
LYMP (ang. lymphocytes) – limfocyty
MCV (ang. mean cell volume) – średnia objętość krwinki czerwonej
MECT (ang. mast cells extracellular traps) – zewnątrzkomórkowe pułapki
mastocytowe
MET (ang. macrophage extracellular traps) – zewnątrzkomórkowe sieci uwalniane
przez makrofagi
MMP-9 (ang. matrix metalloproteinases) – metaloproteinaza macierzy
zewnątrzkomórkowej
MONO (ang. monocytes) – monocyty
MPO (ang. meloperoxidase) – mieloperoksydaza
MPR (ang. mean platelet volume-to-platelet ratio) – stosunek średniej wielkości
płytek krwi do płytek krwi
MPV (ang. mean platelet volume) – średnia objętość płytek krwi
NADPH (ang. nicotinamide adenine dinucleotide) – dinukleotyd
nikotynoamidoadeninowy
NAFLD (ang. nonalcoholic fatty liver disease) – niealkoholowa stłuszczeniowa
choroby wątroby

8
NDG (ang. normal density granulocytes) – neutrofile o normalnej gęstości
NE (ang. neutrophil elastase) – elastaza neutrofilowa
NEToza (ang. NETosis) – programowana śmierć komórki
NETs (ang. neutrophil extracelullar traps) – zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili
NEUT (ang. neutrophils) – neutrofile
NEUT-GI (ang. neutrophil granularity intensity) – intensywność ziarnistości
neutrofili
NEUT-RI (ang. neutrophil reactive intensity) – nasilenie reaktywności neutrofili
NLR (ang. neutrophil-to-lymphocyte ratio) – stosunek neutrofili do limfocytów
PAD (ang. peptidylarginine deiminase) – deiminaza peptydyloargininowa
PBC (ang. primary biliary cholangitis) – pierwotne zapalenie dróg żółciowych
PBMC (ang. peripheral blood mononuclear cells) – leukocyty o jądrze
niepodzielonym
PLR (ang. platelet-to-lymphocyte ratio) – stosunek płytek krwi do limfocytów
PLT (ang. platelets) – płytki krwi
PMN (ang. polymorphonuclear leukocytes) – leukocyty o jądrze podzielonym
RBC (ang. red blood cells) – krwinki czerwone
RDW-SD (ang. red blood cell distribution width standard deviation) – współczynnik
zmienności rozkładu objętości erytrocytów
RE-LYMP (ang. reactive lymphocytes) – reaktywne limfocyty
RLR (ang. red blood cell distribution width-to-lymphocyte ratio) – stosunek
współczynnika zmienności rozkładu objętości erytrocytów do limfocytów
ROS (ang. reactive oxygen species) – reaktywne formy tlenu
RPR (ang. red blood cell distribution width-to-platelet ratio) – stosunek
współczynnika zmienności rozkładu objętości erytrocytów do płytek krwi
RA (ang. rheumatoid arthritis) - reumatoidalne zapalenie stawów
SLE (ang. systemic lupus erythematosus) – toczeń rumieniowaty układowy
TNF-α (ang. tumor necrosis factor) – czynnik martwicy nowotworu
WBC (ang. white blood cells) – krwinki białe

9
 4. Streszczenie po polsku
NEToza (ang. NETosis) to mechanizm programowanej śmierci komórki, który
prowadzi do dekondensacji chromatyny w jądrze, dezintegracji organelli komórkowych,
mieszania się ich składników, lizy błony komórkowej oraz uwalniania zewnątrzkomórkowej
sieci neutrofili (ang. neutrophil extracellular traps, NETs). Proces NETozy po raz pierwszy
w 2004r. opisał Brinkmann wraz z zespołem jako odpowiedź immunologiczną przeciwko
bakteriom Gram – dodatnim, Gram – ujemnym, grzybom, pierwotniakom i wirusom.
Zdolność do uwalniania sieci NETs posiadają neutrofile o obniżonej gęstości (ang. low
density granulocytes, LDG), które aktywowane przez patogenne drobnoustroje lub prozapalne
cytokiny, mogą ulegać spontanicznej NETozie. Komórki te wykazują cechy komórek
prozapalnych. Po aktywacji mogą uszkodzić komórki śródbłonka i uwolnić dużą ilość
czynników martwicy nowotworu α (ang. tumor necrosis factor,TNF- α) oraz interferonów
typu I i II (IFN). W 1986r. zespół Hacbarth i wsp. po raz pierwszy zauważyli, że wyższy
odsetek LDG jest charakterystyczny dla chorób reumatologicznych, takich jak toczeń
rumieniowaty układowy (ang. systemic lupus erythematosus, SLE) niż u osób zdrowych.
Ponadto pojawiły się prace wskazujące, że LDG mogą odgrywać znaczącą rolę
w patomechanizmie różnych chorób o podłożu autoimmunizacyjnym, w tym w łuszczycy,
reumatoidalnym zapaleniu stawów (ang. rheumatoid arthritis, RA) oraz
autoimmunologicznym zapaleniu wątroby (ang. autoimmune hepatitis, AIH). W polskiej
populacji chorych na AIH, dotychczas nie przeprowadzono żadnych badań oceniających
wykładniki molekularne NETozy oraz oceny przydatności diagnostycznej wybranych
wyliczanych wskaźników hematologicznych oraz rozszerzonych parametrów stanu zapalnego
(ang. extended inflammation parameters, EIP) jako wykładników ogólnoustrojowego
nasilenia stanu zapalnego w AIH. W celu lepszego zobrazowania i oceny wykładników
NETozy wykorzystuje się mikroskopię elektronową, cytometrię przepływową oraz testy
immunoenzymatyczne (ang. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). Aktualna wiedza
dotycząca tworzenia NETs proponuje jakościowe badania mikroskopowe in-vitro. Metoda ta
charakteryzuje się zwiększoną czułością w wykrywaniu powstawania sieci NET wtedy, gdy
proces nie jest nasilony. Jednak wadą tej metody jest brak obiektywizmu oraz trudność
w ocenie ilościowej tego procesu. Pomiary oparte na cytometrii przepływowej pozwalają na
szybką i obiektywną ocenę wielu tysięcy komórek jednocześnie. Zastosowanie cytometrii
ułatwia bezpośrednie wykrywanie komórek uwalniających NET oraz poszczególnych
składników sieci w próbkach krwi.

10
 Cel pracy
Celem głównym niniejszej pracy doktorskiej była ocena wykładników molekularnych
NETozy w chorobach autoimmunizacyjnych.
Celami szczegółowymi były:
1) Poznanie pośrednich i bezpośrednich metod wizualizacji procesu NETozy.
2) Zapoznanie się z etiopatogenezą i strategiami diagnostycznymi
w autoimmunologicznym zapaleniu wątroby.
3) Ocena wykładników stanu zapalnego i NETozy - granulocytów o niskiej gęstości
(LDG) jako biomarkerów w autoimmunologicznym zapaleniu wątroby.
4) Ocena przydatności diagnostycznej wybranych wyliczanych wskaźników
hematologicznych oraz rozszerzonych parametrów stanu zapalnego jako wykładników
ogólnoustrojowego nasilenia stanu zapalnego w AIH.
5) Ocena istniejących zależności pomiędzy wymienionymi parametrami w AIH oraz
ocena przydatności tych markerów w zwłóknieniu wątroby.

Materiały i metody
Badanie objęło grupę 105 osób:
1. Zdrowi wolontariusze (n = 50).
2. Pacjenci z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby, diagnozowani i leczeni
w Samodzielnym Publicznym Szpitalu Klinicznym Nr 4 Katedry i Kliniki Gastrologii
Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, (n = 55, w tym n=18 ze zwłóknieniem wątroby).

Materiałem do badań była krew pozyskana z żyły łokciowej. Pobranie krwi odbywało
się w godzinach porannych od pacjentów będących na czczo. Analizę odsetka LDG oraz LDG
wykazującej ekspresję mieloperoksydazy (ang. meloperoxidase, MPO) wykonano przy użyciu
metody cytometrii przepływowej. Oznaczenia hematologiczne: krwinek białych (ang. white
blood cells, WBC), płytek krwi (ang. platelets, PLT), reaktywnych limfocytów (ang. reactive
lymphocytes, RE-LYMP), limfocytów aktywowanych wytwarzających przeciwciała (ang.
antibody-secreting reactive lymphocytes, AS-LYMP), nasilenia reaktywności i ziarnistości
aktywowanych neutrofili (ang. neutrophil reactive intensity, NEUT-RI oraz ang. neutrophil
granularity intensity, NEUT-GI), krwinek czerwonych (ang. red blood cells, RBC), neutrofili
(ang. neutrophils, NEUT), limfocytów (ang. lymphocytes, LYMP), monocytów (ang.
monocytes, MONO), niedojrzałych granulocytów (ang. immature granulocytes, IG),
współczynnika zmienności rozkładu objętości erytrocytów (ang. red blood cell distribution
width standard deviation, RDW-SD), średniej objętości płytek krwi (ang. mean platelet

11
volume, MPV) i średniej objętości krwinki czerwonej (ang. mean cell volume, MCV)
wykonano z zastosowaniem aparatu firmy Sysmex XN 1500. Oznaczenia parametrów
biochemicznych: białka C-reaktywnego (ang. C-reactive protein, CRP),
ɣ-glutamylotranspeptydazy (ang. gamma-glutamyl transpeptidase, GGTP), aminotransferazy
alaninowej (ang. alanine aminotransferase, ALT), aminotransferazy asparaginianowej (ang.
aspartate aminotransferase, AST), fosfatazy zasadowej (ang. alkaline phosphatase, ALP)
oraz bilirubiny wykonano przy użyciu aparatu Cobas 6000 firmy Roche. Spośród tych
parametrów zostały wyliczone wskaźniki hematologiczne: wskaźnik neutrofili do limfocytów
(ang. neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR), wskaźnik płytek krwi do limfocytów (ang.
platelet-to-lymphocyte ratio, PLR), wskaźnik zmienności rozkładu objętości erytrocytów do
płytek krwi (ang. red blood cell distribution width-to-platelet ratio, RPR), wskaźnik średniej
objętości płytek krwi do płytek krwi (ang. mean platelet volume-to-platelet ratio, MPR),
wskaźnik zmienności rozkładu objętości erytrocytów do limfocytów (ang. red blood cell
distribution width-to-lymphocyte ratio, RLR) oraz wskaźniki serologiczne: wskaźnik
aminotransferazy asparaginianowej do aminotransferazy alaninowej (ang. aspartate
aminotransferase-to-alanine aminotransferase ratio, AAR), wskaźnik aminotransferazy
asparaginianowej do płytek krwi (ang. aspartate aminotransferase-to-platelet ratio index,
APRI), wskaźnik włóknienia wątroby (ang. fibrosis-4, FIB-4) oraz stosunek
ɣ-glutamylotranspeptydazy do płytek krwi (ang. gamma-glutamyl-transpeptidase-to-platelet
ratio, GPR).

Wyniki

U chorych z AIH zaobserwowano wyższą medianę odsetka LDG (1.2 vs 0.1;

p=0.0001) oraz LDG wykazujących ekspresję MPO+ (0.8 vs 0.3; p=0.0017) w porównaniu
do zdrowych wolontariuszy. Ponadto odsetek LDG charakteryzował się 100% czułością
i 55% specyficznością (AUC=0.84; p<0.0001), natomiast odsetek LDG wykazujących
ekspresję MPO+ charakteryzował się 92% czułością i 55% specyficznością (AUC=0.78;
p=0.0001) w wykrywaniu AIH. Ocena odsetka LDG oraz frakcji LDG wykazującej ekspresję
MPO+ charakteryzują się umiarkowaną czułością (odpowiednio 50% oraz 62.75%) oraz
wysoką specyficznością (93.75% oraz 62.50%) w wykrywaniu LC w przebiegu AIH.
Odnotowano znamienną statystycznie, silną, dodatnią korelację pomiędzy odsetkiem frakcji
LDG wykazującej ekspresję MPO+ a pośrednim serologicznym markerem włóknienia
wątroby APRI (rho=0.0792; p=0.0280) w grupie chorych z LC.

12
 W porównaniu do kontroli u chorych z AIH zaobserwowano istotnie wyższe wartości
EIP: NEUT-RI (48.05 vs 43.30; p<0.0001), NEUT-GI (152.65 vs 147.40; p=0.0001),
RE-LYMP (0.07 vs 0.03; p=0.0001) oraz wyliczanych wskaźników hematologicznych: MPR
(0.05 vs 0.04; p=0.0004), RPR (0.07 vs 0.05; p=0.0007), NLR (2.81 vs 1.42; p<0.0001).
Spośród badanych markerów istotny potencjał diagnostyczny posiadają EIP: NEUT-RI
(AUC=0.86; p<0.0001), NEUT-GI (AUC=0.80; p<0.0001) i RE-LYMP (AUC=0.78;
p<0.0001) oraz wyliczane wskaźniki hematologiczne, tj. MPR (AUC=0.77; p<0.0001), PLR
(AUC=1.00; p<0.0001) i RLR (AUC=1.00; p<0.0001). Ponadto wykazano istotne znaczenie
NEUT-GI (AUC=0.89; p<0.0001), MPR (AUC=0.93; p<0.0001), PLR (AUC=0.86;
p<0.0001), RPR (0.91; p<0.0001), FIB-4 (AUC=0.83; p<0.0001) w wykrywaniu zwłóknienia
wątroby. Odnotowano znamienną statystycznie, negatywną korelację w grupie chorych
pomiędzy: NEUT-GI a MPR (rho=-0.493; p=0.0056), NEUT-GI a RPR (rho=-0.477;
p=0.0077) oraz NEUT-GI a FIB-4 (rho=-0.659; p=0.0001). Ponadto zaobserwowano
znamienną statystycznie, umiarkowaną, dodatnią korelację w grupie AIH bez LC pomiędzy
RE-LYMP a PLR (rho=0.641; p=0.0013) oraz znamienną statystycznie, ujemną korelację
pomiędzy NEUT-GI a FIB-4 (rho=-0.519; p=0.0133).

Wnioski
1. LDG oraz frakcja LDG MPO+ stanowią wykładniki stanu zapalnego i NETozy
w AIH.
2. Cytometryczna ocena odsetka LDG, w tym frakcji LDG MPO+, po odpowiedniej
walidacji mogą stać się użytecznymi markerami w diagnostyce AIH.
3. Oznaczanie parametrów z grupy EIP tj. (NEUT-RI, NEUT-GI, RE-LYMP) oraz
wyliczanych wskaźników stanu zapalnego tj. MPR, PLR i RLR u pacjentów z AIH
może przyczynić się do poprawy interpretacji diagnostycznej wyników badań
chorego.
4. Uzyskane wyniki pozwalają na stwierdzenie, że istnieje pewna potencjalna rola
LDG, w tym frakcji LDG MPO+ oraz NEUT-GI, MPR, PLR, RPR, FIB-4
w nieinwazyjnej ocenie LC.
5. Parametry z grupy EIP oraz wyliczane wskaźniki stanu zapalnego są ściśle
związane z pośrednimi serologicznymi wskaźnikami włóknienia wątroby, co
potwierdza bezpośredni związek między tymi wskaźnikami w przebiegu AIH.

13
6. Nieinwazyjna laboratoryjna diagnostyka włóknienia wątroby może w przyszłości
zmniejszyć liczbę wykonywanych biopsji wątroby, a co za tym idzie ograniczyć
ryzyko związanych z tą procedurą powikłań.

14
 5. Streszczenie po angielsku
NETosis is a programmed cell death mechanism that leads to the decondensation of
chromatin in the nucleus, disintegration of cell organelles, mixing of their components, lysis
of the cell membrane and the release of neutrophil extracellular traps (NETs). In 2004
Brinkmann et al. First described the NETosis process as an immune response against Gram
positive bacteria, Gram negative bacteria, fungi, protozoa and viruses. The ability to release
NETs is found in low density granulocytes (LDG) neutrophils, which, when activated by
pathogenic microbes or pro-inflammatory cytokines, can undergo spontaneous NETosis.
These cells show the features of pro-inflammatory cells. When activated, they can damage
endothelial cells and release a large amount of tumour necrosis factor (α) (TNF-α) and type
I and type II interferons (IFN). In 1986, Hacbarth et al. first noticed that a higher percentage
of LDG is characteristic of rheumatological diseases such as systemic lupus erythematosus
(SLE) compared to healthy subjects. In addition, there are studies indicating that LDG may
play a significant role in the pathomechanism of various autoimmune diseases, including
psoriasis, rheumatoid arthritis (RA) and autoimmune hepatitis (AIH). In the Polish population
of AIH patients, so far no studies have been conducted to assess the molecular exponents of
NETosis and to evaluate the diagnostic usefulness of selected calculated hematological
indicators and extended inflammation parameters (EIP) as markers of the systemic severity of
inflammation in AIH. In order to better visualize and evaluate the exponents of NETosis,
electron microscopy, flow cytometry and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) are
used. Current knowledge on the creation of NETs proposes qualitative in-vitro microscopic
studies. This method is characterized by the increased sensitivity in detecting the formation of
NET when the process is not intensified. However, the disadvantage of this method is the lack
of objectivity and the difficulty in quantifying the process. Until now, measurements based on
flow cytometry allow for quick and objective evaluation of many thousands of cells
simultaneously. The use of cytometry facilitates the direct detection of NET producing cells
and individual network components in blood samples.

Aim of the PhD thesis

The main aim of this dissertation is to evaluate the molecular exponents of NETosis in
autoimmune diseases.
The specific objectives are:
1) Learning about direct and indirect methods of NETosis process visualization.
2) Understanding the etiopathogenesis and diagnostic strategies in autoimmune hepatitis.

15
 3) Assessment of inflammation and NETosis markers – low density granulocytes (LDG)
as biomarkers in autoimmune hepatitis.
4) Assessment of the diagnostic usefulness of selected calculated hematological
indicators and extended parameters of inflammation as markers of the systemic
severity of inflammation in AIH.
5) Assessment of the existing relationships between the above-mentioned parameters in
AIH and assessment of the usefulness of these markers in liver fibrosis.

Materials and methods

The study included a group of 105 people:
1. Healthy volunteers (n=50);
2. Patients with autoimmune hepatitis, diagnosed and treated in the Independent
Public Clinical Hospital No. 4 of the Chair and Department of Gastroenterology,
Medical University of Lublin (n=55, including n=18 with liver fibrosis).

The research material was blood obtained from a vein in the arm. Blood sampling was
performed in the morning from fasting patients. The analysis of the percentage of LDG and
LDG expressing myeloperoxidase (MPO) was performed using the method of flow
cytometry. Haematology tests, such as: white blood cells (WBC), platelets (PLT), reactive
lymphocytes (RE-LYMP), antibody-secreting reactive lymphocytes (AS-LYMP), neutrophil
reactive intensity (NEUT-RI) and neutrophil granularity intensity (NEUT-GI), red blood cells
(RBC), neutrophils (NEUT), lymphocytes (LYMP), monocytes (MONO), immature
granulocytes (IG), red blood cell distribution width standard deviation (RDW-SD), mean
platelet volume (MPV) and mean red cell volume (MCV), were performed using a Sysmex
XN 1500 device.
The determination of biochemical parameters, such as: C-reactive protein (CRP),
gamma-glutamyl transpeptidase (GGTP), alanine aminotransferase (ALT), aspartate
aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP) and bilirubin, was performed using the
Roche Cobas 6000 instrument. From these parameters, the following haematological indices
were calculated: neutrophil-to-lymphocyte ratio (NLR), platelet-to-lymphocyte ratio (PLR),
red blood cell distribution width-to-platelet ratio (RPR), mean platelet volume-to-platelet ratio
(MPR), red blood cell distribution width-to-lymphocyte ratio (RLR) and serological
indicators, such as: aspartate aminotransferase-to-alanine aminotransferase (AAR) ratio,
aspartate aminotransferase-to-platelet ratio index (APRI), fibrosis-4 (FIB-4) and gamma-
glutamyl-transpeptidase-to-platelet ratio (GPR).

16
 Results

The results obtained in the research revealed that the patients with AIH had a higher
median percentage of LDG (1.2 vs 0.1; p=0.0001) and LDG expressing MPO+ (0.8 vs 0.3;
p=0.0017) compared to healthy volunteers. Moreover, the percentage of LDG was 100%
sensitive and 55% specific (AUC=0.84; p<0.0001), while the percentage of LDG expressing
MPO was 92% sensitive and 55% specific (AUC=0.78; p=0.0001) for the detection of AIH.
The assessment of the percentage of LDG and the LDG fraction showing MPO+ expression
are characterized by moderate sensitivity (50% and 62.75%, respectively) and high specificity
(93.75% and 62.50%) in the detection of LC in the course of AIH. There was a statistically
significant, strong, positive correlation between the percentage of the LDG fraction showing
MPO+ expression and the intermediate serological marker of liver fibrosis APRI
(rho=0.0792; p=0.0280) in the group of patients with LC.

Compared to the control group, the patients with AIH showed significantly higher EIP
values: NEUT-RI (48.05 vs 43.30; p<0.0001), NEUT-GI (152.65 vs 147.40; p=0.0001),
RE-LYMP (0.07 vs 0.03; p=0.0001) and the calculated hematological indicators: MPR (0.05
vs 0.04; p=0.0004), RPR (0.07 vs 0.05; p=0.0007), and NLR (2.81 vs 1.42; p<0.0001).
Among the examined markers, the following EIPs appeared to have significant diagnostic
potential: NEUT-RI (AUC=0.86; p<0.0001), NEUT-GI (AUC=0.80; p<0.0001) and
RE-LYMP (AUC=0.78; p<0.0001) and the calculated hematological indicators, i.e. MPR
(AUC=0.77; p<0.0001), PLR (AUC=1.00; p<0.0001) and RLR (AUC=1.00; p<0.0001).
Moreover, the importance of NEUT-GI (AUC=0.89; p<0.0001), MPR (AUC=0.93;
p<0.0001), PLR (AUC=0.86; p<0.0001), RPR (0.91; p<0.0001), and FIB-4 (AUC=0.83;
p<0.0001) for the detection of liver fibrosis was noticed. There was a statistically significant
negative correlation in the group of patients between: NEUT-GI and MPR (rho=-0.493;
p=0.0056), NEUT-GI and RPR (rho=-0.477; p=0.0077) and NEUT-GI and FIB-4
(rho=-0.659; p=0.0001). Additionally, a statistically significant, moderate, positive
correlation was observed in the AIH group without LC between RE-LYMP and PLR
(rho=0.641; p=0.0013) and a statistically significant negative correlation between NEUT-GI
and FIB-4 (rho=-0.519; p=0.0133).

17
Conclusions
1. LDG and LDG MPO+ fraction are markers of inflammation and NETosis in AIH.
2. Cytometry assessment of the percentage of LDG, including the LDG MPO+
fraction, after appropriate validation, may become useful markers in the diagnosis
of AIH.
3. Determination of parameters from the EIP group, i.e. (NEUT-RI, NEUT-GI,
RE-LYMP) and the calculated indicators of inflammation, i.e. MPR, PLR and
RLR in patients with AIH may contribute to the improvement of the diagnostic
interpretation of the patient’s examination results.
4. The obtained results allow to conclude that there is a certain potential role of LDG,
including the LDG MPO+ fraction and NEUT-GI, MPR, PLR, RPR, FIB-4 in the
non-invasive LC assessment.
5. The parameters from the EIP group and the calculated indicators of inflammation
are closely related to the indirect serological indicators of liver fibrosis, which
confirms the direct relationship between these indicators in the course of AIH.
6. Non-invasive laboratory diagnosis of liver fibrosis may reduce the number of liver
biopsies in the future, and thus reduce the risk of complications associated with
this procedure.

18
 6. Wstęp

6.1. Proces NETozy

Proces NETozy po raz pierwszy w 2004r. opisał Brinkmann wraz z zespołem jako
odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko bakteriom Gram – dodatnim, Gram –
ujemnym [1], grzybom [2], pierwotniakom [3] i wirusom [4]. Jest to mechanizm
programowanej śmierci komórki, który prowadzi do dekondensacji chromatyny w jądrze,
dezintegracji organelli komórkowych, mieszania się ich składników oraz lizy błony
komórkowej [1]. Zdolność do uwalniania podobnych sieci wykazują również komórki tuczne
– mastocyty (ang. mast cells extracellular traps, MECT) granulocyty kwasochłonne –
eozynofile (ang. eosinophils extracellular traps, EET) oraz makrofagi (ang. macrophage
extracellular traps, MET) [5,6].

Wykładniki molekularne NETozy

Do niedawna uważano, że niszczenie patogenów przez neutrofile – granulocyty

obojętnochłonne, komórki wielojądrzaste - polimorfonuklearne, (ang. polymorphonuclear
leukocytes, PMN) odbywa się tylko za pomocą procesu fagocytozy. Neutrofile w odpowiedzi
na bodźce zapalne, mogą migrować z krążącej krwi do zainfekowanych tkanek, gdzie
skutecznie pochłaniają i dezaktywują bakterie [7]. Innym procesem, odpowiedzialnym za
niszczenie mikroorganizmów jest uwolnienie przez neutrofile sieci NETs, złożonej z DNA,
składników ziarnistości (w tym enzymów proteolitycznych) oraz zawartości jądra
komórkowego, do przestrzeni zewnątrzkomórkowej [1]. Uwięzione w chromatynowej sieci
NET, patogeny poddawane są działaniu różnych substancji, są to m.in. kationowe proteazy
serynowe: proteinaza 3, katepsyna G (ang. cathepsin G), elastaza neutrofilowa (ang.
neutrophil elastase, NE), mieloperoksydaza (ang. meloperoxidase, MPO), białko BPI (ang.
bactericidal/permeability-increasing protein) – o właściwościach bakteriobójczych
zwiększające przepuszczalność, laktoferryna, żelatynaza B (ang. matrix metalloproteinases,
MMP-9), katelicydyna LL-37 lub CAP-18 (ang. cathelicidin antimicrobial peptide) oraz
białka histonowe (histony rdzeniowe i łącznikowe H1) i tryptaza [8]. Proteinaza 3 jest
enzymem należącym do grupy proteaz serynowych, występuje głównie w granulocytach
obojętnochłonnych. Wpływa na funkcjonowanie wielu wewnątrzkomórkowych białek
zaangażowanych w regulację cyklu komórkowego [9]. Katepsyna G znajduje się
w ziarnistościach neutrofili, powoduje depolimeryzację włókien kolagenowych i degradację

19
proteoglikanów. Odgrywa ważną rolę w odpowiedzi immunologicznej, apoptozie
i chemotaksji [9]. Elastaza neutrofilowa jest enzymem znajdującym się w ziarnistościach
neutrofili, odpowiada za rozkład elastyny, odgrywa istotną rolę w regulacji przebiegu
procesów zapalnych [9]. Mieloperoksydaza jest lizosomalnym enzymem, wytwarzanym przez
granulocyty w przebiegu reakcji zapalnych. Katalizuje reakcje powstawania kwasu
podchlorawego, który jest bardzo toksyczny w stosunku do wielu typów
mikroorganizmów [10]. Laktoferyna jest białkiem z grupy transferryn wykazującym działanie
przeciwbakteryjne wobec różnych patogenów bakteryjnych. Poprzez sekwestrację żelaza
destabilizuje błonę komórkową, zmniejszając ich potencjał chorobotwórczy [11].
Żelatynaza B wykazuje działanie degradujące i destabilizujące składniki macierzy
zewnątrzkomórkowej oraz błony podstawnej. Wpływa na procesy pro nowotworowe: hamuje
apoptozę komórek nowotworowych, zwiększa ich proliferację oraz angiogenezę [12].
Katelicydyna LL-37 jest peptydem, tworzy α-helisę w roztworze wodnym, która umożliwia
rozerwanie zarówno błon bakteryjnych, jak i otoczek wirusowych. Wykazano również jej
działanie przeciwgrzybiczne[13]. Histony pełnią funkcję rdzenia, na którym nawinięta jest
informacja genetyczna, ponadto biorą udział w modyfikacji potranslacyjnej (przepisywanie
i kopiowanie informacji genetycznej), odpowiadają za zmiany epigenetyczne w organizmie.
Wykazują silnie właściwości przeciwbakteryjne [14]. Tryptaza należy do grupy proteaz
serynowych, wykorzystywana jako marker aktywacji komórek tucznych. Uwalniana
z komórek tucznych podczas procesu degranulacji. Wpływa na komórki i tkanki aktywując
proces zapalny [8].

Przebieg procesu NETozy

Śmierć komórki w wyniku NETozy różni się od nekrozy i apoptozy. Wkrótce po

indukcji procesu dochodzi do pojawienia się w neutrofilach wypustek oraz spłaszczenia
komórki. Dochodzi do dekondensacji chromatyny jądrowej oraz wymieszania się jej
z ziarnistościami tych komórek. Nie obserwuje się natomiast pofałdowania błony
komórkowej, kondensacji chromatyny jądrowej, zwiększonej aktywności kaspaz oraz
internukleosomalnych cięć DNA, które są widoczne w procesie apoptozy [15]. Uważa się że
proces ten zależy od trzech czynników tj. cytrulinacji histonów, uwolnienia reaktywnych form
tlenu (ang. reactive oxygen species, ROS) oraz autofagii [1].
Dowiedziono, że histony podlegają wielu modyfikacjom potranslacyjnym, z których
istotną dla NETozy jest deiminacja (cytrulinacja) reszt guanidynowych arginin w histonach

20
H2A, H3 oraz H4. Znanych jest 5 izoform deiminazy peptydyloargininy (ang.peptidylarginine
deiminase, PAD), które zdolne są do przeprowadzenia takiej deiminacji, z których PAD4 jest
postacią najczęściej opisywaną. PAD4 katalizuje konwersję reszt argininy do polipeptydów
cytrulininy, tym samym eliminując dodatni ładunek białka. Zatem cytrulinowanie histonów
osłabia stabilność nukleosomów [16]. Utrata ładunków dodatnich powoduje otwarcie zwartej
struktury chromatyny i umożliwia dekondensację chromatyny w postaci NET. Dotychczas nie
udało się odkryć jak aktywność i ekspresja PAD4 może regulować funkcje neutrofili, choć
z pewnością cytrulinacja jest bardzo ważnym, ale niewystarczającym elementem
modyfikującym przebieg NETozy. Prawdopodobnie konieczne jest uruchomienie
dodatkowych mechanizmów, dzięki którym możliwe jest formowanie się sieci NET [17].
ROS odgrywają znaczącą rolę w uwolnieniu chromatyny do przestrzeni pozakomórkowej.
Powstanie ROS zależy od dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (ang. nicotinamide
adenine dinucleotide, NADPH), szlaków Raf-MEK_ERK i p38MAPK. Prawidłowo
pobudzone neutrofile aktywują oksydazę NADPH, przyczyniając się do produkcji
nadtlenków, natomiast zahamowanie kompleksu oksydazy NADPH np. przez difenylenodiod
(ang. diphenyleneiodonium, DPI), blokuje uwolnienie sieci NET [18].

6.2.Autoimmunologiczne zapalenie wątroby

Autoimmunologiczne zapalenie wątroby jest chorobą przewlekłą o podłożu
immunologicznym, z częstością występowania w Europie od 10 do 17 na 100 000 osób [19].
AIH może przebiegać bezobjawowo lub występować w różnych postaciach, od choroby
subklinicznej po ostrą i schyłkową niewydolność wątroby [20]. Rozpoznanie AIH opiera się
na obecności swoistych przeciwciał, w tym przeciwciał przeciwjądrowych (ang. anti-nuclear
antibodies, ANA), przeciwciał przeciwko mięśniom gładkim (ang. anti-smooth muscle
antibodies, ASMA), przeciwciał przeciwko mikrosomom wątrobowym/nerkowym
typu 1 (ang. anti-liver kidney microsomal type 1, anty-LKM1) oraz przeciwko
rozpuszczalnemu antygenowi wątroby/trzustki (ang. antibodies against soluble liver /
pancreas antygen, anty-SLA) z podwyższonym stężeniem immunoglobuliny G (ang.
immunoglobulin G, IgG) w surowicy. Ze względu na profil przeciwciał AIH można podzielić
na 3 podtypy (autoimmunologiczne zapalenie wątroby typu I, II i III) i kryptogenne zapalenie
wątroby. Kryteria diagnostyczne AIH obejmują również charakterystyczne objawy
histologiczne (zapalenie wrotne, zapalenie wątroby międzyfazowe i zrazikowe zapalenie
wątroby o różnym nasileniu). Leczenie opiera się na kortykosteroidach i immunosupresji.
Stosowane są również leki biologiczne i terapie komórkowe. Przeszczep wątroby wykonuje

21
się u pacjentów z ciężką niewydolnością wątroby w przebiegu ostrego AIH oraz u pacjentów
z już rozwiniętą LC, a następnie rakiem wątrobowokomórkowym (ang. hepatocellular
carcinoma, HCC) [21].
Proces zapalny w przebiegu AIH ma charakter ogólnoustrojowy. Ocena zaburzeń
innych narządów wymaga wykonania badań dodatkowych. Początek choroby jest
prawdopodobnie związany z upośledzoną funkcją limfocytów T [22], rozwojem mimikry
molekularnej [23], dysbiozą jelitową [24] oraz naciekiem LDG [25], które wykazują cechy
komórek reaktywnych i wraz z autoprzeciwciałami (tj. ANA, ASMA) implikują tworzenie
NETs. Rozwój NETs w przebiegu procesu chorobowego warunkuje nieprawidłową
odpowiedź immunologiczną a tym samym nasilenie stanu zapalnego oraz uszkodzenie
tkanek [26]. W rozwoju i utrzymywaniu się stanu zapalnego w AIH prawdopodobnie aktywną
rolę odgrywają komórki LDG oraz LDG wykazujące ekspresję MPO+. Cytometryczna ocena
odsetka LDG, w tym frakcji LDG MPO+ u pacjentów z AIH, może przyczynić się do
poprawy interpretacji diagnostycznej wyników badań chorego. Mogą one stanowić markery
potencjalnie użyteczne w bardziej precyzyjnym diagnozowaniu AIH, jak również
w określaniu jego nasilenia. Uzyskane dane pozwolą na diagnostykę stanu zapalnego
w przebiegu AIH, stanowiąc jednak jedynie pomocnicze markery reakcji zapalnej.
Dodatkowo uzyskane wyniki pozwalają na stwierdzenie, że istnieje pewna potencjalna rola
powyższych markerów w nieinwazyjnej ocenie stopnia LC.
Niemniej jednak analizując dostępną literaturę, wydaje się, że mimo wielu
przeprowadzonych dotąd badań, wciąż istnieje luka w analizie i roli LDG w AIH,
a przedstawione badania w części wypełniają tę lukę.

6.3.Zwłóknienie wątroby w AIH (ang. autoimmune heptitis)

Szacuje się, że na przewlekłą chorobę wątroby (ang. chronic liver disease, CLD)
(niezależnie od stopnia zaawansowania) cierpi 1,5 billiona ludzi na świecie. Następstwem
CLD jest zwłóknienie wątroby, wywołane przez wiele czynników(tj. niealkoholową
stłuszczeniową chorobę wątroby (ang. nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD), chorobę
alkoholową, zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B (ang. hepatitis B virus, HBV) lub
zapalenie wątroby typu C (ang. hepatitis C virus, HCV), choroby autoimmunologiczne,
zaburzenia cholestatyczne oraz przeciążenia żelazem lub miedzią). LC rozwija się po
długotrwałym stanie zapalnym, które prowadzi do odwracalnego zastąpienia zdrowych
hepatocytów tkanką włóknistą i guzkami regeneracyjnymi, i powoduje rozwój rozwoju

22
nadciśnienia wrotnego. Postępujące nadciśnienie wrotne, zapalenie ogólnoustrojowe
i niewydolność wątroby tworzą złożony obraz patologiczny choroby. Leczenie LC ma na celu
walkę z przyczynami i powikłaniami, w niektórych przypadkach wiąże się z koniecznością
przeszczepu wątroby [27].

6.4.Neutrofile o obniżonej gęstości – LDG (ang. low density granulocytes)

W krwi obwodowej obserwuje się dwie populacje komórek, tj. leukocyty

o wielopłatowym jądrze (ang. polymorphonuclear leukocytes, PMN), zawierające w swoim
wnętrzu charakterystyczne ziarnistości stanowiące ok. 50-70% wszystkich leukocytów krwi,
głównie neutrofile oraz komórki o jednym niepodzielonym jądrze (ang. peripheral blood
mononuclear cells, PBMC) głównie limfocyty. LDG to granulocyty obojętnochłonne, które
po rozdzieleniu w gradiencie gęstości pozostają we frakcji PBMC [15]. Kiedy opisano LDG
po raz pierwszy, zauważono, że są one charakterystyczne dla chorób reumatologicznych,
takich jak SLE [28]. Nowsze prace opisują występowanie LDG w różnych chorobach, takich
jak astma [29], gruźlica [30], zapalenie stawów [31], nowotwory [27], posocznica [32],
HIV [33]. Zostały zaobserwowane również w zwierzęcych modelach infekcji wirusowej np.
(ang. classical swine fever virus, CSF) [34]. Dodatkowo poza wspomnianym wyżej SLE,
LDG zaobserwowano w różnych chorobach o podłożu autoimmunizacyjnym, w tym
w łuszczycy [35] oraz RZS [36].
Podobnie jak dojrzałe neutrofile o normalnej gęstości (ang. normal density granulocytes,
NDG), LDG wykazują silną ekspresję charakterystycznych markerów powierzchniowych
CD15, CD10, CD11b, CD11c i CD16 wykrywanych z użyciem cytometrii przepływowej, ale
w przeciwieństwie do NDG, kształt jądra wskazuje na młodsze formy szeregu rozwojowego
granulocytów [37]. W praktyce, do rozróżnienia LDG od NDG stosuje się dodatkowo
odpowiednie sterylne podłoże gradientowe. Podłoże to, pozwala odseparować frakcję PBMC,
w której znajduje się populacja LDG od erytrocytów, dojrzałych granulocytów i osocza. LDG
wykazują cechy komórek prozapalnych, po aktywacji mogą uszkodzić komórki śródbłonka
i uwolnić dużą ilość czynników TNF-α, interferonów typu I i II (IFN) oraz NETs [38]. Coraz
więcej dowodów wskazuje, że niekontrolowane lub nadmierne uwalnianie NETs jest
związane z zaostrzeniem stanu zapalnego oraz rozwojem autoimmunizacji [26].

23
6.5. Rozszerzone parametry stanu zapalnego – EIP (ang. extended inflammation
parameters)
W diagnostyce laboratoryjnej stanu zapalnego od niedawna możliwe jest
wykorzystanie niestosowanych rutynowo parametrów hematologicznych, informujących
o stanie aktywacji komórek układu odpornościowego. Parametry te dostępne są
w analizatorach hematologicznych firmy Sysmex Diagnostic jako rozszerzone parametry
stanu zapalnego - EIP, do których zaliczamy takie deskryptory jak: RE-LYMP, AS-LYMP,
neutrofile aktywowane NEUT-RI oraz NEUT-GI.
Parametry RE-LYMP oraz AS-LYMP dostarczają informacji o ilości we krwi
obwodowej odpowiednio: wszystkich limfocytów reaktywnych i limfocytów reaktywnych
wydzielających przeciwciała. Populacje limfocytów rozróżniane są na podstawie ich
funkcjonalności i wynikających z tego różnic w strukturze wewnętrznej, obecnych
ziarnistości oraz wielkości analizowanych komórek. Parametry dotyczące neutrofili, czyli
NEUT-RI, NEUT-GI informują, na jakim etapie aktywacji znajdują się granulocyty
obojętnochłonne. W pomiarze uwzględniona jest aktywność metaboliczna neutrofili, struktura
wewnętrzna oraz wielkość komórki [39]. Parametry te w powiązaniu z danymi klinicznymi
mogą stanowić użyteczne narzędzie pomocnicze w diagnostyce rozwoju reakcji zapalnej
w przebiegu AIH.
W ostatnich latach zaczęto również podkreślać rolę wyliczanych parametrów stanu
zapalnego, a zwłaszcza wskaźników NLR, PLR, RPR, MPR oraz RLR jako potencjalnych
markerów diagnostycznych w różnych patologiach.
Okazało się, że niektóre z nich mogą znaleźć zastosowanie jako markery
w autoimmunizacyjnych chorobach skóry [40,41,42], w przebiegu chorób
nowotworowych [43,44], nieswoistym zapaleniu jelit [45] czy chorób
sercowo-naczyniowych [46]. Niektóre doniesienia wykazały również ich udział w chorobach
wątroby [39-41]. Te wyliczane wskaźniki hematologiczne u pacjentów z chorobami wątroby
były zwykle postrzegane jako potencjalne wskaźniki marskości wątroby. Zdecydowana
większość badań dotyczy roli NLR i PLR w dekompensacji zwłóknienia wątroby lub rozwoju
HCC z powodu ścisłego powiązania między patologiami wątroby a stanem zapalnym. NLR
odzwierciedla ogólnoustrojową odpowiedź zapalną a wzrost wartości koresponduje ze
wzrostem śmiertelności u pacjentów z LC [47]. Wskaźnik ten jest często przytaczany jako
czynnik prognostyczny m. in. w przebiegu ostrych zespołów wieńcowych [46] czy też
nowotworów [43,44].

24
 PLR badano głównie wśród pacjentów z przewlekłym HBV/HCV. Niższe wartości
tego parametru towarzyszyły bardziej zaawansowanemu zwłóknieniu wątroby, ale liczba
przeprowadzonych badań jest niewielka. Z drugiej strony, wysoki poziom PLR (wraz z NLR)
odnotowano u pacjentów z bardziej zaawansowanym HCC i większym ryzykiem nawrotu
choroby [48]. Wydaje się, że PLR jest jak dotąd badany wśród patologii wątroby tylko
u pacjentów z pierwotnym zapaleniem dróg żółciowych (ang. primary biliary cholangitis,
PBC) i osób dotkniętych ostrym zakażeniem wirusem zapalenia wątroby typu E (ang.
hepatitis E virus, HEV). Był markerem zwłóknienia wątroby o większej dokładności
diagnostycznej w porównaniu z APRI, FIB-4 i RPR w przebiegu PBC oraz markerem
zakażenia HEV u pacjentów objawowych [49].
Niemniej jednak wskaźniki te były dotychczas wyłącznie przedmiotem badań
naukowych, a nie elementem codziennej praktyki klinicznej. Biorąc pod uwagę powyższe
przykłady, wymienione markery wydają się być szczególnie przydatne w diagnostyce nagłej
dekompensacji funkcji wątroby w przebiegu jej przewlekłej niewydolności.
Według naszej wiedzy nie ma badań dotyczących roli badanych markerów EIP oraz
wyliczanych wskaźników stanu zapalnego w AIH. Nieliczne badania poruszają rolę
nieinwazyjnych wyliczanych markerów stanu zapalnego w przewidywaniu stopnia LC
u pacjentów z AIH. Mając na uwadze ogólnoustrojowy charakter AIH wydaje się istotne
poszukiwanie wskaźników przydatnych diagnostycznie do wykrywania zwiększonej
ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej, która jest nierozerwalnie wpisana w przebieg tej
choroby. Ze względu na obecność stanu zapalnego jako kluczowego elementu AIH
postanowiliśmy zweryfikować rolę EIP oraz wyliczanych wskaźników stanu zapalnego
w diagnostyce AIH.

Przedstawione powyżej problemy badawcze stały się inspiracją do przeprowadzenia

badań w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej. Publikacje wchodzące w skład
przedstawianego cyklu pracy doktorskiej stanowią uzupełniającą się całość dotyczą oceny
przydatności diagnostycznej wybranych wykładników molekularnych NETozy oraz oceny
przydatności diagnostycznej wybranych ogólnoustrojowych markerów stanu zapalnego oraz
EIP, jako wskaźników ogólnoustrojowego nasilenia stanu zapalnego w AIH.
Przedstawiona praca jako pierwsza prezentuje charakterystykę wybranych wykładników
NETozy oraz wyliczanych wskaźników stanu zapalnego jako wykładników
ogólnoustrojowego nasilenia stanu zapalnego w AIH.

25
 7. Cel pracy

Celem niniejszej pracy doktorskiej była ocena molekularnych wykładników NETozy

w chorobach autoimmunizacyjnych.
Celami szczegółowymi były:
1) Poznanie pośrednich i bezpośrednich metod wizualizacji procesu NETozy.
2) Zapoznanie się z etiopatogenezą i strategiami diagnostycznymi
w autoimmunologicznym zapaleniu wątroby.
3) Ocena wykładników stanu zapalnego i NETozy - granulocytów o niskiej gęstości
(LDG) jako biomarkerów w autoimmunologicznym zapaleniu wątroby.
4) Ocena przydatności diagnostycznej wybranych wyliczanych wskaźników
hematologicznych oraz rozszerzonych parametrów stanu zapalnego jako
wykładników ogólnoustrojowego nasilenia stanu zapalnego w AIH.
5) Oceny istniejących zależności pomiędzy wymienionymi parametrami w AIH oraz
ocena przydatności tych markerów w zwłóknieniu wątroby.

8. Materiały i metody

Badanie objęło grupę 105 osób:

1. Zdrowi wolontariusze (n = 50);
2. Pacjenci z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby, diagnozowani i leczeni
w Samodzielnym Publicznym Szpitalu Klinicznym Nr 4 Katedry i Kliniki Gastrologii
Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, (n = 55 w tym n=18 z LC).

Materiałem do badań była krew pozyskana z żyły łokciowej. Pobranie krwi odbywało
się w godzinach porannych od pacjentów będących na czczo. Analizę odsetka LDG oraz
LDG wykazującej ekspresję MPO+ wykonano przy użyciu metody cytometrii przepływowej.
Oznaczenia hematologiczne: WBC, PLT, RE-LYMP, AS-LYMP, NEUT-RI, NEUT-GI,
RBC, NEUT, LYMP, MONO, IG, RDW-SD, MPV oraz MCV wykonano z zastosowaniem
aparatu firmy Sysmex XN 1500. Oznaczenia parametrów biochemicznych: CRP, GGTP,
ALT, AST, ALP oraz bilirubiny wykonano przy użyciu aparatu Cobas 6000 firmy Roche.
Spośród tych parametrów, zostały wyliczone wskaźniki hematologiczne: wskaźniki NLR,
PLR, RPR, MPR, RLR oraz wskaźniki serologiczne: AAR, APRI, FIB-4 oraz GPR.

26
Izolacja neutrofili o niskiej gęstości
Pełną krew obwodową przeniesiono do probówki typu Falcon o pojemności 15 ml
i rozcieńczono w stosunku 1:1 zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej bez jonów
wapnia i magnezu (PBS, Biomed). Następnie rozcieńczoną krew nawarstwiono powoli na
odczynnik Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich) w stosunku 2:1 (czyli dwukrotnie mniejszą
objętość niż krwi). Zastosowany odczynnik charakteryzuje się gęstością (d = 1,077 g/ml),
która pozwala odseparować frakcję PBMC, w której znajduje się populacja LDG od
erytrocytów, dojrzałych granulocytów i osocza. Próbki wirowano po nawarstwieniu przez 20
minut przy 1360 × g w temperaturze pokojowej z opcją powolnego rozpędzania i hamowania
rotora w wirówce. Następnie po wirowaniu w gradiencie gęstości otrzymano frakcję PBMC
znajdującą się w interfazie pomiędzy warstwą osocza a zastosowanym odczynnikiem
Histopaque, oraz na samym dnie probówki frakcję erytrocytów wraz z granulocytami. Na
samym początku zebrano frakcję PBMC, gdzie osadziły się LDG. W kolejnym etapie
komórki te oczyszczono poprzez dodanie 3 ml zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej
bez jonów wapnia i magnezu (PBS, Biomed) i wirowano 500 × g przez 5 minut. Usunięto
supernatant, a otrzymany izolat przeznaczono do analizy cytometrycznej.

Analiza żywotności badanej populacji neutrofili LDG za pomocą cytometrii

przepływowej

Ocenę żywotności LDG wykonano w izolacie komórkowym, który pozyskano z frakcji

PBMC wirując w gradiencie gęstości (odczynnik Histopaque, ThermoFisher Scientific) przed
analizą cytometryczną. Zastosowano jodek propidyny (IP) (eBioscience Propidium Iodide,
ThermoFischer Scientific)w celu wybarwienia komórek apoptotycznych (PI-). Do 100 µl
izolatu neutrofili LDG (1×106 komórek) dodano 10 µl PI po czym komórki inkubowano przez
5 minut. Następnie dodano 2 ml zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej bez jonów
wapnia i magnezu (PBS, Biomed) i wirowano 5 minut przy 300 × g w wirówce (Centrifuge
5810R, Eppendorf). Supernatant odrzucono, a wyznakowane neutrofile LDG zawieszono
w 400 µl zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej bez jonów wapnia i magnezu. Wkrótce
potem, próbki poddano analizie cytometrycznej. Wykazano, że populacja LDG (PI-)
charakteryzowała się zbliżoną, wysoką żywotnością w grupie kontrolnej i badanej (>98%).
Minimalna żywotność w obu grupach wynosiła >75%, natomiast maksymalna 99%.

27
 Immunofenotypowanie
Na początku cytometr przepływowy Navios (Beckman Coulter) kalibrowano stosując
kulki fluorescencyjne (Flow Check Pro Fluorospheres) w trzech wielkościach. Do kalibracji
lasera niebieskiego (488 nm) zastosowano kulki o wielkości 10 µm, dla lasera czerwonego
(635 nm) zastosowano kulki o wielkości 6 µm oraz dla lasera fioletowego (405 nm)
zastosowano kulki wielkości 3 µm.
W celu oznaczenia immunofenotypu LDG, otrzymany izolat komórkowy podzielono
na dwie części. Jedną część frakcji PBMC inkubowano z przeciwciałami monoklonalnymi
CD10-PE-Cy5, CD14-PE oraz CD15-FITC (Becton Dickinson) w ilości po 10 µl przez 20
minut bez dostępu światła w temperaturze pokojowej. Po czym próbki wirowano 300 × g
przez 5 minut. Supernatant odrzucono, a wybarwione neutrofile LDG poddano analizie
cytometrycznej.
Drugą część frakcji PBMC poddano permeabilizacji błony komórkowej w celu
wybarwienia wewnątrzkomórkowej MPO. Do permeabilizacji wykorzystano zestaw Cell
Fixation and Permeabilization Kit (Abcam). W tym celu komórki inkubowano najpierw
z przeciwciałami monoklonalnymi wybarwiającymi antygeny zewnątrzkomórkowe. Dodano
po 10 µl przeciwciał monoklonalnych CD10-PE-Cy5 oraz CD15-FITC i inkubowano przez
20 minut bez dostępu światła w temperaturze pokojowej. Następnie dodano 3 ml
zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej bez jonów wapnia i magnezu i wirowano 300 × g
przez 5 minut. Supernatant odrzucono, a do osadu komórkowego dodano 100 µl Reagentu A,
składającego się z formaldehydu, który utrwala komórki. Osad komórkowy inkubowano
następnie przez 15 minut w temperaturze pokojowej. W kolejnym etapie dodano 3 ml
zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej bez jonów wapnia i magnezu i wirowano 300 × g
przez 5 minut. Supernatant odrzucono, a do osadu komórkowego dodano 100 µl Reagentu B,
który permeabilizuje błonę komórkową, wywołując jej częściową dezintegrację, poprzez
utworzenie szczelin w błonie komórkowej, co ułatwia przenikanie przeciwciał skierowanych
przeciwko antygenom wewnątrzkomórkowym. W następnej kolejności, dodano 10 µl
przeciwciała monoklonalnego MPO-PE (Becton Dickinson) i inkubowano przez 15 minut bez
dostępu światła w temperaturze pokojowej. Po tym czasie, dodano 3 ml zbuforowanego
roztworu soli fizjologicznej bez jonów wapnia i magnezu i wirowano 300 × g przez 5 minut.
Supernatant odrzucono, a do wybarwionych neutrofili LDG dodano 500 µl zbuforowanego
roztworu soli fizjologicznej bez jonów wapnia i magnezu i poddano analizie w cytometrze
przepływowym. Przy każdej analizie stosowano minimalny przepływ komórek oraz zliczano

28
100 000 komórek. Do analizy otrzymanych wyników wykorzystano oprogramowanie Navios
Software v. 1.0 oraz Kaluza Analysis software v. 2.1 (Beckman Coulter).

9. Analiza statystyczna
Zgromadzone dane przeanalizowano z wykorzystanie oprogramowania statistica v. 13 PL
oraz MedCalc v 15.8 PL. Dystrybucję danych skategoryzowanych przedstawiono za pomocą
odsetków. Normalność rozkładu danych o charakterze ciągłym oceniono za pomocą testu
D`Agostino Pearson. W przypadku rozkładu różnego od normalnego zastosowano testy
nieparametryczne oraz mediany i przedziały międzykwartylowe jako odpowiednio miary
skupienia i rozproszenia danych. W celu oceny różnic pomiędzy zmiennymi ciągłymi
zastosowano test U Manna-Whitneya. Ocenę korelacji pomiędzy zmiennymi przeprowadzono
z wykorzystaniem testu korelacji rang Spearmana. W ocenie przydatności diagnostycznej
wybranych zmiennych (dla których uzyskano wyniki znamienne statystycznie w teście
U Manna-Whitneya lub jeżeli były to parametry nie oceniane rutynowo) w różnicowaniu
odmiennych stanów klinicznych zastosowano analizę krzywych ROC. We wszystkich
analizach wyniki p<0.05 uznawano za istotne statystycznie.

Zgoda Komisji Bioetycznej

Badanie uzyskało zgodę Komisji Bioetycznej przy Uniwersytecie Medycznym
w Lublinie o numerze KE-0254/21/2016 i zostało przeprowadzone zgodnie
z wytycznymi Deklaracji Helsińskiej.

29
 10. Opis publikacji stanowiących rozprawę doktorską

10.1.Artykuł I (A.1)
Artykuł stanowił przegląd aktualnie dostępnej literatury dotyczącej pośrednich
i bezpośrednich metod wizualizacji NETozy. Przedstawiono definicje oraz czynniki
indukujące NETozę, składniki sieci NETs oraz metody obserwacji procesu NETozy.
W celu lepszego zobrazowania i oceny wykładników NETozy wykorzystuje się
mikroskopię elektronową, cytometrię przepływową oraz testy ELISA. Aktualna wiedza
dotycząca tworzenia sieci NET proponuje jakościowe badania mikroskopowe in-vitro.
Metoda ta charakteryzuje się zwiększoną czułością w wykrywaniu powstawania sieci NET
wtedy, gdy proces nie jest nasilony. Jednak wadą tej metody jest brak obiektywizmu oraz
trudność w ocenie ilościowej tego procesu. Dotychczas, pomiary oparte na cytometrii
przepływowej pozwalają na szybką i obiektywną ocenę wielu tysięcy komórek jednocześnie.
Zastosowanie cytometrii ułatwia bezpośrednie wykrywanie komórek produkujących NETs
w próbkach krwi. Z kolei technika ELISA ze względu na prostotę wykonywania oznaczeń
oraz rozpowszechnienie zwalidowanych testów może przyczynić się do rutynowego jej
stosowania jako narzędzia w badaniach przesiewowych.
Badacze powinni wybrać najbardziej odpowiedni marker lub metodę w oparciu
o znajomość odpowiednich wad i zalet. Wadą najpowszechniej stosowanych metod
tj. mikroskopii jest brak obiektywizmu oraz trudność w ocenie ilościowej tego procesu.
W przeciwieństwie do mikroskopii, cytometria przepływowa pozwala na specyficzne,
obiektywne i ilościowe oznaczenie NET w próbkach krwi (ocenianych może być wiele
komórek jednocześnie). Metoda ta jest jednak obarczona kilkoma wadami m. in. wysoką ceną
sprzętu wymaganego do prowadzenia badań oraz konieczności posiadania doświadczenia
w pracy z cytometrem.

10.2.Artykuł II (A.2)
W publikacji 2 przedstawiony jest przegląd literatury dotyczący etiopatogenezy i strategii
diagnostycznych w AIH. W ciągu ostatnich dziesięcioleci dokonał się znaczący postęp
w zrozumieniu patogenezy i diagnostyki AIH, jednak dokładna przyczyna rozwoju tej
choroby jest nadal niepoznana. Coraz więcej badań sugeruje znaczącą rolę NETs
w zaostrzeniu stanu zapalnego oraz wystąpieniu chorób autoimmunizacyjnych, w tym AIH.
Obecnie stosowane systemy diagnostyczne (tj. badanie histologiczne wątroby, badania
laboratoryjne tj. obecność autoprzeciwciał, zwiększona aktywność aminotransferaz,

30
podwyższone stężenie immunoglobuliny G w surowicy), wykazują wysoką czułość
i swoistość, jednak nadal brakuje testu, który w szybki i łatwy sposób przyczyniłby się do
wykrycia tej choroby. Jednak dzięki rozwojowi nauki, istnieje możliwość zgłębiania
najbardziej nietypowych czynników etiologicznych, takich jak NETs lub mikrobiom jelitowy,
które sprzyjają rozwojowi choroby. Wiedza ta w przyszłości mogłaby przyczynić się do
wdrożenia odpowiedniej terapii oraz innowacyjnych metod diagnostycznych.

10.3.Artykuł III (A.3)

Trzecia spośród cyklu prac miała charakter badawczy, a jej celem była ocena
wykładników stanu zapalnego i NETozy oraz ocena przydatności diagnostycznej odsetka
LDG, w tym frakcji wykazującej ekspresję MPO jako wykładników ogólnoustrojowego
nasilenia stanu zapalnego w AIH.
Badaniem objęto grupę 25 pacjentów z AIH (w tym 8 pacjentów z LC) oraz 20 zdrowych
wolontariuszy.
Oznaczenia parametrów biochemicznych wykonano z użyciem aparatu COBAS 6000,
Roche Diagnostics Polska natomiast oznaczenia hematologiczne wykonano z użyciem aparatu
Sysmex XN1500, (Sysmex Europe GmbH).

Od wszystkich badanych pobrano 10 ml krwi żylnej z wykorzystaniem sprzętu

jednorazowego użytku. W pierwszej kolejności krew pobrano do probówek próżniowych na
skrzep, w których przeprowadzono badania biochemiczne: CRP GGTP, ALT, AST. Spośród
tych parametrów, zostały wyliczone wskaźniki: AAR, APRI, FIB-4 oraz GPR. Następnie
krew pobrano do probówek próżniowych, zawierających antykoagulant w postaci soli kwasu
etylenodiaminotetraoctowego (ang. tripotassium ethylenediaminetetraacetic acid, K3EDTA),
aby móc wykonać oznaczenia cytometryczne LDG oraz LDG wykazujących ekspresję
MPO+. Ponadto u wszystkich chorych wykonano oznaczenia hematologiczne: WBC, PLT.

Wyizolowane z krwi obwodowej komórki jednojądrzaste znakowano przeciwciałami

monoklonalnymi sprzężonymi z odpowiednimi fluorochromami (CD15-FITC, CD14-PE,
CD10-PE-Cy5, MPO), a następnie analizowano w cytometrze przepływowym Navios
(Beckman Coulter).

U chorych z AIH zaobserwowano wyższą medianę odsetka LDG (1.2 vs 0.1; p=0.0001)
oraz LDG wykazujących ekspresję MPO+ (0.8 vs 0.3; p=0.0017) w porównaniu do zdrowych
wolontariuszy. Ponadto, odsetek LDG charakteryzował się 100% czułością i 55%
specyficznością (AUC=0.84; p<0.0001), natomiast odsetek LDG wykazujących ekspresję
31
MPO+ charakteryzował się 92% czułością i 55% specyficznością (AUC=0.78; p=0.0001)
w wykrywaniu AIH.
Wyniki tego badania wskazują, że ocena markerów stanu zapalnego, takich jak odsetek
LDG i odsetek LDG wykazujących ekspresję MPO+, może okazać się pomocna
w oszacowaniu zjawiska zwiększonej ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej oraz ocenie
zwłóknienia wątroby, które jest nierozerwalnie związane z dekompensacją funkcji wątroby.
Biorąc pod uwagę powyższe argumenty ocena odsetka LDG, w tym LDG wykazujących
ekspresję MPO+ może okazać się markerem przydatnym w diagnostyce AIH.
W opublikowanych dotychczas pracach badawczych rola LDG w AIH nie była jak dotąd
analizowana. Nasze badanie ma na celu wyjaśnić i zgłębić ten temat dlatego jako grupę
badawczą wybraliśmy pacjentów z AIH.

10.4.Artykuł IV (A.4)
W tym badaniu, podjęliśmy się oceny przydatności rozszerzonych parametrów stanu
zapalnego (RE-LYMP, AS-LYMP, NEUT-RI, NEUT-GI) i ogólnoustrojowych markerów
odpowiedzi zapalnej (NLR, PLR, MPR, RLR, RPR) w diagnostyce AIH przeprowadzonych
na grupie 30 pacjentów z AIH (w tym 10 pacjentów z LC) oraz 30 zdrowych wolontariuszy.
Oznaczenia hematologiczne wykonano z zastosowaniem aparatu Sysmex XN 1500 (Sysmex
Europe GmbH), oznaczenia biochemiczne przy użyciu aparatu Cobas 6000
(Roche Diagnostics Polska). Materiałem do badań była krew pozyskana z żyły łokciowej.
Analizie zostały poddane następujące parametry hematologiczne: WBC, PLT, RE-LYMP,
AS-LYMP, NEUT-RI, NEUT-GI, RBC, NEUT, LYMP, MONO, IG, RDW-SD, MPV, MCV
oraz biochemiczne CRP, GGTP, ALT, AST, ALP i bilirubina. Spośród tych parametrów,
zostały wyliczone wskaźniki hematologiczne: NLR, PLR, RPR, MPR, RLR oraz wskaźniki
serologiczne: AAR, APRI, FIB-4 oraz GPR.
Wyniki przeprowadzonych badań pozwalają sądzić, że w wykrywaniu AIH mają
znaczenie następujące parametry: NEUT-RI, NEUT-GI, RE-LYMP, MPR, PLR, RPR, RLR
i NLR. Pacjenci ze zdiagnozowanym i potwierdzonym AIH charakteryzowali się wyższymi
wartościami parametrów: NEUT-RI (48.05 vs 43.3 [FI]; p<0.0001), NEUT-GI (152.65 vs;
147.40 [SI]; p=0.0001), RE-LYMP (0.07 vs 0.03 [103/µl]; p=0.0001), NLR (2.81 vs 1.42;
p<0.0001), RPR (0.07 vs 0.05; p=0.0007), MPR (0.05 vs 0.04; p=0.0004) w porównaniu do
osób zdrowych. Okazało się, że pod tym względem najwyższą przydatnością diagnostyczną
(AUC>0.90) w wykrywaniu AIH odznaczały się parametry: MPR, PLR, RLR, wysoką
przydatnością diagnostyczną (AUC>0.80) cechowały się: NEUT-RI, NEUT-GI, NLR,

32
natomiast dobrą przydatnością diagnostyczną (AUC>70) odznaczały się parametry:
RE-LYMP, MPR, RPR. Parametry te w powiązaniu z danymi klinicznymi mogą stanowić
użyteczne narzędzie pomocnicze w diagnostyce rozwoju reakcji zapalnej w przebiegu AIH.

Ocenialiśmy także przydatność diagnostyczną EIP oraz wyliczanych wskaźników

stanu zapalnego w różnicowaniu LC i non-LC w AIH. Okazało się, że pod tym względem
najwyższą przydatnością diagnostyczną (AUC>0.90) w różnicowaniu LC i non-LC
odznaczały się parametry: NEUT-GI, MPR, RPR, wysoką przydatnością diagnostyczną
(AUC>0.80) cechował się wskaźnik PLR. Odnotowano znamienną statystycznie, negatywną
korelację w grupie chorych pomiędzy: NEUT-GI a MPR (rho=-0.493; p=0.0056), NEUT-GI
a RPR (rho=-0.477; p=0.0077) oraz NEUT-GI a FIB-4 (rho=-0.659; p=0.0001). Ponadto,
zaobserwowano znamienną statystycznie, umiarkowaną, dodatnią korelację w grupie AIH bez
LC pomiędzy RE-LYMP a PLR (rho=0.641; p=0.0013) oraz znamienną statystycznie, ujemną
korelację pomiędzy NEUT-GI a FIB-4 (rho=-0.519; p=0.0133).
Podwyższony poziom NEUT-GI u pacjentów z AIH-non LC w porównaniu z grupą
AIH-LC sugeruje znaczenie stanu zapalnego jako tła dla obserwowanych różnic
w wartościach. Marskość wątroby jako końcowy etap różnych patologii wątroby
charakteryzuje się stosunkowo niskim stopniem stanu zapalnego, będącego rodzajem
schorzenia wypalonego.

Zastosowane w naszym badaniu parametry serologiczne włóknienia wątroby zostały

przedstawione jako dodatkowe wskaźniki ze względu na występowanie podgrupy pacjentów
z LC. Dodatkowo, wydaje nam się, że nie były one skorelowane z przedstawionymi tutaj
potencjalnymi nowymi markerami hematologicznymi w przebiegu AIH. Szczególnie istotne
zależności były widoczne w podgrupie pacjentów z rozwiniętą LC.

Wyniki te dają nową perspektywę dla przyszłych badań i postrzegania zarówno

zapalenia, jak i zwłóknienia jako nierozerwalnie związanych zjawisk u pacjentów
z marskością wątroby w AIH.

33
 11. Wnioski
Przedstawiony cykl publikacji przedstawia znaczenie nowych wykładników NETozy oraz
stanu zapalnego u chorych na autoimmunologiczne zapalenie wątroby. Odsetka LDG i LDG
MPO+ oraz niestosowanych rutynowo parametrów hematologicznych, informujących o stanie
aktywacji komórek układu odpornościowego EIP, do których zaliczamy takie deskryptory
jak: RE-LYMP, AS-LYMP, NEUT-RI i NEUT-GI oraz wyliczanych wskaźników stanu
zapalnego (NLR, PLR, MPR, RLR, RPR) i wskaźników serologicznych (AAR, APRI, FIB-4,
GPR).
Wyniki wszystkich zawartych w cyklu tematycznym prac pozwalają na wyciągnięcie
następujących wniosków końcowych:
1. LDG oraz frakcja LDG MPO+ stanowią wykładniki stanu zapalnego i NETozy
w AIH.
2. Cytometryczna ocena odsetka LDG, w tym frakcji LDG MPO+, po odpowiedniej
walidacji mogą stać się użytecznymi markerami w diagnostyce AIH.
3. Oznaczanie parametrów z grupy EIP tj. (NEUT-RI, NEUT-GI, RE-LYMP) oraz
wyliczanych wskaźników stanu zapalnego tj. MPR, PLR i RLR u pacjentów z AIH
może przyczynić się do poprawy interpretacji diagnostycznej wyników badań
chorego.
4. Uzyskane wyniki pozwalają na stwierdzenie, że istnieje pewna potencjalna rola
LDG, w tym frakcji LDG MPO+ oraz NEUT-GI, MPR, PLR, RPR, FIB-4
w nieinwazyjnej ocenie LC.
5. Parametry z grupy EIP oraz wyliczane wskaźniki stanu zapalnego są ściśle
związane z pośrednimi serologicznymi wskaźnikami włóknienia wątroby, co
potwierdza bezpośredni związek między tymi wskaźnikami w przebiegu AIH.
6. Nieinwazyjna laboratoryjna diagnostyka włóknienia wątroby może w przyszłości
zmniejszyć liczbę wykonywanych biopsji wątroby, a co za tym idzie ograniczyć
ryzyko związanych z tą procedurą powikłań.

Podsumowując: w przedstawionym cyklu publikacji skupiliśmy się na wykładnikach

stanu zapalnego i NETozy w AIH. Wyniki wskazują jednoznacznie na obecność LDG
i frakcji LDG MPO+ w PBMC krwi obwodowej u pacjentów z AIH. Powyższe subpopulacje
granulocytów prawdopodobnie odgrywają aktywną rolę podczas rozwoju i utrzymywania się
stanu zapalnego w AIH oraz zachodzącej NETozy. Dodatkowo w przeprowadzonym badaniu

34
zaobserwowano wysoką przydatność diagnostyczną takich parametrów jak: NEUT-RI,
NEUT-GI i RE-LYMP oraz MPR, PLR i RLR w wykrywaniu AIH.

Zgodnie z uzyskanymi danymi, prezentowane markery wydają się być ściśle związane
z serologicznymi wskaźnikami zwłóknienia wątroby. Obserwowane zależności wydają się
być rodzajem nowości w dziedzinie hepatologii. Odkrycia te można postrzegać jako
potencjalną nową koncepcję w diagnostyce i monitorowaniu patologii wątroby.

Wyniki naszego badania mają również aspekt praktyczny, markery te mogą być
potencjalnie użyteczne w bardziej precyzyjnym diagnozowaniu AIH jak również w określaniu
jego nasilenia. Uzyskane dane z pewnością pozwolą na diagnostykę stanu zapalnego
w przebiegu AIH, stanowiąc jednak jedynie pomocnicze markery reakcji zapalnej.

35
12. Bibliografia
1. Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C., Fauler B., Uhlemann Y.
Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 2004; 303: 1532-1535
2. von Köckritz-Blickwede M., Nizet V. Innate immunity turned inside- -out:
antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J. Mol. Med. 2009; 87:
775–783
3. Yousefi S., Gold J.A., Andina N., Lee J.J., Kelly A.M. Catapult-like release of
mitochondrial DNA by eosinophils contributes to antibacterial defense. Nat.
Med. 2008; 14: 949–953
4. Martin S.J., Henry C.M. Distinguishing between apoptosis, necrosis,
necroptosis and other cell death modalities. Methods. 2013: 1; 61(2): 87-9
5. Urban C.F., Reichard U., Brinkmann V., Zychlinsky A. Neutrophil
extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms.
Cell. Microbiol. 2006; 8: 668–676
6. Gabriel C., McMaster W.R., Girard D., Descoteaux A. Leishmania donovani
promastigotes evade the antimicrobial activity of neutrophil extracellular traps.
J. Immunol. 2010; 185: 4319–4327
7. Guimarães-Costa A.B., Nascimento M.T., Froment G.S., Soares R.P.,
Morgado F.N. Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by
neutrophil extracellular traps. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106: 6748–
6753
8. Papayannopoulos V., Zychlinsky A. NETs: a new strategy for using old
weapons. Trends Immunol. 2009; 30: 513–52
9. Korkmaz B., Horwitz M.S., Jenne D.E., Gauthier F. Neutrophil elastase,
proteinase 3, and cathepsin Gas therapeutic targets in human diseases.
Pharmacol. Rev. 2010; 62: 726-759
10. Droeser R.A., Hirt C., Eppenberger-Castori S., Zlobec I., Viehl C.T., et al.
High myeloperoxidase positive cell infiltration in colorectal cancer is an
independent favorable prognostic factor. PLoS One. 2013; 8: e64814
11. Jenssen H., Hancock RE. Antimicrobial properties of lactoferrin. Biochimie.
2009; 91 (1): 19-29
12. Tazzyman S., Niaz H., Murdoch C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis:
subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin. Cancer
Biol. 2013; 23: 149-158

36
13. Reinholz M., Thomas Ruzicka T., Jürgen Schauber J. Cathelicidin LL-37: An
Antimicrobial Peptide with a Role in Inflammatory Skin Disease. Ann
Dermatol. 2012; 24(2): 126–135
14. Neeli I., Radic M. Knotting the NETs: analyzing histone modifications in
neutrophil extracellular traps. Arthritis Res Ther. 2012;14(2):115
15. Ostendorf L., Mothes R., van Koppen S., Lindquist Randall L., Bellmann-
Strobl J. Low-Density Granulocytes Are a Novel Immunopathological Feature
in Both Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica Spectrum Disorder. Front
Immunol. 2019; 10: 13-18
16. Wang Y., Li M., Sonja S., Sarah C., Pingxin L., et al. Histone
hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil
extracellular trap formation. J Cell Biol. 2009; 184(2): 205–13
17. Pingxin L., Ming L., Lindberg M.R., Kennett M.J., Na X., et al. PAD4 is
essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular
traps. J Exp Med. 2010; 207(9): 1853–62
18. Fuchs T.A., Abed U., Goosmann C., Hurwitz R., Schulze I. Novel cell death
program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 2007; 176: 231–24
19. Floreani A., Restrepo-Jiménez P., Secchi M. F., De Martin S., Leung P.S.C., et
al. Etiopathogenesis of autoimmune hepatitis. J Autoimmun. 2018; 95: 133–
143
20. Czaja A. J. Diagnosis and management of autoimmune hepatitis: current status
and future directions. Gut Liver, 2016; 10(2): 177–203
21. Sirbe C., Simu G., Szabo I., Grama A., Pop T.L. Pathogenesis of Autoimmune
Hepatitis-Cellular and Molecular Mechanisms. Int J Mol Sci.
2021;22(24):13578
22. Lu J.G., Ji P., French S.W. The Major Histocompatibility Complex Class II-
CD4 Immunologic Synapse in Alcoholic Hepatitis and Autoimmune Liver
Pathology: The Role of Aberrant Major Histocompatibility Complex Class II
in Hepatocytes. Am J Pathol. 2020; 190(1): 25-32
23. Rojas M., Restrepo-Jiménez P., Monsalve D.M., Pacheco Y., Acosta-Ampudia
Y., et al. Molecular mimicry and autoimmunity. J Autoimmun. 2018; 95:
100–123
24. Wei Y., Li Y., Yan L., Sun C., Miao Q., et al. Alterations of gut microbiome in
autoimmune hepatitis. Gut. 2020; 69(3): 569-577

37
25. Honda M., Kubes P. Neutrophils and neutrophil extracellular traps in the liver
and gastrointestinal system. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2018; 15(4): 206-
221
26. Kim T.L., Kim H., Shim J.S. Neutrophil extracellular traps (NETs) in
autoimmune diseases: A comprehensive review. Autoimmun Rev. 2017; 16
(11): 1160-1173
27. Sagiv J.Y., Voels S., Granot Z. Isolation and characterization of low- vs.
high-density neutrophils in cancer. Methods Mol Biol. 2016; 1458:179–93
28. Hacbarth E., Kajdacsy-Balla A. Low density neutrophils in patients with
systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic
fever. Arthritis Rheum. 1986; 29:1334–42
29. Fu J., Tobin M.C., Thomas L.L. Neutrophil-like low-density granulocytes are
elevated in patients with moderate to severe persistent asthma. Ann Allergy
Asthma Immunol. 2014; 113:635–40.e2
30. Deng Y., Ye J., Luo Q., Huang Z., Peng Y., et al. Low-density granulocytes
are elevated in mycobacterial infection and associated with the severity of
tuberculosis. PLoS ONE. 2016; 11:e0153567
31. Hoffmann M.H., Bruns H., Bäckdahl L., Neregård P., Niederreiter B., et
al. The cathelicidins LL-37 and rCRAMP are associated with pathogenic
events of arthritis in humans and rats. Ann Rheumat Dis. 2013; 72:1239–48
32. Darcy C.J., Minigo G., Piera K.A., Davis J.S., McNeil Y.R. Neutrophils with
myeloid derived suppressor function deplete arginine and constrain T cell
function in septic shock patients. Crit Care. 2014; 18:R163
33. Cloke T., Munder M., Bergin P., Herath S., Modolell M., et al. Phenotypic
alteration of neutrophils in the blood of HIV seropositive patients. PLoS
ONE. 2013; 8:e72034
34. Porntrakulpipat S., Depner K.R., Moennig V. Are low-density granulocytes the
major target cells of classical swine fever virus in the peripheral blood? J Vet
Med Ser. 2001; 48:593–602
35. Lin A.M., Rubin C.J., Khandpur R., Wang J.Y., Riblett M., et al. Mast cells
and neutrophils release IL-17 through extracellular trap formation in
psoriasis. J Immunol. 2011; 187:490–500
36. Wright H.L., Makki F.A., Moots R.J., Edwards S.W. Low-density
granulocytes: functionally distinct, immature neutrophils in rheumatoid

38
 arthritis with altered properties and defective TNF signalling. J Leukoc
Biol. 2016; 101:599–611
37. Zhang S.G., Song Y.X., Shu X.M., Shen H.L., Yang H.B., et al. A simple
method for removing low-density granulocytes to purify T lymphocytes from
peripheral blood mononuclear cells. J Zhejiang Univ Sci B. 2017; 18(7):605-
614
38. Villanueva E., Yalavarthi S., Berthier C.C., Hodgin J.B., Khandpur R., et al.
Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose
immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol.
2011; 187(1):538-52
39. Kowalska-Kępczyńska A., Kasprzycka W., Donica H. Innovative assessment
practices of inflammation. European Journal of Medical Technologies. 2020;
1(26): 1-10
40. Kim D.S., Shin D., Lee M.S., Kim H.J., Kim D.Y., et al. Assessments of
neutrophil to lymphocyte ratio and platelet to lymphocyte ratio in Korean
patients with psoriasis vulgaris and psoriatic arthritis. The Journal of
Dermatology. 2016;43(3):305-10
41. Hu Z.D., Sun Y.I., Guo J., Huang Y.L., Qin B. D., et al. Red blood cell
distribution width and neutrophil/lymphocyte ratio are positively correlated
with disease activity in primary Sjögren's syndrome. Clin
Biochem. 2014; 47(18): 287- 290
42. Yang Z., Zhang Z., Lin F., Ren Y., Liu D., et al. Comparisons of neutrophil-,
monocyte-, eosinophil-, and basophil-lymphocyte ratios among various
systemic autoimmune rheumatic diseases. APMIS. 2017; 125(10): 863- 871
43. Chen L., Zeng H., Yang J., Lu Y., Zhang D., et al. Survival and prognostic
analysis of preoperative inflammatory markers in patients undergoing surgical
resection for laryngeal squamous cell carcinoma. BMC Cancer. 2018;
18(1):816
44. Nakamura K., Nakayama K., Tatsumi N., Minamoto T., Ishibashi T., et al.
Prognostic significance of pre-treatment neutrophil-to-lymphocyte and
platelet-to-lymphocyte ratios in non-surgically treated uterine cervical
carcinoma. Mol Clin Oncol. 2018; 9(2):138-144

39
45. Jeong Y., Jeon S.R., Kim H.G., Moon J.R., Lee T.H., et al. The role of platelet
to lymphocyte ratio and neutrophil to lymphocyte ratio in ulcerative
colitis. Intest Res. 2021;19(1):62-70
46. Sari I., Sunbul M., Mammadov C., Durmus E., Bozbay M., et al. Relation of
neutrophil-to-lymphocyte and platelet-to-lymphocyte ratio with coronary
artery disease severity in patients undergoing coronary angiography.Kaardiol
Pol. 2015;73(12):1310-6
47. Rice J., Dodge J.L., Bambha K.M., Bajaj J.S., Reddy K.R., et al. Neutrophil-
to-lymphocyte ratio associates independently with mortality in hospitalized
patients with cirrhosis. Clin Gastroenterol Hepatol. 2018; 16:1786.e1–91.e1
48. Meng X., Wei G., Chang Q., Peng R., Shi G., et al. The platelet-to-lymphocyte
ratio, superior to the neutrophil-to-lymphocyte ratio, correlates with hepatitis C
virus infection. Int J Infect Dis. 2016;45:72–77
49. Wu J., Zhang X., Liu H., Guo N., Pan Q., et al. RDW, NLR and RLR in
predicting liver failure and prognosis in patients with hepatitis E virus
infection. Clin Biochem. 2019; 63: 24-31

40
13. Kopie opublikowanych prac

41
Artykuł A.1

42
43
44
45
46
47
48
49
Artykuł A.2

50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
Artykuł A.3

66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
Artykuł A.4

82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
14. Oświadczenia współautorów publikacji

101
102
103
104
105
106
107
108
109
110