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    Biotecnologia e DNA Recombinante Por centenas de anos, as pessoas tém consumido alimentos que so produzidos pela aco de mmicro-organismos. Pao, chocolate e molho de soja séo alguns dos exemplos mais conhecidos. Mas {oj somente ha pouco mais de 100 anos que os cientistas demonstraram que as micro-organismos: ‘so responsévels por esses produtos, Esse conhecimento abriu o caminho para o uso de micro- ‘organismos na manufatura de outros produtos importantes. Desde a Primeira Guerra Mundial, 0s mmicr6bios tém sido usados para produzir uma variedade de subst&ncias quimicas, como 0 etanol, ‘a.acetona ¢ o dcido cftrico. Desde a Segunda Guerra Mundial, os micro-organismos tém sido cult- vvados em larga escala para produzir antibidticos. Mais recentemente, os micrdbios e suas enzimas. ‘tém substituldo uma variedade de processos quimicos envolvidos na fabricagao de produtos, como papel, tecdos efrutose, 0 uso de micrébios ou de suas enzimas em vez de substancias quimicas ‘oferece vérias vantagens: os micrébios podem usar matérias primas baratas e abundantes como ‘amido -, podem trabalhar sob temperaturas e presses normais, evitando, portanto, a necessidade de sistemas pressurizados caros e perigosos, e no produzem resfduos téxicos ediff- cols de lidar [Neste capitulo voc aprender sobre as ferramentas e as técnicas que sto utlizadas para pesquisar e desenvolver um produto, Vocé também vverd como a tecnologia do DNA recombinante é usada para investigar surtos de doengas infecciosas e fomnecer evidéncias para tribunals de Justiga em microbiologia forense. Ha trinta anos, pesquisadores sabia que os inter ferons sto agentes antivirisefcazes, Entetan er Te la ‘les descobriram que os interferons s30 espécie~ Pe ee res “especificos,e desta forma, para que pudessem Peete eee ser uilizados em seres humanos, deveriam ser Loe produzdos em eélulas humanss Os pesquisida Saree, ‘es temiam que os interferons tivessem que ser ‘stlizados om quantidades kmitadas sempre. Vook pode pensar em uma mancira de aumentar osu primento de interferons para que eles pudessem fer utilizados no tratamento de doensax? Procure pela resposta nese capitulo. eee tree meprer rs eat Microbiologia 247 Introdugao a biotecnologia ‘OBJETIVOS DO APRENDIZADO 9-1 Compare diferencia bictecrolgia, engenhaia gendtics © tecnciogia do DNA recombinant denies as fungGes de um clone e de um veto na construgo do DNA recombrante. Biotecnologia é ulilizagio de micro-organismos, células ox com- Ponentes celulates pata fazer um produto, Os micrdbios t8m sido utlizados na produsio comercial de alimentos, vacinas, antibié tics ¢ vitaminas ha anos. As bactérias também tém sido usadas ‘na mineracio para extrair elementos valiosos do minério (veja a Figura 28.14, pagina 807). Além disso, as células animaistém sido utlizadas na produgio de vacinas virais desde a década de 1950, ‘Até 0s anos de 1980, os produtos feitos por clulas vivas eram pro- duzidos pela células naturalmente; o papel dos cientistas era en. contrar a célulaapropriada e desenvolver um método de cultivo ‘em larga escala ‘Agora, os micro-orgenismos, bem como as plantas, estio sendo usados como “fibricas” para produair as substincias qui micas que os organismos nao produzem de forma natural, Isso 6 possivel por meio da insergio de genes nas células, um pro: ‘cesso denominado tecnologia do DNA recombinante (rDNA), também chamado de engenharia genética. O desenvolvimento da ‘engenbaria genética esld expandindo, as aplicagbes priticas da Diotecnologia. Tecnologia do DNA recombinante Lembre-se do Capitulo 8 que a recombinacio do DNA ocorre natu- ralmente nos micrébios. Nas décadas de 1970 e 1980, os cientstas tom @ 4s prosenas essjacas Sseuacnd | Um enepara reste sume Um gee stra acts, de mado quslss Alea cease 0 ml do cst nano vaicereutoanpanss possnirsamagers corcxaosiaere, _caimcuamar “Cues auinotogecuee srogsnmes cos para de defeats do soncionta. alabrearao derouses. Con! me ‘Gonos pertoncentos a uma determinada cula de wm organismo podem sor inseridos © expressos em e6llas de outro organise. Microbiologia 249 ‘0 selecionar os organismos que produzem um produto desejado, ‘O organismo selecionado pode ser submetido a mutagdes para pr ‘Soest rele Eee ‘Stuer, ce nesta agp tm plaside, Outre combos da agnor do tans poder oe uniresatcaboucos dos dois fragmentos de ONA, produinds lima molgela de DNA recombinants, cextremidades coesivas idénticas e poderdo ser unidos (recom- binados) in vitro. As extremidades coesivas se unem de modo ‘espontineo por ligagio de hidroginio (pareamento de bases). A ‘enrima DNA-ligase é usada para unir covalentemente os arca- bougos de diferentes moléculas de DNA, produzindo moléculas de rDNA. Vetores, Existe um grande mimero de tipos de moléculas de DNA que po- ‘dom ser utlizadas como vetores, bastando pera isso quc clas te ham certas propriedades A propriedade mais importante ¢ a au- torreplicagdo, uma ver no interior de uma edule um vetor deve ser ‘apa de replicar-se, Qualquer molécula de DNA que for clonada no vetor, também ser replicada nesse processo. Assim, os vetores funcionam como veiculos para a replicagio de sequéncias de DNA de interesse F também necessério que os vetores tenham um tamanho ‘que permit que eles sejant manipulados fora da eélul, datat- te 0 processo de construgio do rDNA. Os vetores menores sio ‘manipulados mais facilmente que moléculas de DNA maiores, ‘que tendem a ser mais frigeis. A preservacio ¢ outra proprie- dade importante dos vetores. A forma circular das moléculas de DNA é1im fator importante para protecta do DNA da vetor da sua eventual destruigio pela célula receptora. Observe na Figura ‘9.8 que o DNA de um plasmideo é circular. Um outro mecanis- ‘mo de preservagio ocorre quando o DNA de um virus se insere rapidamente no cromostome do hospedeir (veja 0 Capitulo 13, pagina 380), ‘Quando é necestirio recupera células contendo vstor a pre- senga de um gene marcador vetoral muitas vezes pode facilitar 0 pprocesao de seleglo, Oo genes marcadorescelecioniveis mais 60 ‘uns sio aqueles para a resistencia a antibiticos ou para enzimas ‘que realizam reagdes failmente identifcaveis. guns dos principais vetoresutilizados atualmente sao plas- ‘midcos, em especial variantes dc plasmidcos com fatores RO DNA plasmidial pode ser clivado com as mesmas enzimas de restriga0 gue © DNA a ser clonado, ficando assim toxlos os fragmentos de DNA com as mesmas extremidades coesvas. Quando os fragmen- Microbiologia 251 tos sto misturados, 0 DNA a ser clonado ¢ inserido no plasmideo (ej a Figura 9.2). Note que outras combinagbes de fragmentos si0 posslveis e podem ocorrer, inclusive a recirculagao do plasmideo sem nenhum fragmento de DNA inserido, ‘Alguns plasmideos sio capazes de subsistir em varias espécies diferentes. Hes sio chamados de vetores bifuncionais e podem ser utlizados para mover sequéncias de DNA clonadas de um organisro ‘para outro, como entre células bacteranas, de leveduras e de mami {eros ou entre céulas bacterianas, de fungos e de vegetais.Os vetores, bifuncionais podem ser muito dteis no procesto de modiicagio ge nética de organismos mulicellares ~ por exemplo, na tentativa de insere genes de resistencia a herbicidas em plantas Um tipo distinto de vetor é 0 DNA viral. Esse tipo de vetor pode normalmente aceitar fragmentos de DNA exégeno muito maiores que 0 tamanho maximo aceito por plasmideos. Apés o DNA ter si inserido no vetor vial, ele pode ser clonado nas ch las hospedeiras do virus. A escolha de um vetor adequado depen. ante [Ossie ‘esenvclve uma nova porede collar =) (2) Procasso oe fusdo de protopastos. G29 (Oy Fustode potpasios deciles deases. Figura 9.5. Fuso de protoplastos. (8) Un cayraa ce uns uso ce protpastos co cles acterans. (B) Fuso de protopests de ces de Bias Arenog ca parede cular cs eperas a celesca ene plo inde even o corte a 68,0 que perrte ce de DNA P 0 quoé um protoptastor cobertas com DNA e arremessadas pelasparedes de células vegetais por uma explosto de hélio, Algumas das céulas expressam 0 DNA introdusido como se Fosse delas préprias 254 Tortora, Funko & Caso Figura 9.6 Uma pistola de genes, que pode ser usada para inserir “projétois"revostdos de DNA em uma célula. P cite outros quatro métodos de inser DNA em una cdlta, (© DNA pode ser introduzido ditetamente em uma célula animal por microinjegio. Essa técnica requer o uso de uma cxopipeta de video com o didmetro muito menor que a célula, A ‘micropipeta perfura a membrana plastica eo DNA pode ser in- ‘roduzido através dela (Figura 9.7). Exist, portanto, uma grande variedade de enzimas de ret ‘o, vetorese métodos para a introdusdo de DNA em células. En- {retanto, o DNA exégeno sobreviveré somente se estiver presente em um vetor utorreplicativo ou se for incorporado em um dos ‘cromossomos da célula por recombinasio. Obtengao do DNA. ‘Vimos como os genes podem ser clonados em vetores com a uti- lizagao de enzimas de resirigdo e como eles podem ser transfor- ‘mados ou transferidos para virios tipos eelulares. Mas como os engenbeiros genéticos obtém os genes em que estio interessados? Existem duas fontes principais: (1) bibliotecas de genes contendo cépias natursis ou cépias de cDNA dos genes produzidos a partir do mRNA e (2) DNA sintético. Bibliotecas de genes O isolamento de genes especificos na forma de fragmentos indi- vviduais de DNA quase nunca é um processo pritico, Por isso, 08 pesquisadores interessados em genes de um determinado organis- mo comesam pela extragio do DNA do organismo, que pode ser obtido de células de planta, animal ou micr6bio, través da lise celular e da precipitagio do DNA. Esse processo resulta em uma, “massa” de DNA que inclui o genoma completo do organisme, Oo Figura 9.7 Amieroinjego de DNA exégeno em um évulo fecunda- ‘do de camundongo. Inisnert. 0 6 imebiizado com o aux de ura Pibea de exvemdade robe. aicande una oe suey (dei). tas entra ce cps do gene de ineress so ent tad ro len Ge oli por meio de ume miropoeta de exec msec ese) P Por que a microinjeste nto ¢ possivel em células bacteranas e fingicas? -Apés o DNA ser dgerdo pela enzimas de restric, 0 frag rmentos de restrigo so ligados em vtoresplasmiciais ou figicos.e os vetores recombinantes so introduzidos na célla baceriana. O objetivo & produzir ums colegio de clones grande sufcente para assegurar 3 existéncia de pelo menos um clone para cada gene do organismo. Essa colegio de clones contendo diferentes fragmentos eDNA ¢ chamada de biblioteca de genes: cada “livro"é uma li- "hagem bectriana ou de fgo que contém um fragmento do geno- sma Figura 98). Essa biblotecas so esenciai para a manutengio a recuperacio de clones; clas podem até mesmo ser adguridas comercialmente. ‘Aclonagem de genes de organismos eucariicosapresent um problema especiica. Os genes de células eucaridticas geralmente ontém éons,seguimentos de DNA que codificam proteins, eine trons, segmentosintergénicos de DNA que néo colticam prote- nas. Quando o RNA transcrito de um gene come est & convertido em mRNA, 0s introns sao removidos (veja a Figura 8.11, pagina 222). Na clonagem de genes de cluls eucariicas, &desevel a ulizagio de versdes dos genes que nfo possuam introns. Isso éne- cessirio porque um gene que incu introns pode ser grande demais para permit que se trabalhe com ele faciment. Alem disso, se esse gene for colocado em uma céula bacteriana, a bactria noe ‘malmente nfo srdcaparde remover os introns do RNA transcito €, por isso, ndoseré capa de produzir o produto proteico comet. Entretanta, um gene artifical que contenha apenas éxons pode ser produzido com a utiizagi de uma enzima chamada de tanscrip- tase reversa, gue sintetiza DNA complementar (€DNA) a partir de um molde de mRNA (Figura 9.9). Essa sintese €o inverso do processo de trnscrigio normal, de DNA para RNA. Uma cépia de DNA € produridaa partir do mRNA pela transcriptase reversa Microbiologia. © genom fragment com Pasmisoo worse ‘ooomoinnte to vesta “oN NA recomnante forage ago votordo eonagom lene bacteano nes one ‘lbtoteca de plasmideos Blblotece do bacterotagos Figura 9.8 Bibliotecas de gones. Cada fragmento de DNA contendo Tare eae tee pe acts ob ais Oe tums cl bacterana ou un 50 P biforoncio uma RFLP de um gone, [A seguir, o RNA é eliminado por digestio enzimtica. A DNA- -polimerase sintetiza, entdo, uma fita de DNA complementar, criando um fragmento de DNA de fita dupla que contém a infor- ‘magio do mRNA. As moléculas de cDNA produzidas a partir de ‘uma mistura de todos os mRNAs de um tecido ot tipo celular po- dem entio ser clonadas para formar uma biblioteca de cDNA. ( método do cDNA é0 mais comum para a obiengio de genes eucaridticos. Uma das dificuldades deste método é que moléculas dde mRNA mais longas podem néo ter uma transcrigao reversa em DNA completa: a transcrigio reversa muitas vezes € abortada,for- ‘mando apenas partes do gene desejado. DNA sintético Em determinadas circunstancias, os genes podem ser produzidos in vitro, com o auxilio de méquinas de sintese de DNA (Figura 9.10) Um teciado da maquina €utiizado para a entrada da sequéncia de rucleotideos desejada, de maneira similar & entrada de letras em tum processador de textos para a composigio de uma frase. Um mi- croprocessador control a sintese do DNA a partir do suprimento de nucleotideos armazenados e dos demais reagentes necessrios. Cadeias de mais de 120 nucleotideos podem ser sintetizadas por este método. A nao ser que o gene seja muito pequeno, virias ca- deias ever ser sintetizadas separadamente eunidas para formar a sua sequencia complet. Obviamente a dficuldade dessa abordagem € que a sequeéncia 4o gene deve ser conhecida antes de ser sintetizada. Se o gene ainda nao foi isolado, a nica maneiea de prever a sequéncia do DNA & 4 partir da sequéncia de aminoscidos do seu produto proteico. Se © Eremas processors no nictoo Teron © NA Goa don Fetons nem 9 ANA dered oS — | © Jcoiamanto de mana e da célula @ adicao de: ects oe, SSS OC Aimar ta © vam Sot Fla do'ONA Sendo snehcade © omAnac cigatco pte ‘nserplass revere, ‘DNA: DNA ‘fo gene Sem inrone Figura 8.9 Produzindo DNA complementar (cDNA) para um gene ‘eucariodee. A uzstipiise rar vali a suse de ONA de lanento sdupo parr de um meld de RNA Pah guste ners iris ‘essa sequéncia de aminodcidos ¢ conhecida, pode-se, em principio, voltar-se no cédigo genético para se obter a sequencia do DNA. Infelizmente, a degeneragio do cédigo genético impede uma deter ‘minagao livre de ambiguidades; asim, sea proteina contém uma leucina, por exemplo, qual dos seis cécons existentes para esse ami nnodcido estaria presente no gene? Por essasrazdes ¢ rara a lonagem de um gene a partir da sin- tese direta, embora alguns produtos comerciais, como a insulina, © interferon ea somatostatina sejam produzidos a partir de genes sintetizados quimicamente. Sitios de restrigio desejados foram acrescentados aos genes sintticos;entao, os genes poderiam ser in seridos nos vetores plasmidiais para a clonagem em E. coli. DNA sintético tem um papel muito mais importante em processos dese lego, como veremos a segui Qual é a pioposta de uma biinteca de genes? 9-9 Por que ni exste CDNA srtético? 9-10 256 Tortora, Funke & Case gura 9.10 Uma miiquina de sintese de DNA. Saquéncas arta de [DNA podem se sinteizadae por arenas com este, P ausis 250 algunas tesantagens de uma miquina de sntese de DNA? Selecionando um clone Na clonagem, & necessério selecionar aquela célula que contenha fo gene de interesse especifico, Isso & dificil, pois, dentre milhoes de células, apenas algumas poucas podem conter o gene desejado. ‘Analisremos um procestotipico conhecido como seeso branca- azul, nome derivado da cor das colonias bacterianas formadas no final do processo de selesio. O vetorplasmiial contém um gene (amp), que coditica resstén cia a0 antbiotico ampicilina, A bactria hospedeira nfo serécapaz de ‘multplicar-se no meio de teste, que contém ampicilna, a ndo ser que ‘9 veto tenha transfrido o gene de resistincia a0 antbidtico, O vetor plasmidial também contém um segundo gene, que coca a enzima B-galactosidase (lacZ). Observe na Figura 9.3 que existem diverss si- ios de acZ que podem ser clivados peas enzimas de restig. 0 procedimento é mostrado na Figura 8.11. Os dois genes, cha- rmados de genes marcadores, slo utilizados para que a introdugio do DNA plasmidial na bactéria hospedeita possa ser determinada, No processo de selegio branca-azul, uma biblioteca de bactérias & cultivada em um meio denominado X-gal. 0 meio X-gal contém, além daqueles elementos necesirios para o crescimento bacteriana ‘normal, outros dois elementos essencais. Um € 0 antibidtico ampici lina, que impede a multplicagio de qualquer bactéria que nio tena recebido o gene de resisténcia 4 ampicilina do plasmideo. 0 auteo, chamado de X-gal, é um substrato para a-gelactosidase Somente as bactérias que tenham assimilado o plasmideo irdo se multiplicar ~ porque elas agora sioresistentes & ampicilina, As bactérias que assimilaram o plasmideo recombinante ~ no qual o ‘novo gene foi inserido no gene lacZ~ nio iri hidrolisar a lactose © produzirio coldnias brancas, Sea bacteria recebeu o plastnideo or ginal contendo o gene lacZ intacto, as céllas irdo hidrolisar X-gal para produzir um composto azul; a col6nia seré azul (Gane galactosidase (aeZ) Sho de stipe © orn exsg00 nero ro Pinkie ‘olor passin pros onzna Pgalactostaes DNA exegono torso iroduaid re paseo. actin © Aa cots ranean ‘Que spare cavers ‘stoi anus no ‘anim DNA exégeno Figura 9.11 Selegde branca-azul, um método de selecio de bac- {gris recombinantes. P pwr © que testa para ser feito pode ainda se dificil. 0 processo s lecionou colénias brancas que sabidamente contém DNA exégeno, ‘mas ainda nao se sabe se 0 DNA exogeno €0 fragmento desejado. Enecestirio um segundo processo para identifica essa bactéras, Seo DNA exogeno no plasmideo codifica um produto identificével, E necessério apenas muliplicar o isolado bacteriano em cultura ¢ testi-lo, Entretanto, em alguns casos, préprio gene deve ser iden Lucado na bacteria hospedeira ‘A hibridizacao de colénias é 0 método comum para a iden- Lifieagio de células portadoras de um gene clonado espectfico, [esse método, devem ser sintetizadas sondas de DNA, que si0 segmentos curtos de DNA de fita simples complementares 20 igene desejado. Se uma sonda de DNA encontrar uma sequencia complementar, ela iri aderit ao gene-alvo. A soada de DNA é ‘marcada com um elemento radioativo ow uum corante fluores- cente para que sua presensa possa ser determinada. A Figura 9.12 Microbiologia 257 oceoee Una pica da placa rast: 6 in ne vo do © otto 6 rata consotopene {SOS} posta a Seen Ftasde — NA bacteria % © fo 8 aad com Iarbedo ce eto (N20) pare soparar as ‘has ine oo ONA, a racionivamerte © Nicoumons KES Ticoneten ioe © A sondanbviiera amo gone dseaco ‘am clos Fecoianes ONAe fa sinoies Fine ovo aso revslado O ore eae ns Tgeda e depos ‘pen a de Coltniae contends ones de nress6 © fie revelado omparado oom a ‘plea para Wertear caer Eortondoc gore oo Placa pics Figura 9.12 Hibrdizagso de colénias:utlizando uma sonda de DDNA para identifcar uma gene de interesse clonado. P 0 que 6 uma sonda de DNA? esquematiza um tipico experimento de hibridizagao de coldnias, [Um arranjo de sonda de DNA posicionadas em um chip pode ser usado para identificar patégenos (veja a Figura 10.17, pagina 293) Fazendo um produto génico Acabamos de ver como identificareélulas que carr ram um determinado gene. Os produtos génicos sto, imuitas veres, objetivo daengenharia genética. A maioria dos tra ballhosiniiais com engenharia genética utlizou E.coli para sinte- tizar produtos génicos. AE. col €facilmentecultivada e a sua ge nética é bastante conhecida pelos pesquisadores. Por exemplo, alguns promotores passives de indusio, come o do operon la, foram clonados, o que permite que genes também clonados sejam ligados a eles. A sintese de grandes quantidades do produto do gene clonado pode entio ser determinada pela adigdo de um ind: tor. Esse método fi utilizado para produzir interferon gama em E coli Figura 9.13). Entretant, Ecol apresena vias desvantagens. Como outras bactérias gram-negativa, ela produz endotoxinas como parte da camada externa da sua parede celular. Como essis endotoxinas causam febre e choque em animais, ental delas em produtos destinados a0 consumo humano seria tum problema grave Outra desvantagem da E. coli que la geralmente ndo secreta Produtos proteicos, Para a obtengio de um produto, as células de- vem ser rompidase a proteina em questio deve ser purifcada da “sopa" de componente celulares resultantes, A recuperagio de um produto de uma mistura como essa é cara quando feta em escala industrial, E mats econémico utilizar um organismo que secreta 0 produto, de modo que ele posa ser continuamente recuperado do Figura 9.19. & col genet {erferon gama, uma proteina humana que promove uma resposta mune. 0 prodio vise! saw como ume sbetinoa de coraeeniace, poe serlberade pela seca cia, P cto uma vantager « uma desvantagem: E col em en- enhara gondtica, st 258 Tortora, Funko & Caso incio de cultivo, Uma opie €ligagdo do produto a uma proteina de E. coli naturalmente secretada pela bactéria. Porém, as bacté- ras gram positvas, como Bacillus subtilis, am uma probabilidade ‘maior de secetar seus produtose, por isso, com frequéncia sto pre- feridas para ullizagio industrial, ‘Outro microbio que vem sendo utilizado como veiculo para expressar os genes modificados por engenharia genética & 0 fer- ‘mento de plo, Saccharomyces cerevisiae. O seu genoma & cerca de quatro vezes maior que 0 de E. cole provavelmente seja 0 geno- ‘ma eucaridtico mais bem conkecido. Os fermentos, ou leveduras, podem carregar plasmideos, que sao facilmente transferidos pars células de leveduras depois que elas tiverem suas paredes celulares removidas, Como célulaseucaristicas, as leveduras podem ter mais sucesso na expressio de genes eucariticos exégenos. Além disso, asleveduras tém uma probabilidade maior de secretarem continua mente 0 produto. Devido a todos esses fatores, as leveduras torna~ ram-se os orgenismos eucariéticos de escolha na biatecnologia. ‘As células de mamiferos em cultura, inclusive as humanas, podem, assim como as bactérias, ser utiizadas em engenharia ge- nética para a produgio de proteinas, Os cientistas desenvolveram ‘métodos eficientes para a manutengao de certascélulas de mami- feros em cultura como hospedeiras para e multipicagio de virus (veja 0 Capitulo 13, pégina 378), Na engenharia genética, as célu- las de mamiferos geralmente sio as mais adequadas para a pro- dugio de proteinas de uso médico; dentzeessas protetas estio os horménios, as citocinas (que regulam as células do sistema imune) © ointerferon (uma substincia antiviral natural, também utlizada 1 tratamento de alguns tipos de cancer). A utilizagio de células {de mamiferos para a obtengio de produtos de genes exégenos em ‘uma escala industrial frequentemente exige uma etapa preliminar, 1 clonagem do gene em uma bactéria. Considere o exemplo do fator estimulador de coldnia (CSF, de colony stimulating factor) (0 CSE 6 uma proteina produzida naturalmente em quantidades reduzidas pelos globulos brancos do sangue. Ele ¢ valioso porque stimula @ multiplicagao de certas células que protegem contra infecsSes. Para a produgio industrial de grandes quantidades de CSE 0 gene é primeiramenteinserido em tum plasmideo, que, pos- teriormente € multiplicado em bactérias (veja a Figura 9.1). Os plasmideos recombinantes sioinseridas em eélulas de mamiferos, ‘que sio multiplicadas em frascos. {As cdlulas vegetais também podem ser multiplicadss em cul- tura,alteradas por técnicas de DNA recombinante e entio pro duridas para gerar plantas modificadas por engenharia genética sas plantas podem series como fontes de produtos valiosos, como os alcaloides vegetais (o anestésico codeina, por exemplo), (0s isoprenoides que sio a base da borracha sintética ea melanina (© pigmento da pele animal) para a utilizaglo em filtros solees, Plantas geneticamente modificadas apresentam muitas vantagens ‘para producdo de agentes terapeuticos humans, incuindo vaci nase anticorpos. As vantagens desse sistema incluem produgio em larga escala e debaixo custo utilizando a agricultara, além de baixo isco de contaminagio do produto de interesse por patdgenos de ‘mamiferos ou por genes causadores de cincer. O desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas com frequénciarequer 0 uso de uma bactéria Retornaremos ao tpico de plantas geneticamente modificadas neste capitulo (pagina 264). ‘TESTE SEU CONHECIMENTO Coma clones recombinants sa eniicados? 9-11 SC Quotipos de cues so utitzados pars clonagen em engenhara ge- nétca?9-12 Aplicagées da engenharia genética OBJETIVOS DO APRENDIZADO 18 Listar pelo menos cinco apScagdes de engenhars genética, Desir RNA. 15 Discutr 0 valor do Polo Genoma Humana, 16 Def os seguirtes termes: sequenclarentoslesttio por shotgun, boivarmétic,prtedmica 8-17 Esquematizr a metodoigia do Southern blotng e fomecer uma apbeagdo desta técnica Esquematizar a metodciogia da fingerprinting de DNA efonecer una apicagdo desta técnica, 19 Esquematzaa engenita genética com Agrobacterium. Descrevemos a sequéncia completa de eventos na clonagem de um gene. Como indicado anteriorment, esses genes clonadas podem ser ulilizados de diferentes maneiras, Uma delasé na produgio de substancias benéficas de modo mais eficente e mais barato (veja ‘9 quadro no Capitulo 1, pagina 3). Uma outra é na obtencio de Informagio do DNA clonado, que é util para pesquisa bisica ou para aplicagSes médicas. Uma terceira é a utilizagio de genes clo- nados para a alteragdo de caracteristicas de eélulas ou organisms. 0 quadiro no Capitulo 27 (pagina 780) descreve o uso de células ecombinantes para a detecyio de poluentes, Aplicagées terapéuticas © horménio insulina, uma pequena proteina produzida pelo pin creas que controla a absorgio de glicose do sangue, é um produto farmacdutico exteemamente valioso, Por muito anos, diabéticas de- pendentes de insulina controlavam sua enfermidade com injegSes e insulina obtida de pancreas de animais abatidos. A obtengio este horménio é um processo caro e, além disso, a insulina de ani mais néo é tio eficaz quanto a humana. Devido ao valor da insulina humana e ao seu pequeno tama ‘ho, a produgdo desta proteina por ténicas de DNA recombinan- te foi um dos primeiros objetivos da industria farmacéutica, Para a producto do hormonio, foram inicialmente construdos genes sintticos para cada uma das duas cadeias polipeptidicas que cons- Liluem a molécula de insulina. O pequeno tamanho dessascadeias ~ com apenas 21 ou 30 aminodcidos de extensio — tornou possivel ‘uso de genes sintéticos, Seguindo o procedimento descrito ante- lormente, cada um dos genes sintticos foi inserido em um vetor plasmidialeligado & extremidade de um gene codificando a en sma B galactosidase, de modo que o polipeptideo da insulina era coproduido com ela, Foram utilizadas duas culturas bacterianas e E, coli, cada uma produzindo uma das cadeias polipeptidicas da Insulina, Os poipeptideos eram entio recuperados da bactria, se- parados da B-galactosidase c unidos quimicamente para produzir ‘ insulina humana Esse foi um dos primeiros sucessos comerciais Microbiologia 259 da engenharia genética e ilusea varios dos princtpios discutidos neste capital, Outro horménio humano que agora esté sendo produzide comercialmente por meio de manipulagio genstica da E.coli 6a somatostatina J houve uma época que eram necessirios $00 mil cérebros de ovelha para a produgéo de 5 mg de somatostatina ani ‘mal para utilizagio experimental, Em contrast, apenas 8 I.de uma cultura de bactérias modificadas por engenbaria genética sio ne cessirios agora para a obtencio de uma quantidade equivalente do horménio humane. ‘As vacinas de subunidades, que consistem apenas de parte de uma proteina de um patégeno,estio sendo produridas por levedu- ras modificadas por engenlnaria genética. As vacinas de subunida des tem sido produidas contra varias doengas, inclusive a hepatite B, Uma das vantagens de uma vacina de subunidades ¢ inexistén cia de risco de infeccio durante a vacinagio. A proteina éobtida de células modificadas por engenharia genética e purficada paraa wti- lizagdo como vacina. Virus animais, como o virus vaccinia, podem, ser modificados para carregar um gene da proteina de superficie de outro micrdbio. Quando injetado, o virus age como vacina contra esse outro micro-organismo. ‘Vacinas de DNA geralmente sio plasmideos circulares que possuiem um gene codificador de uma protelna viral sob 0 con: tole transcricional de uma regito promotora, passivel de ati vagio em células humanas, Esses plasmideos sio clonados em bactérias. Varios testes de vacinas contra HIV, SARS, influenza maliria estio em fase de teste, Um t6pico sobre vacinas é dis- cutide no Capitulo 18 (pagina 501). A Tabla 92 lista outros im- pportantes produtos obtidos por engenharia genética aplicados na terapia médica ‘A terapia génica pode acabar determinando a cura de algu- mas doencas genética. Jé € possivel imaginar a remogio de al: {gumas células de um individu e a transformagdo delas com um [gene normal, de modo a substituir um gene defeituoso ou mutade, Quando essas células fossem devolvidas 20 individuo, elas pode ‘iam funcionar normalmente. Por exemplo, a terapia génica tem sido usada no ratamento da hemofila B e de imunodeficiéncias severas combinadas, Os adenovirus eos retrovirus sio uilizados com mais frequéncia para dstribuir os genes, Entretanto, alguns pesquisadores estio trabalhando com vetores plasmidiais. O pri: ‘iro tratamento com terapia génica usado para tratar hemolilia em seres humanos foi feito em 1999, Um retrovirus atenvado fot _utilizado como vetor, Diversos experimentos com terapia génica estdo sendo realizados, usando adenovirus manipulado genetica- mente catregando 0 gene humano p53 para tratar alguns tipos de cancer. © gene p53, que codifica uma proteina que reprime tumo- res, 60 gene que softe mutagdes com maior frequéncia nas células ( rndimero de experimentos com terapia génica irk aumentar A medida que os avangos tecnolégicos acontecerem e as tentativas inicias obtiverem sucesso. No entanto, uma grande quantidade de estudos preliminares ainéa precisa ser feita,sendo possivel que nao se encontre acura para todas as doengas genéticas. A insersio de ‘DNA antissenso (veja a pigina 267) nas células também esti sendo explorads no tratamento de hepatite, de formas de cincer e de um lipo de doenca de artériacoronéria ices DNA ee — pe ID ereaita doen one norma‘ gone carcrigene {suum gone wal na 7 ‘hid hospedeira ~— ee = <=) {© 74st a0 mRNA —_= je © ressomo usa —— fo complex 66 RNA, = Figura 8.14 O silenciamento génico poderia fomecer o tratamen- to.de diversas doengas. (Ctoplasma Po nWA atua durante ou aps transerigto? O silenciamento génico ¢ um processo natural que ovorre 1a maioria dos organismos e aparentemente representa uma de- fesa contra virus e transposons. Uma nova tecnologia, chama da de RNA interferente (RNAi), vem se mostrando promissora para a terapia genica, no tratamento de ednceres e de infecgoes virais. RNAs de fita dupla, denominados pequenos RNAs de i terferencia (siRNAs, de small interfering RNAs), podem ser in troduzidos em uma célula (Figura 9.14) edirecionadosa um gene em particular, como um gene viral, por exemplo, As moléculas de siRNA se ligam a0 mRNA, causando sua destruicio enzima- ica, 0 que silencia a expressio de um gene. Em camundongos, a tecnologia do RNAi tem mostrado uma inibigio do virus da hepatite B. As moléculas de siRNA podem ser injetadas dizeta ‘mente dentro de uma célula ou previamente introduridas em um velor de DNA. No segundo caso, um pequeno inserto de DNA, codificador de um siRNA contra um gene de interesse, é clona do dentro de um plasmideo: quando o vetor com o inserto f transferido para dentro de uma céltla, aconteceri a producto do SIRNA desejade, ‘TESTE SEU CONHECIMENTO A Explque como a engenhare genes «wea prevengdo ce coengas. 9-13 WF Aqued slenciamento genes? 9-14 ode ser usade pra o vate. 260 Tortora, Funke & Case Tabela 9.2 _Alguns produtos farmacéuticos da engenharia genétic Produto Comentirios ‘Amtitipsina ‘Asia pacientes com enfisema rocude por ovlas genetcamenteaterad, Proteinas morfogenéticas 6eseas Indzam a foemagto da nov sto elena cue da fratra © em chur de econetruto:procuades em aura de ella de manors. Vacina contra @ cancer cervical Consist em proeinas vas procuids om Score. For estimulador de colonia (6SF) Contapie efoto de quimicteapa: melhor a eine contra doeagas neclesas como a As atamento eleucama, produade parE cole S eresoa Fator de erescimontoepidérmice (EGF) Cur formers, queimeduree Uleras:produrido por E cob Ertropoctina (EPO) “Taxamento do anomie; produda em outa de clas de marvfors Fetor VIL “Taxamento do cident vasculares:produzido om cura de oiulas de marr. Fator vill “Tatarento de home; melhor a coagulage;prosuzido om cultura de cll de mamieros. Intortoron ad “Terapia para eucsia, eanoma e hepatte produid po Ecole. cere. iN “Tatamento do score mit; produzdo om culture do ols de manors Ney “Tatamenio do inlamagSes granulometosas rénicas; produto por E cal Vacina contra a hepatite 8 Produzd po Scerovsge que caroga um gene do vu da hopaite om um pasmidoo. Horménio do crescimento humane (NGH) __Corigedeficiéncas do crestimerta am eriangas procure por Ecol Insulina humana “Taxamento do diabetes melhor tlerada que ainsulne exaida de animes; produ pr E col Vacina contra a gripe \Vacina experimental preduzda por E col ou Score carepands os gones do vin. Interoucinas Regula o sistoma inure poss vatamento para cncer:prduaidas por E ot ‘Antcorpos monocionais Possive ttamento para cincer eejegdo de tronsplontes:ulzagos em testes dag: produzidos or ‘satura de ella de maniero (apart dafusto de une cua cancersa com una ella prdutor de ‘ieorpo8) Ortocione (OKs) Articorge monocional wea en paconos submis a transplanta para air na supose do sistora mane, eduindo a chance de rej do ecto transplonade; roduado por els de camundonges. Prd-uroquinase -Articogulat:tatamento de taquescardacos prod po Ecole ved, Pulmozina (hDNAse) Enda uzada na degradagdo de secregbes mucosas em pacientes com fbrose eta produzida em culture decduas de manitr. Retaxina ila pre facta part; produ em Ecol ‘Suporéxido-dismutase (50D) Minimize os danos causedos or radicals de xignio Ines quando osangue& fomecdo novamente a erdos Privados de xno: produada por S corevisie « Karagtzoe pastors loved). “axot Produto vegeta tzado no rataento do cncer de ova prude pa ca _Atvador do plasminogen tissular Disove a fine de cosguassanguneos trapla de staques cardiac: produnda em cutura de (ectivase) rarer, Fotor de necrose tumoral TNF) Causa a dosinegragto de cdl tumeras produ por Ecol Microbiologia 261 0 Projeto Genoma Humano 0 Projeto Genoma Humana, um projeto internacional que durou 13, anos, iniciado oficialmente em 1990 e finalizado em 2003, eavolve mites das novas tecnologias dsponives.O objetivo dese projeto fot sequenciar 0 genoma human completo, o que cortesponde a apeo: ximadamente 3 bilhdes de pares de nucleotideos, compreendendo ‘entze 20 e25 mil genes. Milhares de pessoas em 18 paises participa ram desse projeto. Os pesquisadores coletaram amostras de sangue {mulheres} ou de esperma (homens) de um grande nimero de doa- dores. Somente algumas amostras foram processadas come fontes de DNA, eos nomes dos doadores foram protegidos. Dessa forma, nem ‘0 proprios doadores nem os cientistas saber quais amostras foram, usadas, O desenvolvimento do sequenciamento shotgun (brevemente discutido) acelerou bastante o processo, eo genoma esté quase com- pletamente sequenciado, ‘Uma surpresa encontrada foi que menos de 2%% do genoma humano codificam produtos funcionais ~ os outros 98% estio sendo chamados de "DNA liso’, onde estio inclufdos introns, as extremidades dos cromossomos (chamados de feldmeros) e os lransposons (sequéncias repelitivas que constituem mais da me- tade do genoma humano; veo Capitulo 8, pégina 240), No mo- ‘mento, os cientistas estdo mapeando genes especificas e determi nando suas funges. O préximo objetivo dos pesquisadores & 0 Projeto Proteoma Hamano, no qual irdo mapear todas as proteinas express pela cé- Tuas humanas. No entanto, antes mesmo de ficar pronto, 0 projeto forneceri dados de grande importdncia para a nossa compreensio da Biologia. Ele também sera muito importante para a medicina, especialmente no diagndstico eno tratamento de doensas genéticas, @ 0m sone NA tragmentaco eres, © Fivqmernos de DNA om set Aplicagées cientificas ‘A tecnologia do DINA recombinante pode ser utlizada na obtengéo de produlos, mas essa ndo é a tnica aplicagio importante. Gragas A sua capacidade de produrir muitas cépias de DNA, ela pode fun cionar como uma espécie de “grifica para imprimir DNAY Apés tuma grande quantidade de um determinado segmento de DNA estar disponivel, virias técnicas analitcas,discutidas nesta segio, podem ser ulilizadas na “leitura’ da informagio contida no DNA, Que tipo de informacio pode ser obtido a partir do DNA clo- nado? Um tipo de informagdo € obtide através do processo de se quenciamento de DNA - a determinasio da sequéncia exata de bases nucleotidicas no DN: ‘Uma técnica de sequenciamento do genoma é o sequenci ‘mento aleat6rio por shotgun, Pequenos fragmentos de um genoma io sequenciados, eas sequéncias sio entio montadas com o uso de tum computador. Quaisquer lacunas entre os fragmentos precisam ser encontradas e sequenciadas (Figura 8.15). As sequencias para os igenomas virais completos agora sio relativament faceis de obter. Os genomas da levedusa S, cerevisiae, da E.coli e de mais outeos 170 micrdbios foram mapeados; outros 100 estio em progresso. O Projeto Genoma Humane foi um empreendimento massivo resul- tando no sequenciamento do genoma humano. Os mapas divulga dos estio entze 70 ¢ 99% completos, com algumas lacunas ainda & serem preenchidas. A maioria das lacunas slo sequencias repetidas que nio codificam nenhum gene. Por exemplo, para completar 0 jgenoma de S. cerevisiae fltam somente 7%, mas as regides codifi- cadoras de genes estio 100% complelas, Programas computacionais podem ser usados para procurar repides codificadoras de proteinas, {que podem entdo ser “traduzidas’ por outros programas © Werapom dos sequins © Dwi

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