BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Họ và tên: Bùi Thị Úy Thương MSSV: 20201233

BÀI 1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITO TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
KEJLDAHL

I. Nguyên tắc của phương pháp

Vô cơ hoá mẫu đem phân tích với H 2SO4 đậm đặc, để tăng nhanh quá trình vô cơ hoá cần cho
thêm chất xúc tác.Các hợp chất hữu cơ trong mẫu phẩm bị oxi hoá. C và H tạo thành CO 2 và H2O, N
sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH3 tác dụng với H2SO4 tạo (NH4)2SO4, dùng NaOH đẩy NH3 ra
khỏi dung dịch, cất và thu bằng 1 lượng dư axit boric H 3BO3 chuyển về dạng NH4+, định phân lượng
NH4+ bằng dung dịch H2SO4 chuẩn.
· Giải thích
- Giai đoạn vô cơ hoá
Chuyển các dạng N khác nhau có trong mẫu phẩm về dạng NH 4+. Khi đốt nóng vật mẫu với
H2SO4 đậm đặc, ở nhiệt độ 300-350oC, C và H tạo thành CO2 và H2O, N sau khi được giải phóng ra
dưới dạng NH3. Bản chất của quá trình là phản ứng oxi hoá khử.NH3 sinh ra tác dụng với H 2SO4 tạo
(NH4)2SO4 tan trong dung dịch.
R(NH2)CHCOOH + H2SO4 → NH3 + CO2 + SO2 + H2O
2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
- Giai đoạn cất đạm
Dùng kiềm mạnh NaOH 40% đẩy khí yếu NH3 trong muối ra. NH3 theo hơi nước được cất và
thu bằng lượng dư H3BO3
(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O
Cất bằng hơi nước
2NH4OH + 4H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 7H2O
Xanh
- Giai đoạn định phân
Định phân lượng tetraborat amon bằng dug dịch H 2SO4 chuẩn, qua đó tính được lượng nito có
trong mẫu vật. Sử dụng chất chỉ thị Taxiro cho phản ứng chuẩn độ này
Khi chưa tác dụng với H3BO3, dung dịch có môi trường axit yếu nên có màu tím hồng, sau đó
tác dụng H3BO3 tạo (NH4)2B4O7, môi trường trung tính màu xanh. Tại điểm tương đương có axit H 3BO3
và muối trung tính, dung dịch có màu tím hồng
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O → (NH4)2SO4 + 4H3BO3
Xanh Tím hồng
II. Cách tiến hành

1. Phần chuẩn bị

 Kiểm tra mức nước trong bình đun (tạo hơi nước).
 Kiểm tra các khoá của bộ cất.
 Cho nước máy chạy qua sinh hàn (mở nhỏ và từ từ van nước).
  Đun sôi nước trong bình tạo hơi
 Rửa bộ cất đạm (ống sinh hàn, bình cất)

2. Cất đạm

Mẫu thí nghiệm

Chuẩn bị bình hấp thụ NH3: Cho vào bình tam giác (cỡ 100ml, miệng rộng):

- 20 ml H3BO3 3% (dùng ống đong)

- 2-3 giọt chỉ thị Taxiro (dung dịch sẽ có màu tím hồng)
- Lắp bình vào bộ cất đạm (đuôi ống sinh hàn ngập trong dung dịch )

Cho vào bầu cất (lần lượt)

- 5 ml dịch vô cơ hoá mẫu (dùng micropipet hút dịch)

- 2 ml H2O (để tráng phễu) (dùng micropipet); Đóng khoá bầu cất
- 5 ml NaOH 40% (dùng ống đong)

Tiến hành cất (khoảng 5-7 phút). Sau khi thấy dung dịch trong bình hấp thụ NH3 chuyển từ
màu tím hồng thành màu xanh đợi khoảng 5 phút. Hạ bình, dùng giấy quì tím hứng một giọt nước
ngưng chảy ra từ ống sinh hàn. Thấy giấy đổi màu, đặt bình hứng vào vị trí cũ. Khi không thấy đổi
màu, lấy bình hấp thụ ra khỏi bộ cất, tia nước cất tráng đuôi ống sinh hàn).

Mẫu kiểm chứng

Chuẩn bị bình hấp thụ NH3 : Cho vào bình tam giác (cỡ 100ml):

- 20 ml H3BO3 3% (dùng ống đong)

- 2-3 giọt chỉ thị Taxiro (dung dịch sẽ có màu tím hồng)
- Lắp bình vào bộ cất đạm (đuôi ống sinh hàn ngập trong dung dịch)

Cho vào bầu cất:

- 5 ml NaOH 40% (dùng ống đong)

- 7 ml H2O (5 mL thay cho dịch vô cơ hoá); Đóng khoá bầu cất

Tiến hành cất (khoảng 5-7 phút) và kiểm tra tương tự như mẫu thínghiệm, dùng giấy quì tím
thử điểm kết thúc quá trình cất.

3. Định phân

Định phân lượng (NH4)2B4O7 tạo ra trong bình hấp thụ NH3 bằng H2SO4 0,1N.

Ghi lượng H2SO4 0,1N dùng định phân cho mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng.

IV. Xử lí số liệu
1. Số liệu thí nghiệm
- Lấy thí nghiệm 5ml dịch cất đạm
- Thể tích H2SO4 0,1N dùng định phân mẫu thí nghiệm = 7,6 ml
- Thể tích H2SO4 0,1N dùng định phân mẫu kiểm chứng = 0,1 ml
2. Tính kết quả
 Ta có: VH2SO4 0,1N (cần tính) = VH2SO4 0,1N (thí nghiệm) - VH2SO4 0,1N (kiểm chứng)
= 7,6 – 0,1 = 7,5 ml
Ta có cứ 1ml H2SO4 0,1N à 1,4 mg Nitơ
7,5ml H2SO4 0,1N à 10,5 mg Nitơ
Trong 5ml dd cất đạm có: 10,5 mg Nitơ
à 100ml dụng dịch cất đạm có 10,5x100/5=210 mg ~ 0,21 g Nito
à Hàm lượng Nito là 0,21/100 x 100%= 0,21% (g/ml)
- Biết N chiếm 16% trong Protein
Cứ 16g Nitơ à 100g protein
0,21g Nitơ à 1,3125g protein
5g mẫu có 1,3125 g protein => hàm lượng protein là: 1,3125/5x 100%= 26,25%
Nhận xét kết quả:
- Kết quả thu được có thể thấp hơn thực tế do sai số trong quá trình tiến hành thí nghiệm
- Hàm lượng protein trong mẫu tương đối lớn
Phạm vi ứng dụng của phương pháp: Phương pháp Kjeldahl giúp xác định hàm lượng nito
tổng số có trong mẫu bao gồm cả nito protein và nito phi protein; được sử dụng để ứng dụng phân tích,
kiểm tra thực phẩm, đất, nước thải, phân bón, thức ăn chăn nuôi và các vật liệu khác.
V. CHÚ Ý
- Quá trình vô cơ hóa mẫu phải tiến hành trong tủ hút vì làm thoát khí SO2 độc.
- Rửa sạch bộ cất đạm, phễu bằng nước cất trước khi làm thí nghiệm để tránh lượng đạm còn
sót lại của các thí nghiệm trước.
- Khi cho các hóa chất vào bầu cất phải mở khóa phễu trước, dùng pipet đưa từ từ thành phễu
nhỏ xuống, đặc biệt cẩn thận đối với NaOH 40%. Chú ý không mở khóa phễu đột ngột do làm biến đổi
áp suất gây thất thoát đạm.
-Lượng NaOH cho vào phải đảm bảo dư thừa để có thể đẩy NH3 ra khỏi (NH4)2SO4.
- Khi lắp bình hấp thụ vào bộ cất đạm, đuôi ống sinh hàn phải ngập trong dung dịch để NH 3
phản ứng ngay với dung dịch tránh NH3 bay khỏi dung dịch.
- Thường xuyên kiểm tra ống sinh hàn nếu thấy nóng thì vặn điều chỉnh ngay để NH 3 không bị
bay hơi.
 Bài 2: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN HÒA TAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY
I. Nguyên tắc phương pháp Lowry
- Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa protein và thuốc thử folin. Cường độ màu
của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của
dung dịch protein nghiên cứu với thuốc thử folin, dựa theo đường chuẩn của protein tinh khiết với thuốc thử
này, có thể dễ dàng tính được hàm lượng protein của mẫu nghiên cứu.
- Đây là phương pháp rất nhạy và chính xác, được dùng phổ biến trong việc xác định protein.
Phương pháp dùng đối với protein hòa tan.
- Bao gồm 2 giai đoạn:
 Phản ứng biure: Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide (CO-NH-). Trong môi trường
kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu
xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ. Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide.
  Phản ứng với thuốc thử folin: Thuốc thử folin có chứa axit phosphomolipdic và axit phos-
phovolframic. Các chất này một mặt làm tăng độ nhạy của phản ứng biure, một mặt khác phản ứng với gốc Tyr
và Trp trong phân tử protein. Các axitamin này tham gia trong quá trình tạo phức chất có màu xanh da trời, hấp
thụ cực đại bước sóng ở 750 nm.

- Đo mật độ quang OD. Định luật Lambert – Beer

A = OD = logIoI =εLC
 C : nồng độ chất hấp thụ ánh sáng (mg/ml , mmol/ml)
 L : chiều dày lớp dung dịch
 ε : hệ số hấp phụ phân tử ( đặc trưng cho từng loại chất)
 OD = εLC = kC (k: const)
 OD = f(C) => quan hệ tuyến tính ( trong một giới hạn nhất định về nồng độ )-> xác định lượng
protein thông qua giá trị OD thu được
II. Cách tiến hành
1. Xây dựng đường chuẩn Albumin cho phương pháp Lowry
- Dung dịch gốc protein chuẩn: Albumin huyết thanh bò (BSA-Bovine Serum Albumin):
1 mg/ml
Phương pháp chọn này cần phải làm với protein tinh khiết 99.999%, vì nếu không tinh khiết thì
có thể còn chứa các chất có thể phản ứng với Cu2+ hay phản ứng với những chất khác có trong phản ứng
này, gây ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
- Tiến hành: Chuẩn bị 1 dãy ống nghiệm được đánh số từ 1-6 rồi thực hiện các bước sau
đây:
 Bổ sung lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau tạo dãy ống có nồng
độ BSA (Ci)

Ống falcon 15ml/ ống1nghiệm 2 3 4 5 6

Dung dịch BSA gốc (ml)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
 Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Nồng độ BSA Ci (mg/ml)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Trộn đều bằng vortex thu được dãy ống BSA làm việc có nồng độ Ci

 Thực hiện phản ứng:

Bổ sung lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau vào dãy ống 1 ở trên tạo dãy ống có
cường độ màu khác nhau tùy thuộc nồng độ BSA Ci khác nhau:

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6

Dung dịch C (ml) 5 5 5 5 5 5

Trộn đều để yên 10 phút

Dung dịch Folin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Trộn đều bằng vortex, để yên 20-30 phút rồi đo độ hấp thụ tại bước sóng 750nm (OD750 nm)

OD750nm 0.00 0.078 0.100 0.127 0.153 0.192

Xây dựng đường chuẩn với OD750nm

0.25

0.2
f(x) = 0.173142857142857 x + 0.0217619047619047
R² = 0.950863080853414
0.15
OD 750nm

0.1

0.05

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Nồng độ protein (mg/ml)

2. Phân tích mẫu

- Mẫu thí nghiệm: Mẫu chứa protein được PTN chuẩn bị

2.1. Chuẩn bị dịch protein phân tích

- Dùng ống đong chuẩn bị 20 ml NaOH 0,1N vào trong cốc dung tích 100 ml

- Cân chính xác 0,31 g mẫu; chuyển mẫu vào cối, cho một ít dung dịch NaOH 0,1N từ cốc
vào để làm ẩm
 - Nghiền nhuyễn mẫu; chuyển toàn bộ mẫu vào bình tam giác dung tích 100 ml.

- Tráng sạch cối chày bằng dung dịch NaOH 0,1N còn lại

- Đặt bình mẫu vào nồi đun cách thuỷ để chiết protein trong 15 phút

- Lấy mẫu ra, làm nguội, trung hoà (tới pH 7) bằng HCl 0,1N (dùng đũa thủy tinh chấm
dịch lên miếng giấy thử pH và so với dải màu chuẩn).

- Chuyển mẫu sang bình định mức 100 ml, định mức bằng nước cất tới vạch. Trộn đều.

- Lọc trong, thu dịch lọc protein phân tích.

2.2. Tiến hành phản ứng và đo độ hấp thụ

 Mẫu thí nghiệm:

 Lấy vào ống nghiệm (khô, sạch):

0,3 ml dịch lọc protein (dùng micropipet)

3 ml dung dịch C (hỗn hợp dung dịch A:B=50:1 mới pha) (dùng micropipet)

 Trộn đều. Để yên 10 phút.

 Cho tiếp 0,3 ml dung dịch Folin. Trộn đều (bằng tay hoặc bằng máy trộn Voltex)
 Để phản ứng 20 -30 phút.

 Mẫu kiểm chứng (làm song song với mẫu thí nghiệm ):

 Lấy vào ống nghiệm(khô,sạch):

0,3 ml H2O (dùng micropipet)

3 ml dung dịch C (dùng micropipet)

 Trộn đều. Để yên 10 phút.

 Cho tiếp 0,3 ml dung dịch Folin. Trộn đều (bằng tay hoặc bằng máy trộn Voltex)
 Để phản ứng 20 – 30 phút.

 Đo độ hấp thụ ánh sáng

Đo độ hấp thụ của dung dịch màu của các ống thí nghiệm ở bước sóng 750 nm, với dung dịch
đối sánh là mẫu kiểm chứng. Ghi kết quả.

Sử dụng đường chuẩn protein để tính hàm lượng protein của dung dịch nghiên cứu.
III. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Lượng mẫu: 0.31g thu được 100ml dung dịch
Lấy thí nghiệm 0.3ml
- Đường chuẩn protein: y = 0.1731x + 0.0218 (Hệ số R2 = 0.9509)
Mẫu kiểm chứng: OD750nm = 0.019
 Mẫu TN 1: OD750nm = 0.086
Mẫu TN 2: OD750nm = 0.093
Trung bình OD750nm = 0.0895
 x= (0.0895 - 0.0218) : 0.1731 = 0.3911 (mg/ml)
Ta có 1 ml dung dịch ban đầu có 0,3911mg protein

 100ml dung dịch ban đầu có 39,11 mg protein (hay 0,03911g)

Hàm lượng protein có trong mẫu thí nghiệm là (0.03911*100%):0.31= 12.62%

 Nhận xét kết quả phân tích:

- Từ đường chuẩn trên ta thấy R2 =0,9509 gần với 1 => kết quả đã khá chuẩn nhưng vẫn
còn sai số .
- Hàm lượng protein trong mẫu tương đối cao

IV. CHÚ Ý
* Chuẩn bị dịch phân tích
- Dùng NaOH để nghiền mẫu, chiết vì NaOH giúp phá vỡ cấu trúc màng tế bào ( Cấu tạo từ
Photpholipit). Nhờ phản ứng este hóa, giải phóng toàn bộ protein.
- Đun ổn định ở 90C để tránh biến tính protein vì nhiệt độ quá cao, protein bị biến tính. Còn
nhiệt độ thấp dẫn tới hiệu suất không cao.
- Sau khi chiết protein xong phải trung hòa dung dịch bằng HCl loãng đến pH=7 vì phản ứng
biure diễn ra mạnh trong môi trường kiềm, phụ thuộc vào pH → phải đưa môi trường dung dịch về
pH=7 để ko làm ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng biure.
- Dùng giấy pH làm chỉ thị kiểm tra môi trường trong dung dịch, không dùng phenolphthalein
vì phenolphthalein sẽ làm ảnh hưởng đến màu sắc của dung dịch sau phản ứng biure → mật độ quang
đo được sẽ bị ảnh hưởng.
- Dung dịch trước khi đưa vào máy đo quang phổ phải được lọc kỹ, trong và không có những
hạt lơ lửng vì sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả đo.
* Làm phản ứng màu:
- Dung dịch A: Na2CO3 2% pha trong NaOH 0,1 N => Cung cấp môi trường kiềm.
- Dung dịch B: CuSO4.5H2O 0,5 % pha trong dung dịch natrixitrat 1% bền vững hơn trong
Kali- natrixitrat 1%
- Dung dịch C: hỗn hợp A/B = 50/1
- Dung dịch A có Na2CO3 dùng làm dung dịch đệm duy trì PH. Nếu không có Na2CO3 thì thời
gian đạt tiêu chuẩn sẽ thay đổi.
- Dung dịch B có Cu2+ tham gia phản ứng Biure tạo phức đồng protein màu xanh.
* Đo độ hấp phụ:
- Mẫu TN và mẫu KC phải được tiến hành trong cùng điều kiện, dùng cùng một máy đo quang,
đo cùng lúc.

 PHẠM VI ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP

Định lượng protein tổng trong mẫu với độ chính xác cao
Bổ sung: Phương pháp này chỉ có tác dụng với các protein hòa tan được trong dung dịch =>
Các protein không hòa tan không được phân tích theo phương pháp này
 BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ TỔNG SỐ THEO PHƯƠNG PHÁP
ROZEVICH
I. Nguyên tắc phương pháp Rodzevich
Phản ứng dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm các đường khử ( glucoza, fructoza , mantoza,…) có thể
khử dễ dàng đồng II oxit thành đồng I (Cu2+ -> Cu+) dưới dạng kết tủa màu đỏ Cu2O và qua lượng CuSO4 dư
tính được lượng đường khử
Cơ chế của qá trình xảy ra theo các giai đoạn sau :

- Giai đoạn 1 : Khi trộn 2 dung dịch felin I và felin II với nhau thì xảy ra phản ứng giữa chúng
theo hai giai đoạn. Ngay lập tức tạo thành kết tủa hidroxit đồng màu xanh da trời
CuSO4 + NaOH -> Cu(OH)2 + Na2SO4
(Felin I) (Felin II) kết tủa xanh
Cu(OH)2 tác dụng với muối Kali natri tatrate (có trong dung dịch Felin II) tạo phức đồng không bền,
làm hòa tan kết tủa.
O-CH-COONa
HO-CH-COONa /

Cu(OH)2 + | ® Cu | + H2O

HO-CH-COOK \
O-CH-COOK
Phức trên là phức không bền nên dễ bị các nhóm andehit hay xeton ở trong đường khử khử từ CU2+
thành Cu + và bản thân các đường bị oxi hóa

CHO O-CH-COONa COOH

| / | HO-CH-COONa

(CHOH)4 + 2Cu + H2O ® (CHOH)4 + Cu2O¯ + |

| \ | HO-CH-COONK
CH2OH O-CH-COOK CH2OH (đỏ gạch)

- Giai đoạn 2 : Xác định lường đường thông qua lượng Cu2+ phản ứng

=> Xác định lượng Cu2+ phản ứng thông qua lượng Cu2+ dư
Lượng CuSO4 dư (không tham gia phản ứng) cho tác dụng với KI trong môi trường axit sunfuric sẽ
giải phóng ra iot tự do
2CuSO4 + 4KI + H2SO4 -> I2 + Cu2I2 + 2K2SO4
(khí màu tím )
Chuẩn độ lượng iot tạo thành bằng tiosulfat natri chuẩn , qua đó tính được lượng đường khử trong dung
dịch (chuẩn độ đến khi hết màu tím, dung dịch có màu trắng sữa)

I2 + 2Na2S2O3 -> Na2S4O6 + 2NaI

 Dựa trên thực nghiệm: cứ 1 ml Na2S2O3 0,1N tiêu tốn cho định phân tương ứng với 3,3 mg đường
khử trong mẫu thử

II. Cách tiến hành

1. Chuẩn bị dịch phân tích
- Cân chính xác 5,05g mẫu ( chuối chín) cho vào cối nghiền nhỏ cùng lượng nhỏ nước cất.
Chuyển mẫu vào bình tam giác 100ml. Tráng rửa cối, chày (30ml)
- Cho 2 giọt chỉ thị phenolphthalein vào bình
- Trung hòa mẫu bằng NaOH 5% đến pH =7 ( để trung hòa lượng axit có trong hoa quả nhằm
tránh thủy phân đường) (dung dịch đổi màu phớt hồng thì dừng lại )
- Chiết đường trong bình ổn nhiệt ở 70-80 độ C trong 15 phút
- Làm nguội và kết tủa protein bằng axetat chì 10%
- Loại chì dư bằng NaH2PO4 bão hòa
- Chuyển hỗn dịch vào bình định mức 100ml, định mức tới 100ml bằng nước cất
- Lắc đều, lọc và thu dịch lọc (dịch phân tích)
2. Tiến hành
a. Mẫu thí nghiệm
- Chuẩn bị bình tam giác (50ml)
- Cho vào bình 1ml dịch phân tích
- Tiếp vào 1ml dung dịch Felin I, 1ml Felin II và 2ml nước
- Đun sôi 2 phút ( tính từ lúc xuất hiện bọt khí đầu tiên)
- Làm nguội
- Thêm vào 1ml H2SO4 25% và lắc đều. Thêm tiếp 1ml KI30% lắc đều
- Để phản ứng trong 20 phút
- Chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,1N đến hết màu iot ( dung dịch có màu trắng sữa)
b. Mẫu kiểm chứng
- Chuẩn bị bình tam giác (50ml)
- Cho vào bình 3ml nước cất
- Tiếp vào 1ml dung dịch Felin I, 1ml Felin II và trộn đều
- Đun sôi 2 phút ( tính từ lúc xuất hiện bọt khí đầu tiên)
- Làm nguội
- Thêm vào 1ml H2SO4 25% và lắc đều. Thêm tiếp 1ml KI 30% lắc đều
- Để phản ứng trong 20 phút
- Chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,1N đến hết màu iot ( dung dịch có màu trắng sữa)
III. Một số lưu ý
- Khi chiết chỉ để nhiệt độ từ 70-80 độ C vì nhiệt cao dễ gây ra hiện tượng oxi hóa đường hoặc có
phản ứng Maillard
- Phải kết tủa protein vì nếu để dư protein cùng đường khử sẽ dễ có phản ứng Maillard hay có
protein và Cu2+ sẽ có phản ứng màu Biure dẫn đến sai lệch về nồng độ Cu2+
- Khi tiến hành cho H2SO4 vào trước KI nhằm tạo môi trường cho phản ứng CuSO4 + KI
IV. Xử lí số liệu
- Yêu cầu : Tính hàm lượng đường khử tổng số (%), biết rằng cứ 1ml Na2S2O3 0,1N tiêu tốn cho
định phân tương ứng với 3,3mg đường khử trong mẫu thử
- Xử lí :
 Khối lượng mẫu : 5,05 g thu được 100ml dịch
 Lượng Na2S2O3 ở mẫu thí nghiệm :
Mẫu 1: 1,50 ml
 Mẫu 2: 1,56ml
 Trung bình: 1,53 ml
 Lượng Na2S2O3 ở mẫu kiểm chứng : 2,88 ml

Lượng Na2S2O3 0,1N (cần tính) = Na2S2O3 0,1N(kiểm chứng) -Na2S2O3 0,1N(thí nghiệm)

= 2,88 - 1,53 = 1,35 ml

Ta có cứ 1ml Na2S2O3 0,1N à 3,3mg đường khử

1,35ml Na2S2O3 0,1N à 4,455mg đường khử trong 1ml dịch đường khử

Þ Trong 100ml dịch sẽ có : 4,455 ×10-3×100 = 0,4455 g đường khử.

Þ Hàm lượng đường khử tổng số có trong mẫu là :

0,4455
% đường khử = × 100%» 8,822%
5 , 05

Vậy hàm lượng đường khử tổng số có trong 5,05 g mẫu là 8,822%

 Nhận xét kết quả thí nghiệm:

Hàm lượng đường trong mẫu thí nghiệm tương đối cao
Kết quả thu được có thể sai số so với thực tế do các thao tác trong quá trình tiến hành thí nghiệm chưa
đảm bảo tính chính xác 100%
V. Phạm vi ứng dụng của phương pháp

Xác định hàm lượng đường khử để biết được tính chất của nguyên liệu, hiểu được khó khăn gì trong
công nghệ sản xuất, từ đó có biện pháp khắc phục làm cho quá trình chế biến ít khó khăn, hiệu quả cao hơn.

Đồng thời thuận lợi cho quá trình bảo quản, nâng cao hơn về mặt chất lượng.
 Bài 4 :

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SACCAROSE

(THEO PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN, XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ THEO PHƯƠNG PHÁP DNS)

I. Nguyên tắc:

Khi thủy phân dung dịch saccaroza bằng axit ta được hỗn hợp của hai đường khử
glucoza và fructoza. Định lượng đường khử tạo thành cho phép tính được lượng saccaroza có
trong mẫu thí nghiệm.

C12H22O11 + H2O H +¿ ¿ C6H12O6 + C6H12O6

→

Gulcozo Fructozo
Định phân đường khử bằng phương pháp DNS dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa
đường khử với thuốc thử axit dinitro salicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ
lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dung
dịch đường khử nghiên cứu với thuốc thử DNS, dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucoza tinh
khiết với thuốc thử này, ta sẽ dễ dàng tính được hàm lượng đường khử, cũng như là hàm lượng
sacaroza trong mẫu.

Glucose + DNS oxy hóa OH −¿ ¿ axit gluconic + DNSkhử ( OD540nm)

→

(vàng) (nâu đỏ)

342
a (g) đường khử ó
360
x a (g) saccaroza ≈ 0.95a (g)
II. Cách tiến hành
1. Hóa chất:
- Thuốc thử DNS:
Hỗn hợp: Nước cất 1416ml
3,5 axit Dinitrosalicylic 10,6 g
NaOH 19,8 g à tạo môi trường
Sau khi hòa tan thì cho thêm vào dung dịch :
Muối K-Na tactra kép 306g àđảm bảo bền màu dung dịch
Phenol( nóng chảy ở 50°C ) 7,6 mlà tăng độ nhạy của thuốc thử
Na metabi sulfit ( Na2S2O5) 8,3g à chất khử để đảm bảo không có phản ứng giữa O 2
không khí và đường khử
Chuẩn 3ml thuốc thử DNS bằng HCl 0,1 N với chỉ thị phenolphtalein hết 5-6ml là được.
Thêm NaOH nếu cần.
- Dùng thủy phân saccaroza:
Dung dịch HCl 5%
 Dung dịch NaOH 5% hoặc dung dịch Na2CO3 bão hòa
2. Cách tiến hành:
PHẦN 1. Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp DNS
2.1. Dung dịch glucose gốc : 1mg/ml
2.2. Tiến hành:
Chuẩn bị một dãy ống nghiệm sạch (6 ống).
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Dung dịch glucoso gốc0(ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

Dung dịch DNS (ml) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Trộn đều, đun sôi cách thủy 5 phút, làm lạnh nhanh trong nước lạnh
Đo độ hấp thụ của dung dịch màu tại bước sóng 540nm với dung dịch đối sánh là mẫu
trong ống nghiệm 1.
Yêu cầu: tính toán, đo và điền số liệu vào bảng tiếp theo và vẽ đồ thị đường chắn.
Nồng độ glucose Ci (mg/ml)
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

OD540nm

Dạng đồ thị đường chuẩn glucose (cần dựng)

PHẦN 2. Phân tích mẫu:

 Mẫu thí nghiệm: nước ngọt được PTN pha sẵn không màu, không có ga
1.Thủy phân saccarose
- Cho vào bình tam giác 100ml 0,4 ml mẫu (dùng pipet) không màu, thêm 19ml
nước cất (dùng ống đong) và 10ml HCl 5% (dùng ống đong). Lắp sinh hàn khí và đun sôi cách
thủy 30 phút để thủy phân saccarose.
- Làm nguội và trung hòa mẫu bằng NaOH 5%: ước lượng lượng NaOH trung hòa
(khoảng 14ml). Ta cho trước 10ml vào mẫu sau đó cho từ từ gần với khoảng ước lượng. Thử
giấy chỉ thị pH, so sánh màu đến khi pH = 7
- Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức cỡ 100ml, định mức bằng nước cất
tới vạch mức. Lắc đều, được dịch đường khử sau thủy phân.
2. Dịch đường khử trước thủy phân
Dùng pipet cho 0,4 ml dịch mẫu nước ngọt vào bình định mức cỡ 100ml. Định mức
bằng nước cất tới vạch mức. Lắc đều, được dịch đường khử trước thủy phân.
3. Xác định đường khử theo phương pháp axit dinitro salicylic ( DNS)
Mẫu sau thủy phân: 2 ống nghiệm
0,5 ml dịch đường khử sau thủy phân( pha loãng nếu cần, dùng pipet)+ 1,5 ml DNS
(dùng pipet) ta thấy trong ống nghiệm có màu vàng hơi cam nhẹ;
Đun sôi cách thủy 5 phút (khi nồi cách thủy sôi mới cho mẫu vào). Trong quá trình đun
ta thấy màu của dd chuyển dần sang màu đỏ cam;
Làm nguội nhanh: cho ngay vào khay nước lạnh;
Đo độ hấp thụ của dung dịch màu ở bước sóng 540nm với dung dịch đối sánh là mẫu
trước thủy phân
Mẫu trước thủy phân: 2 ống nghiệm
0,5 ml dịch đường khử trước thủy phân (dùng pipet) + 1,5 ml DNS ta thấy trong ống
nghiệm có màu vàng hơi cam nhẹ;
Đun sôi cách thủy 5 phút. Trong quá trình đun ta thấy màu của dd chuyển dần sang màu
đỏ cam;
Làm nguội nhanh: cho ngay vào khay nước lạnh;
Mẫu này dùng để set máy về giá trị OD=0
III. Xử lý số liệu
Giá trị OD 540nm đo được: Mẫu 1= 0,396
Mẫu 2= 0,341
 Trung bình = 0,3685
Phương trình đường chuẩn: y= 1,749x – 0,0746
 Thay y=0,3685 vào phương trình đường chuẩn ta được x=0,2533 (mg/ml)
1ml dịch đường à 0,2533mg đường khử
à 100 ml dịch đường à 25,33mg đường khử
à số gam saccacrozo có trong 0,4 ml mẫu là
25,33 × 0,95 = 24,0635 mg = 0,0240635g
à hàm lượng saccarozo trong mẫu là:
(0,0240635/0,4)x100% = 6,016%
Vậy hàm lượng saccarozo có trong mẫu là: 6,016g/100ml
 Nhận xét kết quả thí nghiệm: Hàm lượng đường saccarose trong mẫu là tương
đối lớn. Tuy nhiên kết quả đo được có thể có sự sai lệch so với hàm lượng thực tế do sai số
trong các thao tác tiến hành hoặc do một phần đường saccarose đã bị thủy phân theo thời gian.
IV. Các chú ý khi tiến hành
o Cần phải trung hòa mẫu vì phản ứng DNS – đường khử diễn ra trong môi trường
kiềm mới tạo ra phản ứng màu nên mẫu có axit (của quá trình thủy phân thừa) cần phải được
trung hòa.
o Không dùng phenolphtalein vì ảnh hưởng đến màu của phản ứng dẫn đến sai số.
o Thủy phân bằng HCl chứ không bằng H2SO4 vì H2SO4 có tính oxi hóa mạnh sẽ
xảy ra phản ứng oxi hóa nếu dùng H2SO4. Ngoài ra có thể sử dụng enzym với tính đặc hiệu cao
để hạn chế các đường khác ngoài saccarose cũng sẽ bị thủy phân dưới môi trường axit
o Các mẫu đã được đun có thể để được một thời gian ( 20 phút) trước khi đo. Các
mẫu không đun sẽ bị phân hủy dần dần.
o Nếu dùng nước ngọt có ga cần phải bài khí, không được đun nóng để đuổi CO 2 vì
saccarose bị thủy phân và hàm lượng sẽ giảm.
o Nếu lượng đường nhiều thì phải pha loãng dung dịch đường để nồng độ nằm trong
vùng OD vì ở đây thì nồng độ mới tỷ lệ thuận với cường độ màu. Chú ý không pha loãng dung
dịch DNS hay thay vào phương trình vì lúc này nồng độ không tỷ lệ với cường độ màu.
V. Phạm vi ứng dụng của phương pháp
- Từ nguyên tắc của phương pháp, nhận thấy rằng phương pháp chỉ phù hợp với
môi trường sau thủy phân chỉ có 1 loại đường khử trong mẫu
- Qua giá trị thu được có thể xác định được tốc độ hay mức độ thủy phân của đường
- Thay đổi hóa chất thủy phân từ môi trường H+ bằng việc sử dụng enzym có thể
xác định được hoạt độ enzym thủy phân đường.
 BÀI 5:
PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ĐƯỜNG/ OLIGOSACCHARIT
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ BẢN MỎNG
I. NGUYÊN TẮC:
- Phương pháp sắc kí bản mỏng là phương pháp phân tích các chất dựa trên sự khác
nhau về ái lực của chất cần phân tích giữa pha tĩnh và pha động => khả năng bám dính trên pha
tĩnh và di chuyển cùng pha động khác nhau => Quãng đường di chuyển trên pha tĩnh khác nhau
- Tính chất của các pha:
 Pha động và pha tĩnh có tính chất ngược nhau ( Phân cực/không phân cực)
 Tính chất của pha động được chọn theo độ phân cực của chất cần phân tích (cùng
tính chất)
 Không chọn dung môi quá dễ bay hơi => hệ dung môi không ổn định, ít thấm để
hạn chế bị loang khi chấm mẫu
II. VẬT LIỆU VÀ CÁCH TIẾN HÀNH
1. Vật liệu
- Pha tĩnh: bản sắc ký bản mỏng (Meck, Silicagen
20x20cm ) theo kích thước 4x10cm (PTN chuẩn bị)
- Pha động: hệ dung môi ( n- butanol: axit acetic:
H2O= 45:20:35) ( dùng nước làm dung môi do nước có độ phân cực cao phù hợp với mẫu phân
tích là hỗn hợp đường có độ phân).
- Hóa chất: dung dịch đường Glucose, Raffinose, và
hỗn hợp 2 đường

Raffinose
- Lớp silicagen ở pha tĩnh tạo cầu liên kết H với 2
đường
- Khi chạy sắc kí một thời gian, chất có ái lực cao
hơn với pha tĩnh sẽ bị giữ lại trên pha tĩnh lâu hơn nên chuyển động chậm hơn, quãng đường
dịch chuyển cũng ngắn hơn.
2. Cách tiến hành:
II.1. Chấm mẫu:
- Đi găng tay, cố gắng hạn chế chạm vào mặt phủ silicagel, chỉ cầm nhẹ hoặc dùng
nhíp kẹp ở một góc. Lấy bản sắc ký bản mỏng, dùng bút chì kẻ đường chấm mẫu, đánh dấu vị
trí và tên mẫu ( xem hình)
 1,5 cm

Lưu ý: kẻ đường chấm mẫu bằng bút chì, không kẻ bằng bút bi, bút mực vì mực là chất
hữu cơ, khi nhúng vào dung môi trong quá trình chạy sắc kí sẽ gây loang màu.
- Thực hiện:
 Lấy mẫu bằng đầu côn 10 ul. Lượng mẫu lấy vừa đủ
 Chấm mẫu vào vị trí quy định, đường kính vết loang không vượt quá 0,5cm.
Đường kính vết chấm càng nhỏ càng tốt.
Lưu ý: chấm 2 lần ( chờ khô lần chấm đầu tiên mới chấm tiếp)
- Sấy khô bằng máy sấy với nhiệt độ thấp hạn chết cháy vết
II.2. Chạy sắc kí:
- Đặt bản sắc kí đã chấm mẫu vào bình sắc kí , mép dưới bản sắc kí được nhúng vào
dung môi sao cho không ngâm ngập mẫu trong dung môi, mặt chấm mẫu hướng xuống phía
dưới.
- Quá trình chạy được kết thúc khi vệt chạy của dung môi cách mép trên của tờ giấy
sắc kí 1 cm
- Lấy bản sắc kí ra, đánh dấu vị trí của vệt dung môi
- Sấy khô bản sắc kí bằng máy sấy với nhiệt độ thấp hạn chế cháy vết
II.3. Phát hiện mẫu:
- Nhúng nhanh bản sắc ký vào dung dịch H2SO4 5% trong cồn tuyệt đối
Phản ứng hiện màu : (C6H12O6)n H 2 SO 4 , t ° 6n C + 6n H2O
→

Phản ứng không đặc hiệu với đường

- Hơ bản sắc kí trên bếp điện ở nhiệt độ khoảng 110°C trong khoảng 5 phút xuất
hiện dần các vết màu. Cẩn thận làm cháy bản sắc kí.
III. XỬ LÝ SỐ LIỆU (Tính toán giá trị Rf)
1. Hệ số dịch chuyển Rf :
d1
+ Rf = d (Rf =0,2-0,8)
trong đó : d1 là quãng đường dịch chuyển của chất cần phân tích.
d là quãng đường dịch chuyển của dung môi.
+ Rf phụ thuộc vào :
- Pha tĩnh / động
- Chất cần phân tích ( nồng độ lượng mẫu càng cao -> Rf càng thấp)
+ Rf >> thì ái lực của chất phân tích với pha tĩnh càng nhỏ và ngược lại.
 + Trong 1 điều kiện xác định ở cùng một điều kiện, R f là một hằng số dặc trưng cho chất
cần phân tích ( thông thường là khi thực hiện trên cùng một bản sắc kí).
2. Xử lý số liệu

Raffinose Glucose Mẫu 3 (hỗn hợp)

d1(cm) 2,5 3,1 2,4 3,0
d(cm) 6,1 6,1 6,1 6,1
Rf  0,4098 0,5082 0,3934 0,4918

Bản sắc khí sau khi hơ trên bếp

IV. Các biện pháp cải thiện sắc ký đồ khi kết quả phân tách không tốt
- Các mẫu không tách nhau ( điểm loang trùm lên nhau )
 Ở cuối bản sắc ký ( do ái lực với pha tĩnh quá lớn )
 Thay đổi bề mặt pha tĩnh ( giảm độ phân cực )
 Tăng độ phân cực của dung môi
 Kéo dài thời gian chạy (~ sấy khô, chạy tiếp)
 Xoay bản sắc ký chạy theo chiều khác
 Pha loãng nồng độ
 Ở trên/ giữa bản sắc ký
 Tăng thời gian chạy ( ~ sấy khô, chạy tiếp )
 Sử dụng tấm sắc ký 2 lớp

- .Cách biến bản phân cực thành không phân cực:

 Phủ gốc -NH2, -CN (độ phân cực nhỏ)
 Sử dụng hợp chất hydrocacbon mạch dài (C18) => hoàn toàn không phân cực
 V. Các phương pháp hiện màu đối với phân tích đường bằng TLC
- Phản ứng hiện màu bằng gia nhiệt:
(C6H12O6)n H 2 SO 4 , t ° 6n C + 6n H O
→ 2

( tuy nhiên phản ứng không đặc hiệu đối với đường )
- Phủ chất huỳnh quang trên bền mặt bản sắc ký (OD254nm)
Hiện màu bằng cách chụp sắc ký
VI. Ưu điểm và nhược điểm, phạm vi áp dụng của phương pháp
- Ưu điểm: Đơn giản dễ làm
- Nhược điểm:
 Độ lặp lại của giá trị Rf không cao, phụ thuộc vào nhiều yếu tố do hệ mở ( nhiệt
độ, độ ẩm, ánh sáng,…)
 Mẫu phân tích cần tương đối tinh khiết ( không có quá nhiều cấu tử)
 Chỉ phân tích được với các chất hòa tan( không áp dụng với các chất không hòa
tan hoặc bay hơi )
 Chỉ xác định định tính ( mẫu phân tích gồm những thành phần gì)
- Phạm vi áp dụng: Phân tích thành phần mẫu trong dược phẩm, thực phẩm.
 Bài 6: Xác định hoạt độ glucomylase
I. Nguyên tắc của phương pháp
- Glucoamylase là enzym có khả năng thủy phân các liên kết α (1-4) , α(1-6) -
glycozit bên trong phân tử tinh bột tạo sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân là glucose.
- Phương pháp này dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bằng enzym glucoamylase sau
đó xác định lượng đường khử glucose bằng phương pháp DNS. Đo giá trị OD 540nm, dựa
đường chuẩn xác định lượng glucose sản phẩm từ đó xác định hoạt độ enzym.
- Đơn vị hoạt độ glucoamylase : một đơn vị hoạt độ glucoamylase được định nghĩa
là lượng enzym cần thiết trong thời gian 1 giờ ở 30°C tác dụng lên tinh bột tan giải phóng được
1mg glucose. (Tinh bột tan sử dụng hồ tinh bột).
(C6H10O5)n + nH2O glucoamylase , →30 ° C , pH tốiưu n C6H12O6
Tinh bột Glucose
Glucose + DNS oxy hóa OH −¿ ¿ axit gluconic + DNSkhử ( OD540nm)
→

(vàng) (đỏ đậm)

II. Cách tiến hành
1. Chuẩn bị
- Dung dịch cơ chất: Dung dịch hồ tinh bột 1%
- Dung dịch enzym: pha loãng enzym gốc trong dung dịch đệm citrare pH 4,7
- Đặt bể ổn nhiệt ở 30°C; để lọ dung dịch cơ chất và lọ dung dịch enzym 10 phút
trong bể ổn nhiệt 30°C ( để ổn nhiệt trước khi phản ứng )
2. Tiến hành ( Làm song song mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng )

Các bước tiến hành

Ống nghiệm 2,3(mẫu thí nghiệm) Ống nghiệm 1 (mẫu kiểm chứng)

Bước 1: 0,5ml dịch enzym phân tích (đã ở 30o

Phản ứng enzyme0,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1% (đã ở 30
Trộn đều và để phản ứng đúng 10 phút ở 30
Bước 2: Bổ sung 3 ml DNS, trộn đều ngay lập 0,5ml
tức (sau
dịch enzym phân tích
Vô hoạt đóenzyme
nhanh chóng
bằng đặt ống nghiệm vào giá trong3 ml DNS
nồi
cách thủy đang sôi) Trộn đều
0,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%
Trộn đều ngay lập tức (sau đó nhanh chó
đặt ống nghiệm vào giá trong nồi cách thủy đang sô
Bước 3: Đun sôi cách thuỷ 5 phút Đun sôi cách thuỷ 5 phút
Phản ứng giữa Làm đường
nguội nhanh (bằng cách nhúng Làm ốngnguội nhanh (bằng cách nhúng ố
khử và DNS nghiệm vào khay/chậu nước lạnh hoặcnghiệm
nước đá)vào khay/chậu nước lạnh hoặc nước đá)
Bước 4 Đo độ hấp thụ của dung dịch thí nghiệm ở bước sóng 540 nm với dung dịch đ
 sánh là mẫu kiểm chứng.

III. Tính toán kết quả thí nghiệm

- Dạng đồ thị đường chuẩn glucose cần dựng:

Phương trình đường chuẩn glucose: y=OD=1,749x-0,0746

- Mẫu kiểm chứng : OD=0

- Mẫu thí nghiệm : OD1=1,619
OD2=1,642
 Trung bình OD=1,6305
y+ 0,0746 1,6305+0,0746
x= = =0,9749 (mg/ml)
1,749 1,749
Lượng Glucose khi cho 0,5ml dung dịch enzyme Glucoamylase tác dụng với 0,5ml hồ
tinh bột 1% được giải phóng là :
m = x * 1 (mg)= 0,9749 mg
10 phút ở 30 độ C 0,5 ml enzyme thu được 0,9749 mg glucose
60 phút ở 30 độ C 0,5 ml enzyme thu được 5,8494 mg glucose
60 phút ở 30 độ C 1 ml enzyme thu được 11,6988 mg glucose
 Hoạt độ enzym đã dùng là 11,6988U/ml
Vì enzyme được pha loãng 20000 lần
 Hoạt độ của enzyme glucomylase gốc là 233976 U/ml

Nhận xét:
- Hoạt độ enzym gốc tính toán được theo thực nghiệm có giá trị cao
- Kết quả thực nghiệm có thể có sai sót so với giá trị thực của sản phẩm do các
điều kiện tiến hành thí nghiệm và các thao tác khi tiến hành

IV. CÁC CHÚ Ý KHI TIẾN HÀNH THAO TÁC THÍ NGHIỆM
 - Xác định hoạt độ enym là xác định tốc độ phản ứng chuyển hóa từ cơ chất thành
sản phẩm với sự xúc tác của enzym (xác định v max) do đó thời gian xác định hoạt độ không
quá lâu, thường là 10 phút ( từ 5-30 phút) ~ vì ở thời gian này tốc độ phản ứng khá ổn định ,
sau đó bắt đầu giảm. Trong một số trường hợp hoạt độ enzym quá thấp có kéo dài thời gian
phản ứng giữa enzym với cơ chất đến 1 giờ hay lâu hơn, hoặc ở một số trường hợp hoạt độ
enzym rất cao rút ngắn thời gian phản ứng.
- Các yếu tố làm giảm vận tốc phản ứng:
 [S] giảm
 [E] giảm ( Enzym biến tính dần theo thời gian )
 [P] tăng : gây hiệu ứng chắn không gian hoặc có cấu trúc gần giống cơ chất gây
nhầm lẫn, làm giảm hiệu suất và vận tốc phản ứng
- Cần tránh các yếu tố có thể gây biến tính protein ( do enzyme có nguồn gốc là
protein có hoạt tính xúc tác nên không bền vững, nhạy với các tác động lý, hóa học) như nhiệt
độ cao, pH quá axit hoặc quá kiềm, muối kim loại nặng vv… Ngoài ra cần tránh tạo bọt trong
hỗn hợp phản ứng vì một số enzyme có thể bị kìm hãm trên bề mặt phân chia. Các điều kiện
phản ứng (pH, nhiệt độ) phải ở trong giới hạn enzyme có thể tồn tại bền vững và giữ được cố
định trong suốt thời gian phản ứng. Thường người ta tiến hành phản ứng trong dung dịch đệm
duy trì pH ổn định ( ở bài này pH thích hợp là 4,7) và trong máy ổn nhiệt để duy trì nhiệt độ của
môi trường ( 30 độ)
- Khi xác định hoạt độ enzyme phải làm mẫu kiểm chứng song song với thí nghiệm.
Trong mẫu kiểm chứng enzyme đã bị làm vô hoạt trước khi cho vào tiếp xúc với cơ chất
( Thành phần mẫu kiểm chứng giống với mẫu thí nghiệm nhưng enzym bị vô hoạt : để trừ đi tất
cả các chất có thể phản ứng với DNS trong mẫu mà không phải cho do enzym xúc tác tạo
thành )
- Khi chuẩn bị dung dịch enzyme để xác định hoạt độ thì tùy theo đặc tính và mức
độ thuần khiết của chế phẩm enzyme mà tiến hành chuẩn bị để có được dung dịch enzyme trong
suốt ( vì có thể lúc hút để lấy enzyme đó không phải là enzyme)
- Phản ứng enzyme được tiến hành trong điều kiện dư cơ chất (dư 80-90%)

V. Thảo luận
Có thể sử dụng phương pháp khác để xác định đường khử trong bài này hay không?
Trả lời : Có thể xác định hàm lượng đường khử tổng số theo phương pháp Rodzevich do
sản phẩm cuối cùng thu được do quá trình thủy phân tinh bột chỉ gồm một loại đường duy nhất
là glucose.
Phản ứng dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm các đường khử ( glucose, fructose ,
mantose,…) có thể khử dễ dàng đồng II oxit thành đồng I (Cu2+ -> Cu+) dưới dạng kết tủa màu
đỏ Cu2O và qua lượng CuSO4 dư tính được lượng đường khử.
 BÀI 7:
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PROTEASE
( Theo phương pháp Anson cải tiến)

I. NGUYÊN TẮC:
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân protein cazeinat natri ( cơ chất có thể là cazein hoặc
hemoglobin) bằng chế phẩm enzim có trong dung dịch nghiên cứu rồi tiếp đó làm vô hoạt enzim và kết tủa
protein chưa bị thủy phân bằng axit tricloaxetic. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy phân
bằng phản ứng màu với thuốc thử folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của tyrozin để tính lượng sản phẩm tương ứng do
enzim xúc tác tạo nên.
Caseinat natri + protease, 30℃, pH tối ưu→ aa + peptit ngắn + peptit dài
- Phản ứng với thuốc thử Folin
Bao gồm 2 giai đoạn:
 Phản ứng biure: Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide (CO-NH-). Trong môi trường
kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu
xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ. Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide

 Phản ứng với thuốc thử folin: Thuốc thử folin có chứa axit phosphomolipdic và axit phos-
phovolframic. Các chất này một mặt làm tăng độ nhạy của phản ứng biure, một mặt khác phản ứng với gốc Tyr
và Trp trong phân tử protein. Các axitamin này tham gia trong quá trình tạo phức chất có màu xanh da trời, hấp
thụ cực đại bước sóng ở 750 nm.
 Hoạt độ proteaza ( HĐP) đặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải protein tới peptit và axit amin của
các enzim và được biểu thị bằng số đơn vị proteaza trong 1g chế phẩm. Hoạt độ riêng của chế phẩm biểu thị
bằng số đơn vị proteaza trên 1 mg protein của chế phẩm.
Dựa vào định nghĩa hoạt độ ta sẽ có các bước làm và những hóa chất cần sử dụng trong thí nghiệm.
Định nghĩa : 1 đơn vị hoạt độ protease là lượng enzim cần thiết trong thời gian 1 phút ở 30°C chuyển
hóa được casein thành một lượng sản phẩm không bị kết tủa bởi axit tricloacetic ( TCA) tương đương với 1
mol tyrosine. ( trong sản phẩm của không chỉ có tyrosine nên ở đây chúng ta coi là tương đương).
1 AU : casein lượng enzim sản phẩm ( không kết tủa với TCA )  1 mol Tyrosine.
→

II. CÁCH TIẾN HÀNH:

1. Chuẩn bị:
- Dung dịch cơ chất: casein 1% pha trong đệm phosphate pH 7 ( pH ở đây để cho cơ chất có thể
hoạt động mạnh nhất)
- Dung dịch enzym : alcalase pha loãng trong dung dịch đệm phosphate pH 7
- TCA 0,3 M
- Na2CO3 0,5 M
- Dung dịch folin
- Để bình ổn nhiệt ở 30°C; Để lọ dung dịch cơ chất và lọ dung dịch enzym 10 phút trong bể ổn
nhiệt 30°C ( để ổn nhiệt trước khi phản ứng )
2. Cách tiến hành ( làm song song ống nghiệm với ống kiểm chứng) :
Lấy các ống nghiệm khô, sạch:

Các bước tiến hành Ống nghiệm 1,2 (mẫu thí nghiệm) Ống nghiệm 3 (mẫu thí nghiệm)
Bước 1 : Phản ứng enzyme
2ml dung dịch cơ chất
2ml dịch enzyme
Trộn đều, để phản ứng trong đúng 10 phút ở

Bước 2 : Vô hoạt enzyme

Bổ sung 4ml TCA 0,3M 2ml dịch enzym
bằng TCA, thu sản phẩm phản
Trộnứng
đều ngay lập tức, để yên hỗn hợp
4ml
trong
TCA 0,3M
enzyme 20 phút 2ml dung dịch cơ chất
Lọc, thu được dịch lọc thí nghiệm Trộn đều ngay lập tức, để yên hỗn hợp trong 20 phút
Lọc, thu được dịch lọc kiểm chứng
Bước 3 : Phản ứng 0,3ml
giữa
dịch lọc thí nghiệm (dùng pipet) 0,3ml dịch lọc kiểm chứng ( dùng pipet)
đường sản phẩm tạo thành và 1,5ml
folin Na2CO3 0,5M 1,5ml Na2CO3 0,5M
Trộn đều, để 10 phút Trộn đều, để 10 phút
Thêm 0,3ml dung dịch folin. Thêm 0,3ml dung dịch folin.
Trộn đều, để 25 phút. Trộn đều, để 25 phút.
Bước 4 Đo độ hấp thụ của dung dịch thí nghiệm ở bước sóng 750nm với dung dịch đối sánh là mẫu
kiểm chứng
Tra đồ thị chuẩn giữa hàm lượng tyrosine và mật độ quang.
III. XỬ LÝ SỐ LIỆU:

Phương trình đường chuẩn tyrosine : y = OD = 1,0629x + 0,0016

Theo phương trình có: nồng độ tyrosine là x mol/ml.
 trong 8ml sẽ có 8x mol tyrosine được sinh ra trong 10 phút.
 trong 1 phút sẽ có 0,8x mol tyrosine.
1 đơn vị hoạt độ chuyển hóa được tương đương 1mol.
 có 0,8x đơn vị hoạt độ trong 2ml dịch enzym.
 có 0,4x× f AU/ml trong dịch enzym.( f=10000 lần)

Kết quả: Lần 1: OD750nm =0,231

Lần 2: OD750nm =0,268
Trung bình = 0,2495
Nồng độ tyrosine = 0,2332 mol/ml.
 Hoạt độ dung dịch enzym là 0,4x0,2332x10000 = 932,8 (U/ml)
CÔ CHỮA VD :
 Tính toán bài protease:
 Thể tích dung dịch:
Vdd sản phẩm phản ứng enzyme =2+2+4=8(ml)

 Phương trình đường chuẩn:

y=1,0629x+0,0016;

 Giá trị OD đo được là:

OD1=0,135; OD2=0,148

 OD=(OD1+OD2)/2=0,135+0,1482=0,1415=0,1415

 y=0,1415

 Theo phương trình có: nồng độ Tyrosine là x (µmol/ml)

  x=(y−0,0016)/1,0629=(0,1415−0,0016)/1,0629≈0,1316
(µmol/ml)
 Nồng độ Tyrosine trong dung dịch lọc = 0,1316 (µmol/ml)
 Lượng sản phẩm không bị kết tủa tương đương với lượng Tyrosine là
0,1316 x 8= 1,0528 (µmol)
 Trong 10 phút, 30oC, 2ml enzyme Xúc tác thủy phân protein giải phóng ra
lượng sản phẩm k bị kết tủa bởi TCA tương đương 1,0528 µmol tyrosine
 Trong 1 phút30oC, 2ml dịch emzyme protease xúc tác thuỷ phân
protein thu được 1,0528/10=0,10528 µmol Tyrosine
 Trong 1 phút, 1ml enzyme protease xúc tác thuỷ phân protein thu được
0,0526 µmol Tyrosine
 Vậy hoạt độ của enzyme protease là 0,0526 U/ml (enzyme đaz pha
loãng
 Hoạt độ enzyme ban đầu là 0,0526 x f (f là hệ số pha loãng enzyme
protease, bài này là 10.000) = 0,0526 x 10.000 =526U/ml

IV. CÁC CHÚ Ý

 Trước khi thực hiện phản ứng thủy phân,dung dịch cơ chất lẫn dung dịch enzyme đều phải đưa
o
về nhiệt độ 30 C
 Lượng enzyme cần lấy phải tính toán sao cho lượng cơ chất còn dư nhiều
 Đối với mỗi enzym bền trong khoảng pH nhất định do vậy tùy thuộc vào từng enzym nghiên cứu
mà ta chọn các dung dịch đệm cũng như khoảng pH thích hợp để chiết rút enzym, đảm bảo không làm mất hoặc
làm giảm hoạt tính xúc tác của nó.
 Thời gian xác định hoạt độ enzym thường là 10 phút: nếu thời gian quá ngắn sai số do thao tác thí
nghiệm, lượng sản phẩm tạo ra quá ít không đủ để đo quang. Còn nếu thời gian quá dài, tốc độ phản ứng bắt đầu
giảm. Trong khoảng 10 phút, enzym hoạt động mạnh nhất, tốc độ phản ứng lớn nhất. Trong một số trường hợp,
hoạt độ của enzym quá thấp có thể kéo dài thời gian phản ứng đến 1h hoặc lâu hơn.
 Khi xác định hoạt độ enzyme phải làm mẫu kiểm chứng song song với thí nghiệm. Trong mẫu kiểm
chứng enzyme đã bị làm vô hoạt trước khi cho vào tiếp xúc với cơ chất
 Protease: dùng TCA có 2 tác dụng: kết tủa protein và các peptit mạch dài để tránh sai số trong
phản ứng tạo màu với folin và tạo môi trường axit để vô hoạt enzym.
 Bài 8: Xác định hàm lượng vitamin C
I. NGUYÊN TẮC
1.1. Nguyên tắc chuẩn độ:
Axit ascocbic ( vitamin C) là một hợp chất chưa no có chứa nhóm endiol , hòa tan trong nước và tồn tại
dưới dạng oxi hóa và dạng khử.

Axit ascocbic bị phá hủy rất nhanh dưới tác dụng của các chất oxy hóa và bền trong môi trường axit.
Do vậy, người ta thường chiết axit ascocbic trong mẫu bằng các dung dịch axit như axetic 5%, axit
metaphotphoric 2%...
* Phương pháp dựa trên nguyên tắc là axit ascocbic có khả năng oxi hóa khử thuận nghịch chất chỉ thị
đặc trưng màu xanh là 2,6 diclophenolindophenol ( DCIP). Dựa vào lượng chất chỉ thị tiêu tốn ta tính được
lượng axit ascocbic có trong mẫu thí nghiệm. Sơ đồ phản ứng giữa axit ascocbic với chất chỉ thị DCIP như sau:
Vitamin C (axit ascocbic) + 2,6 DCIP  Dehydro ax ascocbic + 2,6 DCIP
(Khử) ( oxi hóa) (oxi hóa) (Khử)
* Quá trình đổi màu:

Màu xanh (môi trường kiềm) màu hồng ( môi trường axit)  không màu

Dạng oxh  Dạng khử

Phản ứng là phản ứng thuận nghịch, chiều thuận xảy ra ở điều kiện thường và rất dễ dàng xảy ra, nhưng
chiều nghịch lại khó xảy ra và cần có chất xúc tác.

* Đặc điểm chất chỉ thị:

- DCIP là chất không bền, nồng độ thay đổi theo thời gian
 - Chất chỉ thị này là một hợp chất có khả năng đổi màu kép, một mặt, khi pH của môi trương thay đổi
từ kiềm qua axit thì màu của chất chỉ thị chuyển từ xanh sang hồng, mặt khác dạng oxy hóa của DCIP có màu,
còn dạng khử không màu (DCIP có màu xanh tỏng môi trường kiềm và môi trường axit yếu, có màu tím trong
khoảng pH từ 4 đến 5 và có màu hồng ở môi trường có pH < 4 ).
- DCIP bền trong môi trường trung tính và kém bền ở môi trường axit nên màu hồng khi DCIP dư chỉ
tồn tại trong vòng khoảng 1 phút.

1.2. Nguyên tắc xác định hệ số f:

- Do DCIP kém bền, thay đổi nồng độ tùy thuộc vào nhiệt độ nên nồng độ của nó cũng thay đổi. Chính
vì vậy, nên phải xác định hệ số f.
- Vitamin C + KIO3/H+ + hồ tinh bột  xuất hiện màu xanh
+ Phương trình phản ứng :
KIO3 + 6HCl + 5KI  3I2 + 6KCl + 3H2O
+ Vitamin C trong trường hợp này ở dạng khử ( axit ascocbic), khi cho I 2 vào thì axit ascocbic bị oxi
hóa và chuyển sang dạng dehydroascorbic còn I0 bị khử thành I- nên dung dịch mất màu.
Khi cho dư I2 thì lúc này dung dịch xuất hiện màu xanh (với chất chỉ thị là hồ tinh bột).
Phương trình phản ứng:

Chuẩn độ cho đến khi xuất hiện màu xanh : lúc này ta tính được lượng I 2, từ đó xác định được nồng độ
Vitamin C, cuối cùng suy ra được nồng độ DCIP.
CN( DCIP) × VDCIP = CN( vitamin C) × Vvitamin C = CN( KIO3) × VKIO3
 CN( DCIP) =?

II. CÁCH TIẾN HÀNH

Mẫu thí nghiệm: Mẫu chanh do PTN chuẩn bị
1. Chuẩn bị
1.1. Dung dịch 2,6 DCIP (PTN chuẩn bị )
Xác định hệ số hiệu chỉnh nồng độ (f) của dung dịch 2,6 DCIP
 Bình tam giác 1 (cỡ 50 ml):
5 ml dịch vitamin C tinh khiết pha trong H2SO4 2%(PTN pha sẵn)
2,5 ml Oxalatamon bão hoà
Chuẩn độ bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút, được a1 ml
 Bình tam giác 2 (cỡ 50ml):
5 ml dịch vitamin C tinh khiết pha trong H2SO4 2%(PTN pha sẵn)
Vài hạt tinh thể KI (khoảng bằng hạt gạo)
5 giọt chỉ thị hồ tinh bột
Chuẩn độ bằng KIO3 0,001N cho đến khi dung dịch xuất hiện màu xanh, được b1 ml
 Tính hệ số f của dung dịch 2,6 DCIP dùng trong phân tích : f = b1 / a1
1.2. Dịch vitamin C phân tích:
 Cân chính xác 10,84 g mẫu, cho vào cối, nghiền ngập trong axit metaphosphoric 5% (hoặc HCl 1%).
Chuyển mẫu vào bình định mức cỡ 100 ml. Định mức tới vạch bằng axit metaphosphoric 5% (hoặc HCl 1%).
Lắc đều, lọc và thu dịch lọc vitamin C phân tích.
2. Tiến hành phản ứng
 Mẫu thí nghiệm:
Cho vào bình tam giác (sạch, khô, cỡ 50 ml, bình số 3):
10 ml dịch lọc vitamin C phân tích (dùng micropipet)
5 ml dung dịch oxalatamon bão hoà (dùng micropipet)
Chuẩn độ bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút.
 Mẫu kiểm chứng:
Cho vào bình tam giác (sạch, khô, cỡ 50 ml, bình số 4):
10 ml HCl 1% (dùng pipet)
5 ml Oxalatamon bão hoà
Chuẩn độ bằng 2,6 DCIP (phân tích) cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút
III. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Mẫu thí nghiệm : chanh
 Tính hệ số f
Bình tam giác 1: 2,24 ml 2,6 DCIP  a1 = 2,24
Bình tam giác 2: 2,14 ml 2,6 DCIP  b1 = 2,14

b 1 2 ,14
 f= = = 0,955
a 1 2 ,24
 Tính hàm lượng vitamin C
- Thể tích 2,6 DCIP đã dùng:
+ Mẫu thí nghiệm :V1=2,20ml
V2=2,18ml
 Vtb = 2,19 ml
+ Mẫu kiểm chứng: V=0,3ml
 Số ml 2,6 DCIP cần dùng : V = Vmẫu thí nghiệm - Vmẫu kiểm chứng
= 2,19– 0,3 = 1,89ml
Biết rằng: 1ml 2,6 DCIP 0,001N chuẩn độ hết 0,088mg vitamin C trong mẫu
 Số mg vitamin C có trong 10ml mẫu thí nghiệm là:
m = V× f × 0.088= 1.89× 0,955 × 0.088 = 0.1588 (mg)
 Số mg vitamin C có trong 100ml là: 0.1588*10 = 1.588 (mg)
 Trong 10,84 (g) mẫu → 1,588 (mg) vitamin C
 100 (g) mẫu → 14,649 (mg) vitamin C
 Hàm lượng vitamin C trong mẫu chanh thí nghiệm là 14,649 (mg%)
Nhận xét: - Hàm lượng vitamin C trong mẫu tương đối cao
-Kết quả thu được có thể sai lệch so với thực tế do sai số khi tiến hành thực nghiệm và ảnh hưởng bởi
các yếu tố như nhiệt độ,..
 CÔ CHỮA VD:

Hệ số f:
f=b1/a1=2,15/2,4=0,896
10.00 g mẫu > 100 ml định mức >
Mẫu TN: lấy 10 ml dịch lọc chuẩn độ hết 2,62 ml 2,6 DCIP
Mâu KC: lấy 10 ml HCl chuẩn độ hết 0,06 ml 2,6 DCIP
10 ml dịch lọc mẫu chuẩn độ hết với:
(Vthí nghiệm - Vkiểm chứng) x f = (2,62 – 0,06) x 0,896 = 2,294 ml 2,6 DCIP 0,001N
100 ml dịch lọc mẫu chuẩn độ hết với:
2,294 x 100/10=22,94 ml 2,6 DCIP 0,001N
Theo phương trình phản ứng, ta có:
1 ml 2,6 DCIP 0,001 N tương ứng (phản ứng hết) với 0,088 mg vitamin C
Lượng vitamin C ứng với 22,94 ml 2,6 DCIP 0,001N là
0,088 x 22,94 = 2,02(mg) (đây là lượn vitamin C có trong 10g mẫu
Hàm lượng vitamin C có trong mẫu:
100 x 2,02/10,00=20,2 mg%

IV. CÁC CHÚ Ý KHI LÀM THÍ NGHIỆM ĐỂ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CHÍNH XÁC
 Khi làm thí nghiệm xác định hệ số điều chỉnh nồng độ f sử dụng dịch vitamin C tinh khiết để
hạn chế sai số do các chất khác có trong dịch phân tích có thể phản ứng với CCT 2,6 DCIP
 Dung dịch Oxalatamon trong các bình tam giác phản ứng với một số kim loại như Ca, Mg tạo
kết tủa => loại bỏ/hạn chết các ion kim loại tham gia phản ứng với vitamin C hoặc tham gia vào các trung tâm
hoạt động của enzym. Từ đó làm bền vitamin C
 Khi nghiền mẫu, cần nghiền ngập trong axit HCl 1% để hạn chết vitamin C tham gia phản ứng
với oxh với các oxit ( do vitamin C bền trong môi trường axit)
 Dung dịch sau khi định mức cần được lọc để tránh hiện tượng đục
 Do vitamin C rất dễ bị oxh bởi các tác nhân ngoài không khí nên thời gian chuẩn độ nhanh và
dụng cụ chuẩn độ dùng là microburet với đường kính nhỏ
 BÀI 9: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ AXIT CỦA DẦU THỰC VẬT
I. NGUYÊN TẮC
1. Định nghĩa
Chỉ số axit là số mg KOH cần để trung hòa các axit béo tự do có trong 1g chất béo.
2. Nguyên tắc:
Trung hòa chất béo bằng dung dịch KOH chuẩn độ, khi đó giữa KOH và các axit béo tự do có trong
chất béo xảy ra phản ứng.
RCOOH + KOH -> RCOOK + H2O
Dựa vào lượng KOH dùng để trung hòa các axit, tính chỉ số axit.
II. CÁCH TIẾN HÀNH:
Mẫu thí nghiệm: dầu thực vật Tường An do phòng thí nghiệm cung cấp
*Mẫu Thí nghiệm
- Cân chính xác 3,02 g chất béo (cân bằng cân phân tích) trong bình tam giác 250ml có nút nhám.
- Thêm 30 ml hỗn hợp ete- cồn ( 1:1) để hòa tan chất béo
- Lắc đều cho chất béo tan ( dạng mixen đục )
- Thêm vào bình tam giác 3 giọt CCT phenolphtalein
- Định phân bằng hỗn hợp KOH 0,1N trong rượu
- Chuẩn độ đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút thì dừng
*Mẫu kiểm chứng
- Cho lượng nước cất tương đương chất béo vào bình tam giác 250ml có nút nhám
- Thêm 30ml hỗn hợp ete- cồn ( 1:1)
- Lắc cẩn thận
- Thêm vào bình tam giác 3 giọt CCT phenolphtalein
- Định phân bằng hỗn hợp KOH 0,1N trong rượu
- Chuẩn độ đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút thì dừng

III. CHÚ Ý
- KOH 0,1N trong rượu được sử dụng thay vì KOH trong nước để tránh những sai sót có thể xảy
ra do sự thủy phân của các các axit béo liên kết
- Không dùng NaOH thay cho KOH vì KOH có thể tan tốt trong cồn còn NaOH thì không
- Mẫu kiểm chứng để xem khi dung dịch mẫu không chứa chất béo có chất nào trong mẫu có chất
nào tác dụng với KOH 0,1N không.
IV. XỬ LÝ SỐ LIỆU:
- Khối lượng dầu thực vật lấy được : m= 3.02 g
- Số ml KOH 0,1N dùng định phân ở mẫu Thí nghiệm : 1,3 ml
 - Số ml KOH 0,1N dùng định phân ở mẫu kiểm chứng: 0,6 ml
5.611×b × f
- Chỉ số axit được tính theo công thức: Ax =
m
Trong đó: b là số ml KOH 0,1N dùng để định phân.
m là khối lượng mẫu thí nghiệm (gam)
f là hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch KOH 0,1N đem dùng.
5.611 là số mg KOH có trong 1ml KOH 0,1N
*Tính toán
- Nồng độ của dung dịch KOH dùng là không đổi => f=1
Chỉ số axit của mẫu dầu thực vật là:
5.611×b × f 5.611×(1, 3−0 ,6)×1
Ax = = =1,301
m 3 ,02
* Nhận xét: Mẫu dầu thực vật này có thể đã bị thuỷ phân một phần trong quá trình bảo quản và sử dụng

V. Ý NGHĨA CỦA CHỈ SỐ AXIT

- Chỉ số axit cho biết độ tươi của chất béo
- Thông qua chỉ số axit sẽ biết được thời gian bảo quản. Chỉ số axit càng cao thì thời gian đã bảo
quản càng lâu, chỉ số axit càng thấp thì mẫu càng tươi
- Mặt khác , ta còn biết được chất béo được bảo quản đúng cách không?
 BÀI 10: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ XÀ PHÒNG CỦA DẦU THỰC VẬT

I. NGUYÊN TẮC
1. Định nghĩa
Chỉ số xà phòng hóa là lượng mg KOH cần để trung hòa các axit béo tự do cũng như liên kết có trong
1g chất béo. Nói cách khác là lượng mg KOH ần để xà phòng hóa các glixerit cũng như để trung hòa axit béo tự
do có trong 1g chất béo.
2. Nguyên tắc:
Đun sôi chất béo với một lượng dư dung dịch KOH chuẩn độ thì chất béo bị thủy phân tạo muối và
glyxerin

Các chất béo tự do phản ứng với KOH sơ đồ .

RCOOH + KOH -> RCOOK + H2O
Lượng kiềm dư, không tham gia phản ứng với các axit béo được định phân bằng HCl chuẩn. Dựa vào
lượng kiềm tiêu tốn để trung hòa các loại axit béo trong chất béo, tính được chỉ số xà phòng.
II. CÁCH TIẾN HÀNH
Mẫu thí nghiệm: mẫu dầu thực vật Tường An do phòng thí nghiệm cung cấp
*Mẫu thí nghiệm:
- Cân chính xác 2,02g chất béo vào bình tam giác 100ml.
- Cho 20ml KOH 0,5N trong rượu ( lấy bằng buret).
- Đậy bình bằng ống sinh hàn khí và đun sôi cách thủy hỗn hợp trong 1giờ.
- Làm nguội hỗn hợp dưới nước lạnh, thêm 3 giọt phenolphtalein trong rượu ( dung dịch có màu hồng)
- Tiến hành định phân bằng dung dịch HCl 0,5N đến khi dung dịch mất màu hồng.
*Mẫu kiểm chứng:
- Lấy 2,02 ml nước cất vào bình tam giác 100ml.
- Cho 20ml KOH 0,5N trong rượu ( dùng buret).
- Đậy bình bằng ống sinh hàn khí và đun sôi cách thủy hỗn hợp trong 1 giờ.
- Làm nguội hỗn hợp, thêm 3 giọt phenolphtalein trong rượu ( dung dịch có màu hồng)
- Tiến hành định phân bằng dung dịch HCl 0,5N đến khi dung dịch mất màu hồng.

III. CHÚ Ý
- Nếu xà phòng khó tan có thể thêm khoảng 20ml một trong các dung môi có nhiệt độ sôi cao như
toluen, rượu propilic, butylic hoặc amilic.
 - Song song làm thí nghiệm kiểm chứng, thay chất béo bằng một lượng nước cất tương ứng (cần làm thí
nghiệm kiểm chứng vì nồng độ của kiềm có thể bị biến đổi).

IV. XỬ LÝ SỐ LIỆU:
- m= 2.02 g
- Ban đầu cho 20ml KOH 0.5N
- Thể tích HCl 0,5N tiêu tốn sau định phân là:
- Mẫu thí nghiệm: 0,7 ml
- Mẫu kiểm chứng: 17.7 ml
( a−b ) × f 1 ×28.05 × f 2
- Chỉ số xà phòng ( Xp ) được tính theo công thức: Xp =
m
Trong đó: a là số ml HCl 0,5N dùng để định phân mẫu kiểm chứng.
b là số ml HCl 0,5N dùng để định phân mẫu thí nghiệm.
m là khối lượng mẫu chất béo (gam)
f 1 là hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch HCl đem dùng.
f 2 là hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch KOH đem dùng.
28.05 là số mg KOH có trong 1ml KOH 0,5N
* Tính toán:
- Nồng độ của dung dịch KCl và KOH đem dùng không đổi nên f1=f2=1
Chỉ số xà phòng hoá của mẫu thí nghiệm là:
( a−b ) × f 1 ×28.05 × f 2 ( 17 ,7−0 , 7 ) ×1 ×28.05 × 1
Xp = = = 236,064
m 2 ,02

V. Ý NGHĨA CỦA CHỈ SỐ XÀ PHÒNG

- Thông qua chỉ số xà phòng có thể dự đoán được nguồn gốc của chất béo
Chỉ số xà phòng càng nhỏ -> Khối lượng trung bình của phân tử chất béo càng lớn -> dự đoán được độ
dài ngắn của các axit béo trong chất béo
- Chỉ số xà phòng ít bị thay đổi, hay không thay đổi
 -
BÀI 11: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ PEROXIT CỦA DẦU THỰC VẬT

I. NGUYÊN TẮC
1. Định nghĩa
Chỉ số peroxit là số gam iot có thể phản ứng với hydro hoạt động của các peroxit chứa trong 100g chất
béo, nói cách khác, chỉ số peroxit là số gam iot được giải phóng ra khi cho dung dịch KI tác dụng với 100g chất
béo nhờ tác dụng của các peroxit (sản phẩn của sự ôi hóa chất béo) có trong chất béo.
2. Nguyên tắc:
Xác định chỉ số peroxit dựa trên nguyên tắc: các peroxit của chất béo (tạo thành trong quá trình ôi hóa
của chất béo) trong môi trường axit có khả năng phản ứng với KI thải ra I2 theo phản ứng:

Iot được tạo thành định phân bằng dung dịch tiosunfat . Điểm tương đương nhận được khi dung dịch
chuyển từ màu tím đen sang không màu.
2Na2S2O3 + I2 -> 2NaI + Na2S4O6
Dựa vào lượng tiosunfat tiêu tốn khi định phân iot tính chỉ số peroxit.

II. CÁCH TIẾN HÀNH:

Mẫu thí nghiệm: Mẫu dầu thực vật Tường An do phòng thí nghiệm cung cấp.
* Mẫu thí nghiệm:
- Lấy 3,0g dầu vào bình tam giác 250ml có nút nhám
- Thêm vào bình 5 ml cloroform để hoà tan chất béo, thực hiện trong tủ hút do cloroform là chất độc và
dễ bay hơi.
- Thêm vào bình 10 ml CH3COOH, thực hiện trong tủ hút
- Thêm 1 ít tinh thể KI. ( bằng hạt gạo) sau đó đóng nút nhám lại.
- Lắc hỗn hợp thật cẩn thận trong 10 phút.
- Thêm vào hỗn hợp 30ml nước cất.
- Thêm chất chỉ thị hồ tinh bột ( 0,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%).
- Định phân iot tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N
- Chuẩn độ cho đến khi mất màu xanh (nâu tím).
* Mẫu kiểm chứng:
- Lấy 3 ml nước cất vào bình tam giác 250ml có nút nhám.
- Thêm vào 5 ml clorofocm, thực hiện trong tủ hút.
- Thêm 10 ml CH3COOH thực hiện trong tủ hút.
 - Thêm 1 ít tinh thể KI. (bằng hạt gạo), sau đó đóng nút nhám lại.
- Lắc hỗn hợp thật cẩn thận trong 10 phút.
- Thêm vào hỗn hợp 30 ml nước cất.
- Thêm chất chỉ thị hồ tinh bột ( 0,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%).
- Định phân iot tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N
- Chuẩn độ cho đến khi mất màu xanh (nâu tím).
III. CHÚ Ý
- Phải cho clorofocm vì khi chiết chất béo, tập trung chất béo ở 1 chỗ làm cho I 2 nằm ngoài lớp
clorofocm dẫn đến không tác dụng với chất béo làm I2 dễ tác dụng với thuốc thử.
- Lắc hỗn hợp thật cẩn thận.
- Sử dụng KI tinh thể mà không sử dụng dung dịch KI bão hòa do nó dễ bị oxi hóa.

IV. XỬ LÝ SỐ LIỆU:
- Khối lượng mẫu dầu thực vật lấy được là 3,00 g
- Thể tích Na2S2O3 tiêu tốn cho mẫu thí nghiệm là 2,34 ml
- Thể tích Na2S2O3 tiêu tốn cho mẫu kiểm chứng là: 0,35 ml
- Chỉ số peroxit ( P ) được tính theo công thức:

Trong đó: a – Số ml dung dịch Na2S2O3 0.01N dùng định phân mẫu thí nghiệm
b – Số ml dung dịch Na2S2O3 0.01N dùng định phân mẫu kiểm chứng
f – Hệ số hiệu chỉnh nồng độ Na2S2O3 0.01N đem dùng
m – Lượng mẫu cân chất béo, gam
0.001269 là số gam iot tương ứng với 1ml Na2S2O3 0.01N
100 là hệ số quy chuyển theo 100g chất béo
* Tính toán:
- Do nồng độ của dung dịch Na2SO3 đem dùng không có sự biến đổi nên f=1
- Chỉ số peroxit là:
( a−b ) × f × 0,001269 ×100 ( 2 ,34−0 , 35 ) ×1 ×0,001269 × 100
P= = = 0,0842
m 3 , 00

V. Ý NGHĨA CỦA CHỈ SỐ PEROXIT

Ý nghĩa:
- Peroxit là sản phẩm của quá trình ôi hóa chất béo.
 - Chỉ số peroxit đăch trưng cho mức độ ôi hóa của chất béo, tăng trong suốt thời gian bảo quản
( do nhiệt độ, oxi nên khó kiềm chế)
 BÀI 12: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ IOT CỦA DẦU THỰC VẬT
I. NGUYÊN TẮC
1. Định nghĩa
- Chỉ số iot là số gam iot có thể kết hợp với 100g chất béo
2. Nguyên tắc
Xác định chỉ số iot dựa trên nguyên tắc: Iot clorua được tạo thành theo phản ứng sau
2KI + KIO3 + 6HCl -> 3ICl + 3KCl + 3H2O
Iot clorua kết hợp vào các nối kép của axit béo có trong chất béo. Lượng ClI dư định phân bằng
dung dịch tiosunfat natri chuẩn độ sau khi đã thêm dung dịch KI và nước vào hỗn hợp phản ứng
KI + ClI -> 2NaI + I2
2Na2S2O3 + I2 -> 2NaI + Na2S4O6
Dựa vào lượng tiosunfat tiêu tốn khi định phân iot tính chỉ số iot.
II. CÁCH TIẾN HÀNH
1. Hóa chất
- Mẫu thí nghiệm: Mẫu dầu thực vật do phòng thí nghiệm cung cấp
- Dung dịch ClI trong HCl 0,2N
- Tinh thể KI
- Dung dịch Na2S2O3 0,1N
- Dung dịch hồ tinh bột 1%
- Dung dịch ete etylic
2. Cách tiến hành
* Mẫu thí nghiệm:
- Lấy 0,2g dầu thực vật vào bình tam giác 250ml có nút nhám
- Thêm vào bình 5ml ete etylic để hoà tan chất béo.
- Thêm 25ml dung dịch ICl/HCl 0,2N.
- Lắc đều, đậy kín bình và để yên 15 phút.
- Thêm 1 ít tinh thể KI (bằng hạt 2 hạt gạo) sau đó đóng nút nhám lại.
- Lắc hỗn hợp thật cẩn thận trong 10 phút.
- Thêm vào hỗn hợp 50ml nước cất.
- Định phân iot tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N cho đến khi có màu vàng rơm.
- Thêm 5 giọt chất chỉ thị hồ tinh bột (0,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%) và 3ml clorofocm và
định phân tiếp đến khi mất màu xanh (nâu tím).
 * Mẫu kiểm chứng:
- Lấy 0,2 ml nước cất vào bình tam giác 250ml có nút nhám
- Thêm vào bình 5ml ete etylic để hoà tan chất béo.
- Thêm 25ml dung dịch ICl/ HCl 0,2N.
- Lắc đều, đậy kín bình và để yên 15 phút.
- Thêm 1 ít tinh thể KI (bằng hạt gạo) sau đó đóng nút nhám lại.
- Lắc hỗn hợp thật cẩn thận trong 5 phút.
- Thêm vào hỗn hợp 50ml nước cất.
- Định phân iot tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N cho đến khi có màu vàng rơm.
- Thêm chất chỉ thị hồ tinh bột (0,5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%) và 3ml clorofocm và định
phân tiếp đến khi mất màu xanh (nâu tím).
III. CHÚ Ý
- Phải cho clorofocm vì khi chiết chất béo, tập trung chất béo ở 1 chỗ làm cho I 2 nằm
ngoài lớp clorofocm dẫn đến không tác dụng với chất béo làm I2 dễ tác dụng với thuốc thử.
- Lắc hỗn hợp thật cẩn thận để cho I2 phân bố ở nước để dễ tác dụng với thuốc thử.
IV. XỬ LÝ SỐ LIỆU
- Khối lượng mẫu dầu thực vật lấy được là 0,2 g
- Thể tích Na2S2O3 tiêu tốn cho mẫu thí nghiệm là 25,00 ml
- Thể tích Na2S2O3 tiêu tốn cho mẫu kiểm chứng là: 30 ml
- Chỉ số iot (I) được tính theo công thức:
( b−a ) . f .0,001269.100
I=
m

Trong đó: a – Số ml dung dịch Na2S2O3 0,1N dùng định phân mẫu thí nghiệm
b – Số ml dung dịch Na2S2O3 0,1N dùng định phân mẫu kiểm chứng
f – Hệ số hiệu chỉnh nồng độ Na2S2O3 0,1N đem dùng
m – Lượng mẫu cân chất béo, gam
0,001269 là số gam iot tương ứng với 1ml Na2S2O3 0,1N
100 là hệ số quy chuyển theo 100g chất béo
* Tính toán:
- Nồng độ của dung dịch Na2S2O3 đem dùng ổn định nên f=1
- Chỉ số iot là:
I = (30 – 25,00) x 1 x 0,001269 x 100 / 0,2 = 3,1725
 V. Ý NGHĨA CỦA CHỈ SỐ IOD
- Là chỉ số biểu hiện cho sự no hoặc không no của chất béo
- Chỉ số iot càng cao thì axit béo càng không no và dễ bị oxi hóa

NHẬN XÉT CHUNG:

- Mẫu dầu thực vật cho PTN cung cấp là dầu Tường An, có thành phần: dầu olein, dầu đậu nành,
dầu hạt cải tinh luyện, Ester của Polyglycerol với acid béo (475), Vitamin A.
- Chỉ số axit: Ax = 1,31
- Chỉ số xà phòng: Xp = 236.064
- Chỉ số peroxit: P = 0.842
Mẫu dầu thực vật này có thể đã bị thuỷ phân một phần trong quá trình sử dụng, do tiêu chuẩn quốc tế
về lipit trong thực phẩm là lipit không bị thuỷ phân, tức là chỉ số axit = 0.
Mẫu dầu thực vật này đang trong quá trình ôi hoá vì chỉ số peroxit > 0. Trong thực phẩm, nếu ban đầu
đã có peroxit thì quá trình ôi hoá sẽ diễn ra rất nhanh nên chỉ số peroxit mong muốn trong thực phẩm là bằng
0