UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGIA – MICROBIOLOGÍA

ASIGNATURA: TECNICAS MOLECULARES DE LABORATORIOS
DOCENTE: DR. ALONSO R. POMA TICONA
LABORATORIO PRÁCTICO N° 6 y 7

EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO

OBJETIVOS:

El objetivo de este experimento es introducir los principios de la extracción de

ADN cromosómico a partir de células bacterianas.
FUNDAMENTO:

Toda la información genética esencial para la vida de la bacteria está

contenida en una única molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble
cadena y circular, cerrado por enlace covalente. Dicha molécula se denomina
cromosoma bacteriano. Muchas bacterias poseen además ADN
extracromosómico, también circular y cerrado, denominado ADN plasmídico por
estar contenido en los plásmidos. Éstos, portan información génica para muchas
funciones que no son esenciales para la célula en condiciones normales de
crecimiento.
En términos bioquímicos la composición y estructura de los ácidos
nucleicos bacterianos es la misma que para cualquier célula. Conviene recordar
brevemente que los ácidos nucleicos son macromoléculas compuestas de
nucleótidos unidos de forma covalente, de dos residuos de azúcares adyacentes.
Esta estructura forma un esqueleto de azúcares y fosfatos constante en toda la
macromolécula.

El ADN, como macromolécula, está compuesto por dos cadenas

nucleotídicas o hebras antiparalelas que se enlazan entre sí formando una doble
hélice. Los enlaces entre ambas hebras de ADN están determinados por puentes
de hidrógeno entre las purinas de una cadena, con las pirimidinas de la otra.
Entonces, la A forma dos puentes de hidrógeno con la T, mientras que la C forma
tres puentes de hidrógeno con la G. Dicho fenómeno se conoce como
complementariedad de bases, es decir que la A es complementaria a la T y la C
lo es para la G. Estos enlaces mantienen estable la estructura de doble hélice de
ADN.

El cromosoma bacteriano es utilizado para obtener información

filogenética de los microorganismos. En tal sentido la extracción del ADN es un
método por el cual se puede liberar el ADN del medio intracelular y luego ser
purificado para ser finalmente utilizado para la amplificación del gen ADNr 16S
para estudios filogenéticos.
MATERIALES

 Pellet bacteriano
 Solución de Lisozima
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ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGIA – MICROBIOLOGÍA
ASIGNATURA: TECNICAS MOLECULARES DE LABORATORIOS
DOCENTE: DR. ALONSO R. POMA TICONA
 Solución de proteinasa K
 Solución de SDS
 Solución de NaCl y CTAB/NaCl
 Solución de Cloroformo/alcohol-isoamílico
 Solución de fenol/cloroformo/alcohol-isoamilico
 Solución de Isopropanol
 Solución de etanol 70% y agua ultra pura
 Microcentrífuga
 Microtubos y micropipetas
 Bano Maria
PROCEDIMIENTO

Protocolo adaptado de Wilson (1987).

1. Tomar 1,5 ml de cultivo líquido de cultivo bacteriano a un microtubo de 1,5
ml, luego centrigugar a 8000 rpm por 5 min.
2. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 550 ml de buffer TE.
3. Luego adicionar 200 µl de lisozima (52,5mg/ml) e incubar por 30 min a
37°C.
4. Luego de la incubación adicionar 100 µl de Proteinasa K y 100 µl de SDS
10% e incubar por 30 min a 37°C.
5. Luego del pretratamiento agregar 300 µl de 5M de NaCl y 150 µl de
CTAB/NaCl, homogenizar con micropipeta e incubar a 65°C por 10 min.
6. Posteriormente agregar 750 µl de Cloroformo/alcohol-isoamílico y
centrifugar a 8000 rpm durante 10 min.
7. Rescatar el sobrenadante y repetir el paso con fenol/cloroformo/alcohol-
isoamilico. Recuperar el sobrenadante.
8. Adicionar 600 µl de isopropanol helado al sobrenadante (precipitación del
ADN).
9. Centrifugar la mezcla a 12000 rpm por 10 min a 4°C.
10. Descartar el sobrenandante.
11. Lavar el pellet con 100 µl de etanol 70 %. Repetir procedimiento.
12. Centrifugar.
13. Rehidratar el ADN con 100 µl de agua ultra pura y conservar a 2°C.

REFERENCIA: Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria, in Current

Protocols in Molecular Biology (1987). Wiley, New York, pp. 241.-245. 1987.