PL1 – Determinação do KM e Vmáx do enzima invertase

 Reação: Sacarose+ H 2 Oinvertase Glucose + Frutose

→
 Enzima invertase catalisa a hidrólise das ligações glicosídeas 1,2 da molécula de
sacarose.
 O reagente DNS permite a identificação dos açucares redutores
 O reagente tem de ser adicionado em meio ácido. Caso seja adicionado em maio
alcalino este irá reagir com o carbono anomérico livre, sendo reduzido a ácido 3-amino-
5-nitrosalicilico.
 Fonte do enzima é a levedura S. cervisiae.
 A reação decorreu durante um intervalo de 5 min num banho de água a 35C, tendo os
tubos sido transferidos para um banho de água a 100C de modo a desnaturar o enzima
e parar a reação.
 Quando a concentração do substrato é bastante superior à do enzima, a velocidade da
reação é apenas dependente da capacidade do enzima formar o complexo enzima-
substrato, com posterior formação do produto.
 Os parâmetros cinéticos serão determinados a partir da equação de Michaelis-Menten e
o gráfico de Lineweaver-Burk.
V máx × [ S ]
 Equação de Michaelis-Menten: v 0=
K M+⌊S ⌋
 A preparação da solução de invertase passa por uma centrifugação de 3000 rpm.
 Em todos os tubos é adicionada solução tampão 0,2M a pH= 4,5, água e sacarose
0,05M.
 Preparam-se tubos padrão de glucose para a construção do gráfico.
 Após o arrefecimento dos tubos foi adicionado o reagente DNS.
 Foram lidas as absorvências dos tubos da reação e dos tubos padrão
 Determinação dos parâmetros cinéticos:
1. Construção do gráfico padrão
2. Substituição do y pelos valores das absorvências dos tubos da reação
3. Dividir os valores obtidos de x por 2 de modo a determinar a concentração de
glucose em g/L.
4. Passar g/L a mM (MM=180,2 g/mol)
5. Calcular v0, 1/v0, 1/[S]
6. Construir o gráfico
7. Determinar KM e Vmáx
PL2 - Determinação do KM e Vmáx da fosfatase ácida de gérmen de trigo e o efeito do
inibidor Na2PO4

 Reação: P−nitrofenilfosfato+ H 2 O fosfatase

→
ácida P−nitrofenol+ P i
P−nitrofenol+ KOH → anião P−nitrofenilato
 As fosfatases são proteínas diméricas que contém um centro ativo com resíduos de
serina.
 As fosfatases ácidas têm um pH ótimo inferior a 7 e existem em plantas e animais.
 As fosfatases básicas têm um pH ótimo superior a 7 e existem em bactérias, fungos e
animais superiores.
 O substrato da reação é o PNPP.
 Após a formação do PNP é adicionado KOH que aumenta o pH da reação, de modo a
para-la e a originar o anião P-nitrofenilato que absorve a 405nm (Ԑ=1.88×104 M-1 cm-1).
  A cada tubo de ensaio é adicionado o substrato com diferentes concentrações e água.
 Posteriormente é adicionado uma solução de tampão fosfato 1M pH=5.7, de modo a
garantir o pH ácido para a ação do enzima, e MgCl2 que serve como cofator da reação.
 A cada 2min é adicionada a solução do enzima, que são transferidos para incubação
30C.
 Passados 15min é adicionado o KOH.
 Preparar novamente os tubos com a posterior adição do inibidor Na2PO4.
 Registar as absorvências lidas.
 Determinação dos parâmetros cinéticos:
1. Determinação das concentrações em Mm (A=Ԑcd).
2. Calcular v0, 1/v0, 1/[S].
3. Construção dos gráficos com inibidor e sem inibidor.
4. Determinar KM e Vmáx
K M s /inibidor
 Cálculo do Ki: K M c/inibidor=K M s /inibidor + ×i
Ki
 Caso KM s/inibidor  KM c/inibidor e Vmáx s/inibidor  Vmáx c/inibidor, trata-se de um
inibidor anti-competitivo.
 Caso KM s/inibidor = KM c/inibidor e Vmáx s/inibidor  Vmáx c/inibidor, trata-se de um
inibidor competitivo.
PL3 – Separação de componentes celulares por centrifugação diferencial

 Obtenção da fração mitocondrial e citosólica para posterior análise

 Métodos de rutura da membrana celular: choque osmótico (soluções com diferentes
concentrações), vibrações ultrassónicas, detergentes, trituração (método utilizado em
aula).
 A escolha do meio de isolamento correto permite manter as propriedades bioquímicas
dos organitos.
 A separação dos diferentes organitos é possível através de ultracentrifugas preparativas.
 Centrifugação diferencial: método que permite a separação dos vários constituintes
celulares através de centrifugações sucessivas com velocidade crescente de rotor.
 Rotações baixas permitem a deposição de partículas mais pesadas e rotações mais altas
a deposição de partículas mais leves.
 A centrifugação tem de ser realizada no frio para impedir a destruição dos organelos
por parte dos enzimas.
 A fração nuclear contém DNA, RNA e proteínas.
 A fração mitocondrial contém mitocôndrias, peroxissomas e lisossomas. A presença de
mitocôndrias permite o estudo da respiração aeróbia devido à presença do ciclo do
ácido cítrico e da fosforilação oxidativa nestas.
 A fração microssomal contém pequenas vesiculas, formadas a partir da fragmentação
do reticulo endoplasmático, ribossomas e polissomas.
 A fração citoplasmática contém proteínas solúveis.
 A primeira centrifugação ocorre a 4000g durante 10min, a 4C, com um rotor JA20
raio 7cm. O sedimento desta centrifugação diz respeito à fração nuclear, que é
descartada.
 O sobrenadante é novamente centrifugado, a 4C, a 15000g durante 20min co um rotor
JA21 raio 7.3cm. O sedimento diz respeito à fração mitocondrial e o sobrenadante à
citosólica.
 O meio de isolamento utilizado para a trituração do fígado de vaca é constituído por
sacarose, EDTA, HEPES e KOH. O KOH é utilizado para acertar o pH a 7,5.
  Converter g em rpm: g=1,118 ×10−5 × raio(cm)×rpm2
 Cuidados a ter com a centrifugadora: colocar tubos com igual volume em posições
opostas de modo a garantir o equilíbrio das forças.
PL4 – Análise da atividade da succinato desidrogenase em mitocôndrias

 Reação: Succinato SDH

→
Fumarato

+¿¿
F ADH 2−SDH + DCIP ox → DCIP red + FAD−SDH +2 H

 Reação do ciclo do ácido cítrico, presente na mitocôndria.

 Enzima SDH catalisa a oxidação de 2H do succinato originando fumarato, com o
auxilio do cofator FAD que é reduzido a FADH2.
 Dois eletrões do FADH2 são transferidos para a ubiquinona, um componente da
fosforilação oxidativa, restaurando o FAD.
 Como nenhum dos componentes da reação pode ser medido, a atividade da SDH é
seguida pela redução de um aceitador artificial de eletrões, o DCIP.
 Para tal é necessário interromper o percurso natural dos eletrões, através da azida de
sódio (veneno). Este veneno impede a passagem dos eletrões do citocromo a3 para o
oxigénio.
 O aceitador artificial de eletrões, DCIP, na forma oxidada apresenta uma coloração azul
e na forma reduzida apresenta-se incolor.
 À medida que o succinato é convertido em fumarato, o FAD é reduzido a FADH 2. O
DCIPox recebe os eletrões do FADH2 sendo reduzido a DCIPred. À medida que o
succinato é oxidado a fumarato, os valores de absorção lidos a 600nm vão diminuindo,
uma vez que o DCIP vai sendo reduzido, perdendo assim a sua coloração.
 Foram preparados 6 tubos, sendo que quatro deles funcionaram como controlo.
 O tubo 1 continha a azida de sódio, o succinato (substrato), as mitocôndrias e o DCIP.
 O tubo 2 continha os mesmos componentes e o inibidor malonato, sendo o único tubo a
conter o inibidor.
 O tubo C1 não continha mitocôndrias, permitindo avaliar a reação na ausência de
mitocôndrias.
 O tubo C2 não continha succinato, permitindo verificar o efeito do substrato.
 O tubo C3 não continha a azida de sódio, permitindo avaliar o efeito do veneno.
 O tubo C4 só continha mitocôndrias, permitindo verificar a influência das mitocôndrias.
 O DCIP foia adicionado antes da leitura de cada tubo.
 Cálculo da velocidade de desaparecimento do DCIPox:
1. Calcular a variação da absorvência entre t=0s e t=180s
|¿|
2. Calcular v 0=∆ ¿, com Ԑ= 2,06×104 M-1cm-1
ε∆t
 Cálculo da velocidade da SDH:
6
v 0 × 10
1. atividade=
m
2. v0 corresponde à velocidade do tubo 1.
 Na presença do inibidor a velocidade da reação diminui, pelo que é possível afirmar que
se trata de um inibidor competitivo.
PL5 – Análise da fração citosólica (trasaminases)

 Reação: L− Alanina+α −cetoglutarato GTP

→
Piruvato + L−glutamato
Piruvato+2 , 4−dinitrofenilhidrazina → Hidrazina
 Uma reação de transaminação consiste na transferência do grupo amina de um
aminoácido para um α-cetoácido, originando um novo aminoácido e um novo α-
cetoácido.
 Na maioria dos casos o α-cetoácido aceitador utilizado é o α-cetoglutarato, que ao
receber o grupo amina transforma-se em L-glutamato, sendo utilizado o coenzima PLP.
 A aspartato transaminase ou GOT converte o aspartato em oxaloacetato.
 A alanina transaminase ou GPT converte a alanina em piruvato, sendo esta a
transaminase estudada na aula.
 Foram preparados 4 tubos de ensaio, 2 contendo alanina como substrato (A1 e A2) e
outros dois contendo treonina como substrato (B1 e B2).
 Todos os tubos continham α-cetoglutarato, o aceitador do grupo amina.
 Os tubos A1 e B1 não continha enzima, servindo de controlo, enquanto que o A2 e B2
continha a fração citosólica.
 Depois de um período de incubação é adicionada o 2,4-dinitrofenilhidrazina, um
reagente de cor que permite a quantificação dos carbonilos.
 A solução do 2,4-dinitrofenilhidrazina é preparada em meio ácido.
 É adicionada posteriormente a cada tubo uma solução de NaOH, que permite a
formação de um complexo intensificando a cor, para a leitura da absorvência a 540nm.
 O α-cetoglutarato tem uma concentração bastante inferior à da alanina para evitar que
reaja com o 2,4-dinitrofenilhidrazina.
 Os tubos B1 e B2 servem para avaliar a presença do enzima treonina desidrogenase.
 O facto de se observar absorvência no tubo B2 é um indicio da existência do enzima
treonina desidrogenase na fração citosólica.