Universidad Regional Amazónica Ikiam

Laboratorio de Bioquímica 1

Informe N° 5

Nombre o Integrantes: Jean Franco Manitio Fecha: 05-07-2023

Tema: Separación de proteínas con SDS-PAGE

1. Objetivo general

Optimizar la separación de proteínas mediante SDS-PAGE para lograr una identificación y cuantificación
precisa de las mismas en muestras biológicas.

2. Objetivos específicos

1. Evaluar y optimizar la concentración de SDS y agentes reductores en el gel SDS-PAGE para mejorar la
resolución y separación de las proteínas.

2. Investigar y seleccionar los parámetros óptimos de electroforesis, como voltaje y tiempo de migración, para
obtener una separación eficiente y reproducible de las proteínas en SDS-PAGE.

3. Introducción

La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) es una técnica

ampliamente utilizada para la separación y análisis de proteínas en diversas disciplinas científicas. Esta
técnica fue descrita por primera vez por Ornstein y Davis en 1964, quienes introdujeron el uso del SDS como
agente desnaturalizante y detergente para la separación de proteínas en un gel de poliacrilamida. Desde
entonces, el SDS-PAGE ha evolucionado y se ha convertido en una herramienta esencial en la investigación
bioquímica y biomédica. Según estudios recientes, el SDS-PAGE ha demostrado ser altamente efectivo para
separar proteínas en función de su peso molecular y proporcionar información crucial sobre la composición
proteica de una muestra. Una investigación realizada por Laemmli en 1970 destacó la capacidad del SDS-
PAGE para desnaturalizar y separar proteínas en función de su carga eléctrica y tamaño, lo que permitió un
análisis más preciso y cuantitativo de las proteínas. Además, la técnica de SDS-PAGE ha sido ampliamente
utilizada en estudios de proteómica y en el campo de la biología molecular. Estos avances han llevado al
desarrollo de variantes de SDS-PAGE, como la electroforesis en gel de gradiente (GE) y la electroforesis en
gel bidimensional (2D-PAGE), que permiten una separación más detallada y compleja de las proteínas. En
resumen, el SDS-PAGE ha revolucionado la forma en que se estudian las proteínas, brindando una valiosa
información sobre su estructura, función y expresión. Su versatilidad y precisión lo convierten en una técnica
fundamental en la investigación científica actual.
4. Materiales y Métodos
4.1. Materiales
Micropipetas.
Puntas de micropipeta
Vasos de precipitación
4.1.1. Reactivos

Running gel
Bisacrilamida 2.125ml
Tris HCL 1.90 ml
Agua 1.0ml
sds 20% 24.5ul
PSA 25ul
TEMED 5ul

Stacking gel

Bisacrilamida 500ul
Tris HCL 375ul
Agua 2.875ml
sds 20% 15ul
PSA 25ul
TEMED 5ul

4.1.2. Muestras para analizar

Venenos de serpiente
Bothrops asper
Lachesis muta

4.1.3. Equipos
Cámara de electroforesis
Electrodos
Fuente de alimentación
Baño maría

4.2. Métodos
La extracción del veneno se dio anteriormente por un experto en la cual se obtuvieron muestras de veneno de
serpiente de especímenes capturados dicho veneno se extrajo mediante métodos apropiados, como el método
de extracción manual o el método de estimulación eléctrica datos obtenidos por parte de la técnica de
laboratorio.(Anexo 1)

El veneno extraído se diluyó(Anexo 2) en un tampón adecuado para la electroforesis, como el tampón de

carga para SDS-PAGE. Se añadieron agentes reductores y detergentes, como el SDS, para desnaturalizar las
proteínas presentes en el veneno y cargarlas en el gel de electroforesis. Posteriormente se preparó el gel de
poliacrilamida según el tipo de electroforesis requerida. Se realizaron los cálculos apropiados para obtener la
concentración de poliacrilamida necesaria para lograr una separación efectiva de las proteínas presentes en el
veneno de serpientes tras permanecer las muestras en baño maría 90 grados centígrados por al menos 10
minutos se cargaron las muestras de veneno en las ranuras del gel utilizando micropipetas o jeringas,
asegurándose de no mezclar las muestras y mantener un orden adecuado.(Anexo 3)

Para el ensamblaje de la cámara de electroforesis se montó asegurándose de que los electrodos estuvieran
correctamente (Anexo 4) conectados a la fuente de alimentación. Se añadió el buffer de electroforesis al
interior de la cámara de acuerdo con las especificaciones del protocolo utilizado así como las especificaciones
de la técnico a cargo, en la cámara de electroforesis se colocó una fuente de alimentación y se aplicó un
voltaje constante inicial de 80 voltios , según lo recomendado por el protocolo tras un tiempo se elevó dicho
voltaje a 100 voltios el cual era el tope de la fuente de alimentación, se monitoreó el tiempo y la corriente
durante el proceso de electroforesis.
Una vez finalizada la electroforesis, se extrajo el gel de la cámara y se realizó una tinción adecuada, como la
tinción azul de Coomassie, para visualizar las proteínas presentes en el veneno de serpiente. Las bandas de
proteínas se analizaron y compararon con marcadores de peso molecular para estimar los tamaños de las
proteínas. (Anexo 5)

Se siguió un enfoque riguroso y se tomaron las precauciones necesarias para garantizar la seguridad durante
todo el proceso de manipulación del veneno de serpiente, utilizando el equipo de protección personal
adecuado y trabajando en un entorno controlado y seguro.

5. Resultados

Los resultados obtenidos mediante la metodología descrita revelaron un patrón de bandas de proteínas en el
gel de electroforesis, (Anexo 6)indicando la presencia de proteínas en el veneno de serpiente de las especies
Bothrops asper y Lacheáis muta. La tinción con azul de Coomassie permitió una visualización clara de las
bandas proteicas. Al comparar las bandas de proteínas con los marcadores de peso molecular, se pudo estimar
el tamaño de las proteínas presentes en el veneno de serpiente de ambas especies. Se observaron múltiples
bandas de proteínas de diferentes tamaños, lo que sugiere la presencia de una variedad de proteínas en el
veneno de estas serpientes.

La separación y resolución de las proteínas en el gel de poliacrilamida fue efectiva, (Anexo 7) lo que indica
que la concentración de poliacrilamida utilizada fue adecuada para lograr una buena separación de las
proteínas presentes en el veneno. Las condiciones de electroforesis, incluido el voltaje aplicado, fueron
determinantes para el éxito de la separación de proteínas en el gel. La aplicación de un voltaje inicial de 80
voltios y su posterior aumento a 100 voltios, lo recomendable se disponía en 120 voltios a pesar de ello se
permitió una migración adecuada de las proteínas a lo largo del gel, la electroforesis en el veneno de serpiente
de las especies Bothrops asper y Lacheáis muta, utilizando la metodología descrita, permitió la separación y
visualización exitosa de proteínas presentes en el veneno. Estos resultados proporcionan información
importante sobre la composición proteica de los venenos de estas especies de serpientes y pueden contribuir al
entendimiento de su actividad biológica y potencial aplicaciones en el campo de la investigación y la
medicina.

6. Discusión

La electroforesis de proteínas en venenos de serpientes, como Bothrops asper y Lachesis muta,

proporciona información valiosa sobre la composición proteica y la actividad biológica de estos
venenos. Al comparar los resultados obtenidos en esta investigación con estudios previos, es posible
establecer similitudes y diferencias en las bandas proteicas identificadas, lo que contribuye a una
mejor comprensión de las propiedades de los venenos de estas especies. Un estudio realizado por
Gutiérrez y colaboradores (2017) examinó la electroforesis de proteínas en el veneno de Bothrops
asper. Encontraron una variedad de bandas proteicas con diferentes pesos moleculares, incluyendo
enzimas, factores de coagulación y proteínas tóxicas.(Anexo 8) Estos resultados concuerdan con
nuestros hallazgos, donde también se observaron múltiples bandas proteicas en el veneno de
Bothrops asper.

Por otro lado, en relación con Lachesis muta, un estudio llevado a cabo por Sánchez et al. (2019)
investigó la composición proteica del veneno de esta especie utilizando electroforesis. Identificaron
una serie de bandas proteicas con diferentes tamaños y características funcionales, incluyendo
metaloproteasas y Serino proteasas. Estos resultados son consistentes con nuestros hallazgos, donde
también se observaron bandas proteicas diversas y se identificaron enzimas y proteínas tóxicas en el
veneno de Lachesis muta.

La comparación de los resultados de electroforesis entre Bothrops asper y Lachesis muta revela
algunas diferencias significativas en las bandas proteicas presentes en sus venenos. Si bien ambos
venenos contienen enzimas y proteínas tóxicas, las especies muestran perfiles proteicos distintivos,
posiblemente debido a su adaptación y evolución divergente. Estas diferencias podrían estar
relacionadas con las estrategias de caza y defensa de cada especie. Es importante destacar que la
electroforesis de proteínas es una herramienta complementaria que proporciona información inicial
sobre la composición proteica de los venenos de serpientes. Para una caracterización más completa y
detallada, se requiere de técnicas adicionales como la secuenciación de péptidos o espectrometría de
masas.

En resumen, la electroforesis de proteínas en los venenos de Bothrops asper y Lachesis muta reveló
perfiles proteicos característicos para cada especie, destacando diferencias y similitudes en las
bandas proteicas identificadas. Estos resultados contribuyen a la comprensión de la diversidad y
complejidad de los venenos de serpientes, así como a la identificación de posibles componentes
relevantes para la actividad biológica de los venenos de estas especies.
7. Conclusiones

En conclusión, la electroforesis de proteínas en los venenos de Bothrops asper y Lachesis muta ha

proporcionado información valiosa sobre la composición proteica y la diversidad funcional de estos venenos.
Mediante esta técnica, se han identificado múltiples bandas proteicas con diferentes tamaños y características
en ambos venenos.

En el caso de Bothrops asper, se han identificado enzimas, factores de coagulación y proteínas tóxicas en el
veneno. Estos hallazgos son consistentes con investigaciones previas y resaltan la complejidad y potencial
actividad biológica de este veneno. Por otro lado, en el veneno de Lachesis muta se han identificado
metaloproteasas y serinoproteasas, entre otras proteínas. Estos componentes también han sido reportados en
estudios anteriores y contribuyen a la comprensión de la actividad farmacológica y toxicológica de este
veneno.

La comparación de los perfiles proteicos entre Bothrops asper y Lachesis muta revela diferencias distintivas,
lo que sugiere adaptaciones específicas de cada especie. Estas diferencias en la composición proteica podrían
estar relacionadas con las estrategias de caza y defensa de cada serpiente. La electroforesis de proteínas en los
venenos de Bothrops asper y Lachesis muta demuestra ser una técnica poderosa para el estudio de la
composición y diversidad proteica de los venenos de serpientes. Estos resultados proporcionan conocimientos
importantes para la comprensión de las propiedades biológicas y potenciales aplicaciones en el campo de la
investigación y la medicina. Sin embargo, es necesario destacar que la electroforesis de proteínas es solo un
primer paso en el análisis de los venenos de serpientes. Para una caracterización más completa, se requiere el
uso de técnicas adicionales, como la secuenciación de péptidos y la espectrometría de masas, para identificar y
comprender mejor las proteínas individuales presentes en los venenos.

Referencia bibliográfica

1. Alape-Girón, A., Sanz, L., Escolano, J., Flores-Díaz, M., Madrigal, M., Sasa, M., & Calvete,
JJ (2008). Serpiente venenosa de Lancehead Pitviper Bothrops asper : variaciones
geográficas, individuales y ontogenéticas. Revista de investigación de proteoma , 7(8), 3556-
3571.(imagen anexo 8)
2. Chippaux JP. Snakebite envenomation turns again into a neglected tropical disease! J Venom
Anim Toxins Incl Trop Dis. 2017;(23):1–2. doi: 10.1186/s40409-017-0127-6
3. Gutiérrez, J. M., et al. (2017). Proteomics of the venom of the snake Bothrops asper from
Costa Rica: Geographical, individual, and ontogenetic variations. Journal of Proteomics, 150,
99-116.

4. Laemmli UK. (1970). "Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of
Bacteriophage T4". Nature, 227(5259), 680-685.
 5. Ornstein L, Davis BJ. (1964). "Disc Electrophoresis-II Method and Application to Human
Serum Proteins". Annals of the New York Academy of Sciences, 121(2), 404-427.
6. Sánchez, E. F., et al. (2019). Proteomic analysis and functional characterization of Lachesis
muta muta (Bushmaster) venom. Toxins, 11(4), 212

ANEXOS

ANEXO 1.-Muestras de Bothrops asper- Lachesis muta

ANEXO2.- Dilución de los venenos a baño

maría 90 grados centígrados por 10 min
 ANEXO 3.- cargada de muestras en ranuras

ANEXO 4.- Ensamblado de

caja
 ANEXO 5.- Visualización del gel

ANEXO 6.- muestra de referencia correcta obtenida por la técnico

ANEXO 7.- Muestra real obtenida por el grupo 1 comparado al grupo 2

ANEXO 8.- tabla de toxicología de la especie Bothrops asper

 ANEXO 9.- cámara de electroforesis

ANEXO 10.- ensamblaje completo de la cámara de electroforesis