Sanidad CFGS Laboratorio Analisis bioquimico Ue TOC PC ema UT oS aa UL aE UT Bficomar —Agradecimientos: Centro de Formacin Profesional de Puerta de Hierro Las actividadestejareicios que se plantean en este libro se deben realizar en un cuaderno de trabajo y no an al libro. Andlisis bioquimieo Queda prohibida, salvo excepcién prevista en la ley, cualquier forma de reproduccién, distribuckén, camunicacién y transfarmacida de esta obra sin cantar con autorizacibn de los ttulares de la propiedad intelectual. La infraccién de las derechos menconados puede ser constitutiva de delito contra fa propiedad intelectual (arts. 270 y siguientes del Cédigo Penal). £1 Centro Esnarcl de Derechos Repragrificas (wvi.cedra.org} vela por él respeto de les ciladas derechos. (© 2016, Femando Simén Luts, Fernanda Gémez Aguada, Marla abel Lorenzo Luque, Benito Hemdnddaz Giménez ©2016, ALTAMAR, S.A, C/ Medes 8-10, (98023 (Barcelana} IS8N: 978-84-16415-23-6 Depésho Legal: 83172-2016 Diseria de cubiertas: Oriol Mind Genovart Diseria de interiores: Oriol Miré Genovart Fotografla de la cublerta: © transS61 llustraciones: Joaquin Romera Requeiro, Francasca Mufioz Serrano y Eximpre SL Fotografias: BigStock, iStockphota y Fondo Altamar Maquelacién: Eximpre SL Impreso en: GRAFO Impreso en Espana — Printed in SpainEl de Anilisis bioquimico es un médulo profesional de la familia de sanidad, que se cursa ‘en el ciclo de grado superior LagorATORIO CLINICO Y BIOMEDICO. E! presente libro esta elaborado partiendo de los minimos establecidos en el Real Decre-to 77122014, de 12 de septiembre. Esta organizado en nueve unidades didécticas, que abor- dan todos los contenidos que prevé el curriculum. Las dos primeras unidades desarrollan los conceptos relatives a las técnicas utilizadas en el laboratorio de bioquimica clinica. En la tercera, cuarta, quinta y sexta unidades se describen las magnitudes bioquimicas relacionadas con el metabolismo de los principios inmediatos, los productos finales del metabolismo, los equilibrios hidroelectroliticas y acido-base y la determinacién de enzimas. A partir de la séptima se explican las determinaciones en orina, heces y atros liquides corparales, mientras que la Gitima esta dedicada a las determinacio- nes en estudios especiales. Hemos intentado elaborar un manual completo y de facil lectura que sea a la vez sencillo. de comprander y manejar, de modo que el alumnado tenga recopilada la informacion nece- saria y pueda estudiarla y trabajar con ella de forma organizada. También pretendemos que el profesorado disponga de un texto bien estructurado que le sirva de pauta y apoyo en su labor. Para ayudar a consolidar los conocimientos adquiridos, cada unidad incluye una serie de ejercicios y actividades practicas, utiles tanto para aplicar procedimientos y adquirir habili- dades como para realizar investigaciones en pequefios grupos. Somos conscientes de la imposibilidad de tratar a fondo todos los aspectos de la bioquimica clinica; por eso hemos intentado en este libro referencia la mayoria de los conceptos bio- quimicos que deben servir de base, abriendo la posibilidad de profundizar en aquellos ‘temas que el profesorado considere oportunos. Esperamos que este libro ayude a los futuros técnicos superiores a adquitir los conocimien- ‘os que necesitardn en su préxima vida laboral, tenlendo siempre presente que es un sector en constante cambio, en el que los profesionales deben tener unos conocimientos basicos sdlidos que les permitan comprender e incorporar a su actividad cotidiana las nuevas técni- cas y procedimientos. Los autoresUnidad diddctica 1 3.2.4. Determinacién dela hernaglobina glicasiada... 59) ‘Técnicas del laboratario de bioquimica dinica() 6 —__ 3.2.5. vas deterrinacones. 60 11. Inet seis de biogutnea cna... T 3.3. Magnitude loqumias det metals de os 412, Las tdeneas espectrométicas 7 pid yas inoproteinas st 1.2.1. Las radiaciones electramagnéticas. Conceptos z aa Cees ore de is j at bse. 7 3.322 Principles compuestcs relacionados con el 1.2.2 Interac vadiseidn musta y principales metabolism liniica 81 enicas espectroméicas 3 23.3.8 matabolsmo de ls ipoproalnas 63 1.2.3. La insrumentacié: el especioftémetra 10 3.3.4 Regulacién del metabolism de fos lipids a 13, Espectrometia de absorcion molecular 12 3.3.5 Patrones de altracon del metabolsmo de 13.1 La abuorlén molecular a lipids - 6 13.2 La leyde Lambert Beer 15 3.3.6 Determinsdionessnaicas poral valoraclon 13.3 Instumentadon: especvofotbmetio WWW... 16 al metabolism lpitica 66 13.4 Cunvas de eallvade 17 3.3.7. tas determinacones analtcas 68 1.3°5. Medicines a punto final, cndtica y enzimaticas 18 34. Magnitudes bloqulmicas de metabollsmo de las 1.3.6. Especiometia de absorcion moleaulr en el proteinas 6 infanajo 21 3.4.1. Caractersticas generales de las protenas 14, Expectometia de abioreién aibmica 2 plasmic 9 1.4.1 Especrometia de absorén stémica con lama. 22-342 Estuda delas proteins passa 70 1.4.2 Especrometia de absorcén atomica con 3.4.3. Patrones de altracin de las protelnas aibmazlon elecrotetmica a pasmétcas «= 3 15, Espectiometia de emisién ardmica 24 244. Dlagnéstendelabortroparadlinfatoagudo 1.5.1 Fotometra de lama 2a - 1.5.2 Espacrometia de emision atmica por plasma. 24 Unidad didAetiea 4. 116, Espectometia de luminscencia 25 Magnitudes: productos finales del metabolismo 80 Ped aoe 25 4.1. Compuestosnitrogenados no proteicas at 1.6.2. Quimioluiniscenia 26 ay tes . a1 17. Espectometia de dispersion dela radcién ata creatnhna. 0. a 17-1 Turbdimatla. pels : 3 fo eee a ated 2T AA elde ico 21> 8 118, Retsctometis de quidas Pa oT areca ant 119, Folometia deeelctancia. Quimica seca a at caren 7 IO iLRrcirat oC ab ete 28 "12.1. H1 metabolsmo de le hemoglbina at eer 304222 Miperbieubinemia 92 ida did ne a 304.23. Determinacidn de bilmubina 82 Unidas actica 2 4.3. Acido lictica y dcide pirtwico. 93 ‘Técnicas del laboratorio de bloguimica clinica (l) 34 4.3.1.Melabolsmo de k glccsa....-.-.0s.c0 98 2.1, Espoctometuia de masas 3S 4.3.2 leiden tei... aa 2.11. ELespeetrémetro de masas 35 4.3.3 Determinaclones delscatay pirwato oa 2.1.2. Aplicaciones dela espectometia demasss-... 37 4.4 Cuerposcetonicas Ss eae Nees ones os 38 “41.1. Matabolstne de las Sedos gratosyeatoscldess 95, 2.2.1. Tipas de comatograias 3B 4.4.2 Doterminacén de curpos cetdnicas 36 2.2.2. Ctomatageais de guides de at esoucion 2.23. Clomatograia de gases y-ugunne sel] di dactica) 324 Cromatagratia plana 42 Magnitudes: equilibrios hidrostectrolitico y 23, Osmametia ug Sdido-base . ao +++ 100 214, Tenlcaselectroquimicas a 5.1. Equllb hidiaelectroica tot 710.1. Toeieas potencom dices 44 —_5.11.La compartimentacion del agua corporal 101 2.4.2 Tenleas amparornétrcas 4 5.12 La compasiién Sinica de is fides 101 243. Bosensores...... LL ap 5.1. Ragulecén del equi hidoelectotica. $02 2.5, Automaizacion de las téenicas de Tabara ora 48 5.1.4. Osmoalidad plasma 103 25.1, Autemaizaeion pari 4a 5.15. Elecroitas de interés dlagnésten. 10a 2.5.2. Automatizacin total dl aboratorio 43 5.1.6 Determinaclones espectrométcas deelecoltos t08 Unidad diddctica 3 5.2. Estudio dela oxigenacin. Gasometia 109 5.2.1 Valoraiém dl estado de oxigenscion 110 fe CE TOC ID 5. 522 Procadinieno dela gasometia 413 3 treduccin : $353. Elequlibriodddosbese 14 2.2, Magnitudes bioquimicas det metabolisma de los 53) tes sieras ae Salorgentene.-.. 115 guddos sa 2. Los mecanisnes de compensa. 12.1. El metabolism dels glo S4 5.33. Alteracones del equllrio dido-base 116 412.2. Pattones de lteacén del metabolitno 5.3.4 Determinecones en el equilbio Sedo-base... 119 hrocarbonado. 55 5.4, Determinaciones ala cabecera el padente 120 3.2.3. Determinacidn dela gucasa 5B 5.4.1. Clasficcion delas POCT. 1205.4.2 Principals dspasitios y daterminaclones bolas usadas como POCT 5.4.3. Caldad en las POCT.....- Unidad didactica 6 Determinacién de enzimas. ... 6.1. Concentos bésicos sobre las enzimas 6.1.1. Nomendanua y dasifcacin de las enzimas. 6.1.2 Estructura y especticdad de sustrato, 6.1.3 Catdlssy cindica enzimatica. 6-1-4 Regulacidn de la acthided enzimitica 6.2. Actividad enzimatica y diagndstico cinco, 6.2.1 Sruimas presentes en el plasma 6.2.2. Enzimas presentes en ares liquide biolagios. 6.2.3 Principals enzimas de interés clinica 6.3. Enaimas asociadas a patalogias hepaticas 6.3.1 Foslatasaalealina - 6.3.2. Gamma-glutamil vansferasa .. 6.3.3 Aminovansferesas: ALT y AST 6.3.4 Lactate deshideogenasa 6.3.5. Ovas enaimas para la valoracin hepdtica 6.4. Enzimas asociadas a patologjas pancredticas. 6.4.1 acai, - 6.42. pasa 6.5, Enzimas asociadas a patologias cardiac y mmuseulares 6.5.1. Creatine quinasa total 6.5.2. Crealna quinasa MB... 6.6. Otras enzimas. Unidad didactica 7 Técnicas de estudio en muestras de orina. 7.1, Estudio dela ovina 7.2. Bramen macroscapico y fisico de la orina 7.2.1. Volumen de erina - 72.2 Aspecto : 7.2.3. Color : 72.4. Oloe : 712.5 Densidad : 7.2.6. Osmolavidadiosenolaidad. 7.3. Examen bioguimica de la orina 7.3.1. Determinacién del pH... - 7.3.2. Determinacién de proteinas 7.3.3 Determinacién de glueesa - 7.4.4 Determinacién de cuerpos 4 Sanit? ‘le Ne aaa ow vitie Fig. 1.2, Magnitudes caracteriticas de las ondas, Fig. 1.3, Espectio electromag,1.2.2. Interaccién radiacién- muestra y principales técnicas espectrométricas ‘Como ya hemos sefialado, cuando un haz de ra- diacién incide sobre un compuesto se pueden pro- ducir diferentes fenémenos. Los que tienen mayor interés por su aplicacién en las técnicas de espec- trometria son: Transmisién. Se produce cuando la radiacian incide sobre una sustancia sin producirse pérdi da de energia ni cambios de direccién. Absorcion. Se produce cuando existe una pér- dida de intensidad de la radiaci6n al atravesar la sustancia. Las moléculas 0 partfculas que absor ben radiacién ganan energia (estado excitado). Emisién. Se produce cuando moléculas 0 ato- mos en estado excitado liberan su energia y wuelven a su estado de reposo, Dispersion. Se produce cuando el haz de radia- ci6n choca contra una particula en suspension y cambia de direccién sin variar su energia Refraccién. E| haz de radiacién al atravesar una solucién se desvia © cambia de direccién por la diferente naturaleza del medio de propagacién Reflexién. El haz de luz incide sobre una super- ficie y se produce un efecto de rebote y cambio de ditecci6n Difraccién, El haz de luz se desvia al pasar por el extremo de una superficie o al atravesar una rendija, Laespectroscopia es al estudio de la interaccién entrela radiacién electromagnética y la materia y nos permite detectary cuantificar un gran n> mera de magnitudes bioquimicas. fefiexon ‘enémenos de Interacdién radiacidn-materia, Que se produzca un fenémeno u otro depende de distintas Factores, como el estado de agregaci6n del medio material de la muestra, su densidad, el tipo y forma de las particulas que la forman, su concantracién, etc. La medicidn de la intensidad de radiacién que es absorbida, transmnitida, disper- sada, reflejada, etc, mediante las técnicas de es- pectrometria permite identificar las sustancias. Las diferentes técnicas de espectrometria se pue- den clasificar segun el tipo de interaccién radia- cién-muestra de la siguiente manera: 5 uv-is Espectrometria de absorci6n molecular , Absorcién Infrarrojo Espectrometria de absorcién atémica Espectrometria de emisién molecular Fluorescencia i © luminiscencia Fosforescencia Emisién es Espectrometria de emisién atomica Técnicas espectrométricas Dispersion | tbidlmetria 'sPersion | Nefelometria Refraccién { Refractometria Refle: { Fotometria de reflectancia1.2.5, Lainstrumentaci6: el espectrofotémetro De forma genérica, el espectrafotémetro es el equipo que se utiliza en las técnicas de espec- trofetometria. A pesar de que su disefio puede variar mucho segiin la técnica especifica, todos presentan unos elementos comunes: la fuente de radiacién, el manocramador, la cubeta, el detector de radiacién y el sistema de registro y lectura. Fig. 1.5. Componentes basicos de un espectrofotémetio convencional Fuente deradiacién La fuente de radiacion, fuente de luz o lémpara es el componente que proporciona la energia radian- te de forma continua y estable. Segiin el tipo de espectra y las longitudes de onda que emitan, se distingue entre fuentes de espectro cantinuo, de espectro de lineas 0 juz léser Fuentes de espectro continuo. Se usan en las téenicas dé absoreién molecular (UV, VIS ¢ IR} y de emisién molecular par fluorescencia. Las mds comunes san: Lémparas de filamento de tungsteno (wolframio). Se utilizan para longitudes de onda del espectro visible y para el ultravio- leta préximo. Son fuentes de un espectro continuo de energfa radiante, entre 360 y 950 nm. Lamparas de filamentos de haluros de tungsteno. Tienen una duracién mayor que las de filamento de tungsten y emiten ener Qia radiante de mayor intensidad. Lamparas de hidrégeno y deuterio. Pro- ducen un espectro continuo en la regién uk travioleta, entre 220 y 360 nm. Parahen ol UW Parad encl VIS; 4 i Limpara de tungsteno 5 [\ timporade 2 (wofamia) q 300500700 ~~ 8001.10 Llongitud de onda (nm) Fig. 1.6. Comparacién de la energla radiante de las lim- parascde tungenteno y deuteria, Lamparas de arco de xenén o mercurio a elevada presi6n. Se obtienen altas intensi- dades entre 200 y 1.000 nm. Fuentes de espectros de lineas. Emiten radia- cién en forma de lineas discretas. Se utilizan en las técnicas de absorcién atémica y de emisién molecular por fluorescencia, Las més comunes son: Lamparas de vapores de mercurio, que son las més utilizadas. Lamparas de vapor de sodio. Lamparas de eétodo hueco. Fuentes de luz léser. Los espectrofotémetras més modernos usan léseres que permiten apli- car luz completamente monacromatica, sin an- cho de banda. Monocromador La luz que emite la fuente atraviesa una rendija de entrada, llega al selector de longitud de onda y sale a través de una rendija de salida como un rayo oF sgenizado de luz paralela con la longitud de onda deseada Este canjunto de elementos se denomina mono- cramador y, en sentido estricto, se refiere al selec- tor dé lengitud de onda. | Un monocromador es un dispositive éptico que | permite seleccionar y transmitir una radiacién © monacromética 2 partir de la luz generada por la fuente emisora, que produce una amplia gana de longitudes de onda Laldmparatiene una vida ctl limitada y se debe vigilar periédicamente. Ademas, las subidas y bhajadas bruscas de tension afectan al funcio- namiento de estas lamparas.Rendija de entrada La rendija de entrada evita la entrada de luz difu- sa. Estas rendijas pueden ser lentes colimadoras que colectan los rayos de luz y los enfocan de for ma que la luz pasa siendo un rayo arganizado de luz paralela. Lente colmadora Renda Ae entscs deradin Fig. Detalle de larendlja de entrada, Selector de longitud de onda El rayo organizado de luz paralela pasa al selector de longitud de onda, que modifica la longitud de onda de la radiaci6n a la que se haya programado, Los selectores se caracterizan por el ancho de ban- da que pueden seleccionar. Cuanto més estrecho sea este ancho de banda, mds pura serd la rad cidn que incida sobre la muestra y ms exactos se~ ran los valores de absorbancia abtenidos. El ancho de banda se define como el intervalo © de longitudes de onda medido ena mitad de un © pico del flujo radiante detectado. sie bat Ny 0c taco Legit de cra Fig, tepresentacidn del ancho de banda. Hay dos tipos de selectores: redes de alifraccidn y prismas. Redes de difraccién. Estén formadas por un vi- dria o una superficie metdlica con un gran nime- ro de hendiduras paralelas, situadas a cistancias iguales entre si. Cada una de estas hendidiuras se comporta como un pequeria prisma Las redes de difraccién eonsiguen anchos de banda menores de 0,5 nm y son los mejores mo- noctomadores o seleetores de onda Prismas. Tienen anchos de banda de entre 0,5 y 1.5 nm que se consiguen madificando la an- chura de la rejila de salida. Si se trabaja en la zona del visible y en la del UY proximo se pueden utilizar prismas de vidrio, pera sise trabaja en el UV lejano deben ser de cuarza porque el vidrio absorbe la luz ultravioleta Esta rendija deja pasar Ia parte del abanico desple- gada por la redo el prisma que cortesponde a las longitudes de onda seleccionadas y dirige este haz sobre la cubeta Los colorimetros tienen el mismo funciona- miento basico que los espectrofotémetras, con dos diferencias esenciales: Un colorimetra 0 fotémetro trabaja tnicamen- te en el espectro de luz visible, mientras que Un espectrofotémetro es capaz de trabajar con la luz visible, la wltravioleta y la infrarroja. Elcolorimetro utliza filtros como selector de longitud de onda. Los fitras pueden ser ~ Filtras de absorcién. Son vidrios de cola- res que absorben tadas las longitudes de ‘onda excepto la de su color: Proporcionan anchos de banda de 50 nm. ~ Filtros de interferencia. Solo dejan pasar las ‘ondas que estén en fase con un cristal die- Iéctrico que forma el filtro. Proporcionan anchos de banda de 10 nm.Cubeta Las cubetas son los recipientes en que se coloca la muestra para la medicién. Pueden ser individuales © agrupadas y de distintos tipos y tamanos (cua- dradas, rectangulares, redondas). Suelen tener un ancho de 1 cm y voldmenes variables. Se fabrican en materiales que no absorban ala lone gitud de onda deseada Para trabajar con luz visible se usan cubetas de plastico. Para trabajar con luz UV se usan cubetas de cuarzo. La cubeta tipica para espectrofatémetros simples es un prisma rectangular con dos caras transparen- tes y las otras dos mates para su manejo. Detector Esté basada en el efecto fotoeléctrico: los fotones que inciden sobre un material originan la liberacin de electrones, que producen una corriente eléctri- ca proporcional a los fotones recibidos. Esta serial eléctrica minima se amplifica posteriormente. Existen varios tipos de detectores: fototubos, fato- tubos multipicadores, fotodiodos y detectores de carga acoplada. Fototubes y fototubos multiplicadores. La luz incide sobre un cétodo fotosensible que des- prende electrones, estos electrones pasan a un 4nodo 0 a varios dinodos para amplificar la corriente. Fotodiodas. El haz de luz incide sobre un dio- do. Cuando el haz tiene suficiente energia, ex: cita un electién déndole movimiento y crea una corriente. Detectores de carga acoplada (Charge- Coupfed Device, CCD). Semejantes 3 los usados en fotografia digital. Sisterma de registro ylectura La sefial eléctrica procedente del detector se am- plifica y trasforma a continuacién en una seal di- ital. El sistema informatico interpreta el resultado, y gracias a su software, puede realizar los calculos necesarios, usando curvas de calibracién para ob- tener datos de concentracién. Tipos deespectrofatémetros Existen muchos tipos diferentes de espectrafoté- metros. De forma general y segin la disposicién de sus cornpanentes, se pueden distinguir tres: Espectrofotémetros de haz simple. Tienen los componentes basicos que hemos estudiada en el apartado anterior Espectrofotémetros de doble haz en el tiem- po. Permiten estudiar a la vez dos muestras, la muestra problema y el blanco, Parahaceslo, tienen tun dispositive con capacidad reflectante (chop- per), que obliga a la radiacién procedente de un monocramador a sequir alternativamente dos d- recciones. Una de ellas atraviesa la cubeta en que se deposita el blanco y Ia otra atraviesa la cubeta en que esté la muestra. A continuacién, las radia- ciones separadas son reorientadas mediante es- pejos para que llequen al mismo detector, que mide altemativamente las intensidades de ambas. Espectrofotémetros de doble haz en el es- patio. Todos los companentes estén duplicados menos la ldmpara; dos haces de luz pasan al risma tiempo a través de los cornpanentes se- parados en el espacio Fig. 1.10.Espectialotometies de doble haz en el tampa (1) y de doble haz-en el espacio (2).1.3. Espectrometria de absorcién molecular La espectrometria de absorcién molecular se basa enla capacidad de las moléculas de absorber una parte de la radiacién que reciben. Las longitudes de onda que cada sustancia absorbe (que no pue- den atravesarla) son caracteristicas dela molécula y, en consecuencia, se pueden usar para identificarla El andlisis por espectrometria de absorcién mole- cular puede ser cuantitativo o cualitativo: El andlisis cuantitativo. Se realiza con radia- clones del UV-VIS y se fundamenta en la ley de Lambert-Beer. Es el andlisis mas usado en los laboratorios de bioquimica y permite obtener infarmacién de las magnitudes biaquimicas, al comparar la radiacién absorbida por una solu- ci6n que contiene una concentracién descona- cida de una molécula con una que contiene una concentracién conocida de la misma molécula Anélisis cualitativo. Se realiza con radiaciones dellty en ellaboratorio clinico se usa principal mente para andlisis de a composicién de cAlcur los urinarios. 1.3.1, Laabsorcién molecular Una molécula se compone de étomos unidos en- tre sf por diferentes arbitales de enlace que com- parten electrones. Cuando una molécula absorbe radiacion electromagnética pasa de un estadaini- cial de reposo a un estado de mayor energia 0 excitado. Estado excited g S| | Foren ‘sbsorcion ain por {| ¢ fons 5 ql bade bel Fig. 1.11. Representacidn de la absoreién moleeuiar. En este estado, el aumento de energia produce cambios en los enlaces y en el movimiento de los electrones en los atornos, de manera que cambia su estructura electrénica global. Estos cambios se conocen como transiciones. Las transiciones que pueden producirse en una mo- Iécula dependen del tipo de enlaces que existan entre sus étomos y de sila energia absorbida es suficiente para producir tales ransiciones. Por esto, una molé- cula tiene la capacidad de absorber radiscién electro- magnética a unas deterninadas longitudes de onda a aquellas que tienen la energia igual a la necesaria ppara pasar del estado fundamental al excitado, Las radiaciones de mayor energia UV-VIS son ca- paces de producir transiciones electrénicas entre tomas, Las IR de menor energia solo son capaces de producir transiciones de vibracién o rotacién en las moléculas, son muy especificas de enlace y se usan para el andlisis. cualitativo. Rvs uw ENERGIA = e SUDOOCOEe eee Fig. 1.12. Niveles de energia en IR, VIS y UV. ‘Transmitancia, absorbancia y espectro deabsorcién Para medir la absorcién de energia radiante que caracteriza a una molécula se ulizan dos térmi- nos: transmitancia y absorbancia El espectrofotémetro puede calcular la intensidad de luz absorbida midiendo el resultado de dividir la intensidad de luz transmitida (i) entre la inten- sidad de luz incidente (i). Este cociente recibe el nombre de transmitancia (7). T=4 Tepe 100 le le El valor de esta magnitud no tiene unidades, est camprendida entre 0 y 1 (0% y 100%) 0 (0.0%): no se transmite luz; por tanto, Ia ab- sorcién es total 1 (0 100%) se transmite toda la luz; por tanto, ino existe absorcisn.La transmitancia disminuye exponencialmente a medida que aumenta la concentraci6n o el ancho de cubeta. Convirtiendo la transmitancia en absor bancia se consigue una relacién lineal y positiva. Tranertanc ts) Teanamiuna es) Tore Waco ea poses Tonner Fig. 1.13. Representacién vansmitancia-concentracién, aabsorbancia concentracion, La absorbancia es el logaritmo inverso 0 negative de la transmitancia 1 Aslog-> =4o9 7 Cuando la transmitancia se expresa mediante por centaje, los valores de la absorbancia se pueden calcular de la siguiente manera: (% A= (log {%2D) = -Iog %7= (log 100) = =2-log %T « Los espectrofotometros miden tisicarmente la | transmitancia y efectdan un calculo matemético © para obtener ios valores de absorbancla Cuando se estudian las absorbancias para un ran- go de longitudes de onda, se obstiene el espectro de absoreién, « Elespectro de absoreiéies el conjunto de ban- | das itransiciones electrénicas) que indican la can- “tidad de luz absorbida por una sustancia a diferentes valores de longitud de onda, yes dini- co a caracteristico de cada sustancia El espectro de absorcién se puede representar gré- ficamente—absorbancia frente a longitud de onda-, yse registran diferentes picos de mayor absorban- Cia a determinadas longitudes de onda. Estas transiciones pueden ser de tres tipos: electré- nica, vibracional 0 rotacional y en las moléculas curren los tres, dando lugar a espectros de absor- ci6n casi continues en comparacién con los espec- tros de absarcién atémicos. Nines de wera elacion ‘Nivel de energia bracorad — Niland energie rtaconal I] Terence Fig. 1.44. Transiclones electninicas y espectros UVMIS en maleeulas. Bs NAD* g 2 gs Sy NADH 0 240 Bo 3 360 Longitus deen (nm) Fig. 1.15. Espectro de absoreidn de la nieatinamida ade nina dinuclebtido oxidado NAD* y de su forma tedudda NADH. Estas propiedades también permiten explicar cémo vemos la luz visible. Dependiendo de la longitud de onda a que un material presente mayor absorbancia, lo veremos de una u atro color, La tabla siguiente muestra la relacién en- ‘re los colores absorbides y sus complementa- rios, los transmitidas (los que se observa) ina | Color absorbido | Color observado 380-420 | Violeta Amarillo-verde 420-440 | agulwioleta | Amarillo, 440-470 | Azul Anaranjado 470-500 | Verde-azul Roja 500-520 | Verde Porpura 520-550 | Amarillo-verde | Violeta 550-580 | Amarillo Azulvioleta 580-620 | Anaranjado | Azul 620-680 | Rojo Verde-azul 680-780 | Porpura Verde1.3.2. Laley de Lambert-Beer La mayorfa de las determinaciones del laboratorio. dlinico se obtienen midiendo la absorbancia de moléculas que se presentan en disoluciones a muy baja concentracién. Beer estudié el comportamiento de la luz al atrar vesar disoluciones coloreadas y baséndose en los experimentos de Lambert enuncié la ley de Lambert-Beer que permite calcular la concentrar cién de un analito midiendo su absorbancia « La ley de Lambert-Beer enuncia que la ab- «© sorbancia de un analito es directamente pra- “ porcional al coeficiente de absorcién de la molécula, a la distancia recorrida por el haz de luz en la disolucién y a la concentracién de di- cho analito. (om) ni Fate Detesoe abet Fig. 1.46. Representacién dela ley de Lambert-Beer Mateméticamente se expresa como’ Ase bec Siendo: A, la absorbancia (también llamada extincién o densidad dptica). No tiene unidades. ¢, el coeticiante de extincién molar a coeticiente de absorcién. Es constante para un compuesto. dado, siempre que se fijen condiciones de lon- gitud de onda, de pH, de temperatura, de sal- ventes, etc. Sus unidades son Iimal - em) &, Ia longitud recorrida por la luz en la cubeta que contiene la disolucién. Se ride en cm. ¢, la concentracién de la molécula absorbente en la disolucién. Se mide en moll. El coeficiente de extincion molar Hl coeficiente de extincion molar o coeficiente de absorcion depende de la composicidn qui mica de la rolécula, ya que segin el tipo y el ndmero de enlaces presentes, esta absorbers diferentes longitudes de ond. Se definen dos grupos de enlaces, que deter- minan el coeficiente que tendra la sustanci: Grupos croméforos. Son enlaces quimicos que absorben radiacién VIS-UV. Los principar les grupos croméforos contienen un doble enlace y son los radicales: = Etileno PE=C=) — — Azoico (N=N-) = Cattonilo (=C=0) — — Nitroso (-N=0) = Tiazblica (C25) = Nitro (-NO) = imino C=N-) —— ~ Quinona. La formacion de enlaces conjugados favorece la absorcion. Grupos auxocromos. Son enlaces quimicos ‘que no absorben luz pero que provocan un desplazamiento de la longitud de onda a la que absorbe un grupo croméforo coma: los radicales hidroxilo (-OH) y amnina (-NH;). Linealidad y desviaciones dela ley de Lambert-Beer Lalinealidad es el intervalo de concentraciones © entre las cuales existe una telacién lineal entre la © concentracién y la absorbancia (es decir, se cum ple la ley de Beer) La lectura de una absorbancia Tuere de los limites de linealidad proporciona concentraciones falsas; ante esta situacidn, hay que diuir la muestra para que su concentracién quede dentro de las limites de lineal- dad. Por tanto, es necesario controlar la concentra Giény cuando supera los 0,01 M, dilur la solucién, sonaciin iat - posts $ — 5 veoetn 3 2 Concentvacion Fig, 1.17. Representacién de la linealidad.Los espectrofotémetros trabajan con disolucio- nes que presentan una transmitancia entre el 80 y el 20%. En la siguiente tabla se represen- tan los valores de trensmitancia y absorbancia. %T | T | A=-ogr| A=2=log %T soo | 1,00 a 2-2 so | 080 | oos69 | 2~1,9030 75 | 07s | 01249 | 2-1,8750 so | oso | o3010 | 2~1,6989 25 | 0,25 | 06020 | 2~1,3979 20 | 020 | osce9 | 2-1,3010 72,5|0125| 0.9030 | 2~-1,0969 o | o Puesto que el coeficiente de extincién molar es constante para un compuesto dadas unas ca- racteristicas establecidas, la ley de Beer (en el intervalo de linealidad) permite: Conocienda el compuesta y por tanto, su co- eficiente de extincién molar, obtener la con- in de la ab- Conociendo la concentracion y midiendo la absorbancia, calcular el coeficiente de ext cién molar y, par tanto, idertfcar la sustanc Las desviaciones de la ley de Beer pueden causarlas iversos Factores, instrumentales 0 quimicos Desviaciones instrumentales Pueden deberse a Alteraciones en la luz incidente. Por ejemplo, que la radiacién incidente no sea monocrométi- ca; puesto que las moléculas tienen diferentes coeficientes de absorcién en funcién de la longi- tud de onda, al recibir varias longitudes a la vez, la relacién absarbancia/concentracién se altera Errores en la rendija de salida. Se produce cuando la anchura y la posicién de la rencija de salida de la luz cambian la longitud de onda que llega a la cubeta La cubeta.£! material de fabricacién yu grosor, estado de mantenimiente (si ests impia, si tiene rayaduras 0 golpes, etc), construccién (si sus pa- redes son perfectamente paralelas 0 tienen algu- na indlinacién), etc. pueden producir errores. El detector. Se producen cuando al detector llega luz procedente de otros lugares distintos a la fuente de luz Desviaciones quimicas Es necesario controlar el pH de la solucién, ya que a diferentes pH se absorben diferentes longitudes de onda, Otros factores que se deben tener en cuenta son: la absorbancia del solvente es significativa ‘comparada con la del soluto Si hay interferentes, es decir, si en Ia solucin hay otros compuestos qué absorben a la longi- jud de onda que se aplica Si existe Fenémeno de fluorescencia Si se pueden praducir reacciones quimicas entre compuestos que den lugar a otros cramégenas Para evitar medir moléculas distintas ala deseads, los espectrofatémetros clinicos miden al menos dos longitudes de onda pars la misma molécula, una con alta y otra con baja absorcién. 1.3.3. Instrumentaci6n: espectrofotémetro UV-VIS La instrumentacin utiizada en espectrometria de absorcién molecular es el espectrofotmetro UV- VIS. Las caracteristicas técnicas de un espectrofo- t6metro sencillo podrian ser: dos Iémparas, una para UV y otra para VIS para un rango de 200- 1.000 nm, ancho de banda espectral 4 nm, haz simple, red de difaccién de 1.200 lineasimm, de- tector de fotodiodas y con posibilidad de 4 cubetas de 10 ren Manejo del espectrofoté metro UV-VIS continuacién se describe un procedimiento ge~ neral para el manejo de un espectrofot6metro UV- VIS de sobremesa. Este procedimiento puede variar ligeramente entre casas comerciales y el fabricante debe adjuntar las instrucciones precisas de cada instrumento. 1. Puesta en marcha: se enciende el aparato yse esperan unos 20 minutos de calentamiento. 2. Seleccién de la longitud de onda. 3. Seleccién del made de medida: absorbancia o ‘wansmitancia.4, Selecci6n de la lampara: deuterio (UV) 0 tungs- teno (VIS) 5. Ajuste del 0% de transmitancia, las llamadas corrientes oscuras, 6. Seleccidn de la curva de calibracién adecuada ala muestra que se va a medir: en esta curva se incluye el blanco de reactives, 100% de ‘ransmitancia 7. Medicisn de la muestra problema 1.5.4. Curvas de calibrado Las desviacones dea ley de Beer impiden en la préc- ‘ica su aplicacién directa, es decir, averiguar la pre- sencia y [a concentracién de una molécula en una muestra al medir directameente su absorbancia En las muestras bioldgicas se encuentran muchas moléculas en disoluci6n ademés de la que nos in- ‘teresa medit, las cuales pueden actuar como inter Jerentes puesto que absorben en la misma longitud de onda, Ademés, se debe tener en cuenta la ab- sorbancia del disolvente, — Compuesto — scheme — terete Amabanca Tonghud deanda Fig, 1.18. Para i, la absorbaneia del analto interfere eon ‘otras sustancias, no asi con’, Por eso, antes de realizar una medicidn espectro- fotométrica se deben hacer madicianes de la ab- sorbancia que no es debida a la sustancia que ‘queremos estudiar. Estas son’ La absorbancia debida a las corrientes ascuras 0 radiaciones, que no procede de la fuente de luz y corresponde a 04% de T. La absorbancia debida a la compasicién de la cubeta, los disolventes y otros reactivos usados y-corresponde al 100% de la trasmitancia La determinacién de estas absorbancias se conace con el nombre de blaneas, y se eorresponde con un blanco de cubeta y un blanco de reactivos. Estos blancas establecen una linea basal de absor- bancias sobre la que aplicar la ley de Lambert-Beer y desde la medicién espectrofotométrica de la muestra obtener la concentracién de la molécula problema al extrapolar este valor sobre una recta de calibracién La ley de Lambert-Beer real quedaria: Azeb-com Siendo n la absorbancia de los blancos. Por tanto, para establecer la relacidn entre la ab- sorbancia de la muestra y la concentracién del ana- lito se requiere aplicar antes un procedimiento de calibracio de la técnica de medida que permita ob- tener una relacién matemdtica entre arnbas. angen! Concantracién Fig. 1.19. Absorbandias de las blancos. Procedimientos de calibracién El procedimiento de calibrado se puede realizar mediante dos métodos: Mediante un factor de ealibracién, ‘Construyendo una curva de calibracién Mediante un factor de calibracién Cuando para una determinada molécula (con coeficiente de extincién molar ¢) se dispane de una disolucién patran (de concentracién conacida, cy), se puede calcular la concentracidn de otra disolucion de la misma sustancia usando un factorPuesto que by e tienen el risme valor en ambos fe. An G Gn G in = Ag “ Ar Lainformacién dela disolucion patron fc,y A,) es co- nocida, y el cociente de la concentracién y la absar bancia se conoce como factor de calibracién (k).. n= K- Ay Para obtener la conicentracién problema debemos tener an cuenta, como hemos explicado, el valor de la absorbancia que se debe restar, porlo tanto de lg expresién anterior se obtiene: G KA,“ A, Siendo Cq, fa concentracién de la muestra. K =cyJA,, el Factor de callbracién (¢,, la concen- tracién del patron y A,, la absorbancia del patrén) Am, la absorbancia de la muestra ‘Ay, la absorbancia del blanco. La representacion grafiea del valor de las concer traciones en abscisas y de las absorbancias en or denadas permite obtener una recta cuya pendiente es justamente el factor de calibracién y la ordenada en el ofigen, la absorbancia del blanco de reactivos, Una vez obtenida, se extrapola en Ia recta el valor de la concentracién de la muestra a partir de la ab- sorbancia medida con el espectrofotémetro. Construyendo una curva de calibracién (recta a varios puntos) Lacurva de calibracién es la representacién gréfica de la absorbancia (ordenadas) frente a la concen- tracién (abscisas). Elprocedimiento de construccién es similar a la recta de dos puntos pero en este caso el patrén inicial se diuye sucesivariente y se determinan los valores de absorbancia comespondientes, Se abtienen asi varios puntos 0 coordenadas (se emplean un minimo de 3) que permitiran trazarla curva de calibracion. Lacuna de calibracién es la recta que se aproxima lo més poste alas coordenadas abtenidas y que se ob- tiene por métodos matemiéticos de regresin lineal. Una vez ensayadas las soludiones problema, su concentracién se averigua por interpolacién de las absorbaricias de las soluciones problema en la rec- ta de calibracién * » sandr 3 Absorbanca Cconcentracin ddescanacida L- Concentracién Fig. 1.20. Curva de calibracion, i conocemos el coeficiente de extincion molar (@) de fa sustancia problema y medimos su ab sorbancia, podremos conoter su concentracion en la muestra (Cy). aplicanda la expresion mate- matica de la ley de Beer: Ag = fp D-Cp Ao n= Te, B) Pero este coeficiente depende de las caracteris- ticas del instrument utlizado y por esto se usan calibraciones para obtener la concentracion 1.3.5. Mediciones a punto final, cinéticas y enzimaticas La espectrofotometifa de absorcién molecular en UVMIS también es aplicable a moléculas poco ab- sorbenies 0 no absorbentes a las longitudes de onda UVIS utilizando métodos indirectos. Estos métodos consisten en hacer reaccionar las molé- culas con otros compuestos para formar derivados absorbentes. La mayoria de las magnitudes bioquimicas, anali- tos, no absorben luz y es necesario usar reactivos comerciales que en presencia del analito desenca- denan una serie de reactiones que dan lugar auna sustancia mensurable por el equipo instrumental A+B+C ————» D+ESiendo: A, el analito B y C, reactivos comerciales. D ylo E, sustancias mensurables. Cuando las reacciones analiticas se disefian para transfarmar el anelito en una sustancia que absor- ba dentro de la regidn visible del espectro elactra- magnético (la disolucién adquiere color} se habla de métodos colorimétricos. En cierlas reacciones la sustancia mensurable es- pectrofotométricamente se consigue con la inter- vencién de enzimas. La enzima realiza su funcién ante la presencia de un sustrato adecuado. El sustrato se une al sitio activa de la enzima, y se for ma un complejo enzima-sustrato. El sustrato por ac- Gin de la enzima es transformado en producto y es liberado del sitio activo, quedando libre para recibir otro sustrato. La ecuacién general es la siguient E+SSESSEPSELP Los métodos analiticos que utilizan enzimas entre sus reactives se cenocen come métodos enziméticos. Teniendo en cuenta este tipo de reacciones, el cA culo de las magnitudes bioquimicas se divide en tres grandes grupos: El célculo de la concentracién en técnicas de punto final El cdleulo de la concentracién en téenicas cingticas, El calculo de la actividad enzimatica. CAlculo dela concentraci6n a punto final A punto final significa que la reaccién entre la muestra y Ios reactivos se ha producido completa- mente, es decit, que en la reaccién AeB4C ——__sD+E sa habré agotado A, B ylo C yse habré formado D yo E. En bicquimica, un sustrato es uns molécula sobre la que acta una enzima. Las enzimas catalizan reacciones quimicas en las que el sus- ‘rato 0 los sustratos toman parte Asi, en las deterrninaciones con reactivas comer- ciales suele haber excesa de reactivos para asegu- rar que el analita reacciona en su totalidad en las condiciones de temperatura, pH y tiempo indica- das en los protocalos de trabajo. En esta situacién, la concentracién del analito es directamente proporcional a la concentracién de algune de los productos formados en la reaccién. En las condiciones establecidas por el protocolo de la casa comercial, se cumple la ley de Lambert-Beer yy se emplea un factor de calibracién para el céleulo de la concentracién 0 se aplican factores de conversién: Acsstiens pana preter pet Medicién a punto final en reacciones colorimétricas La técnica colorimétrica consiste en la determina- cién por colorimetria de la cancentracién de una susiancia o bien del producto de su reaccién con un reactivo espectiico. La absorbancia de! producto obtenido es pro- porcional a la concentracién del analito en la muestra. Analito + reactive ———» Producto coloreado Un ejemplo de este tipo de técnica es la medida del calcio por el método de Ia artocresoiftaleina complexona: en un medio alealina, el calcio forma un complejo violeta al afiadirse ortacresolftaleina complexona a la muestra. Medicién a punto final en reacciones ‘onzimaticas De I misma manera, en los métodos enzimati- os, la concentracién del sustrato padré deter- minarse a punto final. El métada consiste en acoplar una reaccién enzimatica, de forma que la sustaneia problema es sustrato de una enzima es- pecifica. Esta enzima transforma la sustancia problema en un producto coloreade que absorbe en el UV-visible, de forma que pueda leerse en el espectrofotémetro. La concentracién del producto coloreado obtenido es proportional a la concentracién de la sustancia problema. Analito + enzitna ———> producto eoloreadeUn ejerplo de este tipo de medicién lo encantra- mos en el métado de la hexoquinasa. Se trata de un método enzimstico para medir la concentracion de glucosa a punto final hexoquinass Glucosa + ATP ————— Glucasa-6-fosfato Gucosa-€-ostato- sdechidrogenasa Glucasa-6-losfata ——> gluconate--fosfato + NADPY + NADPH + H* La cantidad de NADPH (coloreado) formado es pro porcional a la cantidad de glucosa. Esta segunda reaccién es la llamada reaccién auailar. Observa quella tinica diferencia respecto a una téc- nica calorimétrica es que en lugar de establecerse una reaccién quimica con la sustancia problema, se establece una reacci6n enzimatica. CAlculo dela concentracién en técnicas cinéticas En las determinaciones cinéticas se mide la velaci- dad de la reaecién antes de que esta concluya. Es muy importante mantener las condiciones de la reaccién descritas en los protacolos comerciales sobre temperatura, tiempo de medida, etc. para gerantizar la fiabilidad de los resultados. En las determinaciones cinéticas, la variacién de la absorbancia por unidad de tiempo es proportional a la concentracién y/o actividad del analito, Esto se debe a que la presencia del analito en la muestra va a dar lugar a la aparicién o desapari- ci6n de sustancias capaces de absorber la radiacion ala longitud de onda de medida La ley de Lambert-Beer que se aplica en estos ca- sos queda modificada 0 adaptada como: AAse-bec Siendo QA, la variacién dela absorbancia. Generalmente se toma el minuto como unidad de tiempo de medida de la variacién de la absorban- cia por lo que se expresa: AAI Alser ey b, dos valores constantes, se expresa su producto come un factor numérico, F, que a me- nudo proporcionan las casas comerciales, de tal manera que la concentracién del parametro viene expresada coma: DA, min La reactién que da lugar a una variacién de la ab- sorbancia se desencadena al afiadir los otros reac- tivas a la muestra bioldgica y con las condiciones de reaccién controladas. A mayor concentracién del parémetra biolégico, rnayar serd la variacign de absorbancia en la uni- dad de tiempo. Cuando se dispone de una disolucién con concen- tracién conocida se puede calcular la concentra- ci6n desconocida a partir de las variaciones de absorbancia usando factores de conversién DA rts wetrin ” BAprtn Ertiema Mediciones cinéticas en reacciones enzimaticas En el método enzimatica, la enzima afiadida como parte de los reactivos al unirse al pardmetro de- sencadena una reaccién que en este caso permite su determinacién por variacién de la absorbancia por unidad de tiempo. Un ejemplo de este tipo de medicién esl método dela glucosa oxidasa. Para la determinacién de la glucosa es muy conacida la técnica de Trinder, la enzima que acivia sobre la glucosa es la glucosa oxidasa (GOD), transformandola en agua oxigena- day dcido glucénico: Goo Glucosa+0,+H,0—s 1,0, + dcido glucénico ocsloreads) ——(Noaloreads) (Wa coloreado) El agua oxigenada formada se hace reaccionar con fenol y 4-aminofenazona (4-AF) para formar un, complejo que en presencia de una segunda enzi- rma, la peroxidasa (POD), transforma este complejo en quinona, un producto rojo que ahora sf puede ser leido al espectrofatémetto, Pop 2H,0, + Fenol + 4-AF —s Quinona + 4H,0 (No eolerends) (Roe) Es una tecnica cinética y el incremento de absor- bancia es directamente proporcional a la cantidad de glucosa en la muestraCAlculo de la actividad enzimatica La concentracién de enzimas en suero es muy baja, sin embargo, dada su elevada capacidad cataltica, es posible determinar su actividad y presuponer que dicha capacidad es proporcional a su concentracién. El cdlculo de la actividad enzimatica se realiza midien- do la velocidad de reaccidn, es deci, ridiendo la can- fidad de sustrato que desaparece o la cantidad de producto que se forma en un intervalo de tiempo. Las reacciones enziméticas son muy sensibles a las condiciones de reaccidn, por lo que se debe con- trolar muy bien la temperatura, asi como el pH y las concentraciones de reactivos. Lamedicién dela absorbancia puede ser aun tiem- po fijo o una medicién continua, De la misma ma- nera queen el célculo de concentracién de sustratos, se pueden necesitar reacciones aurlianes Métodos a punto final Se ponen en contacto reactivo y muestra (enzima} y se determina la absorbancia a la longitud de onda indicada. Tras un tiempo establecido, se de- fiene la reaccidn (desnaturalizacién de la enzima) y se mide la absorbancia final El método a punto final puede ser: 4 un punto: cuando la enzima no tiene perio~ do de incubacién. A dos puntos: cuando existe un periode de in- cubacién. Se realizan dos medidas: una tras el periodo de incubacién y otra al final de la reacci6n. Métodos cinéticos Estos meétodos son mejores porque si se detectan deswios de la linealidad se puede despreciar alguna de las medidas y porque permiten asegurar que la condicién de velocidad constante se mantiene du- rante todo el tiempo del ensayo. Estosuele ocurrir con grandes concentraciones de enzima, que ago- tan enseguida el sustrato, con lo que se produce una bajada en la velocidad de reaccién_ Se ponen en contacto los reactivos y la mues- tra (enzima}. Se determina la absorbancia a la longitud de onda indicada Se realizan lecturas cada minuto durante 3- 5 minutos para estar seguros de que se estd tra- bajando en la fase lineal de la curva La actividad enzimatica se expresa en unidades de actividad enzimatica (U) que es la cantidad de en- zima que cataliza la transformacién de un micro- mol de sustrato por minuto. La coneentracién satalitica se expresa como U/l En el Sisterna Internacional de Unidades {SI} se uti liza el katal. Un katal es la unidad de medida de la actividad catalitica de una enzima que especifica la cantidad de moles de enzima que son necesarios para transforrnar un mol de sustrato en un segundo. Un katal equivale a 60 -10% Ul Como se trata de tuna unidad muy grande se utilizan los submultiplos micro y nano ketal. 1.3.6. Espectrometria de absorcién molecular enelinfrarrojo Esta técnica se usa para averiguar la composiciéin quimica de los célculos urinarios. $e canstruye una coréfica que representa el porcentaje de transmi- ‘ancia frente a la longitud de onda (expresada en fr"), Dependiendo de la compasicién del eélculo urinario se obtendrd un tipo de grética que se com- para con los gréticos patranes. ®

| Analzador (Fuente de ones) I Inroducaén \de la muestra pecra Fig. 2.1. Componentes basis del espectidmetro de masas Laespectrometria de masas no sa puede consicle- raruna técnica espectrafotométrica puesto que no utiliza ningun tipe de radicion electromagneética,Sistema de vaporizacién y ionizacién El sistema de vaporizacién y ionizacién es el com- ponente que permite volatilizar y ionizar la mues- tra, Para ello se utilizan principalmente dos tipos de técnicas La lonizacién por pulverizacién eléctrica (ESI, del inglés Electrospray ionization}. Se emplea pare disoluciones y se obtienen bastantes molé- ulas ionizadlas, por lo que el espectra de masas que se obtiene de esa sustancia presenta muchos picos, correspondientes a cada ion. E1ESI se aco- pla a métodos cromatogréficos en media liquida ue seleccianan la muestra que se va a ionizar. La desorcién por ldser asistida por mati (MALDI, del inglés Matriz Assisted taser Desorptiorvionization). La muestra se solidifica y¥se excita con un léser que provoca la ionizacién yvolatiizacién de la muestra. Con esta técnica se puede identificar cualquier microorganism. Otros sistemas de ionizacién que también se utili- zan son la desorcidn léser, la ianizacién por laser inducida en superficie 0 el bornbardea con atomnos acelerados, Analizador de masa El analizador de masa es el dispositive que separa la mezcla de iones, que se ha abtenido tras la io- nizacién, en funciéin de su relacién masa/carga Para realizar esta separacién hay varies procedi- rmientos posibles, pero tienen en comin que sepa- ran las moléculas mediante campos eléctricas y magnéticos en cémaras de vacio para facilitar la movilidad, y dirigirlas hacia un detector. Existen diferentes tipos de analizadores de masas que son capaces de seleccionar y detectar todos 0 tuna parte de las innes formadas: Analizadores de sector magnético. En estos analizadores se utiliza un sistema de aceleracién de los iones y un imén que hard que el haz de iones se desplace con una trayectoria circular. Espectrometro de masa cuadripolar (Q). Se com pone de 4 barras alargadas en formacidn cua drada, conectadas eléctricamente entre si en pares opuestas. A dichas pares (polos) se les aplica una tension de radiofrecuencia variable que sintoniza con un determinade ion. Cuando existe sintonia entre el ion que estd pasando por ellas y a frecuencia aplicada, dicho ion continia su camina y todos los dems no sintanizados se desvian fuera del cuadripolo; de esta manera no impactan en el detector. Analizadores de masas de tiempo de vuelo TOF), Son capaces de separar los ianes segin el tiempo que tardan en llegar al detector Otros, como los analizadores de trampa de ones (7), la resonans ica ciclotronica con transformada de Fourier (FFICR) 0 los analizadores orbitrap. Los espectrémetros de masa se construyen combi nando los diferentes sistemas de ionizacién y de andlisis, ya su vez, se combinan con diferentes sis- ‘temas cromatograficos (de alta presién, de gases, lc) para obtener muestras ya separadas y facilitar Ia identificacién y cuamtificacion, Fig. 2.2. Representacién delsisiema de ioniza- Fig. 2.2. Analzadores de mass (1) De sector magnético. 2} Cuadrupolar eign MALDI, 2) De tlempo develo,Asi, algunos ejemplos de espectrémetros de masa son: MALDI-TOF: Matniz Assisted Laser Desorption! lonization-Time of Flight. ESI-Q: ElectroSpray lonization-Quadrupale. ESLT: ElectraSpray onization-lon Trap. Detector y registrader Losiones procedentes del sisteria acelerador llegan aldetector (fotomultiplicador, copa de Faraday}, que generalmente est constituido por un catodo emi- Sor que al recibir el impacto producido por las par- ticulas cargadas emite electrones. De la misma manera que en los espectrofotémetros, esta sefial es amplificada, registrada y digitalizada. Elespectro resultante es un grafico que representa la abundaneia relativa de los ones producidos (96 de abundancia relativa de los iones praducidos) respecto de su relacién masa/carga (m/z). La seftal correspondiente a un ion aparece en forma de va- rigs picos que corresponden a la distribucién esta- distica de los distintos isétopos delion. Se obtienen tes tipos de picos: Pico molecular a ion molecular. Es la serial pro- ducids por el ion obtenido al perder un electrén. Pico base. Es {a seftal mds intensa del espectro'y por convenio se le asigna el 100% de intensidad. Picos de fragmentacién. Se corresponden ase- fiales de fragrentos obtenidos por descompost cién del ion molecular. Espectrometria de masas del CO, Puesto que una molécula de diéxido de cartsono. CO, se compone de solo tres atamas, su espectro de masas es muy simple. Elion molecular es tam- bign el pico de base, y los fragmentos de iones solo son CO (en/z = 28) yO (miz = 16). sis de cate bo |» #50: +a: mitts ves Intensidad relative 2 2.1.2. Aplicaciones dela espectrometria de masas La espectrometria de masas es una técnica de amplia utilizacién en la determinacién de com- puestos orgénicos. Algunas de sus aplicaciones son En las técnicas de screening neonatal parala de- tecciGn de enfermedades rmetabdlicas heredita- rias, Se suelen utilizar la cromatografia de gases acoplads a espectrometria de masas (CGEM) 0 el espectrémetro de masas en tndem con aco- plamiento a cromatograffa Ifquida (CLEM/EM) En toxicologia es el método de referencia para la deteccién de cocaina, marihuana, ete En la monitorizacin de farmaces. En proteGmica. EI proyecto proteoma humana 2 partir del proyecto genoma humano persigue descifrar el funcionamiento de cada proteina que viene determinada en cada uno de los ge- nes, Las modificaciones postraduccionales de las proteinas, tales como glicosilacién o fosforila- ién, y muchas otras, dan lugar a muchos més productos génicos que genes (més proteinas que ARN mensajeros), de esta manera un geno- ma genera diferentes proteomas. Las técnicas que se aplican para caracterizar péptidos y proteinas se basan en la tecnologia de espectrometria de masas en tandem, siendo el MALDI-TOF-MS el instrumento mas utilizado en protedmica Espectroscopia de masas del propane C,H, Tiene $ iones moleculares, m/z de 15, 28, 29, 43 'y 44, el pico base esta en 29. Ademas se obtie- rien picos de fragmentos en cada ion molecular 14; 26 y 27; 39,41 y 422.2. Técnicas cromatograficas La cromatografia agrupa un conjunto de métodos fisicos que permiten separar los diferentes compo- nentes que se encuentran estrechamente relacio- nados en una muestra compleja. « El funcionamienta de la eramatografia se basa | en el diferente comportarniento de los compo- “nentes dela muestra al ser desplazados o rete- nidos por la accién conjunta y contrapuesta de una fase mévil que se hace pasar a través de una Fase estacionaria La fase mévil puede ser un gas 0 un liquida que ejerceré el efecto del desplazamiento de los componentes de la muestra. También recibe el nombre de eluyente La fase estacionaria esta incluids en un soporte que puede ser una colurmna o una superficie s6- lida y retendrd los componentes de la muestra Para conseguir la adecuada separacién de los com- ponentes de la muestra, estos deberan distribuirse de forma distinta entre amas tases: Los componentes que se unan fuertemente a la fase estacionaria se moverén lentamente con el flujo de la fase mévil Los que se unan débilmente a la fase estaciona- ria se moverén rSpidamente al ser arrastrados por la fase mévil De esta manera, la diferente movilidad de los cam- ponentes de la muestra hace posible su separacién. Elregistro de esta separacién o cromatograma per- mite realizat un estudio tanto cualitativo coma cuantitativo. 2.2.1. Tipos de cromatografias Las cromatografias se pueden clasificar atendienda a diversos criterios camo pueden ser el estado de agregacién de la fase mavil,el tipo de soporte de la fase estacionaria o el tipo de interaccién que se produce entre los cornponentes de la mezcla y las fases. Seguin la fase mévil Cromatografia gaseosa. La fase mévil es un gas. Cromatografia Ic ida. La fase mévil es liquida. Segtin el soporte de la fase estacionaria Cromatografia plana. El soporie dela fase es- tacionaria es plano y puede ser un papel o un gel sabre el que se desplaza la fase movil por capilaridad o gravedad. Los cromatagramas planos consisten en bandas separadas que se revelan pulverizando la capa con fluoreseeina ¢ iluminando con luz UV re- diante una sustancia quimica comola ninhidrina que reacciana con los aminodcidos de las pro- teinas y produce manchas coloreadas. Una vez identificadas, las bandas se recortan y se cuan- tifican fotométricarnente. Cromatografia en columna. La columna es un tubo relleno de fase estacionaria (liquida © sélida) sabre la que se inyecta una fase mévil (gas 0 Iiquido} de forma continua, de tal forma que al final de la colurina se reco- gen volimenes de los eluyentes a diferentes tiempos. Ted peplosbcanetns Eannatagecpn de secaren @ —encrare Faso Fig. 2.4, Representacién dela cromatogralla plana (1) y de la cromatogratia de column (2).Tras la cromatagtafia en columna se abtiene un Cromatograma que cansiste en una serie de pi cos que aparecen en funcién del tiempo y que se cotresponden especificamente con la presen- cia de una malécula y su concentracién en la muestra. (Doc 2.1) Estos picos pueden ser detectados por espectrofo- tometria a medida que van saliendo por la columnas Los picos de la gréfica identifican las sustan- ‘as analizadas por comparacion con los tiem- pos de retencién. El drea de los picos permite calcular la concen- tracién de la sustancia Cuanto mas estrechos y separades estén los picos, mejor sera la separacién de las sustancias. Partes del cromatograma (cromatografia de eolumna) Enel cromatograma que se obtiene en una cro- matagrafia de columna se pueden identificar diferentes part Tiempo muerto (t,). Tiempo que tarda en salir Ia fase movil desde que se inyecta la muestra. Tiempo de retencién (j,). Tiempo que tarda en saliruna determinada molécula. Lo deter- rina el punto maximo dal pico del grafico Proparciona por tanto la identificacién de un compuesto al ser comparado con un patron de composicion conocida. Tiempo de retencidn corregido (¢,). Tiempo real que la fase estacionaria ha retrasado el Linea base. Sofal producida cuando solo pasa la fase movil Altura y érea de pico. informa sobre la con- centracién de la sustancia. Es necesaria una calibracién previa 4—th ||» —¥ ‘SERALDETECTOR compuesto TEMPO re retenio ino por FE Seguin el tipo deinteraccién que permite laseparacion ‘Cromatogratia de adsorcién. La fase estacio- traria es sélida y la fase mévil puede ser un liqui- do 6 un gas. La separacién depende de la polaridad de las moléculas de la muestra y se suelen hacer en columna, Las muastias se colo- can disueltas en la parte superior de la columna yyse pasan mezclas de disolventes polaresy apo- iares que van separando los componentes por su diferente solubilidad en el liquide disolvente. ‘Cada componente eluye en un tiempo determi- nado. Este tipo de cromatogratia no es habitual en el laboratorio dinies. Cromatografia de reparto (o de particién). Separa las sustancias segin su distribucién en ‘dos tases lfquidas inmiscibles. Cada sustancia migra una distancia segdn su solubilidad y se define para cada sustancia un valor, elf, que se ‘obtiene al dvidr a distancia recorrida porla sus- tancia entre la distancia recorrida por el frente de avance de la fase mévil Puede hacerse en colurina, en papel een capa Jina y se definen dos tipos: Cromatografia en fase normal. La fase mé- viles apolary la estacionaria polar (retiene los componentes polares). Cromatografia en fase reversa. La fase mé- vil es polar Ia estacionaria apolar (retiene los componentes apolares). ‘Cromatografia de intercambio iénico. Las sustanclas se separan segiin su carga. Se basa en la interaccidn iénics del soluto con la fase estacionaria que tiene grupos funcionales cargados. La fase mévil es un liquido, la fase estacionaria un sélido, y se lleva a cabo en. columna El soporte (fase estacionaria) es una resina car gada con grupos funcionales fijos a los que se unen los llarnados cantraiones, que pueden intercambiarse de manera reversible con otros iones de la misma carga: Resina con eargas fjas negativas y contraiones positivos, intercambiador catiénico: retinen las moléculas eargadas positivamente. Resina con cargas fijas pasitivas y contraiones negatives, intercambiador anidnico: retiene las moléculas cargadas negativamente. Para llevar @ cabo esta cromatogratia, primera se introduce la muestra en lacolumna y los com- ponentes de la muestra quedan més 0 menos