DIAGNOSIS DHF Pada infeksi awal, isolasi dan identifikasi virus dengue merupakan satu satunya cara untuk

mendiagnosis infeksi dengue. Serum penderita dimasukkan ke tubuh nyamuk. Setelah terjadi amplifikasi virus dalam sel yang terinfeksi, serotipe tersebut kemudian diidentifikasi dengan menggunakan antibodi monoklonal spesifik pada setiap serotipe. Cara ini hanya sensitif bila terdapat hubungan yang kuat antara partikel infeksius dalam serum. Viremia dengue

berlangsung singkat, biasanya dimulai 2 atau 3 hari sebelum onset demam dan berakhir pada hari 4 atau 5 dari penyakit. Serum merupakan sampel yang rutin digunakan pada deteksi virus, selain itu virus juga dapat ditemukan pada plasma, leukosit tanpa antibodi, cairan serebrospinal, dan pada beberapa jaringan organ seperti hati, paru, lien, nodus limfatikus dan tymus.

Gambar . Rentang waktu dalam mengidentifikasi Ig M, Ig G isolasi virus

Uji laboratorium merupakan uji yang sangat penting dalam memberikan konfirmasi diagnosis klinis dari infeksi virus dengue. Uji laboratorium tersebut meliputi kultur virus dan serologi : 1. Isolasi virus dengue Isolasi virus merupakan cara yang paling baik dalam arti sangat menentukan, tetapi diperlukan peralatan dan teknik yang canggih, sehingga tidak dipakai secara rutin. Keberhasilan isolasi virus ini sangat tergantung dari kualitas specimen yang dipakai yaitu:

Spesimen darah/serum: plasma dari fase akut jaringan otopsi terutama dari hati, limpa, timus dan nyamuk yang dikumpulkan di alam disimpan dalam suhu -70C

Spesimen kemudian ditanam dalam biakan jaringan nyamuk atau biakan jaringan mamalia. Akan terjadi pertumbuhan virus yang terlihat dengan adanya antigen yang ditunjukkan dengan immunoflouresen atau adanya CPE (cytopathic effect) pada biakan jaringan mamalia

Inokulasi/penyuntikan pada nyamuk, adanya pertumbuhan virus ditunjukkan dengan adanya antigen dengue pada kepala nyamuk yang dilihat dengan uji immunofluoresen. Pada identifikasi serotipe virus dengue yang telah diisolasi dilakukan dengan uji

immunofluoresen dengan menggunakan antibodi monoklonal spesifik. Cara untuk isolasi virus yang dipilih di laboratorium sangat tergantung pada fasilitas laboratorium dan keahlian petugas yang ada.

2.

Kenaikan titer antibodi antara serum akut dengan serum konvalesen Pemeriksaan serologi yang dianggap sebagai dasar dan hal terpenting yang patut

diketahui adalah terjadinya kenaikan titer antibodi akut ke antibodi konvalesen sebesar 4 kali atau lebih. Pemeriksaan serologis tersebut yaitu: a. Uji HI (Hemagglutination Inhibition Test) Uji ini merupakan uji serologi yang paling banyak dipakai secara rutin. Selain sederhana, mudah dan murah juga sensitif dan hasilnya sangat dapat dipercaya apabila dilakukan sesuai prosedur yang ada. Perlu diketahui bahwa antibodi HI akan berada di dalam darah dalam jangka waktu yang sangat lama (>50 tahun) begitu seseorang mendapatkan infeksi dengan virus dengue. Keadaan ini memungkinkan uji HI dipakai sebagai studi epidemiologi

Tabel . Interpretasi hasil uji HI

Antibodi HI biasanya timbul pada kadar yang dapat terdeteksi yaitu 10 pada hari ke 5 atau 6 dari perjalanan penyakit, sedangkan antibodi konvalesen biasanya akan mencapai titer 640 atau dibawahnya pada infeksi primer. Pada infeksi sekunder atau tersier akan terjadi reaksi anamnestik yang cepat dan titer antibodi konvalesen akan naik tinggi pada hari-hari pertama dari jalannya penyakit mencapai 5120 sampai 10240 atau bahkan lebih. Adanya titer yang tinggi, 1280 atau lebih pada spesimen akut, menunjukkan adanya dugaan infeksi baru (recent infection) dan diduga keras sebagai infeksi dengue baru. Titer HI yang tinggi biasanya akan berlangsung selama 2-3 bulan pada beberapa penderita dan mulai menurun pada hari 30-40.

b. Uji pengikatan komplemen (Complement Fixation Test) Uji ini tidak banyak dipakai untuk diagnosis serologi secara rutin. Selain rumit caranya juga memerlukan keahlian tersendiri. Antibodi pengikat komplemen (CF antibody)

biasanya timbul setelah antibodi HI muncul dan sifatnya lebih spesifik pada infeksi primer dan biasanya cepat menghilang dari darah dalam 2-3 tahun.

c. Uji Neutralisasi (Neutralization test) Uji ini merupakan ui serologi yang paling sensitif dan spesifik untuk infeksi dengue dibandingkan dengan uji serologi yang lain. Cara yang dianggap paling baik adalah apa yang disebut PRNT (Plague Reduction Neutralization Test) yaitu uji neutralisasi yang berdasarkan adanya reduksi plak yang terjadi sebagai akibat dari adanya proses neutralisasi virus oleh antibody di dalam serum penderita. Pada umumnya, antibodi netralisasi timbul bersamaan atau sedikit lebih lambat dari antibodi HI tetapi lebih cepat dari pada timbulnya antibodi pengikat komplemen. Antibodi netralisasi ini juga akan bertahan di dalam darah untuk waktu yang lama (> 50 tahun). Uji neutralisasi ini tidak dipakai secara rutin mengingat cara yang rumit, mahal dan memerlukan ketrampilan khusus.

d. Uji Mac Elisa (IgM capture enzyme-linked immunosorbent assay) Uji ini cukup sederhana dan tidak memerlukan alat canggih. Uji ini berdasarkan atas adanya antibody Ig M pada serum penderita yang ditangkap oleh goat anti human Ig M yang sebelumnya dilekatkan pada suatu permukaan yang kasar (plastik, piringan plastik). Jika antibodi dari penderita adalah antibodi anti dengue, maka mereka akan mengikat antigen dengue yang ditambahkan kemudian dan adanya ikatan tersebut dapat ditunjukkan dengan pemberian antibodi anti-dengue yang dilabel dengan enzim dan kemudian ditambahkan substrat sehingga akan menimbulkan warna.

Tabel . Interpretasi hasil Uji Mac Elisa Ig M antibody response Increase in molar fraction
Elevated, no change or decrease in molar fraction Elevated

S1-S2 interval 2-14 days 2-14 days Single specimen

Ig M to Ig G ratio High Low High Low High Low

Interpretation Acute flavivirus infection, primary Acute flavivirus infection, secondary Recent flavivirus infection, primary Recent flavivirus infection, secondary Recent flavivirus infection, primary Recent flavivirus infection, probably secondary

Antibodi anti-dengue Ig M akan tibul lebih dulu dari pada antibodi anti-dengue Ig G, dan biasanya sudah dapat terdeteksi pada hari ke-5. Timbulnya Ig M ini dapat bervariasi pada beberapa orang. Pada beberapa orang dapat timbul pada hari ke 2-4 dari jalannya penyakit tetapi dapat pula baru timbul pada hari ke 7-8. Pada infeksi primer, titer Ig M dapat juga lebih tinggi dibandingkan pada infeksi sekunder. Pada beberapa infeksi primer IgM dapat bertahan di dalam darah sampai 90 hari setelah infeksi, tetapi pada kebanyakan penderita Ig M sudah akan menurun dan hilang pada hari ke 60. Uji Mac elisa tidak selalu dapat menentukan secara pasti adanya infeksi dengue baru. Jika pengambilan spesimen akut terlalu dini ada kemungkinan Ig M belum timbul sehingga di dalam uji hasilnya akan negatif. Demikian juga sebaliknya Ig M positif, masih belum tentu terjadi infeksi karena ada kemungkinan infeksi terjadi 60-90 hari yang lalu. Karena itu diperlukan kehati-hatian dalam menginterpretasikan hasil tersebut. Untuk memberikan kepastian maka pemeriksaan ulangan terhadap spesimen konvalesen sangat diperlukan. Imunoglobulin Mac elisa kurang sensitifdibandingkan dengan uji HI. Dalam hal ini uji Mac elisa hanya menggunakan spesimen akut sedangkan uji HI

menggunakan spesimen akut dan konvalesen. Kelemahan uji HI memerlukan spesimen konvalesen, yang seperti yang diketahui bersama sulit mendapatkannya dan harus menunggu waktu yang lama maka Ig M elisa dengan menggunakan spesimen akut dengan waktu pengambilan yang tepat, merupakan keunggulan.

e. Uji IgG Elisa indirek Imunoglobulin G elisa secara indirek merupakan uji serologi yang sebanding dengan uji HI. Hanya uji ini sedikit lebih sensitif. Uji ini memerlukan dua spesimen yaitu akut dan konvalesen. Uji ini juga dapat membedakan antara infeksi primer dan sekunder. Uji

sederhana dan mudah dilakukan untuk memeriksa sampel dalam jumlah banyak. Sebagaimana uji HI, uji Ig G elisa juga tidak spesifik, banyak reaksi silang dengan serotipe dan flavivirus lain.

3. Pembuktian adanya antigen virus yang spesifik atau adanya RNA di dalam jaringan atau serum Dengan kemajuan teknologi, kini juga tersedia pemeriksaan baru untuk pemeriksaan yang tidak serumit isolasi virus yaitu dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). Teknik ini membutuhkan biaya mahal dan tidak tersedia di semua tempat pelayanan kesehatan. Reverse Transcription and PCR amplifikasi (RT-PCR) adalah teknik yang

digunakan untuk mendeteksi RNA virus DEN dengan menggunakan serotipe primer spesifik. Satu siklus untuk reaksi Reverse Transcriptase yaitu 60C selama 30 menit, kemudian diikuti dengan 2 menit untuk 94C. Sedangkan untuk PCR amplifikasinya ada 40 siklus, dimana tiap siklusnya terdiri dari 94C untuk 45 detik; 50C untuk 1 menit dan 60C untuk 1 menit,

sedangkan untuk fase elongation akhir yaitu 60C selama 7 menit. Bagaimanapun, banyak laboratorium yang tidak memiliki kemampuan untuk mengkultur virus ataupun mengisolasinya. Oleh karena itu, single-reaction ini dapat digunakan untuk diagnosis serotipe spesifik virus dengue yang berbeda pada pasien dengue dan merupakan alat untuk rapid indentifikasi dan isolasi virus dengue. 4. NS1 Assays Protein NS1 merupakan glikoprotein yang dihasilkan oleh flavivirus dan sangat berperan dalam morfogenesis dan replikasi virus. Protein NS1 memiliki berat molekul kirakira 48.000 dan disintesis pada retikulum endoplasmik kasar (Rough endoplasmic reticulum). Selama proses infeksi, NS1 dapat berada di dalam sel, di membran plasma maupun disekresikan keluar sel sehingga ia juga berperan dalam proses imunopatologi infeksi. Antigen NS1 terdapat baik pada infeksi primer maupun sekunder. Antigen NS1 dapat dideteksi dalam 9 hari pertama demam, yang terdapat baik pada serotipe DEN-1 (terbanyak), DEN-2, DEN-3 dan DEN-4. Sensitivitas antigen NS1 berkisar 63% - 93,4% dengan

spesifisitas 100% sama tingginya dengan spesifisitas gold standard kultur virus. Teknik pemeriksaan antigen NS1 dalam sampel serum saat ini sudah tersedia dalam bentuk KIT. Terdapat 2 macam kit pemeriksaan antigen NS1 di Indonesia, yaitu dari Panbio dan BioRad, keduanya memakai prinsip metode ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Saat ini juga sudah terdapat reagen NS1 dalam bentuk rapid test(ICT). Keuntungan dari pemeriksaan ini adalah, NS1 terdeteksi lebih awal dibandingkan antibodi lainnya dalam menegakkan kasus baru dan KLB. Untuk memastikan suatu infeksi virus, idealnya dilakukan isolasi terhadap virus itu. Isolasi virus merupakan cara terbaik untuk memastikan infeksi virus dengue. Namun untuk

melakukan isolasi virus ini diperlukan teknik dan peralatan laboratorium yang canggih. Guna menentukan seseorang terinfeksi virus, misalnya diagnosis flavivirus secara konvensional, dilakukan pemeriksaan serologi yaitu pemeriksaan terhadap ada/tidaknya antibodi terhadap virus dengue akibat infeksi virus tersebut pada masa lalu ataupun saat sekarang. Antibodi terhadap virus dengue akan terbentuk bila seseorang terinfeksi virus tersebut. Teknik yang ada saat ini dapat mendeteksi antibodi pada titer yang cukup yaitu pada hari ke-5 setelah terinfeksi. Pemeriksaan serologi jauh lebih sederhana dan murah dibandingkan dengan isolasi virus, namun punya beberapa kelemahan. Selain waktu yang dibutuhkan lebih lama serta fasilitas dan keamanan laboratorium yang tinggi, pemeriksaan ini dapat juga memberikan hasil positif palsu pada penderita yang mengalami infeksi virus yang satu kelompok dengan virus dengue (sensivitasnya rendah). Di samping itu, pemeriksaan ini juga tidak dapat menentukan jenis virus dengue yang mana (serotipe). Antigen NS1 dapat dideteksi pada awal demam hari pertama sampai hari ke delapan . Penggunaan IgM dan IgG anti dengue tetap diperlukan untuk membedakan infeksi dengue primer atau sekunder, namun hasil positif keduanya dapat dijumpai tidak hanya pada DBD tetapi juga pada demam dengue. Namun dalam penanganan penderita yang diduga menderita infeksi virus dengue dari gejala-gejala klinisnya, pemeriksaan serologi dapat digunakan sebagai pegangan diagnosis. Antigen NS1 dianjurkan diperiksa pada awal demam sampai hari ke delapan. Hasil negatif antigen NS1 tidak menyingkirkan adanya infeksi virus dengue, karena variasi hasil ini diduga berkaitan dengan serotipe virus dengue yang menginfeksi. Pemeriksaan antigen NS1 tetap disertai dengan pemeriksaan antibodi IgM dan IgG anti dengue sebagai penentu

infeksi primer ataupun sekunder, sekaligus untuk mengatasi kemungkinan hasil negatif palsu pada pemeriksaan antigen NS1.

Dengue NS 1 Dengan menggunakan pipet sekali pakai yang telah disediakan, teteskan 3 tetes serum, plasma, atau darah ke dalam tempat sample dan tunggu 20 menit. Jika pada colom bertanda C (Control) dan T (Test) keluar garis berwarna merah maka dapat dinyatakan positif demam berdarah (dalam masa akut). Jika hanya satu garis saja pada colom C (Control) saja maka pasien dapat dinyatakan negatif demam berdarah. Perlu diperhatikan, jika dalam colom C tidak keluar garis maka hasil tes dinyatakan invalid.

Dengue IgG/IgM

Dengan menggunakan pipet kapiler yang telah disediakan, masukkan 10 ml serum, plasma, atau darah ke dalam tempat sample. Berikan 4 tetes cairan pelarut ke dalam alat uji yang berbentuk lingkaran dan tunggu 20 menit.

Jika pada colom bertanda C dan G atau M keluar garis berwarna merah maka dapat dinyatakan bahwa antibodi IgM atau IgG telah terbentuk.

Jika hanya satu garis saja pada colom C (Control) saja, maka pasien dapat dinyatakan negatif demam berdarah.

Perlu diperhatikan, jika dalam colom C tidak keluar garis maka hasil tes dinyatakan invalid.