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    NEFROLOGIA. Vol. IX. Nim, 1. 1989 Biologia molecular, biogénesis y regulacién de la bomba de sodio P. Martin Vasallo * Department of Cell Biology. Yale Univesity Mediéal School El gran desarrollo que ha experimentado la biolo- ‘gfa molecular durante la citima década ha hecho po- sible el entendimiento de la expresién y regulacién ‘g6nicas y de la funcidn celular hasta un nivel mole- ular que previamente estaba vedado a nuestras posi- bilidades. Los dos tipos de tecnologfas mas importan- tes han sido los conocidos genéricamente como DNA recombinante y genética celular somatica; am- bos estén siendo aplicados extensivamente tanto en células procariéticas como eucariéticas, incluidas las humanas. Mediante procedimientos de DNA recom- binante se ha conseguido la clonacién de DNAS en- ‘cargados de codificar una determinada proteina. Me- diante técnicas de genética celular somatica, la pieza de genoma disecada ha sido transfectada a otras cé- lulas distintas, las cuales han sido sometidas a selec- cién darwiniana para en las supervivientes estudiar las funciones desconocidas y sus mecanismos de re- gulacién ‘Al estudiar un determinado gen o grupo de genes las preguntas que se han planteado han sido: a). ;qué gen contiene la informacién para el mensaje de esta proteina, cual es su estructura y cudl es la secuencia de la proteina que codifica?; b) ztiene isoformas?; ©) gen qué cromosoma esti localizado?; d). zqué teji- dos lo expresan y cudles lo tienen reprimido?; ©) scémo se lleva a cabo su traduccién y cudles son sus modificaciones postraduccionales?; {) ycémo se regula su expresién? Uno de los sistemas genéticos:cuyo estudio se ha visto beneficiado' por el uso de dichas tecnologias ha sido la (Na, K)-ATPasa, también conocida como bomba de sodio-potasio 0 bomba de sodio. En el presente trabajo se revisa la biogénesis y regulacién de dicho sistema de transporte, asi como sus homo- logias funcionales y estructurales con otros mecanis- ‘mos de transporte i6nico junto con los que pudo evo- lucionar de un antepasado molecular comin. = Profesor itular de Bioqufmica y Biologia Molecular de la Universidad de La Laguna. Islas Canarias. Correspondencia: Or. Pablo M. Vasallo, Department of Cell Biology. Yale University School of Medicine 33 Cedar Street, P.O, Box 3333 ‘New Haven, Conn, 06510. USA. Informacién general sobre la bomba de sodio La (Na, K)-ATPasa es una enzima que se encuentra en la membrana plasmatica de las células animales; iftercambia tres iones sodio intracelulares por dos io- nes potasio extracelulares a expensas de la energia obtenida de la hidrdlisis del ATP; de esta forma genera gradientes de concentracién. Por medio de este siste- ma la célula mantiene la estabilidad osmotica y un medio interno rico en potasio Sptimo para la funcién de varios enzimas. Esté implicada en las labores de excrecién y reabsorcién en epitelios especializados, como los tiabulos renales ' y el epitelio ciliar del ojo, en el proceso de regeneracin dsea? y en la gene- raci6n de potenciales eléctricos usados en la conduc- i6n del impulso nervioso y en la contraccién mus- cular. Esta diferencia de potencial provee de energia a los sistemas de co y contratransporte implicados en la captacién de glucosa, protones y calcio, entre otros. Para generar estos gradientes de concentra- cién, la bomba de sodio trabaja mediante un ciclo de fosforilacién-defosforilaci6n en el cual la enzima al- terna entre dos estados conformacionales diferentes En presencia de sodio el enzima E se estabiliza en la llamada forma £1, que acepta un grupo fosfato del complejo Mg-ATP, y en presencia de potasio en la conformacién E2, que puede ser fosforilada por fosfa- to inorgénico. Asi pues, el equilibrio entre las formas E1 y E2 depende de las concentraciones de sodio y potasio. Los tejidos mas ricos en bomba de sodio son aque- los con una actividad alta de transporte de sodio y potasio. Entre los tejidos de mamifero, el mas usado es la médula roja exterior del rifén. El procedimiento ‘comin para obtener (Na, K)-ATPasa es el denomina- do de Jorgensen y la preparacién de enzima asi obte- ida muestra dos bandas en gel de poliacrilami- da-SDS, conocidas como alfa y beta, subunidades de 100 kDa y 55 kDa, respectivamente. Todos los lla- mados ligandos fisiol6gicos, sodio, potasio, magne- sio y ATP, interaccionan con la subunidad alfa. Entre las drogas que han sido usadas para investigar en el sistema, los esteroides cardiactivos constituyen el ‘grupo mas importante, y de ellos el més ampliamente usado es la ouabatna, el Gnico que cristaliza, hidro- soluble y facil de putificar. La ouabaina se fija a la 7 . MARTIN VASALLO subunidad alfa e inhibe la actividad enzimatica y el transporte catiénico mediado por la bomba de sodio. Como veremos més tarde, su importancia también ha sido crucial en los estudios de la biologia celular y molecular de este sistema de transporte. La relacién entre el ntimero de copias de subuni- dades alfa y subunidades beta presentes en la mem- brana plasmatica es de 1:1; asociindose una alfa con una beta, también se han sugerido asociaciones se- cundarias de este protémero, como tetrameros o al- fa-beta diprotémeros. Otra cuestién relacionada es cudntas unidades estructuralmente asociadas se nece- sitan para formar una bomba de sodio funcionante; a esto se ha propuesto denominarlo «interaccién» y atin necesita una respuesta definitiva, Las subunidades alfa y beta: sus estructuras e isoformas La subunidad alfa. La secuencia de aminoacidos de la subunidad alfa se ha deducido a partir de sus DNAs, obtenidos mediante screening de librerias en fagos lambda gt11 de rifiones de oveja* y de cerdo®, de la placa eléctrica del Torpedo californica®, de cé- lulas HeLa” y de cerebro de rata®. El rastro de la li- breria de cerebro de rata mostté la existencia de tres isoformas denominadas alfa, alfa (+) y alfa lll. La existencia de estas tres isoformas fue reportada simul- taneamente por dos grupos distintos ® °, apareciendo con nomenclatura distinta: a la isoforma alfa también se la denomina alfa-t y es resistente a la ouabaina; la alfa (+) es también conocida como alfa-3 y es sensi- ble a la ouabatna; el sinénimo de la isoforma alfa ¢s alfa-2, de la que no se conoce ninguna propiedad bioquimica especifica. La tabla | muestra algunas ca- racteristicas moleculares de las tes isoformas y en su leyenda algunas caracteristicas importantes de sus ho- mologias. Usando programas de computador basa- dos en el procedimiento de Kyte y Doolittle"? se han obtenido los patrones de hidropatia-hidrofobici- dad, se han deducido sus estructuras secundarias y las posibles regiones incluidas dentro de la membra- ina. Las regiones hidrofébicas, incluidas en la mem- brana, presentan un mayor grado de homologia que las hidrofflicas, donde se hallan los sitios de fijacién de los ligandos. Un modelo se muestra en la figu- ral. La subunidad beta. También han sido aislados clo- nes de DNA complementario que codifican las sub- nidades beta de rifén de oveja", perro '®, cerdo’, células HeLa '?, cerebro de rata "4, pollo y de la pla~ ca eléctrica del Torpedo californica’. A diferencia de la subunidad alfa, no se conoce ninguna funcién en la que esté implicada esta subunidad. Todas las subunidades clonadas poseen una sola regién hidro- fobica que se encuentra incluida en la membrana y tres dominios de N-glicosilacién situados extracelu- larmente ligados a residuos de asparagina"®. Algu- nas de sus Caracteristicas moleculares y un modelo se representan en ia tabla | Las isoformas. La existencia de formas moleculares distintas de la (Na, k)-ATPasa se habia sospechado baséndose en las diferentes sensibilidades a la oua- baina mostrada en distintos tejidos y en distintas es- pecies animales. En 1856, Vulpian descubrié que los sapos eran muy poco sensibles a los efectos toxicos de los digitélicos, y en 1965, Repke mostré que los Tabla |. Algunas caracteristicas moleculares de las subunidades clonadas. Asn-N.*: indica el nimero de residuo de_asparagina al que se encuentran ligados los polisacéridos de la subunidad beta. El niamero dé aminodcidos que constituyen las distintas subunidades beta varia entre 302 y 303 en los mamiferos y aves y 305 en la de Torpedo californica. Las homologias a nivel de secuencia de nuclestidos entre la misma isoforma en las distintas especies varia entre el 80 y el 90 %; estos porcentajes son mas altos al nivel de secuencia de aminodcidos. La homologia, como en la mayor parte de las proteinas, es siempre mayor entre la misma isoforma en las distintas especies animales que entre las distintas isoformas de la misma especie. Subunidad alta Subunidad beta specie ; eso molecular Peso molecular Ne de residuos Ore ere Asm Oveia 1.016 W217 34.937 157, 192, 264 Cerdo 1016 112.235 34.958 157, 192, 264 Humana 1.023 112.894 35.061 158, 193, 265 Torpedo 1022 112824 Baer 114, 139, 194, 267 Rata alfa 1018 112575 Rata alfo-2 1015 Hi736 34.639 159, 194, 268 Rata alfa:3 1013 wiz Pero 35.007 157, 192, 264 Pollo 159, 194, 266 Fig. 1.—Modelos propuestos para las subunidades alfa y beta de la (va, KeATPasa, basados en las secuencias deducidas de sus DNAS complementarios. EI polipgptido alfa presenta siete dominios includes en la bicapa lipidica, posiblemente formando ‘estructuras alfa-heice. ASP indica el residuo aspirtico aceptor de fosfato ATP. FITC y OUA (ouabaina) indican los lugares de fijacion de tales compuestos. La subunidad beta presenta un solo ‘dominio de membrana y tres residuos polisacdros en la regién textracelular de la proteina, unidos mediante enlaces Neglicosidicos a tes rsiduos de asparagina tejidos del sapo son unas cuatrocientas veces y la ra- ta unas treinta veces menos sensibles que los del ga- to, por ejemplo. También se sabia que la enzima de corazén de embridn de rata es sensible a la ouabaina y después no lo es en el estado adulto, fo cual da una pista para sospechar la existencia de dos genes con patrones de expresidn distinta segtin el periodo del de- sarrollo, Posteriormente se vio que dos células ner- viosas, el astrocito y la neurona, reaccionan de diver- sa forma al ser expuestas a los efectos de la ouabai- nia: el astrocito incrementa su volumen y la neurona no. Y desde el punto de vista cinético, la enzima ob- tenida de cerebro muestra dos sitios de fijacién con dos diferentes afinidades. Finalmente, Sweadner '7 separé en gel de poliacrilamida dos formas molecula- res de la subunidad alfa con diferente movilidad electroforética presentes en el cerebro de varias espe- ies animales. La afinidad por los glicdsidos car- diactivos de las isoformas hizo que a la mas sensi- ble se la denominara alfa (+), presente en el axolema de los nervios mielinizados con peso molecular de 94 kDa, y a la de menor sensibilidad se la llam6 alfa, de 92 kDa, presente en astrocitos. La alfa, también denominada alfa-1, es similar a la que se encuentra en el rifén; por ello se la denomina isoforma «kidney like» Fambrough y Bayne'® separaron una inmunoglo- bulina segregada por el hibridoma 24 que reconoce como antigeno a la subunidad beta de la (Na, K- ‘ATPasa de neurona, misculo y tabulo renal de pollo. BOMBA DE SODIO Por técnicas inmunohistoquimicas se vio que la dis- tribucién del antigeno seguia la membrana basolate- ral de los tbulos renales y la de la glindula salada de la gaviota, habiendo un igual nimero de sitios de fijacién de anticuerpo que de ouabaina tritiada. En contraste, los fibroblastos, células de Schwann y cé- lulas endocapilares tienen mas sitios de fijacion de ouabaina que de anticuerpo, mostrando que hay, al menos, dos ATPasas antigénicamente distintas Sweadner y Gilkeson '? han obtenido anticuerpos es- pecificos inmunizando conejos con enzima de axole- ma de cerebro de rata y de rifién de perro; estos anti- Cuerpos reaccionan especificamente con las isofor- mas alfa y alfa (+) en «western blots» y presentan reactividad cruzada entre las dos isoformas en vaca, ‘oveja, cobaya, perro, hombre, conejo y rana. Otro anticuerpo importante en fa comprensidn de la biolo- gia de la bomba de sodio ha sido el denominado 9- 5A por el grupo de Leffert °, que observa un predo- minio en el nmero de bombas en la cara canalicular de los hepatocitos respecto a las caras sinusoidal y lateral, asi como variaciones en la relacién entre acti- vidad enzimatica y numero de bombas en la fase pre- rreplicativa tardfa de la regeneraci6n hepatica El uso de los anticuerpos ha sido crucial para la se- leccién de los clones positives durante los screening de las librerias de cDNA. Tras haber sido demostrada la existencia de tres isoformas distintas de la subunidad alfa se han cons- truido sondas especificas para cada isoforma, mos- trando que en el ratén se encuentran localizadas en tres cromosomas distintos" y, por consiguiente, son productos de tres genes distintos y no fruto de un «splicing» alternativo. Los «northern blots» prepara- dos con RNA de diversos tejidos de rata? han indica- do que los patrones de expresin presentan una espe- Cificidad de tejido; asi, la isoforma alfa-1 se expresa en todos los tejidos estudiados y la alfa-2 se expresa en cerebro y corazén fetal. El gen de la alfa-3 trans- ctibe dos mRNAs de tamafios diferentes; uno de ellos se expresa s6lo en corazén, cerebro y musculo es- quelético; el otro se expresa ampliamente en todos los tejidos estudiados. Los distintos patrones de ex- presién de las isoformas indican que el mismo siste- ma pudiera tener funciones especializadas en los dis- tintos tejidos 0 que las distintas isoformas estén so- metidas a sistemas de regulacién funcional diversa Usando como sonda el cDNA que codifica la sub- unidad beta de rata para el estudio de su expresién en diversos tejidos del mismo animal se ha encontra- do hibridacién con el RNA obtenido de corazén, tes- ticulos, pulmdn, rinén, cerebro y vejiga urinaria, pe- fo no se detecté en higado '*; sin embargo, la rela- cién entre la cantidad de péptido alfa y péptido beta fs 1:1; si esta relacién es mayor cuando comparamos los niveles de mRNA respectivos puede ser un indica- tivo de la existencia de una isoforma distinta de la sub- 9 P. MARTIN VASALLO. unidad beta, pero por el momento los resultados de esta busqueda son negativos. La bomba de sodio como receptor de glicésidos cardioténicos La sensibilidad de la ouabaina. El efecto terapéuti- co de las plantas digitélicas ha sido conocido durante siglos; actualmente se sabe que es debido a su efecto inotrépico. Schatzmann y Skou demostraron que los esteroides cardiactivos inhiben el intercambio de potasio y la actividad (Na, K)-ATPasa2. La ouabaina forma un complejo inhibido que ain mantiene su ca~ pacidad para ser fosforilado por fosfato inorgénico y estabilizarse en la conformacién £2, come lo hace en presencia de iones potasio *¥. Asi pues, a la ouabana se la puede considerar como un competidor funcio- nal del potasio. Se fija a una porcién hidrofilica ex- tracelular de la subunidad alfa y, aunque no se cono- ce el lugar exacto, se conace la distancia en relacién al lugar de fijacién de ATP?%, y la region més plausi- ble pudiera ser la situada entre los dominios H1-H2 y H3-H4®, baséndose en las diferentes afinidades por la ovabaina y la diversidad en la secuencia de ami- nodcidos entre las isoformas alfa-1 y alfa-3. El porqué las células animales tienen receptores a sustancias vegetales no se conoce. {Qué tienen am- bas en comin? Posiblemente nada. Esta misma pre- gunta se planted para los receptores opidceos y la respuesta fueron las endorfinas, opidceos endégenos. Probablemente también haya glicdsidos endégenos para regular el sistema, pero la respuesta a esta cues- tin estd fuera del 4nimo de esta revisién. La resistencia a la ouabaina. El hecho de que haya tejidos y especies animales con diversas afinidades por los glicésidos hizo pensar en variedades intrinse- cas de la estructura primaria de la protefna o bien la existencia de un modulador intrinseco. Para estudiar las caracteristicas genéticas y mole- culares de esta diversidad de afinidades, el grupo de Levenson * transfecté cromosomas de células NIH- 373 (una linea fibroblastica murina resistente a la ‘ouabaina) detenidas en metafase.a la linea CV-1 (de rifén de mono, sensible a la ouabaina). Las células ransformadas adquirieron el fenotipo de resisten- ia a la ouabaina. La seleccién se Ilevé a cabo me- diante crecimiento en un medio rico en ouabaina. Los clones celulares que sobrevivieron se aislaron y caracterizaron, observandose que mantuvieron el fe- otipo estable durante varias generaciones aun en ausencia de ouabaina, sugiriendo esto una expresién de la isoforma resistente, la alfa-1, cuya presencia determina la diversidad de sensibilidades entre las distintas especies animales. Para comprobar este he- cho, el clon de cDNA que contenfa la informacién genética de la alfa-1 se insert6 en un vector de expre- 10 si6n y se transfect a células CV-1, sometiéndolas a seleccién por ouabaina?®. Un «northern blot» con RNA de las células transfectadas mostré la presencia, de mRNA especifico de alfa-1 al ser sondeado con el correspondiente cDNA, confirmando este hecho la hipétesis anterior. ygénesis de la (Na, K)-ATPasa Biosintesis de los polipéptidos alfa y beta. Los mo- delos celulares elegidos para llevar a cabo este tipo de estudios han sido: células MDCK (Madin-Darby Canine Kidney)?” ?8, neuronas sensoriales de po- Ilo **y larvas en desarrollo de camarén” *°, Pa- ra estos estudios se han utilizado anticuerpos especi- ficos, técnicas fluorograficas y experimentos de pul- so-caza en los que se alimentaba las células con me- tionina marcada con azufre-35. La sintesis de ambos polipéptidos tiene lugar en los polisomas fijados a la membrana, inserténdose contraduccionalmente en la membrana del reticulo endoplasmic; la velocidad de sintesis es similar en ambas, variando entre tres y cuarenta horas, dependiendo del tipo de célula. El precursor de la subunidad alfa posee cinco aminodci- dos més que son cortados antes de llegar a la forma madura. Cuando los experimentos de seguimiento de la sintesis se llevan a cabo en células tratadas con tu- nicamicina (inhibidor especifico de la N-glicosila- cién), la subunidad alfa no muestra diferencias en el peso molecular, pero el de la beta es un 30 % mas bajo (32 kDa). La endoglicosidasa-H rompe los enla- ces entre el primero y segundo residuos aminoglico- idicos; cuando se hace una digestién por ella del polipéptido beta, el analisis posterior del polipéptido demuestra tres residuos de manosa, indicando tres puntos diferentes de glicosilacién, que, como: se vio antes, parten de tres residuos gé asparagina situados en la porci6n extracelular. El,frénsito a través de las distintas organelas intracelufares hasta alcanzar su posicién en la membrana plasiiética no se ve afecta- do por las modificaciones en la glicosilaci6n. El viaje a través de las organelas de las proteinas que se an- clan en membranas puede ser inhibido por monensi na. El uso combinado de este compuesto con los dos anteriores ha ayudado a descifrar cémo la subunidad beta, tras ser glicosilada contraduccionalmente (paso inhibible por tunicamicina) por residuos de manosa, es desglicosilada poco més tarde para, cuando alcanza el aparato de Golgi, ser glicosilada de nuevo en for- ma diferente (paso inhibible por monensina) antes de alcanzar su posici6n definitiva en la membrana plas- matica, También parece que en determinados tipos de células la insercién del polipéptido alfa en el re culo endoplasmico se ve condicionada por la presen- cia previa de la subunidad beta, es decir, que ésta le serviria de seal para su inserci6n Ensamblaje de subunidades, transporte e integra- cién en la membrana plasmética. Tamkun y Fam- brough??, usando un anticuerpo monoclonal contra la subunidad beta, han demostrado que ambas sub- unidades coprecipitan incluso a perfodos tan breves como de quince minutos, sugiriendo que ambas sub- unidades se ensamblan inmediatamente después de sus sintesis. El resultado es el mismo en presencia de tunicamicina, lo cual indica que los residuos glicosi- dicos no son necesarios para la asociacién de sub- unidades o el transporte intracelular. La velocidad de trénsito desde el aparato de Golgi y la membrana plasmatica parece estar més relacionada con el tipo de célula que con las caracteristicas de una proteina en particular; por efemplo, en las neuronas sensoria~ les de pollo suele ser de unos cuarenta y cinco minu- tos hasta la membrana del soma y de tan solo diez para llegar al cono de crecimiento, quiza debido a Un transporte previo intraneuritico. Esto ests en desa- cuerdo con la teor'a de Small y cols. *, que postulan que las proteinas se insertan primero en la membrana plasmatica de! soma y después difunden lateralmente hasta alcanzar sus posiciones definitivas. El porcen- taje de (Na, K)-ATPasa libre en el citoplasma es de tun 30 % en neurona sensorial de pollo, del 60 % en migtabulo de pollo*® y de un 50% en células He- La*. Nada se sabe de su precisa localizacién ni de cual puede ser su posible papel mientras esta en tran- sito hacia la membrana 0 cémo, en el caso de las cé- lulas polarizadas, se dirige siempre a una cara 0 re- 8i6n especifica de la membrana de plasmatica, Degradacién. La degradacién se realiza mediante internalizaci6n de piezas de membranas segin un proceso de primer orden y que necesita energia. Los trozos de membrana son transportados a los lisoso- mas, donde son digeridos. Mediante este sistema la cé- lula elimina de la membrana las bombas de estructu- ra incompleta 0 defectuosa. Dependiendo de la com- plejidad de la célula, el proceso dura entre diez ho- ras y tres 0 cuatro dias. Regulacién La regulacién de los estados dindmicos de la (Na, k)-ATPasa cuando se encuentra incluida en la mem- brana plasmatica es uno de los campos més excitan- tes y en controversia en nuestros dias. Se consideran dos formas de regulaci6n: primera, enzimatica, de la eficacia catalitica del sistema, y segunda, genética, mediante mecanismos de «up y down-regulation» de su expresién génica. Los estudios han sido conduci dos por dos caminos: variaciones en las concentra- ciones extracelulares de potasio e influencias hormo- rales Las células en fase estacionaria expuestas «in vi- tro» a medios de cultivo con concentraciones de po- BOMBA DE SODIO tasio por debajo de los limites normales responden de forma répida con un incremento de la eficacia ca- talitica de la enzima que inmediatamente rebaja las concentraciones intracelulares de sodio y potasio pa- ra poco después Ilevarlas a sus limites normales > Cuando esto sucede en células en fases activas de ‘crecimiento responden con una forma tipica de «up- regulation» con una estimulacién en la expresi6n del gen aumentando a cantidad de proteina funcionan- te? La regulacién hormonal de la bomba de sodio se lleva a cabo principalmente por la aldosterona y las hotmonas tiroideas. Los sistemas usualmente emplea- dos para comprobar los efectos de la aldosterona son la vejiga del sapo y células ventriculares de corazén de pollo; en ambos incrementa el nimero de bombas en la membrana” de dos formas distintas: primera, aumentando la concentracién intracelular de sodio, y segunda, favoreciendo la expresién del. gen de (Na, K)-ATPasa mediante un incremento de la sintesis de mRNA especifico. Las hormgnas titoideas estimulan la actividad (Na, K)-ATPasa” y regulan los distintos grados de expresién durante la diferenciacién celular y el desarrollo y maduracién tisulares*. Las mues- tras para estos estudios se recogen de animales de ex- Perimentacién normales hipotiroideos y de sus. Ctias a distintos estadios de desarrollo, comprobando las variaciones en la sensibilidad a las hormonas y sus efectos. También se ha demostrado un efecto activador de la insulina sobre,la bomba de sodio y que tiene espe- Cificidad tisular ®; el efecto es patente en adipocito y célula muscular, pero ausente en higado. Teniendo en cuenta la distribucién tisular de las isoformas, se ha sugerido que la alfa-3 es la forma regulada por es- ta hormona. Bajo los efectos de la insulina, la célula incrementa la captacién de potasio como resultado de un aumento de la afinidad de la enzima por el so- dio. Para observar estos efectos la célula debe estar intacta; cuando se obtienen trozos de membrana de células tratadas con insulina no se observan modifi- caciones de la actividad (Na, K)-ATPasa El diacilglicerol y los forbolésteres, que disparan los mecanismos dependientes de la protein-kinasa C, también poseen un efecto estimulatorio del sistema, de forma y efectos todavia no bien caracterizados * Homologia con otras ATPasas Tan pronto como se conoce la estructura primaria de una proteina se compara con otras en busca de homologias que pudieran indicar su descendencia de un antepasado comtin, ya sea de forma convergente © divergente. En el caso de la (NA, K)-ATPasa es ra- zonable buscar homologias entre la subunidad alfa y otras ATPasas encargadas de otros sistemas de trans- " P. MARTIN VASALLO. porte cationico a través de fa formacién de un fos- fointermediario; tal es el caso de la Ca-ATPasa del re- ticulo sarcoplismico*’, fa (H, K)-ATPasa de las célu- las parietales gastricas“?, la ATPasa de la membrana plasmatica de levadura””, la Kdp-ATPasa de Escheri- chia coli*® y otras ATPasas encargadas de mantener los gradientes cati6nicos y proténicos en diversos or- ganismos que posteriormente veremos. Las llamadas H-ATPasas de la mitocondria y de los cloroplastos son realmente ATP sintasas, que funcionan a la inver- sa y que no recuerdan a las enzimas anteriormente citadas ni en estructura ni en funcién. La Ca-ATPasa de la membrana del reticulo sarco- plésmico usa la energia liberada del ATP para extraer del citoplasma del miocito dos iones calcio durante la relajaci6n muscular. Esta formada por un solo poli- péptido de 997 aminoacidos y 110 kDa de peso mo- lecular*’, embebida de forma asimétrica en la mem- brana del reticulo sarcoplasmico. La enzima de mis- culo estriado de conejo ha sido clonada, su estructu- ra primaria deducida y demostradas dos isoformas, producto de dos genes independientes que se expre- san de forma especifica en el misculo de contrac- cidn lenta o en el de contraccién répida; un defecto genético en la expresién del gen que codifica la Ca- ATPasa del masculo de contraccién répida parece ser el responsable de la miopatia conocida como enfer- medad de Brody. La (H, K)-ATPasa del sistema tbulo-vesicular de la célula parietal gastrica es un polipéptido de 1.033 aminoacidos con un peso molecular de 114 kD? y es la encargada de acumular dos iones potasio elec- troneutralmente en el citoplasma en intercambio por dos protones segregados a expensas de la energia de la hidrélisis de una molécula de ATP. El procariote E. coli posee una membrana citoplas- matica interna y otra externa, separadas por un pepti- doglicano y el llamado espacio periplasmic. La acu- mulacién de potasio dentro del citoplasma se lleva a cabo por dos sistemas diferentes, situados ambos en la membrana interna: la Trk y’la Kdp-ATPasa. En condiciones normales el sistema Trk es suficiente pa- ra mantener el medio adecuado y el Kdp esta repri- mido. Pero cuando el Trk es incapaz de mantener la concentracién de potasio adecuada, como sucede durante el crecimiento 0 cuando el potasio en el en- toro es bajo, la Kdp-ATPasa se expresa intensamen- te. La Kdp consiste en tres péptidos codificados por tres genes diferentes, el llamado operén KdpABC. La proteina producto del gen Kdp8 también ha sido clo- nada“, su estructura primaria deducida y posee una secuencia fosforilable, de 90 kDa de peso molecular. Similar a ésta y con idéntica funcién es la K-ATPasa que se encuentra en la Gnica membrana plasmatica del Streptococcus faecalis * Las membranas plasmaticas de las células de las plantas y de los hongos poseen una ATPasa que 12 transporta protones hacia el exterior, alcalinizando el medio interior, medio requerido para llevar a cabo el crecimiento, generando a la vez gradientes, que a través de los adecuados sistemas de cotransporte son utilizados para la captacién de nutrentes. La H- ‘ATPasa de levadura ha sido clonada?” y esta consti- tuida por un polipéptido de 918 aminoscidos, de 99,5 kDa de peso molecular. Asimismo, la H-ATPasa de’ Neurospora crassa consta de 920 aminodcidos y tiene un peso molecular de 100 kDa; su secuencia también ha sido deducida del cDNA‘ El polipéptido alfa de la (Na, K)-ATPasa y los des- critos anteriormente pueden ser divididos en tres re- giones: la N-terminal, el dominio de transduccién de energia y la C-terminal. La hipétesis del disparo para la insercién de una proteina en la membrana requie- re la existencia de un N-témino hidrofébico de al menos 20 aminodcidos. En todas estas proteinas di- cho extremo es altamente hidrofilico, lo cual va en contra de tal posibilidad. Los porcentajes de homolo- gia encontrados entre los distintos segmentos N-ter- mminales de las ATPasas son bajos. El C-término pare- ce ser la regién fijadora de cationes a transportar; por ello en esta zona es donde se encuentran las mayores diferencias entre las ATPasas. Los mayores grados de homologfa se encuentran entre las regiones denomi- nadas de transduccién de energia. Esta region in- cluye: a) el residuo aspartato aceptor del fosfato, b) el sitio de fijacién de FITC (fluorescein isotioci nato)*; c) sitio de fijacién de ouabaina y sus deriva dos fotoactivos, y d) sitio de fijacién de nuclestidos (ATP), Desde hace tiempo se sabia que el residuo asparta- to aceptor del fosfato era comin a todas estas ATP- ‘asas. Ocupa una posicién que varia del 369 en las en- zimas de oveja y cerdo a 376 en el de Torpedo cali- fornica; en esta regién todas las (Na, K)-ATPasas tie- nen una total homologia durante una secuencia pr6- xima a 100 aminodcidos. En las isoformas alfa-1, al- fa-2 y alfa-3 de rata ocupa las posiciones 371, 366 y 369, respectivamente. La secuencia préxima al grupo aceptor fosfato —Asp-Lys-Thr-Gly-Thr— es comiin a todas las ATPasas. El sitio de fijacién del FITC, una li- sina, ocupa, por ejemplo, la posici6n 501 en la (Na, K)-ATPasa de oveja y es el quinto de una secuencia de dieciséis comin a todas ellas. En esta regién se encuentra el sitio de fijacién de los nucledtidos**; ain no se conoce cusl es el aminodcido 0 aminoaci- dos directamente implicados. El segmento compren- dido entre los aminodcidos 191 y 198 de la Ca- ATPasa de miisculo de contraccién répida se ha sin- tetizado y caracterizado como un posible sitio de fijacién de calcio*”. Como la (Na, K)-ATPasa puede fijar calcio en el lugar de fijaci6n de los cationes mo- novalentes*®, cuando buscamos por homologia de ese segmento en la secuencia deducida el resultado fue negativo. Estos datos, junto con los obtenidos mediante pro- te6lisis y marcaje covalente de ligandos sintéticos, hacen sospechar que hubo una ATPasa antepasado comin de todas ellas, que posiblemente fuera una bomba de protones y que posteriormente evoluciond hacia el transporte de sodio, potasio y calcio. Perspectivas La biologia molecular, la inmunologia y los estu- dios genéticos nos han dado evidencias de la existen- cia de tres isoformas de la bomba de sodio y nos han ayudado a comprender su biogénesis y expresion. Pero de ello han surgido nuevas preguntas: ;Para qué quiere la célula tener tres isoformas distintas que de- sarrollan la misma funcién? ;Cuéles son sus diferen- cias funcionales? j£s un solo tipo de subunidad beta la que se combina con las distintas alfas? O jexisten otras isoformas hasta ahora no descubiertas? ;Por qué en el caso de las células polarizadas, como las de los tdbulos renales, epitelio ciliar, etc., siempre emigra para colocarse en la misma cara y no a otra diferen- te? Las anteriores cuestiones se estén abordando me- diante la formacién de anticuerpos contra péptidos sintéticos construidos exactos a dominios especificos. Mutaciones puntuales, cambiando de aminodcido en aminodcido y construccién de quimeras entre los di- ferentes DNAs (parte de un gen y parte de otro) y ob- servando diferencias funcionales. Expresar ambas sub- unidades en organismos que no expresan la bomba de sodio, como las levaduras, esto podria aumentar ‘nuestro conocimiento acerca de la asociacién de sub- unidades y dar ideas acerca de un posible papel de la subunidad beta. La (Na, K)-ATPasa es solo un ejemplo de las posibilidades de estas técnicas en el conocimiento de la fisiologia molecular de los distin- tos sistemas de los organismos vivos, asi como su uti- lidad para sentar las bases moleculares de una gran variedad de desérdenes genéticos y que, tarde o tem- prano, conduciré a un mecanismo de terapia de ge- nes. iografia 1. katz Al: Distribution and function of classes of ATPases along the nephron. Kidney Int 29:21-31, 1986. 2. Baron R, Neff CR, Boisvert A y Caplan M: Evidence for a high and specific concentration of Na, K-ATPase in the pla ‘ma membrane of the osteoclast. Cell 46:311-320, 1986 3. Coca-Prados M y Lopez-Briones LG: Evidence thatthe alpha and the alpha (+) isoforms ofthe catalytic subunit of (Na, K) ATPase reside in distinct ciliary epithelial cels of the many ‘malian eye. Biochem Biophys Res Commun 155:460-456, 1987, 4. 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