Manual de Bacteriologia

COLECCIÓN
Textos Universitarios
Libros de LUZ
El Vicerrectorado Académico de la Universidad del Zulia, consciente de la importancia que el

libro tiene como herramienta para fortalecer tareas esenciales como la docencia y la investigación,
presenta su nueva colección de libros que, desde su Consejo de Publicaciones, salen a poner de
manifiesto la diversidad intelectual que caracteriza nuestra institución. Más que un proyecto edito-
rial hecho realidad, esta nueva colección le da forma tangible al conocimiento que tanto docentes
como investigadores producen en sus múltiples actividades de pre y post grado, haciendo realidad
la relación académica entre profesores y estudiantes, como el pilar fundamental del quehacer uni-
versitario.
La colección Textos Universitarios amplía sus dimensiones con el brillo de estos nuevos títu-
los, que a partir de este momento se sumarán a la inquebrantable tarea de iluminar los caminos del
estudio, la indagación y la reflexión, convertidos desde sus páginas en rutas de hallazgo, conoci-
miento y placer, que son en definitiva las potencialidades de cualquier texto. Sabor y saber, como
nos dijeran desde siempre los más fervorosos amantes de los libros. Y es que estos nuevos títulos
vienen a impulsar lo que ya inicialmente se hiciera: enriquecer el patrimonio bibliográfico de la
academia universitaria, hacer tangible el conocimiento producido en nuestra alma máter, prestigiar
a nuestro personal que incansablemente hace posible la expresión diversa del saber, transferir los
grandes logros para consecución del bien colectivo y, con la intensidad de una comunidad que
existe hecha un referente de esplendor, irradiar nuestro quehacer a la región y el país que todos
somos.
Los libros que desde hoy continúan naciendo desde el Consejo de Publicaciones del Vicerrec-
torado de LUZ, expresan un esfuerzo de trabajo conjunto con diversas instituciones públicas y
privadas que creyeron en nuestro proyecto editorial, y trascendieron las meras formalidades de
alianzas - aportes, para identificarse con la trascendental labor de multiplicar el acervo biblio-
gráfico universitario. Con el crecimiento de la colección Textos Universitarios las posibilidades
de crecer como creadores se hace imponderable y permite reencontrarnos perennemente en el
trayecto infinito de la búsqueda del saber. Y es que como decía Oscar Wilde Leer un libro es
leernos a nosotros mismos. Y es esta una noble y extraordinaria tarea.
Profa. Judith Aular de Durán

Vicerrectora Académica de la Universidad del Zulia
MANUAL PRÁCTICO DE
BACTERIOLOGÍA GENERAL
Segunda Edición
Universidad del Zulia
Autoridades Universitarias
Jorge Palencia Piña

Rector
Judith Aular de Durán

Vicerrectora Académica
María Guadalupe Núñez

Vicerrectora Administrativa
Marlene Primera
Secretaria
Consejo de Publicaciones del

Vicerrectorado Académico
Judith Aular de Durán

Directora
Ángel Madriz
Coordinador
MANUAL PRÁCTICO DE
BACTERIOLOGÍA GENERAL
Segunda Edición
Maribel J. Castellano G.
Messaria M. Ginestre P.
Yeiny C. Ávila R.
Sonia C. Romero A.
Armindo J. Perozo M.

Colección Textos Universitarios
Ediciones del Vicerrectorado Académico
© Manual Práctico De Bacteriología General; Segunda Edición
Maribel J. Castellano G.
Messaria M. Ginestre P.
Yeiny C. Ávila R.
Sonia C. Romero A.
Armindo J. Perozo M.
Colección Textos Universitarios

Segunda Edición, 2011.
Diseño y cuidado de edición:

Consejo de Publicaciones de la Universidad del Zulia - Jannieliz Leal
Impresión:
Hecho el Depósito de Ley:

XXXXXXXXXXXXXXXXXXX
Reservados todos los derechos
Este libro ha sido arbitrado por las instancias correspondientes.
© de esta edición
Impreso en Venezuela
Índice General
. Página
Introducción 13
UNIDAD I. INTRODUCCIÓN AL TRABAJO PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍA 15
Objetivos terminales 15
Actividad Práctica 1.1: Introducción al Trabajo Práctico de Bacteriología 17

Objetivos específicos 17
Normas de bioseguridad en el Laboratorio de Bacteriología 17
Material y equipo de uso frecuente en el Laboratorio de Bacteriología 18
Actividad a realizar 23
Ejercicios de auto-evaluación 24
Actividad Práctica 1.2: Observación de Bacterias y otros Microorganismos in vivo 25

Objetivo específico 25
Observación de bacterias y otros microorganismos vivos provenientes de diferentes ambientes naturales:
agua, suelo, alimentos, otros 25
Actividad Práctica 1.3: Examen al Fresco y técnica de la Gota Pendiente 26

Examen microscópico 26
Examen al fresco 26
Técnica de la Gota Pendiente 26
UNIDAD II: MORFOLOGÍA Y ULTRA-ESTRUCTURA DE LA CÉLULA BACTERIANA 29

Actividad Práctica 2.1: Técnicas de Coloración. Examen microscópico de Preparaciones Coloreadas 31

Colorantes 31
Coloraciones 31
Etapas del proceso de coloración 31
Técnicas de coloración 34
Coloración de Gram 34
Coloración de Ziehl-Neelsen 37
Coloración de gránulos metacromáticos 38
Coloración de cápsula 39
Coloración de flagelos 41
Coloración de esporas 43
Laminero Práctica 2.1: Coloraciones 47
Maribel J. Castellano G, Messaria M. Ginestre P, Yeiny C. Ávila R, Sonia C. Romero A, Armindo J. Perozo M
Unidad III: Nutrición y Crecimiento Bacteriano 53

Actividad Práctica 3.1: Técnicas de Siembra y Morfología Colonial 55

Técnicas de siembra o Inoculación 55
Técnicas de inoculación de medios líquidos 55
Técnicas de inoculación de medios sólidos y semi-sólidos en tubo 56
Técnicas de inoculación de medios sólidos en placa 57
Técnicas de aislamiento de colonias en medios sólidos 57
Morfología colonial 59
Laminero3.1:Morfologia colonial bacteriana en medios enriquecidos, selectivos y diferenciales 61
Actividad Práctica 3.2: Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano 67

Factores Físicos 67
Temperatura 67
Concentración de hidrogeniones (pH) 67
Tensión de oxígeno y potencial de óxido-reducción 68
Presión osmótica 70
Actividad Práctica 3.3.: Medición del Crecimiento Bacteriano 72

Cuantificación del crecimiento bacteriano 72
Contaje en placas 72
Turbidimetría 73
UNIDAD IV: METABOLISMO BACTERIANO 79

Objetivo terminal 79
Actividad Práctica 4.1: Pruebas Bioquímicas utilizadas en la Identificación de Bacterias en el Laboratorio 81

Generalidades 81
Identificación utilizando métodos convencionales 112
Laminero 4.1: Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias en el laboratorio 115
UNIDAD V: GENÉTICA BACTERIANA 123

Manual práctico de bacteriología general
Actividad Práctica 5.1: Transferencia de Material Genético por Conjugación

Bacteriana 125
Generalidades 125
UNIDAD VI: CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO 127

Actividad Práctica 6.1: Evaluación de Métodos Físicos para el Control del Crecimiento Bacteriano 129
Efecto del Calor sobre el Crecimiento Bacteriano 129
Efecto de las Radiaciones sobre el Crecimiento Bacteriano 130
Ejericicios de auto-evaluación 131
Actividad Práctica 6.2: Evaluación de Desinfectantes y Antisépticos 132

Generalidades 132
Actividades de auto-evaluación 132
Actividad Práctica 6.3: Pruebas de Susceptibilidad y Resistencia Bacteriana a los Antibióticos 133
Generalidades 133
Métodos para determinar la susceptibilidad bacteriana a los antibióticos 133
Método de Dilución en Caldo 134
Método de Dilución en agar 136
Método de Difusión del Disco en Agar 137
Métodos de Gradiente de Antibióticos 139
Otras pruebas 140
UNIDAD VII: INTERACCIÓN BACTERIA-HOSPEDERO 143

Actividad Práctica 7.1: Flora Normal 145

Generalidades 145
Flora normal del cuerpo humano 145
UNIDAD VIII: CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO 149

Objetivo Terminal 149
Actividad Práctica 8.1: Preparación y Control de Calidad de Medios de Cultivo 151

Objetivos Específicos 151
Generalidades 151
Medios de cultivo 151
Técnica de preparación de medios de cultivo 152
Control de calidad de medios de cultivo 153
Anexos 157
Referencias Bibliográficas 179
INTRODUCCIÓN
El Manual Práctico de Bacteriología General, en su segunda edición, está dirigido fundamentalmente
a los estudiantes que se inician en el fascinante mundo de los microorganismos y contiene una serie de actividades
destinadas a integrar y fortalecer los conocimientos teóricos impartidos en el Programa de Bacteriología General,
asignatura obligatoria para los estudiantes de Bioanálisis de la Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia.
Sin embargo, está concebido como libro de referencia para estudiantes de carreras afines y de post-grado que
necesiten profundizar nociones básicas de bacteriología; así como para cualquier persona que desee información
sobre la bacteriología práctica.
Este manual proporciona una serie de normas y técnicas necesarias para un adecuado desempeño en
el laboratorio de Bacteriología mediante ejercicios prácticos, cuya finalidad es el desarrollo de habilidades y
destrezas en el laboratorio. Con este propósito, los contenidos han sido organizados en ocho unidades, divididas
en un máximo de tres sesiones prácticas por unidad. Cada una de estas sesiones contiene los fundamentos teóricos
básicos, esquemas explicativos, figuras e ilustraciones que facilitan la comprensión de las actividades prácticas
contempladas.
La Unidad I está enfocada en los principios básicos y las normas de bioseguridad que rigen el trabajo de
laboratorio; presenta los materiales y equipos de uso rutinario en el área de Bacteriología e inicia al estudiante en
la observación directa de microorganismos vivos en diferentes tipos de muestras.
La Unidad II comprende la exploración de las técnicas empleadas para la observación de los
microorganismos in vivo, las técnicas de coloración de las bacterias y la comprensión de los diferentes morfotipos
bacterianos apreciables en una muestra biológica.
En la Unidad III, se abordan las técnicas de siembra y los métodos de aislamiento y cuantificación
bacteriana. También se enfoca la visualización de las colonias bacterianas en diversos medios de cultivo y el
reconocimiento de la influencia de los factores físico-químicos en el crecimiento bacteriano.
Los contenidos de la Unidad IV presentan las bases para la comprensión de diversidad de pruebas
bioquímicas que reflejan los procesos metabólicos que se llevan a cabo en la célula procariota; brindando las
herramientas básicas para la correcta ejecución, lectura e interpretación de las pruebas bioquímicas utilizadas de
rutina para la identificación bacteriana.
Por su parte, la Unidad V, estudia la genética bacteriana, específicamente brinda algunos lineamientos
relacionados con los posibles mecanismos de transferencia de material genético entre bacterias, en especial,
mediante la conjugación bacteriana y su implicación en la diseminación de la resistencia bacteriana.
Los contenidos de la Unidad VI abarcan los métodos físicos para el control del crecimiento bacteriano;
la evaluación de desinfectantes y antisépticos y las pruebas de susceptibilidad y resistencia de las bacterias a los
antibióticos.
13
En la Unidad VII, los contenidos han sido organizados en una sesión práctica, relacionada con la
observación de las bacterias y otros microorganismos que forman parte de la flora normal de diferentes sitios del
cuerpo humano.
Finalmente, la Unidad VIII proporciona los principios generales sobre la preparación y control de
calidad de los medios de cultivo utilizados para el aislamiento e identificación bacteriana.
Esperando que esta obra constituya un valioso aporte a la enseñanza de la Bacteriología General y que
sea de provecho para los estudiantes, a quienes va dirigido este trabajo.
Los Autores
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UNIDAD I
INTRODUCCIÓN AL TRABAJO PRÁCTICO DE
BACTERIOLOGÍA
Objetivos Terminales:
Al finalizar la Unidad, el participante estará en capacidad de:
 Aplicar las normas de bioseguridad que rigen el trabajo en el Laboratorio de Bacteriología.

 Diferenciar los materiales y equipos de uso frecuente en el Laboratorio de Bacteriología.
 Verificar la presencia de bacterias y otros microorganismos vivos en diferentes tipos de muestras.
 Reconocer la movilidad bacteriana en preparaciones al fresco.
ACTIVIDAD PRÁCTICA 1.1
INTRODUCCIÓN AL TRABAJO PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍA
Objetivos Específicos:
1. Aplicar las normas de bioseguridad en el Laboratorio de Bacteriología.

2. Identificar los materiales y equipos de mayor utilidad en el Laboratorio de Bacteriología.
Normas de Bioseguridad en el Laboratorio de Bacteriología

Los laboratorios de Bacteriología son ambientes especiales con respecto a la seguridad de las personas
que trabajan en los mismos. Las muestras recibidas para su estudio representan un riesgo potencial para el
personal, debido a los agentes infecciosos que pueden contener. La educación del personal que manipula a diario
los agentes potencialmente infecciosos, así como de aquéllos que sólo tienen una exposición limitada al ambiente
del laboratorio, tales como: personal de mantenimiento, personal que entrega las muestras y visitantes, debe estar
dirigida al conocimiento de las medidas para prevenir las infecciones adquiridas en el laboratorio. Los riesgos de
un laboratorio de esta área pueden extenderse a los laboratorios adyacentes y a las familias del personal.
Además del riesgo por infección, los laboratorios de Bacteriología también están expuestos a todos
los riesgos asociados con cualquier ambiente de laboratorio o institucional, como: incendios, riesgos eléctricos,
químicos, situaciones ambientales, materiales radiactivos, mal funcionamiento de los equipos y peligros
dependientes de desastres naturales.
Los riesgos biológicos existentes en la sección de bacteriología del laboratorio clínico son los de interés
en este caso. Las normas de bioseguridad son un conjunto de medidas preventivas, destinadas a proteger la salud
de los trabajadores y la comunidad frente a riesgos por agentes biológicos en el laboratorio.
A continuación se indican las normas generales que deben cumplirse en el Laboratorio de
Bacteriología:
1. El Laboratorio de Bacteriología representa un gran peligro para las personas no entrenadas, por lo tanto, el
acceso debe estar limitado al personal que labora en él. Deben evitarse las visitas, especialmente de niños.
Ciertas áreas de alto riesgo, como las secciones de Micobacteriología, deben estar cerradas al público.
2. El estudiante, al igual que el resto del personal que allí labora, debe usar una bata de laboratorio. La misma
deberá ser larga (que cubra la ropa de calle), manga larga y estar completamente cerrada. Debe quitársela antes
de abandonar el laboratorio.
3. Es indispensable usar guantes de goma o látex cuando se manipulan materiales potencialmente patógenos.
Como el riesgo de contaminación por aerosoles es grande, es necesario utilizar mascarilla.
4. Dentro de las áreas de trabajo está absolutamente prohibido comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos. Bajo
ninguna circunstancia, utilice la cristalería o los envases del laboratorio para ingerir líquidos o sustancias
alimenticias.
5. Se recomienda no llevarse los objetos o las manos, a la cara o la boca, durante su permanencia en el laboratorio;
sino después de minucioso lavado con agua, jabón y cepillo.
6. Todas las operaciones hechas con pipetas deben ser practicadas con el empleo de propipetas o gomas de
succión. Nunca pipetee con la boca.
7. Está terminantemente prohibido utilizar teléfonos celulares dentro del laboratorio para evitar distracciones que
puedan ocasionar accidentes y disminuir el riesgo de contaminación.
8. Mantenga su mesón de trabajo despejado. Disponga únicamente, los materiales estrictamente necesarios para
realizar su trabajo. Todo artículo que no sea indispensable para la ejecución de las actividades deberá ser
guardado fuera del área para evitar su contaminación.
9. En caso de cualquier accidente, por pequeño que éste sea, notifíquelo de inmediato a su superior para tomar
las acciones pertinentes.
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10. Muchos de los microorganismos estudiados en el laboratorio son patógenos para el hombre; por lo tanto, todas
las muestras y cultivos que se procesan deben ser considerados potencialmente patógenos y ser tratados
como tales.
11. Rotule convenientemente todas las muestras procesadas. Nunca incube cultivos no identificados.
12. No realice experimentos o trabajos sin autorización de su superior.
13. Una vez terminado el trabajo, devuelva a su lugar todos los reactivos y equipos utilizados. Su área de trabajo
debe quedar totalmente despejada. Descarte todos los cultivos, las muestras y la cristalería utilizados en el
recipiente destinado a tal fin. Una vez depositado un objeto en el recipiente, nunca debe ser retirado del
mismo.
14. Deposite las pipetas utilizadas en los recipientes correspondientes. Nunca coloque pipetas contaminadas sobre
su mesa de trabajo.
15. No desplazarse dentro del laboratorio con material contaminado, por ejemplo: pipetas que hayan sido utilizadas.
Asegurarse de tener disponible el recipiente de descarte antes de usar materiales como pipetas, hisopos u
otros.
16. Los microorganismos desecados o fijados sobre láminas portaobjetos no necesariamente están muertos;
manipúlelos con cuidado y al descartarlos, hágalo en el recipiente correspondiente.
17. Nunca saque material contaminado (por ejemplo: cultivos bacteriológicos) del laboratorio sin haber obtenido
las instrucciones pertinentes.
18. No interrumpa a quienes están trabajando; pues se pueden ocasionar graves errores o accidentes.
19. Trabaje siempre cerca del mechero para evitar la contaminación de los cultivos. De igual manera, no hable
mientras está inoculando las muestras en sus correspondientes medios de cultivo.
20. Las personas que tienen el cabello largo, deben recogérselo para prevenir accidentes.
21. Las sandalias o zapatos descubiertos no ofrecen protección adecuada a los pies; por lo tanto, se recomienda el
uso de calzados cerrados.
22. Lave cuidadosamente sus manos con agua y jabón al terminar cada sesión de trabajo y antes de salir del
laboratorio.
23. El laboratorio debe mantenerse limpio y ordenado, retirando del mismo cualquier material que no tenga
relación con el trabajo.
24. Las superficies de trabajo se descontaminarán al terminar cada actividad específica.
25. Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se evite, en lo posible, la formación de
aerosoles.
26. Durante el trabajo se mantendrán cerradas las puertas del laboratorio.
“Cumpliendo a cabalidad las normas anteriormente descritas, el Laboratorio de Bacteriología puede
constituir un área segura para trabajar y aprender”.
Material y Equipo de uso frecuente en el Laboratorio de Bacteriología
Con fines didácticos, el material de uso en el Laboratorio de Bacteriología puede dividirse en dos clases:
A.- Material de vidrio

B.- Instrumentos, equipos y otros materiales microbiológicos.
A) Material de vidrio:
Debe cumplir con ciertos requisitos especiales; como:
1. Ser resistente al calor seco y húmedo
2. Resistir lavados frecuentes
3. El vidrio debe ser neutro (que no altere el pH de los medios que contengan)
4. Resistentes a los ácidos y álcalis.
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El material de vidrio utilizado en los Laboratorios de Bacteriología está representado por:

Cilindros graduados: También denominados Probetas graduadas, son recipientes de vidrio grueso, forma
cilíndrica y diámetro uniforme, provistos de una base o pie para darles estabilidad. No son aptos para calentar ni
para efectuar reacciones químicas. Poseen una escala graduada en mililitros (ml) y calibrada a 20ºC. Generalmente,
tienen una capacidad entre 25 y 2.000 ml. Se usan para medir líquidos. En bacteriología, se emplean durante la
preparación de medios de cultivo, colorantes y reactivos, entre otros.
Embudos: Son conos de vidrio o de material plástico con punta de longitud variable terminada en bisel. Se utilizan
para filtrar reactivos, colorantes y medios de cultivo, para lo cual deben ser preparados, previamente, con papel
de filtro. Otro de sus usos, es facilitar el trasvasado de líquidos y sólidos hacia recipientes de cuello estrecho. Para
obtener una buena filtración, es mejor utilizar un embudo de buena calidad con un ángulo de 58º exactamente.
Espátulas en forma de “L”: Son varillas de vidrio que miden 22 x 25 mm. de largo, dobladas en uno de sus
extremos en ángulo de 90º. Se utilizan para la diseminación de material sobre la superficie de los medios de
cultivo.
Fiolas o Erlenmeyers: Son recipientes de vidrio de forma cónica, cuello corto y fondo plano. Su capacidad está
entre 25 y 5.000 ml. Se utilizan para la preparación de medios de cultivos y soluciones.
Frascos goteros: Son frascos de vidrio que poseen una ranura que al ser colocada de manera que coincida con otra
presente en la tapa, permiten la salida del líquido en forma lenta (gota a gota). Adicionalmente, existen frascos de
plástico o vidrio con un orificio o un dispositivo, que permite dispensar líquidos gota a gota. Por lo general, tienen
una capacidad de 25 a 50 ml.
Frascos para hemocultivo: Son frascos redondeados o rectangulares, de vidrio transparente con tapa de baquelita,
generalmente con una capacidad de 120 ml. Se utilizan para el cultivo de microorganismos a partir de muestras
de sangre.
Láminas cubreobjeto (laminillas): Son laminillas delgadas de vidrio con forma cuadrada, rectangular o redonda
que cubren las preparaciones microscópicas colocadas sobre los portaobjetos. Miden entre 15 y 22 mm de largo
por 0,13; 0,17 a 0,20 mm de espesor.
Láminas excavadas: Son rectángulos de vidrio con tamaños variables, algunas veces iguales a los portaobjetos;
otras veces, de mayor tamaño (110 x 55; 15 x 40 mm) que presentan en su superficie una, dos, tres o más
excavaciones. Se utilizan para observar la movilidad de los microorganismos por el método de la gota pendiente.
Láminas portaobjeto: Son rectángulos de vidrio utilizados para realizar extendidos a ser observados al microscopio.
Las de uso frecuente miden 75 mm de largo por 25 mm de ancho con 1 mm de espesor. Pueden poseer o no, bordes
esmerilados.
Matraces o balones: Son recipientes de forma esférica con un cuello cilíndrico, largo y de fondo plano. Su
capacidad está entre 50 y 5.000 ml. Algunos son aforados; es decir, poseen una marca circular que indica que a ese
nivel contiene un volumen exacto. Se utilizan para la preparación de soluciones.
Mechero de alcohol: Consta de un envase de vidrio o metal, provisto de una mecha, la cual se encuentra en
contacto con el alcohol contenido en el recipiente. Posee una tapa para evitar la evaporación del alcohol cuando no
se encuentra en uso. Se utiliza en algunos procedimientos de coloración que requieren calentamiento y para crear
un ambiente estéril durante la toma de muestra de sangre para hemocultivos.
Pipetas: Son tubos de vidrio con longitud y capacidad variable que terminan en una extremidad afilada. Presentan
una graduación exterior que indica su capacidad a 20ºC; algunas veces, la graduación llega hasta la punta (pipetas
terminales) y en otras, termina por arriba de ella (pipetas no terminales). Las más usadas tienen una capacidad
de 0,1; 0,2; 1; 2; 5 y 10 ml. Las hay también de plástico (desechables). Se emplean para transferir un volumen
determinado de líquido o solución. Existen también las Pipetas volumétricas, calibradas para dispensar volúmenes
fijos de un líquido. Existen de diferentes capacidades que varían en un rango de 1 a 100 ml.
Pipetas Pasteur: Se obtienen comercialmente, o pueden prepararse en el laboratorio. Poseen un extremo afilado
que puede ser largo o corto. Presentan también, un estrechamiento en la parte superior para facilitar el taponamiento.
Se utilizan para la inoculación de medios de cultivo, separar sobrenadantes, añadir reactivos, entre otros usos.
Placas de Petri: Están compuestas por dos platillos que difieren en su diámetro de manera que uno encaje
perfectamente sobre el otro. Existen de varios tipos y tamaños. El diámetro de las más utilizadas es de 100 x 15
19
mm y de 150 x 25 mm. Algunas están divididas en secciones o cuadrantes que permiten estudiar varios cultivos
simultáneamente o efectuar contaje de colonias. Pueden ser de vidrio o de material plástico (desechables). Se
utilizan para contener los medios de cultivo donde se inocularán los microorganismos a estudiar.
Tubos de centrífuga: Son tubos de ensayo, cuyo extremo cerrado termina en forma de cono. Se utilizan en los
procesos de centrifugación de muestras. Algunos poseen una escala graduada que permite medir, la cantidad de
sedimento obtenido. Pueden ser de material plástico o vidrio y tener o no, tapa de baquelita. Los más usados tienen
15 y 30 ml de capacidad.
Tubos de ensayo: Son tubos de vidrio, cerrados por un extremo, con reborde o sin él, de diámetro variable. Los
más utilizados son de: 160 x 15 mm; 150 x 15 mm; 125 x 15 mm y 100 x 13 mm. Algunos llevan tapa de baquelita.
Se usan principalmente para contener medios de cultivo y reactivos, así como también para efectuar pruebas
bioquímicas.
Tubos de fermentación (Durham): Se usan para el estudio de los procesos de fermentación de los carbohidratos
por parte de las bacterias. Permiten detectar la producción de gas a través del desplazamiento del líquido en el
interior del tubo. Generalmente miden 6 mm de diámetro x 50 mm de alto y suelen colocarse invertidos dentro de
otro tubo de mayor diámetro.
Varillas de vidrio: Son cilindros de vidrio con extremos redondeados, de longitud y tamaño variables (20-25 cm
de longitud x 3-5 mm de ancho, respectivamente). Se utilizan para la siembra y aislamiento de colonias en placas.
También para trasvasar líquidos y mezclar sustancias.
Vasos de precipitado (beakers): Son recipientes de forma cilíndrica, poseen una depresión en el borde que facilita
el vaciamiento de los líquidos. La capacidad, por lo general, es entre 25 y 2.000 ml. Se utilizan para transferencia
de líquidos.
B) Instrumentos, Equipos y otros Materiales usados en Bacteriología
Agitador tipo vórtex: Es un aparato formado por una base de aluminio fundido que brinda durabilidad y estabilidad
para su uso. Posee una copa de caucho suave para el mezclado de un tubo de ensayo único. Presenta dos modos de
operación: operación continua y encendido constante; y encendido al tacto, el cual se activa al tocar el accesorio
de copa con un tubo de ensayo.
Asas bacteriológicas: Están formadas por un mango de Kolle unido a un alambre de platino puro u otro metal
que le permite flexibilidad y calentamiento o enfriamiento rápido. Por su flexibilidad, se le pueden dar las formas
de aguja (asa en punta) o en aro (asa en argolla o aro). El elevado punto de fusión del metal con que se elabora
el asa, le permite que sea esterilizado al calor directo de la llama sin que se funda, y su rápido enfriamiento evita
la muerte del microorganismo cuando es tocado por el asa para ser inoculado a otro medio. Este alambre está
sujeto a un mango o cuerpo que generalmente, es de material liviano (aluminio) y es un buen conductor del calor.
Está protegido en su extremidad posterior por una cubierta de ebonita (aislante). Se emplean para la inoculación
de microorganismos en los medios de cultivo. En ocasiones, las asas suelen estar calibradas para dispensar un
volumen determinado de inóculo, por ejemplo 0,001 ml.
Autoclave: Aparato diseñado para la esterilización de materiales por vapor de agua a presión. Está provisto de
una llave y un manómetro para regular la presión, y por consiguiente, la temperatura a la que se desea someter
los microorganismos. Formado por una cámara de vapor de doble pared equipada con dispositivos, que permiten
que la cámara se llene a saturación de vapor y se mantenga a la temperatura y presión deseada. El autoclave es
una pieza indispensable en todo laboratorio de Bacteriología. Se utiliza para la esterilización de la mayoría de los
medios de cultivo durante su preparación; así como, para esterilizar material contaminado antes del lavado. Opera
a una presión de 15 libras a 121ºC de temperatura por un tiempo de 15 minutos.
Balanza: Equipo que permite pesar cualquier compuesto necesario para el trabajo diario de un laboratorio. Existen
en el mercado muchos modelos, algunos son de brazo, mecánicas, electrónicas o digitales.
Bandejas para esterilizar: Son recipientes, con o sin tapa, para descartar el material utilizado en el laboratorio
para luego esterilizarlo en el autoclave. Pueden ser de acero inoxidable o de propileno y su capacidad es variable.
Baños de María: Son aparatos provistos de una doble pared de acero inoxidable, y una capa central de asbesto,
poseen un termostato, un control del nivel de agua y un termómetro para regular la temperatura. El calor es
suministrado por una resistencia eléctrica. Se utilizan para verificar reacciones de los microorganismos a temperaturas
controladas. También se emplean en la estabilización de los medios de cultivo durante su preparación.
20
Campana o jarra de microaerofilia: Son recipientes formados por un cuerpo y una tapa que cierra herméticamente.
El cuerpo está constituido por material de vidrio o plástico de boca ancha; en cuyo interior se colocan las placas
de Petri y tubos de ensayo contentivos de los microorganismos en cultivo para su incubación en atmósferas
especiales (5-10% de CO2). Esta atmósfera especial se logra insertando una vela encendida en el interior del
recipiente o un sobre generador de la mezcla de gases deseada. También puede crearse una atmósfera de este tipo
por procedimientos mecánicos; es decir, extrayendo el aire del interior con una bomba de vacío y cargándolo con
una mezcla que contenga una concentración de 5-10% de CO2.
Campana o jarra de anaerobiosis: Sistema usado para crear una atmósfera anaeróbica. La que se emplea con
mayor frecuencia es la Campana de Gaspak, la cual consiste en una campana de plástico transparente con una
tapa hermética, la cual es ajustada por una abrazadera. La introducción de una mezcla de gases que contiene
H2 es seguida por la reacción catalítica del oxígeno con el hidrógeno para formar agua, estableciéndose así, la
anaerobiosis. Se emplea preferiblemente un catalizador frío compuesto por partículas de alúmina recubiertas con
paladio, ya que no tiene riesgo de explosión. Algunas están provistas de una conexión para aplicar el método de
evacuación/reposición de gases en la creación de un ambiente de anaerobiosis.
Campana de extracción: Sistema de seguridad, compuesto por un extractor centrífugo con motor y protegido de
los vapores por una ventana tipo guillotina con vidrio de seguridad, posee cuatro llaves de servicios localizadas a
cada lado para suministrar gas, agua, aire y vacío, además de toma-corrientes. Permite la manipulación de cultivos
bacteriológicos y muestras clínicas evitando la propagación de aerosoles.
Centrífugas: Son instrumentos metálicos de distintas capacidades, con envoltura de aluminio. Poseen un motor
que opera generalmente con 110-115 voltios y un reóstato que regula las revoluciones por minuto. En su interior
se encuentra un cabezal donde van colocados unos cilindros metálicos que sirven de receptores a los tubos de
centrífuga. Existen también centrífugas refrigeradas con un compresor que controla la temperatura. Poseen un
rango de temperatura de -20ºC a +40ºC. Son aparatos utilizados para la centrifugación; es decir, la aplicación de la
fuerza centrífuga para separar partículas en suspensión. Se emplean generalmente, para concentrar o precipitar los
elementos celulares contenidos en un líquido normal o patológico.
Cestas: Son recipientes de tejido metálico o plástico resistente al calor, de diferentes formas y tamaños. Se usan
para el almacenamiento de los tubos de ensayo y para su esterilización.
Contador de colonias: Aparato que consta de una fuente de luz, una lupa y un vidrio cuadriculado que facilita el
contaje de las colonias presentes en un cultivo. Los contadores digitales están provistos de un sensor que se activa
cada vez que se enumera una colonia durante el contaje.
Destilador de agua: Es un equipo que permite obtener agua de alta calidad, libre de pirógenos e iones metálicos a
partir de agua potable proveniente directamente de la tubería de suministro municipal. Está formado por resistencias,
condensadores y una caldera, entre otras partes. Algunos presentan diferentes dispositivos que interrumpen la
energía eléctrica cuando el nivel de agua disminuye.
Dispensador: Es un dispositivo que se utiliza para repartir volúmenes pequeños de líquido a partir de frascos
grandes. Éstos deben ser exactos y reproducibles en la dosificación. Además, no deben causar desperdicios de
reactivos. Están conformados por una válvula de seguridad, tubo telescópico para adaptarse a frascos de diferente
altura y controlador para ajustar el volumen de forma precisa y sencilla.
Encendedor para mecheros: Pieza metálica accionada por un resorte que lleva en un extremo un carbón
reemplazable, el cual es friccionado sobre una superficie irregular, produciéndose chispas que hacen encender los
mecheros.
Espátulas: Instrumentos planos, obtusos, semejantes a un cuchillo que se emplean para agregar sustancias. Son
de material inoxidable con mango de madera u otro material de hoja flexible, resistente al calor y a los agentes
químicos.
Estufas o incubadoras: Son instrumentos metálicos que poseen una doble pared de aluminio revestida por una
sustancia refractaria al calor proporcionado por una resistencia eléctrica y la temperatura es graduada por medio
de un termómetro que se maneja desde la parte externa. En la parte superior, posee un orificio donde se inserta el
termómetro e indica la temperatura existente en el interior. La temperatura usada en estos aparatos está entre 5 y
50ºC. Se utilizan para proveer de manera constante, temperaturas apropiadas para favorecer el crecimiento de los
microorganismos.
21
Frascos lavadores o picetas: Son recipientes plásticos utilizados para dispersar agua u otras sustancias contenidas
en ellos, permitiendo lavar o arrastrar cualquier material. Se usan para transvasar material sólido y para lavar los
recipientes, sin tocar las paredes. También se emplean en el lavado de preparaciones coloreadas.
Gomas de succión: Son bulbos de goma que se utilizan, al igual que las propipetas, para pipetear líquidos y
reactivos.
Guantes de látex para laboratorio: Son prendas de tamaño variable y ambidextros. Hechos de látex y disponibles
en forma estéril y no estéril, con polvo (almidón de maíz) y sin polvo. Se emplean para proteger las manos cuando
se trabaja con agentes infecciosos o químicos peligrosos. En la actualidad existen también de nitrilo,libres de
polvo, especiales para personas alérgicas al látex y/o al polvo que contienen los guantes de látex.
Guantes de seguridad: Son prendas utilizadas para manipular objetos calientes provenientes del autoclave u
horno. Se fabrican de tejido de algodón puro o de asbesto. Son lavables y resistentes al calor hasta 232ºC.
Gradillas: Soportes especiales de madera, metal o plástico, empleados para colocar los tubos de ensayo.
Horno de aire caliente: Es una cámara rectangular de doble pared, de tamaño variable, con amianto para evitar la
pérdida de calor por radiación, con un espacio aéreo entre ambas paredes. El calor es proporcionado por electricidad.
No puede utilizarse para líquidos ya que se agotarían por ebullición, ni para telas, ni gomas que se quemarían. Se
utilizan para esterilizar cristalería. Este material debe estar limpio, completamente seco y debidamente envuelto
antes de ser esterilizado al calor seco del horno. Opera generalmente a una temperatura de 170-180ºC durante 60-
120 minutos para destruir todos los microorganismos. El más utilizado es el Horno Pasteur.
Hisopos: Son aplicadores de madera que llevan algodón en uno de sus extremos. Son utilizados en forma estéril
para la toma de muestras bacteriológicas y algunas veces, para efectuar siembras.
Lápiz con punta de diamante: Se usan para marcar vidrios y otras superficies. El diamante es montado en bronce
y colocado al final de un mango de aluminio.
Lápices grasos: Son lápices especiales que sirven para escribir en vidrios o superficies muy pulidas. Los hay de
diferentes tipos, colores y marcas. Poseen en su composición, un porcentaje graso que permite la adhesión de éste
en la superficie lisa. Para usarlos, es necesario que la superficie donde se va a escribir esté completamente limpia
y seca.
Lentes de seguridad: Son instrumentos ópticos panorámicos que tienen como función proteger los ojos del
usuario ante cualquier accidente que pueda ocurrir en el laboratorio. Son de policarbonato claro y existen variados
modelos en el mercado.
Mascarillas: Son caretas faciales compuestas por tres capas de propileno fundido poroso que contiene en su parte
intermedia, un filtro del mismo material. Estas mascarillas aseguran la filtración de bacterias.
Mecheros de Bunsen: Son tubos de metal que sirven para la combustión del gas natural. Antes de producir la
llama para la oxidación completa del gas, se requiere mezclar el gas con aire. Se componen de las siguientes partes:
a) Pie: sirve de soporte, b) Válvula para la regulación de la mezcla aire-gas natural y c) Cuello del mechero. Se
utilizan para la esterilización de las asas bacteriológicas y para el flameado de la boca de los tubos que contienen
cultivos, durante su manipulación.
Medidor de pH (pHmetro): Instrumento que tiene como finalidad medir el pH de soluciones químicas en el
laboratorio. Está formado por un electrodo y su soporte, el cual es el sensor que produce la lectura. Este equipo
debe calibrarse con el empleo de una solución buffer o tampón. Existen muchos modelos en el mercado, algunos
pueden presentar dispositivos para determinar otras características, tales como: temperatura, conductividad y
concentración.
Microincinerador: Es un aparato eléctrico que cumple las funciones de un mechero de Bunsen. Además, lleva
adaptado lateralmente, una cámara tubular para incinerar los microorganismos, evitando de esta forma, el peligro
de contaminación de la atmósfera y del operador. Se les conoce popularmente como mecheros eléctricos.
Microscopio: El microscopio compuesto de luz, ampliamente utilizado en la actualidad, es un instrumento óptico
constituido por un conjunto de lentes y partes mecánicas, que permite la observación de especímenes diminutos,
invisibles al ojo humano, revelando detalles de su estructura. Existen otros tipos de microscopio, tales como:
Campo Oscuro, Contraste de Fase, Inmunofluorescencia, Electrónico, entre otros.
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Mortero con mazo: Es un recipiente que sirve para macerar cualquier compuesto químico o material que se desea
utilizar para la preparación de una solución y que se encuentre en estado sólido. Existen de diferente capacidad,
comúnmente se fabrican de porcelana.
Papel de filtro: Material compuesto por microfibrilla de vidrio que se utiliza para la retención de partículas finas
con una alta velocidad de flujo, durante los procesos de filtración.
Pinzas: Tenacillas de metal o acero inoxidable que sirven para varios usos. Por ejemplo: se utilizan para colocar
los discos de antibióticos en las pruebas de susceptibilidad y resistencia a los antimicrobianos, para sujetar hisopos
a fin de no tomarlos con la mano y para retirar el papel de filtro durante las coloraciones, entre otros.
Pipeta automática: Es un dispensador de líquidos automático, exacto y preciso. Presenta un eyector de punta para
evitar el desprendimiento accidental de la puntilla. Existen en el mercado diversidad de modelos y capacidades.
Plancha de calentamiento: Es un instrumento que tiene como finalidad el calentamiento rápido de sustancias
químicas, para facilitar la preparación de soluciones. Presentan una placa de calentamiento metálica, además de
controladores de temperatura. Algunos modelos traen incorporado un agitador con control ajustable.
Propipetas: Son dispositivos de goma que poseen tres válvulas de presión que operan independientemente para
controlar la entrada y salida de líquidos. Poseen un orifico inferior donde se inserta la pipeta que va a ser utilizada.
Poseen también tres botones: uno superior (A) que se utiliza para extraer el aire contenido en el interior del bulbo;
uno inferior (S) para succionar el líquido al interior de la pipeta y otro, lateral (E) que extrae el líquido de la
pipeta. Se usan para pipetear líquidos peligrosos.
Puntillas para pipetas automáticas: Son boquillas de propileno que se colocan en la parte inferior de las pipetas
automáticas y su función es tomar la cantidad de líquido a dispensar. Existen de diferentes capacidades adaptables
a cada modelo de pipeta.
Rejilla metálica: De forma cuadrangular, es una red constituida por finos alambres entrecruzados que llevan en
su centro un área circular de amianto o asbesto. Este material dispersa el calor con uniformidad. Generalmente,
se colocan sobre anillos o trípodes cuando van a calentarse instrumentos o material de vidrio que no deben recibir
calor directo.
Reloj de laboratorio: Es un instrumento que se utiliza para medir el tiempo de todos los procesos y reacciones
que se verifican en el laboratorio. Pueden ser mecánicos o digitales.
Soporte para coloración: Dispositivo en forma de “U” hecho de metal u otro material resistente, sobre el cual
se colocan las láminas portaobjetos que contienen extendidos fijados que van a ser sometidos a procesos de
coloración.
Termómetro: es un instrumento que permite el registro permanente de la temperatura. Existe una gran variedad
de modelos, desde manuales hasta digitales.
Trípodes: Son instrumentos metálicos, hechos generalmente de hierro, provistos de un aro y tres patas que le
sirven de soporte. Se usan para sostener recipientes que van a ser sometidos a ebullición. Por lo común, se coloca
sobre el aro una rejilla metálica.
Actividad a Realizar
 Proceda a identificar el material que se ha colocado sobre el mesón y relaciónelo con su utilidad práctica.
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Ejercicios de Auto-evaluación
1. Defina Normas de Bioseguridad.

2. Explique la importancia del cumplimiento de las normas de bioseguridad en el Laboratorio de Bacteriología.
3. Enumere diez normas de bioseguidad a cumplir en el Laboratorio de Bacteriología.
4. Aparee los siguientes materiales y equipos de laboratorio con su correspondiente utilidad práctica.
Material y Equipo Utilidad Práctica

Asa bacteriológica _______ a) Estudio de los procesos de fermentación
Placa de Petri ________ b) Preparación de soluciones
Estufa ______ c) Contener medios de cultivo
Horno _______ d) Verificar reacciones químicas
Autoclave _______ e) Inoculación de medios de cultivo
Mechero de Bunsen _______ f) Esterilización de asas bacteriológicas
Pipetas _______ g) Esterilización de materiales por vapor de agua a presión
Láminas excavadas _______ h) Esterilización de cristalería
i) Instrumento utilizado para el contaje de colonias
j) Proveer temperaturas apropiadas para el crecimiento bacteriano
k) Transferir líquidos
l) Pesar medios de cultivo y reactivos
m) Observación de la movilidad bacteriana
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OBSERVACIÓN DE BACTERIAS Y OTROS MICROORGANISMOS IN VIVO
Objetivo específico:
1. Observar la presencia de bacterias y otros microorganismos en diferentes tipos de muestras biológicas.
Observación de bacterias y otros microorganismos vivos provenientes de diferentes ambientes naturales:

agua, suelo, alimentos y otras muestras biológicas
La Microbiología se ocupa del estudio de organismos tan pequeños que no pueden observarse a simple
vista. Debido a la naturaleza de esta disciplina, el microscopio tiene una importancia crucial, ya que la mayor parte
de los conocimientos sobre los microorganismos han sido descubiertos con el uso del microscopio.
La primera persona que observó y describió los microorganismos fue el microscopista aficionado Anthony
Van Leeuwenhoek, quien con sus lentes creó una forma de iluminación (campo oscuro) que permitió observar
claramente diferentes formas de vida microbiana.
Las bacterias fueron los primeros organismos vivos del planeta, viven prácticamente en cualquier
lugar donde la vida sea posible, se encuentran en mayor cantidad que otra clase de organismos, y constituyen
probablemente el componente mayoritario de la biomasa terrestre.
En este trabajo práctico, el estudiante examinará al microscopio, preparaciones realizadas con diversos
tipos de muestras con la finalidad de observar la gran cantidad de organismos vivos existentes en la naturaleza.
Materiales
 Láminas portaobjeto
 Laminillas cubreobjeto
 Pipetas Pasteur
 Asa en aro
 Aplicadores de madera
 Solución salina fisiológica (SSF)
 Agua estéril
Muestras
 Diversos alimentos como: quesos no pasteurizados, jugos de frutas naturales, yogurt, entre otros.
 Suelo.
 Agua estancada.
 Muestras clínicas: heces, orina, hisopado de piel, entre otras.
Actividad a realizar
1. A cada grupo de estudiantes, se les asignará una de las muestras seleccionadas para el ejercicio práctico.
2. Con la muestra a observar, preparar una suspensión en SSF estéril.
3. Colocar una gota de la suspensión en una lámina portaobjeto y cubrir con una laminilla. Alternativamente, la
suspensión de la muestra puede prepararse directamente sobre la lámina portaobjeto con ayuda del asa o un
aplicador de madera.
4. Observar la preparación al microscopio, con objetivo seco de mayor aumento (40X).
5. Realizar anotaciones sobre lo observado en cada muestra. Reporte según los siguientes criterios: abundante,
moderado, escaso o ausente.
6. Realice un dibujo de lo observado en cada muestra.
1. Indique cuál muestra tiene mayor cantidad de microorganismos. Explique brevemente por qué.
2. ¿De dónde provienen los microorganismos observados?
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EXAMEN AL FRESCO Y TÉCNICA DE LA GOTA PENDIENTE
1. Distinguir las bacterias de otros elementos presentes en un examen al fresco.
2. Ejecutar correctamente la técnica de la gota pendiente para la observación de la movilidad bacteriana.
3. Diferenciar entre movilidad verdadera y movimiento browniano en las bacterias.
Examen Microscópico
El examen microscópico es usualmente el primer paso para la identificación de una bacteria desconocida.
Las bacterias pueden, tentativamente, ser colocadas en uno u otro grupo, cuando se han observado sus características
morfológicas y sus reacciones tintoriales. Las características morfológicas de importancia son:
a) Tamaño
b) Forma
c) Agrupación
d) Estructuras especiales:
 Flagelos
 Endosporas
 Cápsula
 Gránulos metacromáticos
Existen dos formas en las cuales los microorganismos pueden ser examinados bajo un microscopio: En
estado vivo (in vivo) o en estado de fijación (in vitro).
Observación “in vivo”:
Este tipo de observación puede hacerse necesaria cuando el microorganismo no es fácil de colorear o
cultivar o cuando se desea estudiar su morfología no distorsionada por la fijación.
Existen dos variantes:
1. Examen al fresco (montaje húmedo con SSF)
2. Técnica de la Gota Pendiente.
1. Examen al Fresco:
Procedimiento
1. Colocar sobre una lámina portaobjeto limpia y libre de grasa, una asada de un cultivo puro en caldo
(utilizando para ello un asa en aro previamente esterilizada a la llama del mechero).
2. Cubrir con una laminilla y observar al microscopio óptico con objetivo de 40X, bajando el condensador para
disminuir la cantidad de luz permitida.
3. Si el examen al fresco se realiza a partir de un cultivo en medio sólido, colocar una gota de SSF estéril en una
lámina portaobjeto y resuspender en ella una colonia del cultivo, y repetir el procedimiento anterior.
Esta preparación también puede ser examinada mediante microscopía de campo oscuro o de contraste de
fase. Además, puede hacerse un examen al fresco a partir de muestras clínicas, tales como: orina, secreción
vaginal, líquidos estériles entre otras; con la finalidad de observar si existen bacterias y otras estructuras (cilindros,
leucocitos, glóbulos rojos).
2. Técnica de la Gota Pendiente
Este método se utiliza para la observación de la movilidad de las bacterias aeróbicas estrictas, por ejemplo:
los Bacilos Gram negativos no fermentadores de la Glucosa (BGNNF). Tiene la ventaja de eliminar la distorsión
ocasionada por el peso del cubreobjeto y se puede obtener un campo de foco más profundo dentro de la gota.
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Procedimiento:
1. Colocar, con ayuda de un aplicador de madera, una pequeña cantidad de vaselina alrededor de una depresión de
la lámina excavada. (Alternativamente, puede agregarse la vaselina a la lámina cubreobjeto).
2. Colocar una suspensión de una colonia en SSF o una gota de un cultivo en caldo (4 a 6 horas de incubación) en
un cubreobjeto. No mover la preparación.
Figura 1: Preparación de la suspensión bacteriana

Fuente: Johnson T, Case J. 2001
3. Colocar la lámina excavada sobre la laminilla de manera que la gota del cultivo quede en el centro de la
cavidad. Presionar ligeramente; pero de manera firme para que se fije.
Figura 2: Inversión de la lámina excavada sobre la laminilla cubreobjetos

4. Invertir rápidamente la preparación de manera que la gota penda del cubreobjeto en la cámara.
5. Observar al microscopio óptico con objetivo seco de mayor aumento o con objetivo de inmersión para
evidenciar la movilidad; asegurándose de no confundir el movimiento browniano con la verdadera movilidad
que es mostrada por las bacterias que se desplazan en direcciones opuestas y llegan a cruzarse. El movimiento
browniano, es la constante vibración de las bacterias en un punto fijo, comportamiento que se presenta por
estar suspendidas en medio líquido y por su pequeño tamaño. Es un movimiento aleatorio derivado del empuje
de las moléculas de agua alrededor de la bacteria.
Objetivo 40x
Lámina Excavada
Figura 3: Gota pendiente (Observación al microscopio)

A cada grupo le será suministrado un cultivo puro en caldo y agar. Realice un examen al fresco entre lámina
y laminilla y una movilidad por el método de la gota pendiente. Observe detenidamente y registre los resultados.
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Ejercicios de Auto-Evaluación
1. ¿Qué valor práctico tienen estas técnicas?

2. ¿Cómo puede distinguirse la movilidad verdadera del movimiento browniano de las bacterias?
3. ¿Qué métodos pueden utilizarse para determinar la movilidad de las bacterias en el laboratorio?
4. ¿Cuál es la ventaja que tiene el método de la gota pendiente sobre el montaje húmedo?
5. ¿Para qué se usa la vaselina en el método de la gota pendiente?
6. ¿Por qué son difíciles de observar los microorganismos en montajes húmedos?
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UNIDAD II
MORFOLOGÍA Y ULTRA-ESTRUCTURA DE LA CÉLULA
BACTERIANA
Objetivos Terminales:
 Reconocer la morfología microscópica de las bacterias en preparaciones coloreadas.

 Explicar los fundamentos y procedimientos de diferentes coloraciones.
TÉCNICAS DE COLORACIÓN. EXAMEN MICROSCÓPICO DE PREPARACIONES COLOREADAS
1. Interpretar los fundamentos de las coloraciones de uso más frecuente en Bacteriología.

2. Practicar las técnicas de coloración de uso frecuente en Bacteriología.
3. Examinar al microscopio diversas preparaciones bacterianas.
4. Interpretar los resultados del examen microscópico de las coloraciones realizadas.
Colorantes
Debido a su elevada refringencia, la mayoría de los microorganismos son visibles al microscopio óptico cuando
se examinan en vivo y en suspensión acuosa, pero este examen al fresco, importante para observar la movilidad
de las bacterias, no permite apreciar los detalles de su estructura. En general, son necesarios procedimientos de
tinción o coloración para visualizar los microorganismos y demostrar los detalles finos de sus estructuras internas.
A tal fin, es necesario el empleo de sustancias colorantes.
Los colorantes son sustancias que, por procedimientos apropiados, tienen la capacidad de transmitir su
color a otros cuerpos. Generalmente, son sales de anilina que al disociarse originan iones cargados positiva y
negativamente. Uno de estos iones es el que imparte la propiedad cromógena y se denomina, entonces, cromóforo.
El otro, se denomina auxocromo y es el que permite que el colorante se una a las fibras o tejidos.
En términos amplios, de acuerdo con su comportamiento químico, los colorantes se consideran ácidos o
básicos; lo cual no necesariamente indica su reacción en solución (pH); sino más bien, si una parte significativa de
la molécula es aniónica o catiónica. Si el cromóforo es el ión positivo, el colorante se denomina básico (catiónico),
y si es el negativo, ácido (aniónico).
Las bacterias, a un pH 7,0; tienen una carga ligeramente negativa por ser ricas en ácidos nucléicos, los cuales
poseen cargas negativas en forma de grupos fosfato, por lo tanto, cualquier colorante que vaya a ser utilizado
para teñir este tipo de microorganismos, debe ser un colorante básico, los cuales incluyen: cristal violeta (también
denominado violeta de genciana), azul de metileno, safranina, fucsina básica y verde de malaquita, entre otros.
Los colorantes ácidos, como la eosina, tinta china y nigrosina, son poco utilizados, debido a que su cromóforo
(ión negativo) repele las cargas negativas de la superficie bacteriana. Se usan generalmente, cuando se desea teñir
estructuras citoplasmáticas o efectuar tinciones negativas.
Coloraciones
El estudio de la forma y disposición celular de los microorganismos se efectúa a través de preparaciones
coloreadas.
La introducción de tinciones a mediados del siglo XIX representa, en gran medida, el fundamento de los
principales avances que se han producido en la Microbiología durante los últimos siglos. Hoy en día, se emplean
tanto, que es difícil comprender cómo pudo haber progresado el estudio de los microorganismos, antes de su
aplicación rutinaria en el laboratorio.
Las tinciones consisten en aplicar soluciones acuosas o alcohólicas de colorantes a los microorganismos,
tejidos vegetales y animales, así como también otras sustancias de importancia biológica. Colorear significa,
simplemente, teñir los microorganismos para enfatizar ciertas estructuras.
Etapas del Proceso de Coloración
En el proceso de coloración se cumplen siempre las siguientes etapas:
1.-Preparación del frotis o extendido.
2.-Fijación del frotis o extendido.
3.-Aplicación de colorantes o coloración propiamente dicha.
1. Preparación del Frotis o Extendido
Consiste en colocar el material a examinar sobre el portaobjeto. El extendido debe ser delgado, uniforme
y no llegar hasta los bordes de la lámina. Debe dejarse secar al aire.
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Técnica de Preparación:
1. Colocar una gota de SSF (0,85%) estéril en el centro de un portaobjetos limpio y libre de grasa.
2. Con un asa, previamente esterilizada a la llama del mechero, tocar la superficie del crecimiento bacteriano
(colonia).
3. Resuspender la pequeña cantidad de material retirado del cultivo, en la solución salina. Utilizar el asa para
esto. Con la ayuda del asa, extender la suspensión bacteriana sobre un área pequeña del portaobjeto (1 cm.
aproximadamente).
Figura 4: Preparación de un frotis o extendido

4. Esterilizar nuevamente el asa a la llama del mechero.

5. Permitir que el material se seque espontáneamente al aire.
Figura 5: Secado del frotis

Si el frotis o extendido se va a preparar a partir de un cultivo en caldo: con asa en aro, colocar una o
dos gotas del caldo que contiene el microorganismo en la lámina portaobjeto. Extender con la misma asa. Los otros
pasos de la elaboración son exactamente iguales al anterior.
2. Fijación del Frotis o Extendido
La fijación o segunda etapa de la coloración se efectúa con la finalidad de adherir los microorganismos al
portaobjeto de tal manera que no se desprendan durante los pasos subsiguientes de la coloración. La fijación del
frotis hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología
bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber. La fijación puede hacerse por medio de
agentes físicos como el calor moderado, que es el más frecuentemente usado; o por agentes químicos, entre los
que se encuentra el alcohol.
Figura 6: Fijación del frotis a la llama del mechero

Fuente: Johnson T, Case J. 2001; modificado por Castellano, 2011
Técnica de Fijación por Calor: Una vez que el extendido se ha secado al aire, debe fijarse pasándolo ligeramente
varias veces (3 ó 4) sobre la zona azul de la llama del mechero, con la cara del frotis mirando hacia arriba evitando
el sobrecalentamiento. Compruebe la temperatura alcanzada, colocando la cara limpia del portaobjeto sobre la
eminencia tenar de la mano (base del pulgar).
La temperatura alcanzada no debe ser superior a los 45ºC, la cual es tolerada adecuadamente por la piel del
operador. En la práctica, el frotis se debe calentar hasta que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero sin
quemar.
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Alternativamente, puede calentarse la preparación en un dispositivo adecuado (plancha de calentamiento) a

60ºC por diez minutos para inactivar cualquier patógeno que pudiera estar presente.
Técnica de Fijación por Métodos Químicos: Una vez que el frotis se ha secado al aire, se procede a aplicar
alcohol (metanol al 95%), cubriendo completamente la lámina portaobjeto. Se deja actuar el alcohol por dos
minutos. Luego se escurre el exceso de alcohol y se deja secar al aire antes de proseguir con la coloración.
4. Coloración Propiamente dicha

Es la aplicación del o los colorantes sobre el frotis ya fijado.
Figura 7: Aplicación de colorantes (Tinción propiamente dicha)

Al aplicar colorantes ácidos o básicos, los microbiólogos, usualmente emplean tres técnicas diferentes de
coloración:
 Coloraciones simples.
 Coloraciones diferenciales.
 Coloraciones especiales.
Una coloración simple es la que emplea únicamente un (1) colorante que se aplica al frotis en una sola
operación. Su uso revela la morfología y disposición celular de las bacterias; sin embargo, no muestra detalles
finos de su estructura interna. El tiempo necesario para la coloración varía con la dilución del colorante. Una vez
teñidos, los extendidos son lavados brevemente con agua para eliminar el exceso de colorante, secados al aire
o con papel secante y después de ello, quedan listos para ser observados al microscopio óptico con objetivo de
inmersión (100X).
Las coloraciones simples más utilizadas en bacteriología son: azul de metileno, safranina, fucsina y violeta
de genciana.
Una coloración diferencial es aquella que emplea dos ó más colorantes juntos o separados, según la técnica
que se trate. Permite distinguir entre dos clases diferentes de microorganismos o entre dos partes diferentes de un
mismo organismo.
En frotis previamente elaborados y fijados, típicamente, se utilizan cuatro componentes de manera progresiva:
colorante primario, mordiente, solución decolorante y colorante de contraste.
El colorante primario, usualmente, tiñe del mismo color, todos los componentes celulares y microorganismos
presentes en el especimen. Ocasionalmente, se añade un químico a la solución para intensificar la tinción. Tal aditivo
se conoce como mordiente y su función es incrementar la afinidad del colorante por la muestra biológica. Otra
función sería la de recubrir estructuras, por ejemplo, los flagelos, para hacerlos más gruesos y fáciles de visualizar
después de teñidos. Son ejemplos de mordientes: calor, lugol y fenol. Los agentes decolorantes, típicamente,
son alcoholes y ácidos. La remoción del colorante primario por acción del decolorante permite la tinción, con el
colorante de contraste, de las células que fueron decoloradas; así como también del fondo.
Esta segunda tinción diferencia entre tipos de bacterias, como por ejemplo, organismos violeta intenso y
rojizos vistos con la coloración de Gram; o entre los microorganismos y el fondo, tales como los Bacilos Ácido
Resistentes (BAR) que se tiñen de rojo sobre un fondo azul.
Las dos coloraciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, son sin lugar a dudas, la coloración de
Gram y la coloración de Ziehl-Neelsen.
Una coloración especial o estructural es una coloración diferencial que, como su nombre lo indica,
permite colorear, de manera particular, estructuras especiales de la célula bacteriana, como por ejemplo: cápsula,
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flagelos, endosporas, gránulos metacromáticos y otros constituyentes intracelulares de las células bacterianas.
Técnicas de Coloración
Coloración de Gram
La tinción de Gram, descrita en 1.884 por Hans Christian Gram, se usa con mucha frecuencia para el
examen microscópico directo de muestras y subcultivos.
Fundamento: Aunque se han propuesto varias explicaciones sobre el fundamento de la coloración de Gram,
parece probable que las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares sea la causa de la distinta
reacción de las bacterias Gram positivas y Gram negativas a la coloración.
La pared de la célula grampositiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglucano
así como una pequeña cantidad de ácidos teicoicos. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula grampositiva
es peptidoglucano. La pared de la célula gramnegativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada,
únicamente de peptidoglucano y una membrana externa compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y
lipoproteínas. Sólo 10%-20% de la pared de la célula gramnegativa es peptidoglucano.
Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta
(otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este
estado, todas las células, tanto las grampositivas como las gramnegativas, quedarán teñidas de violeta.
El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente activo es
aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en
agua con el cristal violeta. De nuevo, tanto las células grampositivas como las gramnegativas, se encuentran en la
misma situación y aparecen de color violeta.
Una vez eliminado el exceso de mordiente a través del lavado con agua de chorro, se lleva a cabo la
decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta.
Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen.
La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración;
esta resistencia se debe probablemente al hecho que en el caso de las bacterias gramnegativas, la mezcla de alcohol/
acetona constituye un solvente lipídico y la solubilidad de los lípidos en el alcohol permite que el decolorante
extraiga el complejo cristal violeta–yodo del interior celular sin que la pared celular constituya una barrera
impermeable. La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el complejo cristal violeta-yodo, por tanto,
en ese momento, sale el cristal violeta del interior de la bacteria y la célula se decolora.
Las células grampositivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglucano
y menos lípidos), no son permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros,
disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el complejo cristal violeta-yodo quede atrapado
dentro de la pared celular; por lo que después de la decoloración permanecen de color violeta.
Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente
es un colorante de color rojo, como la safranina; aunque también puede usarse la fucsina básica, en algunas
modificaciones de la tinción original. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son de color
rojo-rosado; mientras que las grampositivas permanecen violetas (Lámina 1).
No obstante, ninguna composición química exclusiva de la pared bacteriana parece explicar la coloración
con Gram; ya que las gruesas paredes de las células de levaduras, que también se tiñen como grampositivas, tienen
una composición química y una estructura diferente de las bacterias grampositivas.
Colorantes de Gram (Modificación de Hucker)
1. Colorante primario: Cristal violeta Solución Madre
Cristal violeta (85%).....................................................................................20,00 g
Etanol (95%).............................................................................................100,00 ml
Solución Madre de Oxalato

Oxalato de Amonio.........................................................................................1,00 g
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Agua Destilada.........................................................................................100,00 ml
Solución de Trabajo: Diluir la solución madre de cristal violeta 1:10 con agua destilada y mezclar con 4
volúmenes de la solución madre de oxalato. Conservar en una botella con tapón de vidrio.
2. Mordiente: Solución de Iodo de Gram
Cristales de yodo............................................................................................1,00 g
Ioduro de Potasio............................................................................................2,00 g
Disolver completamente en 5 ml de agua destilada, luego agregar:

Agua destilada..........................................................................................240,00 ml
Bicarbonato de sodio, solución acuosa al 5%............................................60,00 ml
Mezclar y conservar en una botella de vidrio color ámbar.

3. Solución Decolorante: Alcohol–Acetona
Acetona.....................................................................................................250,00 ml
Etanol (95%).............................................................................................250,00 ml
Mezclar y conservar en una botella con tapón de vidrio.
4. Colorante de Contraste: Safranina
Safranina O.....................................................................................................2,50 g
Etanol (95%).............................................................................................100,00 ml
Solución de Trabajo:
Diluir la solución madre 1:5 ó 1:10 con agua destilada. Conservar en una botella con tapón de vidrio.
Técnica de la Coloración de Gram
Previamente, se debe elaborar un frotis y fíjar al calor. Colocar la lámina que contiene el extendido sobre
un soporte para coloración a fin de mantenerlo en posición horizontal. Proceder entonces a:
1. Cubrir la lámina con cristal violeta. Dejar actuar por un minuto. Lavar con agua corriente.
2. Cubrir la lámina con lugol. Dejar actuar por un minuto. Lavar con agua corriente.
3. Sobre la lámina, dejar correr el decolorante orgánico (alcohol-acetona) hasta que la solución de lavado no salga
teñida con el colorante violeta. Si lo prefiere, puede mantener la lámina sujeta entre el dedo pulgar e índice y
colocarla de manera que se obtenga un ángulo de 45º. Por lo general, el tiempo requerido para la decoloración
oscila entre 10-20 segundos. Lavar de nuevo con agua corriente.
4. Cubrir el frotis con una solución de safranina. Dejar actuar por 30 segundos. Lavar con agua corriente.
5. Colocar la lámina con el frotis en posición vertical para escurrir el exceso de agua y permitir que seque
espontáneamente al aire. En su defecto, se puede emplear papel secante, teniendo cuidado de no arrastrar la
preparación.
6. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación y observar al microscopio con objetivo de 100X
y ocular de 10X, lo cual resulta en un aumento total de 1.000X.
Interpretación
Esta coloración diferencial permite observar la morfología, disposición y afinidad tintorial de las células
bacterianas. Basados en la coloración de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grandes grupos: bacterias
Gram positivas, que se tiñen con el cristal violeta y aparecen de color violeta intenso y, Gram negativas, las que
se tiñen con la safranina y aparecen de color rojo-rosado (Láminas 2 a la 9).
Algunas bacterias no pueden clasificarse mediante la tinción de Gram; ya sea por su difícil tinción o
porque carecen de pared celular. Los micoplasmas carecen de pared celular y por lo tanto, no son susceptibles a
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la tinción por el procedimiento de Gram (no reactivas a la coloración). Por otra parte, las micobacterias son muy
difíciles de teñir porque sus envolturas celulares contienen grandes cantidades de ceras, por lo que requieren el
uso de otras coloraciones diferenciales como la de Ziehl-Neelsen, por ejemplo. Existen microorganismos que se
tiñen indiferentemente como Gram positivos o Gram negativos y son denominados Gram variables. Se cree que
son bacterias que han perdido la habilidad de reaccionar en forma diferencial a esta coloración. Esto generalmente
sucede en cultivos viejos (con más de 48 horas de incubación). Se asume que este fenómeno ocurre debido a
modificaciones en la pared celular provocadas por la edad del cultivo. En consecuencia, se recomienda que los
frotis sean elaborados a partir de cultivos de no más de 24 horas de incubación.
Forma de reportar:
1. Morfología:
 Bacilos
 Cocos
 Cocobacilos
2. Afinidad Tintorial:
 Gram positivos
 Gram negativos
3. Disposición: la agrupación o disposición de las células bacterianas depende de los planos en que ocurre
la división celular y la tendencia de las células hijas a permanecer unidas. En los cocos, constituye una
característica de importancia en la orientación de la identificación en el laboratorio. Pueden observarse las
siguientes disposiciones:
 Cocos aislados
 Cocos en pares
 Cocos en cadenas
 Cocos en tetradas (grupos de cuatro)
 Cocos en sarcinas (grupos de ocho)
 Cocos en racimos
Los bacilos se dividen solamente a través de su eje más corto, de forma que hay menos agrupamientos de
bacilos que de cocos. Pueden aparecer en pares o en cadenas tras la división. Ciertas especies bacterianas, como
Corynebacterium diphtheriae presentan una disposición característica en forma de empalizadas y letras chinas.
Algunos bacilos tienen el aspecto de cilindros, otros poseen extremos afilados (fusiformes) y algunos son curvos
(en forma de comas); sin embargo, la mayoría de los bacilos se presentan de forma aislada.
Limitaciones
La coloración de Gram no permite identificar específicamente ciertas estructuras bacterianas, tales como: la
cápsula, los flagelos, las esporas y los gránulos metacromáticos; así como tampoco proporciona buenos resultados
en la investigación de micobacterias y hongos, salvo en el caso de algunas especies de levaduras.
Estas limitaciones no son absolutas y como ya se ha demostrado, en ocasiones pueden observarse la
cápsula o las esporas (aunque no sean teñidas en forma específica). Por otra parte, las micobacterias, pueden ser
vistas como bacilos Gram positivos; pero se hace necesario realizar la coloración de Ziehl-Neelsen o de Kinyoun
para demostrar su carácter ácido-resistente.
Finalmente, es conveniente destacar que existen numerosas modificaciones de las fórmulas de las
soluciones utilizadas en la técnica de coloración e incluso, del tiempo empleado en cada uno de los pasos señalados.
Realmente, lo importante es el empleo de un procedimiento similar en cada laboratorio para evitar variaciones en
los resultados.
Elabore un frotis con cada uno de los microorganismos que le suministre su profesor. Fíjelos y coloréelos
según la técnica de Gram, obsérvelos al microscopio con objetivo de inmersión. Anote los resultados y elabore los
gráficos correspondientes.
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Coloración de Ziehl-Neelsen
Fundamento
Las paredes celulares de ciertos géneros bacterianos clínicamente importantes, como: Nocardia y
Mycobacterium que incluye el agente causal de la tuberculosis (M. tuberculosis) y la lepra (M. leprae) contienen
una elevada concentración de ceras en forma de ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos
de carbono). Esta gruesa capa de lípidos los provee de una cubierta casi impenetrable, que hace que la célula
sea difícil de colorear. Sin embargo, una vez teñidos con colorantes básicos, poseen la propiedad de resistir la
decoloración con ácidos minerales o alcohol ácido. Por este motivo, a estos microorganismos se les denomina
Bacilos Ácido Resistentes (BAR), un fenómeno descubierto por Ziehl y Neelsen en 1.882.
Es necesario un tratamiento especial para que el colorante primario, fucsina fenicada, atraviese el material
céreo de los bacilos ácido resistentes. En la técnica convencional de Ziehl-Neelsen se usa calor (coloración en
caliente). La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared
bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, se provoca una nueva solidificación
de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento
aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. El
decolorante consiste en una mezcla de alcohol y ácido, la cual es capaz de remover completamente el color rojo
de la fucsina de todos los organismos, excepto de los BAR. El empleo de una coloración de contraste con azul
de metileno tiñe de azul todo lo que no sea resistente al ácido; mientras que los BAR permanecen rojos (Lámina
10).
La modificación de Kinyoun se denomina “método en frío” porque utiliza un detergente activo de superficie,
como tergitol, en lugar de calor. Utiliza un decolorante más débil (0,5-1% de H2SO4) en lugar de alcohol-ácido al
3%. Esto ayuda a diferenciar entre organismos que son débiles o parcialmente ácido-resistentes, particularmente,
Nocardia sp., cualquiera de los dos métodos es satisfactorio.
La cubierta cérea de estas bacterias presenta además un problema adicional, y es que las células tienden a
adherirse unas a otras y formar agregados en los frotis, en vez de extenderse uniformemente.
Colorantes de Ziehl-Neelsen
1. Colorante primario: Fucsina fenicada de Ziehl
Solución I:
Fucsina Básica (Acetato de pararrosanilina)..................................................0,30 g
Etanol (95%)...............................................................................................10,00 ml
Disolver y agregar:
Solución II:
Fenol, cristales.................................................................................5,00 ml ó 5,00g
Agua destilada............................................................................................95,00 ml
Solución de Trabajo:
Mezclar las dos soluciones (I y II). Dejar en reposo por varios días antes de usar. Guardar en frasco ámbar.
Filtrar antes de usar.
2. Solución Decolorante: Alcohol-Ácido
Etanol (95%)...............................................................................................97,00 ml
HCl concentrado...........................................................................................3,00 ml
Mezclar y conservar en un frasco ámbar.
3. Colorante de Contraste: Azul de Metileno
Azul de metileno.............................................................................................0,30 g
Disolver el colorante en el agua. Guardar en frasco ámbar.
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Técnica
1. Elaborar un frotis a partir de un cultivo puro de M. tuberculosis. (Usar portaobjetos nuevos y libres de grasa).
2. Fijar el frotis, utilizando para ello, una plancha de calentamiento (60ºC) durante 10 minutos como mínimo; y
dos horas, como máximo.
3. Aplicar un papel de filtro sobre el portaobjetos con el frotis y colocar la lámina sobre un soporte de metal para
la coloración.
4. Cubrir la preparación con la fucsina fenicada (colorante primario), calentando a la llama de un mechero por
debajo de la lámina (durante 5 a 10 minutos) hasta obtener la emisión de vapor (3 veces). El calor actúa como
mordiente. Evite que la lámina se seque, agregando más colorante si es necesario.
5. Retirar el papel de filtro (con ayuda de una pinza) y lavar el portaobjetos con agua hasta que el colorante deje
de salir. Sacudir el exceso de líquido.
6. Cubrir el portaobjetos con solución decolorante (alcohol-ácido) durante 1 minuto aproximadamente. Comprobar
que no se desprende más color rojo al escurrir el portaobjetos. Decolorar hasta que apenas quede una traza de
color rosado.
7. Lavar con agua y eliminar el exceso.
8. Cubrir la lámina con el colorante de contraste (azul de metileno) y dejar en contacto por 1 ó 2 minutos.
9. Lavar con agua corriente. Escurrir y dejar secar al aire. No secar con papel absorbente.
10. Observar al microscopio óptico con objetivo de inmersión (100X).
Interpretación
Los microorganismos ácido-resistentes aparecerán de color rojo intenso; mientras que otros elementos
celulares y bacterias no ácido resistentes, se tiñen de azul con el colorante de contraste. Las micobacterias,
frecuentemente, aparecen como bacilos ligeramente curvos que muestran la propiedad de ácido-resistencia (BAR).
Pueden presentar gránulos más oscuros y dar la impresión de estar fragmentados (Lámina 11).
Coloree los frotis de M. tuberculosis que le han sido entregados y dibuje lo observado. (Debido a la
elevada patogenicidad de este microorganismo, los frotis, les serán suministrados ya fijados).
Coloración de Gránulos Metacromáticos (Azul de Metileno de Löeffler)
Los gránulos metacromáticos (volutina), son acúmulos intracitoplasmáticos, formados principalmente
por polifosfatos, que desempeñan un importante papel en el metabolismo bacteriano. Al parecer, los polifosfatos
proporcionan el fósforo y la energía requerida para la síntesis de los ácidos nucléicos.
La volutina tiene una notable afinidad por los colorantes básicos (azul de toluidina o azul de metileno), y con
frecuencia se presenta con un color distinto o más intenso que el del colorante aplicado. Por su capacidad de teñirse
metacromáticamente, se denominan gránulos metacromáticos.
Colorantes
Azul de Metileno de Löeffler
Azul de metileno...............................................................................................0,3 g
Etanol (95%)...............................................................................................30,00 ml
Una vez disuelto, agregar:
Agua destilada......................................................................................... 100,00 ml
Guardar bien tapado en frasco de vidrio.
Técnica
1. Elaborar un frotis de un cultivo de Corynebacterium diphtheriae en medio de Löeffler.
2. Dejar secar al aire. Fijar el frotis a la llama del mechero.
3. Cubrir la lámina con una solución alcohólica de azul de metileno. Dejar actuar por cinco (5) minutos.
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4. Lavar la preparación con agua corriente. Escurrir la lámina y dejar secar al aire.
5. Observar la preparación con objetivo de inmersión (100X).
Interpretación
Esta es una coloración simple en la que los gránulos metacromáticos aparecen de color azul intenso y el
resto de la bacteria de color azul claro (Lámina 12).
Coloración de Albert
Otra coloración que puede utilizarse para colorear gránulos metacromáticos es la coloración de Albert.
1. Solución I:
Azul de Toluidina O.........................................................................................1,5 g
Verder de malaquita o Verde de metilo.............................................................2,0 g
Etanol (95%).................................................................................................20,0 ml
Ácido Acético Glacial...................................................................................10,0 ml
Agua Destilada.......................................................................................... 970,0 ml
Disolver los colorantes en el alcohol y luego agregar el agua destilada conteniendo el ácido acético glacial.
Dejar madurar por 24 horas y luego filtrar. Guardar en frasco ámbar.
2. Solución II:
Yodo................................................................................................................6,66 g
Ioduro de Potasio............................................................................................10,0 g
Agua destilada........................................................................................ 1.000,0 ml
Disolver el yodo y el ioduro de potasio en el agua destilada.
Técnica
1. Preparar y fijar el frotis o extendido.
2. Cubrir el portaobjeto con el azul de toluidina-verde de metilo. Dejar actuar por 10 minutos.
3. Lavar con agua corriente. Escurrir.
4. Aplicar la solución II (Iodo). Dejar actuar por 5 minutos.
5. Lavar con agua corriente.
6. Secar con papel absorbente o dejar secar al aire.
7. Observar con objetivo de inmersión.
Interpretación
Esta es una coloración estructural que tiñe los gránulos metacromáticos de color azul oscuro y el citoplasma
bacteriano, de verde claro (Lámina 13).
A cada grupo le serán entregados frotis de un cultivo de C. diphtheriae. Coloréelos según la técnica de
Löeffler y de Albert y observe los gránulos metacromáticos. Registre sus resultados.
Coloración de Cápsula
La virulencia de los microorganismos patógenos, a menudo se correlaciona con la producción de cápsula.
Por ejemplo, las cepas virulentas de Streptococcus pneumoniae y Klebsiella sp. producen abundantes polímeros
capsulares que protegen a la bacteria de la fagocitosis. La pérdida, por mutación, de la capacidad de formar una
cápsula, se asocia con la pérdida de la virulencia y el aumento de la facilidad de destrucción por los fagocitos; pero
no afecta la viabilidad. Es decir, que las cápsulas son prescindibles, al igual que otros apéndices bacterianos.
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Las cápsulas son estructuras mucilaginosas extracelulares que rodean a algunas bacterias. Se cree que
todas las bacterias poseen más o menos un material capsular, fácilmente demostrable cuando son teñidas de forma
adecuada. La mayoría de las cápsulas están formadas por polisacáridos.
Las cápsulas son difíciles de colorear y además, son fácilmente destruidas o disueltas. Se utilizan dos
métodos para visualizarlas al microscopio de luz: Las coloraciones de Anthony o Hiss, que utilizan cristal violeta
o fucsina básica, para teñir la célula, y una sal de cobre que es depositada en la parte exterior de la cápsula. Otro
método consiste en el empleo de una coloración negativa, con la cual, las células quedan suspendidas en tinta
china o nigrosina, que va a teñir el medio que las rodea, pero no las células, dejándolas incoloras.
Coloración de Hiss
Colorantes de Hiss
1.-Cristal Violeta:
Cristal violeta..................................................................................................1,00 g
Disolver el cristal violeta en el agua destilada. Mezclar bien y conservar en frasco ámbar.
Alternativamente, puede utilizarse una solución acuosa de fucsina al 0,5%.
2.- Sulfato de Cobre (20 %):
CuSO4 5 H2O............................................................................................. 200,00 g
Disolver completamente el sulfato de cobre en el agua destilada. Conservar en frasco ámbar.
Técnica
1. Preparar una suspensión bacteriana en SSF, a partir de un cultivo puro de Klebsiella pneumoniae.
2. Preparar un extendido, mezclando una asada de la suspensión bacteriana con una gota de suero normal sobre
un portaobjetos limpio y libre de grasa. Dejar secar al aire y fijar por calor.
3. Cubrir el extendido con cristal violeta. Calentar hasta desprendimiento de vapores durante un minuto
aproximadamente.
4. Enjuagar con sulfato de cobre. Nunca con agua.
5. Escurrir la lámina y dejar secar al aire en posición vertical.
6. Examinar la preparación con objetivo de inmersión (100X).
Interpretación
Las cápsulas aparecerán como un área de color violeta claro alrededor de la célula bacteriana que toma un
color violeta intenso (Lámina 14).
Coloración de Hiss Modificada por Anthony
Esta coloración utiliza los mismos colorantes que la coloración de Hiss, sólo que la técnica ha sido
ligeramente modificada.
Colorantes de Anthony
1.-Cristal Violeta:
Cristal violeta..................................................................................................1,00 g
Disolver el cristal violeta en el agua destilada. Mezclar bien y conservar en frasco ámbar.
2.- Sulfato de Cobre (20 %):

CuSO4 5 H2O .............................................................................................200,00 g
Disolver completamente el sulfato de cobre en el agua destilada. Conservar en frasco ámbar.
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Técnica
1. Elaborar un extendido delgado en una lámina portaobjeto, a partir de un cultivo puro de Klebsiella pneumoniae
en leche descremada. Dejar secar al aire. No fijar con calor.
2. Cubrir la preparación con una solución acuosa de cristal violeta (1%). Dejar actuar por 2 minutos.
3. Lavar la preparación con una solución de sulfato de cobre al 20%.
4. Escurrir la lámina y dejar secar al aire en posición vertical.
5. Examinar la preparación con objetivo de inmersión (100X).
Interpretación
Las cápsulas aparecerán como un área de color violeta claro, alrededor de las bacterias que se tiñen
intensamente. Si se utiliza fucsina, las cápsulas aparecerán como un halo rosado claro alrededor de las bacterias
que se tiñen de color rojo intenso (Lámina 15).
Coloración Negativa o por Contraste
La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero
se colorea en cambio el medio que las rodea. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco
que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china
(que es una suspensión de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua).
La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero
su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.
Técnica
1. Colocar una pequeña gota de SSF sobre un portaobjetos limpio y agregar una cantidad muy pequeña de un
cultivo joven.
2. Mezclar bien y luego agregar una pequeña gota de tinta china y cubrir inmediatamente con un cubreobjetos
delgado dejando que la gota se extienda como una película fina debajo del mismo.
3. Examinar inmediatamente con objetivo de inmersión y bajando el condensador para reducir la luz en forma
marcada.
Interpretación
Las cápsulas se observan como halos claros contra un fondo oscuro (Lámina 16).
Elabore convenientemente, varios frotis de K. pneumoniae y aplique las técnicas de coloración para la
cápsula. Obsérvelos al microscopio y registre los resultados.
Coloración de Flagelos
Muchas bacterias móviles poseen flagelos, cuya forma, número y disposición son características importantes
para la diferenciación de especies, en particular, cuando las reacciones bioquímicas son débiles o equívocas.
La coloración de flagelos no es fácil, es un arte que debe desarrollarse con la experiencia. Los flagelos
son muy frágiles y tienden a desprenderse de la superficie bacteriana durante la manipulación. Muchas células en
cultivo pueden no producir flagelos y la tinción a veces, fracasa.
Coloración de Leifson
En los laboratorios clínicos es más común que se emplee la técnica de Tinción de Leifson (o una
modificación) y no es difícil de llevar a cabo, siempre y cuando se sigan los detalles exactos en cada paso del
procedimiento.
Fundamento
Los flagelos bacterianos pueden teñirse por medio de soluciones alcohólicas de colorantes de rosanilina
que forman un precipitado a medida que el alcohol se evapora en el procedimiento de tinción. La fucsina básica
(acetato de pararrosanilina) sirve como tinción primaria, con el agregado de ácido tánico a la solución como
mordiente. Puede usarse una contra-tinción, como azul de metileno, para visualizar mejor las bacterias; en casos
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en que la tinción primaria resulta débil.

Colorantes de Leifson
1. Solución A: Fucsina Básica al 1,2% en Alcohol al 95%.
Fucsina básica (certificada para tinción)........................................................6,00 g
Alcohol etílico (95%).................................................................................50,00 ml
Agregar a la fucsina, el alcohol y agitar 18–24 horas con un agitador magnético para disolver la fucsina.
2. Solución B: Ácido Tánico al 3% en solución acuosa
Cloruro de sodio.............................................................................................0,37 g
Ácido tánico....................................................................................................0,75 g
La suspensión debe tener color amarillo claro para ser satisfactoria. Se agrega fenol con una concentración
1:200 para evitar la aparición de mohos durante el almacenamiento.
Mezclar cuidadosamente las soluciones A y B. Ajustar el pH con NaOH 1,0 N. Envasar el colorante en un
frasco ámbar, bien tapado y dejar durante tres días en el refrigerador (4ºC) antes de usar, para estabilizar.
El colorante de Leifson puede conservarse durante un mes en refrigeración y un año o más en congelación.
A temperatura ambiente se deteriora rápidamente.
Para el proceso de tinción usar sólo el sobrenadante claro, no agitar el sedimento que se deposita en
el fondo de la botella. Antes de usar, retirar un pequeño volumen de la solución colorante y dejar que alcance
temperatura ambiente. Descartar la fracción de colorante que pueda sobrar luego de la tinción.
Técnica
1. Usando un cultivo joven en un medio de agar libre de carbohidratos, preparar una suspensión bacteriana
equivalente al tubo 5 del nefelómetro de McFarland. (Utilizar agua destilada o desionizada estéril).
2. Colocar dos gotas de la suspensión bacteriana en el extremo de un portaobjetos, previamente tratado con una
solución ácida. Se deja secar al aire. Con un lápiz graso, trazar una línea perpendicular en la superficie de vidrio
hacia el extremo opuesto a la suspensión seca.
3. Colocar el portaobjeto sobre una rejilla inclinada y cubrir la preparación con una delgada película del colorante.
La marca hecha con el lápiz graso, impide que el colorante se corra del extremo de la lámina.
4. Teñir durante 5 a 15 minutos, dejando que se forme un precipitado a medida que se evapora el alcohol. El
tiempo de coloración disminuye si el colorante es fresco, si la temperatura ambiente es alta, si hay corrientes
de aire en el laboratorio y si la capa de colorante es delgada. Las condiciones opuestas incrementan el tiempo
de tinción.
5. Cuando se forma un precipitado, enjuagar suavemente con agua destilada, escurrir el exceso de agua y se deja
secar al aire.
6. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Interpretación
Deben observarse flagelos de color rojo a azul-negro (Lámina 17a).
Nota: Los portaobjetos utilizados para esta coloración deben ser sumergidos en solución de HCl concentrado
(3%) en alcohol etílico (95%) durante 4 días. Lavar con agua corriente (dejar correr el agua sobre las láminas,
previamente colocadas en una jarra de Coplin durante 10 minutos) y luego, enjuagar con varios cambios de agua
destilada. Colocar los portaobjetos en posición vertical para que se sequen al aire. Inmediatamente antes de usarlos,
páselos por la llama del mechero.
Coloración de Ryu
Para la observación de los flagelos, también se aconseja el uso de la tinción de Ryu. que es fácil de llevar
a cabo y da buenos resultados.
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Colorantes de Ryu
Solución I:
Fenol al 5%.................................................................................................10,00 ml
Ácido tánico en polvo.....................................................................................2,00 g
Sulfato de potasio y aluminio saturado con 12 H2O...................................10,00 ml
Solución II:
Cristal violeta................................................................................................12,00 g
Alcohol etílico (95%)...............................................................................100,00 ml
Esta es una solución saturada. Se mezclan 10 partes de la solución I (mordiente) con una parte de la solu-
ción II y se almacena en un frasco plástico a temperatura ambiente.
Procedimiento:
1. Colocar dos gotas de SSF hacia un extremo de un portaobjetos escrupulosamente limpio.
2. Preparar el frotis tomando parte de un cultivo joven en un medio libre de carbohidratos (agar nutritivo), tocando
suavemente el centro de cada una de las dos gotas de SSF previamente colocadas. Dejar secar las gotas a
temperatura ambiente.
3. Cubrir los frotis ya secos con la solución colorante durante 1 a 5 minutos (pueden ser necesarias algunas pruebas
para determinar el tiempo que produce la mejor coloración de los flagelos). Quitar el exceso de colorante con
agua.
4. Una vez que los frotis se han secado, examinar con el objetivo de inmersión del microscopio óptico, comenzando
desde la periferia hacia el centro.
Interpretación
Las bacterias y sus flagelos se tiñen de color violeta (Lámina 17b).
A cada grupo le será entregado un cultivo bacteriano en agar nutritivo. Proceda a efectuar la coloración de
flagelos y registre sus resultados.
Coloración de Esporas
Dos géneros bacterianos, Clostridium y Bacillus se caracterizan por producir esporas. Estas constituyen
formas de resistencia más no son estructuras de reproducción como en los hongos.
Pueden tener una localización variable en la célula bacteriana y estar colocadas en el centro, en la parte
terminal o sub-terminal de la bacteria. Su contenido hídrico es sumamente bajo; por lo tanto, resisten condiciones
de deshidratación que destruyen a las células vegetativas. Contienen ácido dipicolínico y calcio, los cuales son, al
parecer, los responsables de la termo-resistencia de la espora.
Las esporas son impermeables a los colorantes, y así, pueden ser vistas ocasionalmente, como áreas
incoloras en preparaciones teñidas con Gram. Debido a la poca permeabilidad de la espora es necesario utilizar
colorantes muy concentrados; así como la aplicación de calor que facilite su penetración; pero una vez teñidas son
muy difíciles de decolorar, propiedad que se utiliza para poder demostrar su presencia.
Coloración de Wirtz-Conklin modificada por Shaeffler-Foulton
Colorantes
1. Verde de Malaquita
Verde de malaquita.......................................................................................10,00 g
Disolver el verde de malaquita en agua destilada.

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2. Safranina
Safranina.........................................................................................................0,25 g
Disolver la safranina en el agua destilada.

Técnica:
1. Colocar un frotis seco, sobre un soporte para coloración, someter a calentamiento sobre un vaso de precipitado
conteniendo agua hirviente (Alternativamente, puede colocarse la lámina sobre un soporte para coloración
y utilizar un mechero). Permitir que el agua de condensación forme gotas en el reverso de la lámina. (Es
importante no fijar el frotis antes, ya que el vapor facilita la penetración del colorante. La fijación de la espora
previa a la tinción, no permite la acción del vapor).
2. Colocar un papel de filtro sobre la lámina y cubrir con verde de malaquita.
3. Calentar hasta desprendimiento de vapores durante 45 minutos. Agregar más colorante para evitar que se seque
la preparación.
4. Dejar enfriar y lavar con agua corriente.
5. Colorear con safranina durante un minuto.
6. Lavar, dejar secar al aire y examinar con objetivo de inmersión.
Interpretación
Las esporas se observan de color verde (debido a su tinción con el verde de malaquita) y los bacilos, de
color rojo (debido a su tinción con safranina) (Lámina 18).
Coloración de Dorner (Modificada)
Colorantes de Dorner
1. Fucsina fenicada
Fucsina Básica..................................................................................................4,00 g
Etanol (95%).................................................................................................20,00 ml
Fenol, cristales fundidos.................................................................................5,00 ml
Agua destilada.............................................................................................100,00 ml
Disolver la fucsina básica en el alcohol y agregar lentamente el agua mientras se agita. Agregar el fenol a
la solución de fucsina.
2. Nigrosina
Nigrosina.......................................................................................................10,00 ml
Agua destilada.............................................................................................100,00 ml
Diluir la nigrosina para obtener una solución al 10%, calentar hasta ebullición y filtrar.
Técnica
1. En un tubo de ensayo que contiene SSF, preparar una suspensión concentrada del microorganismo y agregar un
volumen igual de fucsina fenicada recientemente filtrada.
2. Colocar el tubo en un baño con agua en ebullición durante 5-10 min.
3. Sobre un portaobjetos limpio, mezclar una gota de la suspensión anterior con una gota de solución de
nigrosina.
4. Extender y secar rápidamente con calor suave.
5. Examinar con objetivo de inmersión.
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Interpretación
Las esporas se tiñen de color rojo y las células bacterianas aparecen casi incoloras contra un fondo gris
oscuro.
Elabore un frotis de un microorganismo esporulado y coloréelo, según las técnicas descritas. Obsérvelos
al microscopio y registre sus observaciones.
1. Complete los siguientes enunciados:

a) Una suspensión bacteriana hecha sobre una lámina portaobjeto se denomina______________.
b) La coloración de Gram es un ejemplo de una coloración______________.
c) Las esporas usualmente aparecen_______________ en preparaciones coloreadas con Gram.
d) Las reacciones a la coloración de Gram son confiables sólo para cultivos de _________ horas o menos.
e) El paso más crítico en la tinción de Gram es _______________________.
f) La coloración de Ziehl Neelsen se utiliza para identificar___________.
2.¿Por qué un organismo Gram positivo puede aparecer como Gram negativo?.
3.¿Puede agregarse el lugol antes que el colorante primario en la coloración de Gram?¿Por qué?.
4.¿Por qué se utiliza sulfato de cobre para lavar durante la coloración de cápsula y no agua?.
5.¿Qué tipo de medio de cultivo debe utilizarse para incrementar el tamaño de la cápsula?.
6. ¿Qué importancia tienen los gránulos metacromáticos en la práctica clínica?
7. Señale las diferencias existentes entre las coloraciones para gránulos metacromáticos.
8.¿Por qué los medios donde crecen bacterias para realizar coloración de flagelos deben estar libres de
carbohidratos?.
9. ¿Qué utilidad tiene el ácido tánico en la coloración de flagelos?.
10.En la siguiente tabla, liste los pasos de la coloración de Gram, en orden, e indique el color de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas después de cada paso.
Apariencia
Paso Reactivo
Gram positiva Gram negativa
1
2
3
4
5
6
7
8
45
11.En la siguiente tabla, liste en orden, los cambios en los BAR y no BAR durante cada paso de la coloración de
Ziehl-Neelsen.
Apariencia
Paso Reactivo
BAR No BAR
1
2
3
4
5
6
7
12.Complete la siguiente tabla mostrando los cambios en bacterias esporuladas y no esporuladas en cada paso de
la coloración de Wirtz-Conklin (modificada por Schaeffler y Foulton).
Apariencia
Paso Químico
Esporas Células vegetativas
1
2
3
4
5
46
LAMINERO PRÁCTICA 2.1: COLORACIONES
LAMINERO PRÁCTICA 2.1: COLORACIONES
COLORACIÓN DE GRAM
Lámina 1: Etapas de la Coloración de Gram Lámina 2: Bacilos Gram positivos (Bacillus sp.)
Digitalización Digitalización
Lámina 3: Bacilos Gram positivos en empalizadas y letras Lámina 4: Bacilos Gram negativos (E. coli)
chinas (Corynebacterium sp) Digitalización
Digitalización
Lámina 5: Cocos Gram positivos en racimos (S. aureus) Lámina 6: Cocos Gram positivos en cadenas (S. pyogenes)
49
Lámina 7: Cocos Gram positivos en cadenas (Enterococcus) Lámina 8: Cocos Gram positivos en pares y cadenas cortas
Digitalización (S. pneumoniae)
Digitalización
Lámina 9: Cocos Gram negativos en pares (Neisseria sp.)

Digitalización
COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
Lámina 10: Etapas de la Coloración de Ziehl-Neelsen Lámina 11: BAR en frotis directo de esputo
50
COLORACIONES ESTRUCTURALES
Lámina 12: Coloración de Gránulos Metacromáticos Lámina 13: Coloración de Gránulos Metacromáticos
(Azul de Metileno de Löeffler) (Albert)
Lámina 14: Coloración de Cápsula (Hiss) Lámina 15: Coloración de Cápsula (Anthony)
Lámina 16: Cápsula: Tinción Negativa con Tinta China Lámina 17a: Coloración de Flagelos (Leifson)
Digitalización Fuente: Mellies J, 2008
Lámina 17b: Coloración de Flagelos (Ryu ) Lámina 18: Coloración de Espora (Wirtz-Conklin modificada por
Fuente: Mellies J, 2008 Schaeffler-Foulton))
Digitalización
51
UNIDAD III
NUTRICIÓN Y CRECIMIENTO BACTERIANO
Objetivos Terminales
 Practicar las técnicas asépticas de siembra o inoculación de bacterias en el laboratorio.

 Reconocer la morfología colonial bacteriana en diferentes medios de cultivo.
 Analizar la influencia de las condiciones físico-químicas sobre el crecimiento bacteriano.
 Cuantificar el crecimiento bacteriano utilizando diferentes métodos.
TÉCNICAS DE SIEMBRA Y MORFOLOGÍA COLONIAL
1. Realizar las técnicas de inoculación en diferentes medios de cultivo.
2. Ejecutar adecuadamente las diferentes técnicas de aislamiento de colonias en medios de cultivo.
3. Reconocer las características macroscópicas de las colonias bacterianas en medios de cultivo enriquecidos.
4. Relacionar la morfología colonial bacteriana en medios diferenciales y selectivos con la actividad metabólica
del microorganismo.
Técnicas de siembra o inoculación

En Bacteriología, se entiende por Siembra o Inoculación, al acto de colocar la muestra que se va a investigar
en medios de cultivo apropiados, para favorecer el crecimiento de las bacterias existentes en la misma.
Es importante la práctica de técnicas asépticas que permitan la transferencia e inoculación de las muestras a
los medios de cultivo, sin que se produzca contaminación de los cultivos por microorganismos no deseados.
El equipo necesario para la inoculación primaria de muestras es relativamente simple: a) asa bacteriológica
(en aro o en punta), b) hisopos o varillas de vidrio, c) pipetas Pasteur o serológicas y d) medios de cultivo en tubos
o en placas.
Las técnicas para efectuar una siembra varían según se trate de medios sólidos, líquidos o semisólidos.
1) Inoculación de medios líquidos
Para la transferencia e inoculación aséptica del material se procede de la siguiente forma:
a) Se esteriliza el asa de inoculación a la llama directa del mechero hasta que el alambre quede al rojo vivo y se
deja enfriar en la zona estéril alrededor del mechero.
Figura 8: Esterilización del asa previa a la siembra

b) Con una mano tome el tubo con crecimiento microbiano y destápelo, sostenga el tapón entre los dedos meñique
y anular y la palma de su otra mano.
c) Flamee o pase ligeramente la boca del tubo por la llama del mechero.
Figura 9: Destapado del tubo y flameado de la boca del mismo

55
d) Introduzca el asa y tome el inóculo.
Figura 10: Toma del inóculo con el asa bacteriológica

e) Flamee de nuevo la boca del tubo y tápelo.
Figura 11: Flameado de la boca del tubo antes de cerrarlo

f) Los medios líquidos en tubo se inoculan introduciendo el asa bacteriológica en forma perpendicular en el tubo
y haciendo un ligero movimiento de vaivén en el líquido. Se debe flamear la boca del tubo antes y después de
inocular el medio.
Figura 12: Inoculación de un medio en caldo

g) Una vez inoculado el medio, el asa debe esterilizarse nuevamente.

Si la siembra es a partir de crecimiento en una placa de agar se toma el inóculo tocando una colonia aislada y
se sigue el procedimiento según se indica en los puntos f y g.
Si la siembra es de un medio líquido a otro, también puede hacerse “boca a boca” directamente de tubo a tubo;
o bien, utilizando pipetas Pasteur o pipetas serológicas.
2) Inoculación en medios sólidos y semi-sólidos en tubo: repita los procedimientos de la “a” hasta la “e”.
 Medios en taco:
Los medios semisólidos, como el agar movilidad, se siembran por punción del taco con un asa en punta,
sin llegar al fondo. La inoculación debe realizarse en el centro del medio de cultivo. Es importante que el alambre
de inoculación sea retirado a lo largo de la misma trayectoria que se usó para atravesar inicialmente el medio. Un
movimiento en abanico puede dar como resultado un patrón de crecimiento a lo largo de la línea de inoculación
56
que puede interpretarse erróneamente como movilidad bacteriana.
Figura 13: Inoculación de agar semi-sólido en taco

 Medios en taco y bisel:
Como por ejemplo, el triple azúcar hierro (TSI), se inoculan por punción del taco y rayado del bisel. La
inoculación de un plano inclinado o bisel, se hace con un asa de inoculación en punta. Primero, se atraviesa el agar
con el alambre hasta el fondo del tubo y luego, éste se retira con un movimiento en “S” ó zig-zag a través del agar
en el bisel para diseminar el inóculo. Alternativamente, puede rayarse primero el bisel y luego, punzar el taco.
En ocasiones, se inocula sólo el bisel o plano inclinado, sin punzar el taco. Este es el caso del Agar
Nutritivo (AN) y ciertos medios para pruebas bioquímicas que se estudiarán posteriormente, como el agar úrea,
agar fenilalanina y el agar citrato, entre otros.
Una vez inoculado el medio se debe esterilizar nuevamente el asa.
Figura 14: Inoculación de medios en taco y bisel Figura 15: Inoculación de medios en bisel
Fuente: Koneman E, 1997 Fuente: Johnson T, Case J. 2001
3) Inoculación de medios en placa

El inóculo primario puede colocarse con asa (en aro), hisopo o pipeta. Una vez colocado dicho inóculo, con
el asa se disemina el material en la placa, haciendo estrías con un movimiento en zig-zag sobre la superficie de la
placa. Evite hablar mientras efectúa la siembra, pues puede contaminar los cultivos.
Nota: Si la muestra a inocular es líquida puede utilizarse una pipeta para colocar el inóculo primario y luego se
disemina el material con el asa.
Figura 16: Inoculación de medios sólidos en placa

Fuente: Koneman E, 1997
Técnicas de Aislamiento de Colonias en Medios Sólidos

En los medios de cultivo sólidos (en placas), los microorganismos de una misma especie pueden ser separados
en pequeñas agrupaciones macroscópicas, llamadas Colonias.
Para aislar colonias en los medios sólidos pueden utilizarse varios métodos:
 Aislamiento por vaciado
 Aislamiento por extensión
 Aislamiento por agotamiento
57
1) Aislamiento por vaciado

Este método consiste en inocular una muestra líquida o un homogeneizado sobre el agar cuando todavía se
encuentra líquido (45ºC), y luego se vacía sobre la placa de Petri estéril. En su defecto, puede colocarse el inóculo
en una placa de Petri estéril y verter el agar, todavía líquido sobre el inóculo. Mezclar para distribuir uniformemente.
De esta forma, se obtienen colonias a través del medio y sobre la superficie.
2) Aislamiento por extensión
Este método consiste en inocular una muestra líquida o un homogeneizado sobre la superficie del agar y luego
se distribuye uniformemente, con la ayuda de una varilla en forma de “L”, con la finalidad de obtener colonias
aisladas sobre la superficie del medio de cultivo. La técnica será descrita con más detalles en la actividad práctica
de medición del crecimiento bacteriano.
Esta técnica se utiliza para el recuento de colonias a partir de muestras de agua y alimentos. También se
aplica para la cuantificación de bacterias en muestras de orina y será utilizada en la práctica de genética bacteriana
(Unidad V).
3) Aislamiento por agotamiento
Consiste en sembrar los microorganismos por rayado sobre un medio sólido, partiendo de inóculos
concentrados de bacterias con el objeto de obtener colonias aisladas.
Técnica
1. Seleccione de una placa o tubo, la porción del crecimiento bacteriano que desea agotar y tome con un asa en
aro, preferiblemente, el inóculo.
2. La placa se inocula en cuatro cuadrantes. Raye el primer cuadrante haciendo tantas estrías como sea posible.
3. Esterilice el asa y déjela enfriar, gire la placa hacia el segundo cuadrante, estríe tocando una pequeña área del
sector inoculado anteriormente.
4. Esterilice el asa y déjela enfriar, gire la placa hacia el tercer cuadrante, estríe tocando una pequeña área del
segundo sector.
5. Esterilice nuevamente el asa y deje enfriar, gire hacia el cuarto cuadrante, raye tocando una pequeña porción
del tercer sector inoculado, luego estríe el área remanente de la superficie del agar teniendo cuidado de no hacer
contacto con las partes ya inoculadas.
6. Después de incubar las placas a una temperatura, atmósfera y tiempo adecuados, en el último cuadrante inocu-
lado aparecerán colonias aisladas.
Figura 17a: Aislamiento de Colonias por Agotamiento Figura 17b: Aislamiento de Colonias por Agotamiento
Fuente: Steve A, 2001 Fuente: Digitalización
A cada grupo se le entregará una variedad de medios de cultivo. Practique las diferentes técnicas de
siembra explicadas anteriormente, utilizando para ello los cultivos que le serán suministrados. En caso de duda,
consulte a su asesor.
58
Morfología Colonial
La observación de las características macroscópicas de las colonias bacterianas, habitualmente se lleva a cabo
por medio de la inspección visual del crecimiento en la superficie de placas de agar. Para ello, se sostiene la placa
en una mano y se observa la superficie del agar en busca de crecimiento bacteriano.
Cada placa debe estudiarse con cuidado porque las bacterias inicialmente recuperadas de muestras, a menudo
crecen produciendo cultivos mixtos; por lo tanto, pueden observarse tipos variados de colonias. En ocasiones,
colonias puntiformes de bacterias que crecen lentamente pueden pasar inadvertidas entre colonias más grandes, en
particular, si el crecimiento tiene tendencia a diseminarse sobre la superficie de la placa.
Durante la observación, las placas deben inclinarse en diversas direcciones, con una iluminación directa y
brillante, de modo que la luz se refleje desde varios ángulos. Es aconsejable el uso de una lupa para detectar las
colonias diminutas y observar mejor sus características.
En medios enriquecidos como Agar Sangre (AS) y Gelosa Chocolate (GC) se pueden visualizar características
de las colonias que son útiles para una identificación bacteriana preliminar, tales como:
Fusiforme
Figura 18: Morfología Colonial en Medios Enriquecidos

Fuente: Steve A, 2001 modificado por Castellano M, 2011
En medios selectivos y diferenciales como Mac Conkey (MC), Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD),

Salmonella-Shigella agar (SSA) y Agar Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sucrosa (TCBS); más que las características antes
mencionadas, se deben observar propiedades metabólicas útiles para la identificación bacteriana (fermentación de
carbohidratos, decarboxilación de aminoácidos, entre otras).
Las características de las colonias bacterianas en medios de cultivo enriquecidos, selectivos y diferenciales se
observan en el laminero de la presente actividad práctica (Láminas 19-28)
59
A cada grupo de estudiantes se le suministrará una serie de medios de cultivo en placas que contienen
diferentes microorganismos. Examine las características de las colonias en los diferentes medios de cultivo y
registre los resultados.
1. ¿Por qué es importante utilizar técnicas asépticas para la inoculación de medios de cultivo?
2. ¿Cuál es el propósito de esterilizar el asa antes y después de su uso?
3. ¿Señale la importancia de enfriar el asa antes de tocar un cultivo?
4. ¿Qué es un cultivo puro?
5. ¿Cómo puede determinarse si una colonia es un contaminante en una placa rayada?
6. ¿Cómo puede determinarse en el laboratorio si un cultivo bacteriano es puro o mixto?.
7. Indique 5 características útiles para la descripción de las colonias bacterianas en medios enriquecidos.
8. ¿Qué utilidad tiene la observación de la morfología de las colonias bacterianas en medios sólidos?
a) El término utilizado cuando un cultivo se coloca a una temperatura específica por un tiempo determinado
es________________.
b) Una masa de células creciendo en la superficie de un agar se denomina________________.
c) Un __________ es un microorganismo no deseado en un cultivo puro.
d) Cuando se desea obtener colonias aisladas se inocula un medio________________________
60
Laminero Práctica 3.1: Morfologia Colonial Bacteriana
en Medios Enriquecidos, Selectivos y Diferenciales
LAMINERO : PRÁCTICA 3.1: MORFOLOGIA COLONIAL
BACTERIANA EN MEDIOS ENRIQUECIDOS, SELECTIVOS Y
DIFERENCIALES
Lámina 19: Colonias de S. aureus en AS Lámina 20: Colonias de S. agalactiae en AS

Colonias grandes (4-6 mm de diámetro), lisas, de bordes Colonias puntiformes (< 0,5 mm de diámetro), de bordes regulares,
regulares, convexas, pigmentadas, consistencia cremosas, β- convexas, no pigmentadas, grises o ligeramente blanquecinas,
hemolíticas. brillantes, β-hemolíticas.
Lámina 21: Colonias de Bacillus spp. en AS Lámina 22: Colonias de S. pneumoniae. en AS

Colonias grandes, secas, planas, de bordes irregulares, con aspecto Colonias pequeñas, translúcidas, de bordes regulares, lisas, α-
de vidrio esmerilado, opacas, pueden o no ser hemolíticas. hemolíticas, umbilicadas.
Lámina 23: Colonias de K. pneumoniae. en AS Lámina 24: Colonias de Enterococcus spp. en AS

Colonias grandes, grises, elevadas, de bordes regulares, brillantes, Colonias medianas, de color blanco grisáceo, de bordes
lisas, mucosas. regulares, lisas, no hemolíticas, no pigmentadas, elevadas.
63
Lámina 25: Colonias Fermentadoras de lactosa (CFL) en MC Lámina 26: Colonias No Fermentadoras de lactosa (CNFL)
Digitalización en MC
Digitalización
Lámina 27: Colonias No Fermentadoras de lactosa (CNFL) Lámina 28: Colonias No Fermentadoras de lactosa (CNFL)
H2S Positivas en SSA H2S Negativas en SSA
Lámina 29 : Colonias Fermentadoras de lactosa (CFL) H2S Lámina 30: Colonias Fermentadoras de lactosa (CFL) H2S
Positivas en SSA negativas en SSA
Lámina 31: Colonias amarillas H2S Positivas en XLD Lámina 32: Colonias amarillas H2S Negativas en XLD
64
Lámina 33: Colonias rojas H2S Positivas en XLD Lámina

Lámina34: Colonias rojas H22S
34:Colonias S Negativas
Negativasenen XLD
XLD
Digitalización
Lámina 35: Colonias Fermentadoras de Sucrosa (CFS) Lámina 36: Colonias No Fermentadoras de Sucrosa (CNFS)
en TCBS en TCBS Digitalización
Digitalización
65
FACTORES FÍSICOS QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO BACTERIANO
Objetivo Específico:
1. Demostrar la influencia que ejercen diversos factores físicos y químicos sobre el crecimiento bacteriano.
Factores Físicos
Los procariotas son microorganismos extremadamente adaptables, pueden sobrevivir en casi todos los
ambientes naturales y son capaces de crecer bajo amplios rangos de condiciones físicas, tales como: tensión de
oxígeno, concentración de hidrogeniones (pH) y temperatura.
Los factores ambientales que pueden influir sobre el crecimiento de las bacterias se dividen en físicos y
químicos. Los factores físicos ejercen su influencia sobre la composición química de la célula y el medio ambiente.
Así, la temperatura, la presión y la radiación se considerarán claramente como físicos; mientras que los antisépticos
y desinfectantes son agentes químicos. No obstante, la presión osmótica puede ser considerada como factor físico
o como fisico-químico; pero, en cualquier caso, no puede ser relegado de los efectos químicos debido a que
interviene en los niveles de concentración iónica.
Así como las bacterias varían ampliamente en sus requerimientos nutricionales, también muestran respuestas
diversas a las condiciones físico-químicas del medio. Estas condiciones incluyen: temperatura, concentración de
hidrogeniones (pH), potencial de oxido-reducción, tensión de oxígeno y presión osmótica, entre otras.
1. Temperatura
Las bacterias se dividen en tres grupos, teniendo como base su temperatura óptima de crecimiento:
a) Psicrófilas o criófilas: crecen en un rango de temperatura que va de 5°C a 30°C, con una temperatura
óptima de crecimiento de 10 a 20ºC.
b) Mesófilas: crecen en un rango de 10 a 45ºC, con una temperatura óptima de 20 a 40ºC.
c) Termófilas: crecen en un rango de 25 a 80ºC, con una temperatura óptima de 50 a 60ºC.
Las bacterias patógenas para el hombre crecen, generalmente, entre 35-37ºC; es decir, a temperaturas similares
a la corporal (mesófilas).
Es conveniente resaltar que algunas especies bacterianas no muestran las mismas características fenotípicas,
cuando se desarrollan a diferentes temperaturas. Por ejemplo, algunas bacterias producen un pigmento característico
a bajas temperaturas; pero no lo producen o lo hacen en muy poca cantidad a altas temperaturas. Tal es el caso de
Serratia marcescens que produce un pigmento rojo a 25ºC; más no a 35ºC.
a) Para verificar el efecto de la temperatura sobre el crecimiento de las bacterias, a cada grupo de trabajo le será
entregada una cepa bacteriana. Esta bacteria se inoculará en tres caldos soya tripticasa (CST), los cuales serán
incubados a diferentes temperaturas: 25ºC, 35ºC y 42ºC. Incube los caldos por 24 horas en condiciones de
microaerofilia y observe el crecimiento. Registre e interprete los resultados obtenidos.
b) Para poner en evidencia el efecto de la temperatura sobre la expresión de ciertas características fenotípicas de
las bacterias, se entregarán a cada grupo dos placas de AN. Cada una de estas placas será inoculada con una
misma cepa bacteriana para luego ser incubadas, una a temperatura ambiente (25ºC) y la otra a 35ºC (en estufa),
por 24 horas. Transcurrido este tiempo proceda a leer la prueba e interpretar los resultados.
2. Concentración de hidrogeniones (pH)
La mayoría de las bacterias crecen bien a pH entre 6,0 y 9,0, tolerando cambios de pH de hasta 3 unidades;
pero, todo cambio superior a una unidad, afecta el crecimiento; sin embargo, existe un pH óptimo de crecimiento
bacteriano.
67
Las bacterias pueden ser clasificadas como: acidófilas, alcalófilas o basófilas y neutrófilas. Las bacterias
acidófilas crecen en un rango de pH entre 0 y 5,4. Las neutrófilas crecen a un rango de pH entre 5,4 y 8,5. A este
grupo pertenecen la mayoría de las bacterias que causan enfermedad en el hombre. Las bacterias alcalófilas, crecen
en un rango de pH entre 7,0 y 11,5.
Para determinar el efecto del pH sobre el crecimiento de los microorganismos, a cada grupo le serán
suministradas placas de Agar Nutritivo (AN), cuyos pH han sido ajustados a 3, 5, 7 y 9. Proceda a dividir el fondo
de la placa en cuatro (4) cuadrantes e inocule en cada sector, con una suspensión estandarizada preparada con
cada uno de los cuatro microorganismos a probar. Incube las placas a 35ºC por 24 horas, en aerobiosis. Observe el
crecimiento, registre e interprete los resultados.
Preparación de la suspensión estandarizada
A partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba, con la ayuda de un asa o un hisopo estéril,
resuspender una pequeña porción del crecimiento en 5 ml de SSF estéril y preparar una suspensión cuya turbidez
sea comparable con el estándar 0,5 de McFarland que contiene aproximadamente 1,5 x 108 UFC (Unidades
Formadoras de Colonias)/ml (Ajustar la turbidez si es necesario, utilizando para ello, SSF estéril).
3. Tensión de oxigeno y potencial de óxido-reducción
El oxígeno es un componente universal de las células y casi siempre es suministrado por el agua en gran
cantidad. El requerimiento de oxígeno de una bacteria en particular, refleja el mecanismo empleado para satisfacer
sus necesidades energéticas. Basándose en los requerimientos de oxígeno, las bacterias pueden dividirse en cinco
grupos:
a) Aerobios estrictos (obligados): requieren del oxígeno para crecer. Su metabolismo es siempre aeróbico
(respiración aeróbica). Ej: Pseudomonas aeruginosa.
b) Anaerobios estrictos (obligados): crecen solo bajo condiciones de alta intensidad reductora; el oxígeno es
tóxico para estas bacterias. Su metabolismo es de tipo anaerobio (fermentación o respiración anaeróbica).
Ej: Clostridium tetani.
c) Anaerobios facultativos (aerobios facultativos): son capaces de crecer, en presencia o ausencia de oxígeno.
En anaerobiosis, utilizan la fermentación o la respiración anaeróbica; pero en presencia de oxígeno, cambian
a respiración aeróbica. Ej: Escherichia coli.
d) Anaerobios aerotolerantes: son aquellos anaerobios que no mueren por exposición al oxígeno, pero su
metabolismo es siempre fermentativo. Ej: bacterias ácido lácticas.
e) Microaerofílicos: crecen en presencia de bajas concentraciones de oxígeno libre, y son inhibidas por altas
tensiones de este gas. Ej: Campylobacter sp.
Las bacterias anaerobias estrictas, sólo se podrán desarrollar si se toman precauciones especiales para
expulsar todo el oxígeno atmosférico del medio. Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por cualquiera de
los siguientes métodos:
a) Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, por ejemplo, tioglicolato de sodio o cisteína, para
disminuir el contenido de oxígeno.
b) Eliminando el oxígeno de los envases cerrados que contienen el medio de cultivo por procedimientos
mecánicos, el aire se expulsa por bombeo y se reemplaza con nitrógeno, helio o una mezcla de nitrógeno y
dióxido de carbono.
c) Mediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio de cultivo inoculado, para combinar
el oxígeno libre con otro compuesto; esto puede conseguirse con el empleo de la Campana de Gaspak, en
cuyo interior se crea un ambiente de anaerobiosis a través de un sobre de Gaspak (BBL)® que contiene en
su interior dos pastillas: a) Borohidrato de sodio y b) Bicarbonato de Sodio y Ácido Cítrico. La campana está
provista en su tapa de Palladium, el cual actúa como catalizador de la reacción. A este sobre, se le añaden 10
ml de agua para que libere hidrógeno que se combina con el oxígeno presente en el medio dando origen a la
formación de gotitas de agua en la campana de Gaspak.
2 H2 + O2 2 H2O
68
Se recomienda el empleo de indicadores, tales como el azul de metileno, que en presencia de oxígeno se
muestra de color azul y, en condiciones de anaerobiosis, es incoloro.
Existe otro sistema para crear una atmósfera de anaerobiosis, el Anaerocult® A (Merck) que contiene
componentes que fijan químicamente en forma completa el oxígeno dentro de breve tiempo y producen un medio
exento de O2 (anaerobio). Las almohadillas contienen tierra silícea, hierro en polvo, ácido cítrico y carbonato
sódico. Para su empleo deben añadirse uniformemente 35 ml de agua, dentro de 15-20 segundos, sobre el papel
especial de Anaerocult®; teniendo la precaución de mantener la almohadilla en posición horizontal. Inmediatamente
después, introducir la almohadilla humedecida en la campana de anaerobiosis, de manera que la página impresa
esté dirigida hacia las placas. Humedecer una tira de Anaerotest® con una gota de agua y fijarla en la campana, la
zona reactiva de la tira indicadora debe quedar colgando libremente en el aire. Cerrar inmediatamente la campana.
La condición de anaerobiosis es indicada por el viraje de color de la tira de anaerotest® de azul a blanco tras
aproximadamente 4 horas.
d) Si se trata de medios líquidos puede crearse un ambiente anaeróbico cubriéndolos con vaselina, parafina o
aceite mineral estéril.
Para el crecimiento de las bacterias microaerofílicas se requiere el empleo de ambientes con una
concentración ente 5 y 10% CO2. Para esto, se colocan los medios inoculados en una jarra o campana en cuyo
interior se enciende una vela blanca. Se tapa la campana y se espera a que la vela se apague. Cuando esto sucede
se ha creado un ambiente microaerofílico en el interior de la campana (método de la vela). Este ambiente también
puede generarse por métodos mecánicos (evacuación-reposicion) o por métodos químicos, a través del uso de
sobres generadores de ambientes microaerofílicos disponibles comercialmente, como el GenBag® (BioMérieux),
por ejemplo.
El potencial de óxido reducción (Eh) es un factor crítico para determinar si habrá o no crecimiento de un
inóculo bacteriano cuando éste sea transferido a un medio fresco. Es una medida cuantitativa de la capacidad del
sistema de aceptar o ceder electrones en forma reversible, con referencia al electrodo de hidrógeno estándar. Un
potencial más positivo que otro, tiene mayor tendencia a aceptar electrones; es decir, es un agente oxidante más
fuerte. Para la mayoría de los medios en contacto con el aire a pH 7,0; el Eh es aproximadamente + 0,2 a + 0,4 v
(+ 200 a + 400 mv).
Según el grupo de bacterias se tienen los siguientes Eh:
a) Aerobios estrictos: + 300 mv a - 50 mv.
b) Anaerobios facultativos: + 300 mv a - 420 mv.
c) Anaerobios aerotolerantes: + 180 mv a - 350 mv.
d) Anaerobios estrictos: - 150 mv a - 420 mv.
a) A fin de verificar el efecto de la tensión de oxígeno y el potencial redox sobre el crecimiento bacteriano proceda
a inocular dos placas: una de Agar Sangre Humana (ASH) y otra de Agar Sangre Anaerobiosis (ASA) con los
tres microorganismos a probar. (Divida cada placa en tres partes iguales). Incube la placa de ASH en aerobiosis
y la de ASA en condiciones de anaerobiosis, por 24 horas a 35ºC. Transcurrido el tiempo de incubación,
proceda a observar el crecimiento de los microorganismos y clasifíquelos de acuerdo a sus requerimientos de
oxígeno. Un microorganismo aerobio estricto crecerá solamente en la placa de ASH incubada en presencia
de oxígeno; un microorganismo anaerobio estricto, crecerá sólo en la placa incubada anaeróbicamente y uno
anaerobio facultativo, crecerá en ambas placas por igual.
El efecto de la tensión de oxígeno también puede verificarse en medios líquidos. A este fin, proceda a inocular un
caldo tioglicolato con cada uno de los microorganismos utilizados en la parte “A”. Incube los tubos herméticamente
cerrados, en la estufa a 37°C por 24 horas. Un microorganismo anaerobio estricto crecerá sólo en el fondo del
caldo; un aerobio estricto lo hará solamente en la parte superior y un anaerobio facultativo, crecerá por igual a todo
lo largo de la columna del caldo.
Observe el crecimiento de los microorganismos en los diferentes medios de cultivo, anote los resultados y
clasifique los microorganismos convenientemente.
69
b) Para verificar la influencia de la tensión de oxígeno sobre el crecimiento de los microorganismos microaerofílicos
proceda de la siguiente manera: inocule dos placas de GC con la cepa bacteriana a probar. Incube a 37ºC por
24 horas, una placa en condiciones de aerobiosis y la otra, en ambiente microaerofílico por el método de la
vela (5-10% CO2). Observe el crecimiento obtenido e interprete los resultados.
4. Presión osmótica
Ósmosis es la difusión de un solvente a través de una membrana semipermeable que separa dos
soluciones de diferentes concentraciones. Al término de la difusión, la concentración es igual en ambos lados de
la membrana. Por ejemplo, si una célula bacteriana está suspendida en una solución que contenga 20% de NaCl
(medio hipertónico), el agua pasará a través de la membrana celular (que es semipermeable) de la región de menor
concentración de sustancias disueltas (el interior de la célula) a la solución que rodea la célula y, como resultado
la célula se deshidratará. A este fenómeno se le denomina Plasmólisis.
Si la situación se invierte y las bacterias se colocan en una solución con una concentración menor del 1%
(medio hipotónico), la corriente se invertirá, y el agua pasará de la solución al interior de la célula, se produce una
gran presión osmótica por la cantidad de agua acumulada en el interior. Esto se conoce como Plasmoptisis.
Las bacterias poseen paredes muy rígidas y, generalmente, no presentan cambios aparentes de tamaño o
forma cuando ocurre plasmólisis o plasmoptisis. Algunas bacterias se han adaptado muy bien a elevadas presiones
osmóticas y son capaces de crecer en un medio de alta concentración salina; incluso, algunos necesitan grandes
cantidades de sal o azúcar para desarrollarse. Tales organismos se denominan Osmófilos, cuando son capaces de
desarrollarse en medios con alta concentración de azúcar o Halofílicos, cuando requieren grandes cantidades de
sal para su desarrollo.
Existe otro grupo de bacterias capaces de crecer a concentraciones moderadas e incluso en ausencia de
NaCl, las Halotolerantes.
Para determinar el efecto de la presión osmótica y la concentración de sal sobre el crecimiento de las bacterias,
se procederá de la siguiente manera:
a) A cada grupo se le hará entrega de 5 placas de AN con diferentes concentraciones de sucrosa: 0; 5; 15; 30 y 60%,
respectivamente. Divida cada placa en cuatro cuadrantes e inocule en cada uno, una suspensión previamente
estandarizada; preparada con cada uno de los microorganismos de prueba. Incube las placas a 37ºC por 24
horas. Lea e interprete los resultados obtenidos.
b) Proceda de manera semejante a inocular 4 placas de AN con diferentes concentraciones de NaCl (0; 0,5; 5; 15
y 25%, respectivamente). Incube de la misma manera. Lea e interprete los resultados obtenidos.
En ambos casos, interprete el comportamiento del microorganismo según la presión osmótica. Reporte el
grado del crecimiento bacteriano de la siguiente forma: ausente, escaso, moderado, abundante.
1. Compare una bacteria aerotolerante y una anaerobia estricta en términos de su capacidad para crecer en presencia
de O2.
2. ¿En qué se diferencia un microorganismo anaerobio aerotolerante de un microaerofílico?.
3. ¿Por qué las bacterias que infectan al hombre corresponden al grupo de los mesófilos?.
4. ¿Cómo se puede lograr un ambiente anaerobio y uno microaerofílico utilizando métodos químicos?.
5. Explique el fenómeno que sucede cuando las bacterias se colocan en un medio hipotónico.
6. Indique tres factores físicos que pueden influir en las características de crecimiento de una bacteria en un medio
que contiene agar.
70
1. Las bacterias que crecen en el fondo de un caldo tioglicolato son referidas como______________.
2. Las bacterias____________ crecen a temperaturas que oscilan entre 20-40°C.
3. Las bacterias ______________ requieren del oxígeno para su crecimiento.
4. Las bacterias___________ crecen a pH ácido.
71
MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
1. Realizar el contaje de colonias bacterianas, previa dilución de la muestra.
2. Efectuar mediciones turbidimétricas de un cultivo bacteriano.
3. Relacionar el contaje de colonias con la absorbancia mediante la elaboración de un gráfico.
Cuantificación del Crecimiento Bacteriano

No solamente es importante el aislamiento de las bacterias, sino también, conocer el número o masa
de células en una muestra. Existen muchas formas de cuantificar el crecimiento bacteriano para determinar la
velocidad de crecimiento y el tiempo de generación. Se puede medir tanto la masa como el número celular en la
población, porque el crecimiento origina un incremento en ambos.
En la actualidad, se dispone de un gran número de métodos directos para medir el crecimiento bacteriano:
determinación del numero más probable (NMP), contaje microscópico directo, contadores automáticos de células,
contaje en placa, determinación del peso seco. Además, existen métodos indirectos, tales como: mediciones
turbidimétricas de un cultivo líquido y medición de un componente celular importante, como las proteínas.
En la presente actividad práctica se aplicarán dos métodos ampliamente utilizados para medir el crecimiento
bacteriano: contaje en placa (directo) y turbidimetría (indirecto), y se relacionarán ambos parámetros a través de
la elaboración de un gráfico, que nos permitirá determinar la concentración celular de un cultivo puro de un
microorganismo.
Contaje en Placas
El contaje en placas se lleva a cabo determinando el número de células capaces de generar colonias sobre
la superficie de un medio sólido. Por esta razón, frecuentemente a este método se le denomina contaje de colonias.
Este tipo de contaje se basa en que cada célula viable puede dar lugar a una colonia. Se dice que una célula es
viable cuando es capaz de dividirse para dar lugar a descendencia.
El número original de microorganismos viables en la muestra puede calcularse a partir del número de
colonias formadas y la dilución de la muestra. Por ejemplo, si 1 ml de una dilución de 1x10-6 produce 150 colonias,
la muestra original contendría alrededor de 1,5 x 108 UFC/ml Normalmente, el recuento es más exacto si se utiliza
un contador especial de colonias.
Se pueden emplear dos técnicas de siembra para realizar el contaje en placas: siembra por extensión y
siembra en profundidad (vaciado). En la técnica de siembra por extensión, un volumen no mayor de 0,1 ml de la
dilución de la muestra, se extiende por toda la superficie del medio utilizando una varilla de vidrio estéril, doblada
en forma de “L”. La placa se incuba bajo las condiciones de tiempo, temperatura y atmósfera apropiadas (Figura
19).
Figura 19: Aislamiento por Extensión

Fuente: Madigan M, 1998
En la técnica de siembra en profundidad, se coloca 1 ml de la dilución de la muestra en un medio de cultivo
previamente fundido y enfriado hasta aproximadamente 40-45°C; después de mezclado se vierte rápidamente en
una placa de Petri estéril, se deja solidificar y se incuba bajo las condiciones apropiadas (Figura 20).
72
Figura 20: Aislamiento por Vaciado

Fuente: Madigan M, 1998
Con los dos métodos anteriores, el número de colonias que se desarrollan en las placas no debe ser muy
elevado para poder contar adecuadamente y, por otra parte, el número de colonias no debe ser muy bajo para que
el contaje tenga significado estadístico. La práctica habitual es que el número de colonias oscile entre 30 y 300 por
placa.
Por lo general, para obtener el número apropiado de colonias, la muestra debe ser diluida. Debido a
que habitualmente no se conoce la carga microbiana de la muestra, es necesario realizar diluciones seriadas,
generalmente en base 10 (ejemplo: 10-1, 10-2, 10-3). Mientras mayor sea la carga microbiana de la muestra (alimento,
agua, suelo) mayor será el número de diluciones a preparar para conseguir el número apropiadas de colonias para
el contaje (entre 30 y 300).
Fuentes de error en el método de contaje en placa
 El número de colonias obtenido en un contaje en placa depende no solamente del tamaño del inóculo; sino
también, del medio de cultivo y las condiciones de incubación empleadas. El recuento será bajo si el medio
de cultivo empleado no puede respaldar el crecimiento de todos los microorganismos viables presentes en la
muestra.
 En la siembra en profundidad, si la temperatura del agar fundido es elevada (por encima de 45ºC) puede
dañar o destruir células sensibles; por ello, la siembra por extensión ofrece a veces recuentos superiores en
comparación a la técnica en profundidad.
 En relación con el tiempo de incubación, no todas las colonias se desarrollan al mismo tiempo, de modo que
si el tiempo de incubación es corto, se obtendrá un recuento más bajo que el real.
 El tamaño de las colonias varía ampliamente, de modo que colonias muy pequeñas pudieran pasar inadvertidas
y no ser contadas.
Debido a que existen muchas fuentes de error en el contaje en placa, se debe sembrar por duplicado cada
dilución.
Para representar el resultado más claramente, el contaje de células viables se expresa como unidades
formadoras de colonias (UFC) en lugar de número de microorganismos (ya que una colonia contiene más de una
célula).
A pesar de las dificultades asociadas con el recuento de colonias en placas, este procedimiento es
ampliamente utilizado en la industria alimentaria y farmacéutica; así como también, en la microbiología acuática.
Este método posee una alta sensibilidad puesto que muestras con escasa cantidad de microorganismos
pueden ser procesadas; además, la disponibilidad de medios de cultivos altamente selectivos, permite realizar el
recuento de un tipo particular de microorganismo a partir de muestras heterogéneas.
Turbidimetría
Este método mide la reducción de la transmisión de luz debida a las partículas en suspensión y cuantifica
la luz residual transmitida (Figura 21).
Es una técnica sensible y rápida que se basa en la capacidad de las células bacterianas de dispersar la luz
que incide sobre éllas. Como el tamaño de las células en una población es casi constante, el grado de dispersión
es proporcional a la concentración de células presentes. Cuando la concentración de las bacterias alcanza casi
73
10 millones de células por ml, el medio aparece ligeramente turbio. Un aumento de la población produce un
incremento de la turbidez y una disminución de la luz transmitida a través del medio.
Figura 21: Turbidimetría

Fuente: Prescott L, 1999
Se puede medir el grado de dispersión de la luz con un espectrofotómetro y prácticamente se observa una
relación lineal con la concentración bacteriana hasta un cierto nivel de absorbancia. Por ello, el crecimiento de
una población microbiana puede medirse mediante técnica de espectrofotometría, siempre que la población sea lo
suficientemente grande y se pueda medir la turbidez. Sin embargo, antes de utilizar la turbidez como método de
contaje, es necesario realizar una curva estándar que relacione el número de UFC/ml de muestra con la absorbancia
de cada una de las diluciones utilizadas para efectuar el contaje en placas.
Materiales
 Cultivo en caldo de E. coli (18-24 horas).

 5 tubos de ensayo con 2 ml de Caldo Soya Tripticasa (CST) cada uno.
 6 tubos con Agar Nutritivo (AN)
 6 placas de Petri estériles.
 Pipetas estériles de 1 y 2 ml
 4 Frascos de dilución con 99 ml de CST cada uno.
 Espectrofotómetro
 Contador de colonias
Procedimiento
A. Determinación del Contaje Bacteriano por unidad de volumen.
Se procede a determinar el número de UFC/ml a partir del cultivo original del microorganismo en estudio.
1. Rotular 4 frascos de dilución conteniendo 99 ml de SSF como: 10-2; 10-4; 10-6 y 10-8.
2. Fundir los 6 tubos con AN, luego enfriar hasta 45°C en Baño de María. Mantener a esta temperatura hasta
el momento de utilizarlos.
3. Con una pipeta de 1 ml, transferir 1 ml del cultivo original de E. coli al primer frasco de dilución marcado
como 10-2. Descartar la pipeta. Mezclar por inversión. Guardar el cultivo original.
4. Con una nueva pipeta, transferir 1 ml de la primera dilución (10-2) al segundo frasco marcado como 10-4.
Descartar la pipeta y mezclar la dilución como se indicó en el paso anterior.
5. Con una nueva pipeta, transferir 1 ml de la segunda dilución (10-4) al frasco marcado como 10-6. Descartar la
pipeta. Mezclar.
6. Con una nueva pipeta, transferir 1 ml de la tercera dilución (10-6) al frasco marcado como 10-8. Mezclar.
7. Tome dos placas rotuladas como 10-6 y transfiera 1 ml de la dilución marcada 10-6 a cada una de ellas. Luego
coloque 0,1 ml de la misma dilución en dos placas estéril marcada como 10-7. Descartar la pipeta.
74
8. Con una nueva pipeta, transferir 1 ml de la cuarta dilución (10-8) a dos placas marcada como 10-8
9. Vaciar el contenido de un tubo con AN dentro de cada placa de Petri y rotar suavemente para mezclar el agar
y la muestra. Mover lentamente, para evitar que el agar salpique la tapa de la placa.
10. Dejar solidificar. Invertir e incubar las placas a 37°C durante 24-48 horas (Figura 22).
Figura 22: Diluciones de la Muestra para Contaje en Placas

Fuente: Kelly S, 2002
B. Mediciones Turbidimétricas
Ahora se determinará la absorbancia de una serie de diluciones del cultivo original y se graficará una curva.
Al medir la absorbancia de un cultivo desconocido del mismo microorganismo en el mismo medio de cultivo, se
puede determinar el número de células por unidad de volumen a partir de la curva.
1. Con el remanente del cultivo original de E. coli procesar como se indica a continuación (Figura 23):
2. Preparar 5 tubos conteniendo 2 ml de CST.
3. Transferir 2 ml del cultivo original de E. coli; al primer tubo con CST. Mezclar. Rotular un tubo como 1:2. No
descartar el cultivo original.
4. Transferir 2 ml del tubo 1:2 al otro tubo. Mezclar y rotular como 1:4.
5. Transferir 2 ml del tubo 1:4 a otro tubo. Mezclar y marcar como 1:8.
6. Transferir 2 ml del tubo 1:8 a otro tubo. Mezclar y marcar como 1:16.
7. No transferir al último tubo y rotular como “Blanco” o “Control”.
8. Usando un espectrofométro, ajustar la longitud de onda a 525 nm.
9. Colocar el blanco dentro del receptáculo y tapar. Ajustar el espectrofotómetro a 0% de Absorbancia (100%
Transmitancia). De esta manera, se mide la absorbancia de un tubo no inoculado del medio de cultivo y se fija
la absorbancia a cero. Todos los cambios en la absorbancia en otros tubos son producto de la turbidez debida a
las células bacterianas en suspensión.
10. Comenzar con el tubo del cultivo original de E. coli, insertar cada dilución preparada dentro del receptáculo
y anotar la absorbancia de cada tubo en la hoja de datos.
Figura 23: Diluciones de la Muestra para Turbidimetría

Fuente: Kelly S, 2002
75
C. Reglas para el Contaje de Colonias

1. Finalizado el período de incubación, se seleccionan las placas donde aparezcan entre 30 y 300 colonias. Con la
ayuda de un contador de colonias, se cuentan todas las colonias, incluyendo las que se observan como pequeños
puntos y se anota la dilución correspondiente. Debe evitarse contar como colonias, partículas de muestra,
pequeñas burbujas, etc.
2. Si las placas de todas las diluciones tienen más de 300 colonias, se seleccionan aquellas que tengan el valor más
cercano a 300.
3. Si las placas de todas las diluciones tienen menos de 30 colonias, se seleccionan aquellas que tengan el valor
más cercano a 30. El número de colonias promedio de las dos placas de una misma dilución se multiplican por
la dilución correspondiente y este será el resultado final.
4. Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan entre 30 y 300 colonias, se multiplica cada recuento por
la dilución correspondiente, se establece el promedio y este será el resultado final. Si el recuento más alto es el
doble del más bajo, se descarta el primero y se toma como resultado el valor más bajo.
Expresión de los resultados
1. Los resultados se expresan como UFC por mililitro o gramo de muestra.
2. El número de colonias obtenido en el contaje, se multiplica por la dilución correspondiente y se expresa como
“Estimado del recuento estándar”.
3. Si no hay colonias en ninguna de las placas, el recuento se reporta como “menos de 1” multiplicado por la
primera dilución de la muestra y se expresa como “Estimado del recuento estándar”.
D. Relación Contaje de Colonias-Absorbancia.
1. Con el valor de las UFC/ml obtenidas en el contaje en placas del cultivo original (sin diluir), calcule las UFC/ml
en cada una de las diluciones correspondientes. Para tal fin, proceda a dividir el resultado entre 2 para calcular
las UFC/ml de la dilución 1:2, y así sucesivamente para cada una de éllas. De tal manera que, en la dilución 1:2
el contaje será la mitad del obtenido en el cultivo no diluido; para la dilución 1:4 el contaje será la cuarta parte
del obtenido en cultivo sin diluir,etc.
2. Con los resultados obtenidos, grafique la absorbancia de cada dilución versus el número de UFC/ml de la
muestra. Este gráfico permitirá determinar el número de UFC/ml de un cultivo similar, tomando como referencia,
la absorbancia de los caldos.
Complete los siguientes enunciados:
1. El número de bacterias es directamente proporcional a la _______________ e inversamente proporcional a la
__________.
2. La forma correcta de reportar 5.365.000 bacterias/ml es ____________________.
3. Si el promedio de colonias obtenidas en la dilución 10-3 fue de 189, el total de UFC/ml de la muestra original
es____________.
4. Si ninguna dilución presentó entre 30-300 colonias; pero la dilución 10-1 presenta 25 colonias, el total de UFC/
ml es________.
5. Si un cultivo contiene 2 x 109 UFC/ml, la dilución 1:4 contiene__________UFC/ml
6. Con los siguientes valores de absorbancia determine el número de UFC/ml, utilizando la curva elaborada durante
el ejercicio práctico:
ABSORBANCIA UFC/ml
0,8
0,5
0,1
Reporte los resultados________________
76
7. En una prueba de contaje en placa se obtuvo los siguientes resultados:

Número de Colonias
Dilución
Placa 1 Placa 2
10-1 Incontables Incontables
10-2 270 330
10-3 100 150
Reporte los resultados________________
8. En una prueba de contaje en placa se obtuvo los siguientes resultados:
Número de Colonias
Dilución
Placa 1 Placa 2
10-1 Incontables Incontables
10 -2
350 400
10 -3
50 60
Reporte los resultados_____________
77
UNIDAD IV
METABOLISMO BACTERIANO
Objetivo terminal
Al finalizar la unidad, el estudiante estará en capacidad de:
 Ejecutar adecuadamente las pruebas bioquímicas usadas para el estudio del metabolismo bacteriano,
interpretando sus resultados.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS UTILIZADAS EN LA IDENTIFICACIÓN DE
BACTERIAS EN EL LABORATORIO
1. Explicar los fundamentos de las pruebas bioquímicas más utilizadas en la identificación bacteriana.
2. Practicar correctamente las pruebas bioquímicas de uso frecuente en la identificación bacteriana.
3. Interpretar adecuadamente los resultados de las pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación de
bacterias en el laboratorio.
Generalidades
Para la identificación de las bacterias en el laboratorio, pueden utilizarse gran variedad de métodos: métodos
convencionales, sistemas multipruebas y sistemas automatizados. En la presente actividad práctica se tratará
lo concerniente a los métodos convencionales utilizados rutinariamente en el laboratorio para la identificación
bacteriana.
Identificación utilizando Métodos Convencionales
En el laboratorio de bacteriología, las pruebas usadas para evaluar la actividad bioquímica o metabólica
de las bacterias, por medio de la cual puede hacerse la identificación final de especie, se llevan a cabo mediante el
subcultivo del aislamiento primario en una serie de medios diferenciales e indicadores, cuyos resultados pueden
interpretarse después de un día o más de incubación.
Debido a que muchas bacterias presentan morfología colonial y celular similar, se requieren características
adicionales para lograr su identificación. A este fin, se recurre al estudio del metabolismo bacteriano, tomando
en consideración el (los) sustrato(s) que utiliza una determinada bacteria y los productos finales que genera. En
consecuencia, se han diseñado pruebas de laboratorio con la finalidad de determinar las enzimas y vías metabólicas
presentes en una bacteria.
La identificación por métodos convencionales requiere la ejecución de una serie de pruebas bioquímicas
especificadas en un esquema predeterminado que contiene las características bacterianas claves. Estas pruebas
deben ser efectuadas en una secuencia específica para poder llegar a la identificación final. Es labor del bacteriólogo,
elegir conjuntos apropiados de características diferenciales que permitan la identificación de cada grupo de
bacterias. A continuación, se estudiarán detalladamente algunas de las pruebas bioquímicas que pueden utilizarse
en el laboratorio para la identificación de especies bacterianas.
Indol
Fundamento:
La prueba se basa en determinar si la bacteria posee el complejo enzimático triptofanasa que le permite
degradar el triptófano para producir indol. El indol es un benzil-pirrol, producto de la degradación metabólica del
aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen el complejo triptofanasa, son capaces de hidrolizar y desaminar
el triptófano con la producción de indol, ácido pirúvico, amoníaco y energía. Esta reacción ocurre con el agregado
de una molécula de agua y en presencia de fosfato de piridoxal como coenzima.
La prueba se basa en la combinación del indol liberado con el aldehído que contiene el reactivo de Kovacs o
el de Erlich para dar un color rojo. Esta reacción ocurre por hidrólisis ácida de las proteínas contenidas en el medio
provocado por el HCl concentrado. La capa alcohólica, concentra la quinona (complejo coloreado de rojo).
Medios y reactivos:
Medio: Caldo triptófano (1%) o agua peptonada con cloruro de sodio (NaCl).
Agua peptonada con NaCl
Peptona o digesto pancreático de caseína (tripticasa)......................................2,0 g
Cloruro de sodio...............................................................................................0,5 g
pH final: 7,0 + 0,2
81
Caldo Triptófano (1%)

Peptona de carne...........................................................................................10,00 g
DL-triptófano....................................................................................................1,0 g
Agua destilada.............................................................................................100,0ml
pH final: 7,2 + 0,2
Reactivo de Kovacs:
Alcohol amílico o isoamílico......................................................................150,0 ml
ρ-dimetil-amino-benzaldehído.......................................................................10,0 g
Ácido clorhídrico concentrado.....................................................................50,0 ml
Reactivo de Erlich:
Alcohol etílico absoluto..............................................................................190,0 ml
ρ-dimetil-amino-benzaldehído.........................................................................2,0 g
Ácido clorhídrico concentrado.....................................................................40,0 ml
Procedimiento:
1. A partir de un cultivo puro con 18 a 24 horas de incubación, inocular un caldo triptófano o agua peptonada con
NaCl.
2. Incubar a 35ºC por 24-48 horas en aerobiosis.
3. Transcurrido este tiempo, añadir 15 gotas del reactivo de Kovacs y agitar suavemente el tubo. Si se va utilizar
el reactivo de Erlich, previamente se debe agregar 1 ml de xilol, agitar suavemente el tubo y agregar luego el
reactivo de Erlich (15 gotas).
Lectura e interpretación: (Lámina 37 )
 Prueba positiva: el desarrollo de un anillo rojo en la capa alcohólica, dentro de segundos posteriores a la
adición del reactivo es indicativo de la presencia de indol y la prueba es positiva; lo que revela que la bacteria
posee el complejo enzimático de la triptofanasa.
 Prueba negativa: no se produce color en la capa alcohólica (toma el color del reactivo). La bacteria carece del
complejo enzimático de la triptofanasa.
Ureasa
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de producir la enzima ureasa
(úrea amidohidrolasa). Ésta, hidroliza la úrea con la producción de dióxido de carbono, agua y dos moléculas
de amoníaco. El amoníaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio, lo que da como resultado
alcalinización del medio, haciendo virar el indicador de pH (rojo de fenol) a un color fucsia intenso.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Urea de Christensen
Peptona...........................................................................................................1,00 g
Glucosa...........................................................................................................1,00 g
Fosfato monopotásico.....................................................................................8,00 g
Urea..............................................................................................................20,00 g
Rojo de fenol................................................................................................0,012 g
82
Agar..............................................................................................................15,00 g
Agua destilada.......................................................................................1.000,00 ml
pH final: 6,8 + 0,2
Procedimiento:
Sembrar por estrías sólo la superficie del bisel (plano inclinado del agar) con un inóculo denso del
microorganismo de prueba. No debe hacerse punción del taco porque éste sirve para control del color. Incubar a
35ºC por 24-48 horas en aerobiosis.
Lectura e interpretación: (Lámina 38)
 Prueba positiva: se observa un color fucsia intenso en todo el medio, o sólo en el bisel, provocado por la
liberación de amoníaco a partir de la hidrólisis enzimática de la úrea.
 Prueba negativa: no se produce cambio de color (el medio permanece amarillo pálido). La bacteria no posee
la enzima ureasa.
Citrato
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de utilizar citrato de sodio como
única fuente de carbono y, sales inorgánicas de amonio, como única fuente de nitrógeno. Las sales de amonio
(fosfato de amonio) son degradadas a amoníaco (NH3), provocando la alcalinización del medio por la producción
de hidróxido de amonio; lo que se evidencia por el cambio de color del indicador de pH que contiene el medio,
azul de bromotimol, de verde (pH neutro) a azul (pH alcalino).
Medios y reactivos:
Medio: Agar Citrato de Simmons
Fosfato dehidrogenado de amonio..................................................................1,00 g
Fosfato dipotásico...........................................................................................1,00 g
Citrato de sodio...............................................................................................2,00 g
Sulfato de magnesio.......................................................................................0,20 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
Azul de bromotimol........................................................................................0,08 g
Agua destilada........................................................................................1000,00 ml
pH final: 6,9+ 0,2
Procedimiento:
Inocular la superficie del bisel del medio agar citrato. Incubar a 35ºC por 24–48 horas en aerobiosis. A
veces es necesaria una incubación más prolongada.
Resultados e interpretación: (Lámina 39)
 Prueba positiva: crecimiento con la aparición de un color azul intenso en el bisel. Indica que el microorganismo
utiliza el citrato como única fuente de carbono para crecer.
 Prueba negativa: no se observa crecimiento, ni cambio de color (el medio se observa verde). Indica que el
microorganismo no utiliza el citrato como única fuente de carbono.
Nota: Esta prueba también puede realizarse en medio líquido (caldo citrato) o en placas con agar citrato. El mismo
fundamento es aplicable a otros sustratos que pueden ser utilizados por las bacterias como única fuente de carbono
para crecer, tales como: acetato de sodio, malonato de sodio, y acetamida, entre otros.
83
Movilidad
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar si un microorganismo es móvil o no. Generalmente, las bacterias son
móviles debido a la presencia de flagelos, los cuales son más frecuentes en bacilos; aunque existen cocos móviles.
Las bacterias no móviles, carecen de flagelos. La presencia y disposición de los flagelos es una característica útil
para la identificación de bacterias en el laboratorio.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Movilidad
Triptosa...........................................................................................................10,0 g
Agar..................................................................................................................5,0 g
Agua destilada.........................................................................................1.000,0 ml
pH final: 7,2 + 0,2
Procedimiento:
Utilizando un cultivo puro del microorganismo en estudio y con ayuda de un asa en punta, inocular el
medio por punción vertical del taco en la parte central del agar sin llegar al fondo, teniendo la precaución de
retirar el asa siguiendo la misma trayectoria por donde se introdujo. La temperatura de incubación es fundamental,
generalmente, es de 35ºC por un tiempo de 24-48 horas en aerobiosis. Algunas bacterias expresan la movilidad a
temperatura ambiente y no a 35ºC.
Se recomienda utilizar sales de tetrazolio (cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio, TTC al 0,005%) para ayudar
a detectar la movilidad, en particular cuando es difícil la interpretación. Las sales de tetrazolio son incoloras; pero
cuando el microorganismo crece, el colorante es incorporado en el interior de las células bacterianas donde es
reducido a un pigmento rojo insoluble, el formazán. El color rojo se forma sólo en la zona del medio de cultivo
donde crecen las bacterias.
 Prueba positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y difunden de forma radial en el me-
dio, provocando turbidez. Indica que el microorganismo posee flagelos.
 Prueba negativa: sin movilidad, crecimiento sólo en la línea de inoculación. El medio se mantiene claro.
Indica que el microorganismo no posee flagelos.
Decarboxilación de Aminoácidos (Lisina, Arginina y Ornitina)
Fundamento:
Esta prueba se usa para determinar si un microorganismo posee enzimas decarboxilasas que le permiten
extraer el grupo carboxilo de un aminoácido y formar aminas con la consiguiente alcalinización del medio.
La decarboxilación es el proceso por el cual, las bacterias que poseen enzimas decarboxilasas (específicas
para cada sustrato) son capaces de atacar a los aminoácidos en su grupo carboxilo terminal (COOH), generando
una amina (diamina) y CO2 como producto secundario.
Las enzimas decarboxilasas son numerosas y cada una es específica para un sustrato determinado. En
un laboratorio de bacteriología, las decarboxilasas más importantes utilizadas para la identificación bacteriana
son: Lisina Decarboxilasa y Ornitina Decarboxilasa. La reacción de la arginina es mediada más bien por una
Arginina Dehidrolasa.
La lisina sufre la decarboxilación para producir cadaverina (una diamina) y anhídrido carbónico por
acción de la enzima específica lisina-decarboxilasa.
La ornitina es decarboxilada por la enzima ornitina-decarboxilasa produciendo putrescina (diamina) y
anhídrido carbónico.
84
La arginina es catabolizada en un proceso a través de dos pasos: la arginina, primero es dehidrolizada

a citrulina, que luego se convierte en ornitina. La ornitina luego se decarboxila a putrescina, que produce los
mismos cambios en el indicador de pH, como se mencionó para los otros aminoácidos.
Las decarboxilasas son enzimas adaptativas o inducibles, formadas por el organismo en un medio ácido
en presencia de sustrato específico, y los productos de la decarboxilación provocan una desviación del pH hacia
la alcalinidad. La decarboxilación ocurre anaeróbicamente, es un proceso irreversible, no oxidativo, que requiere
fosfato de piridoxal como coenzima.
Medios y Reactivos:
Medio: Caldo Base de Möeller
Peptona...........................................................................................................5,00 g
Extracto de carne............................................................................................5,00 g
Púrpura de bromocresol....................................................................................0,1 g
Rojo de cresol.............................................................................................. 0,005 g
Glucosa.............................................................................................................0,5 g
Fosfato de piridoxal......................................................................................0,005 g
L-Aminoácidos*.............................................................................................10,0 g
*Agregar 10 g (concentración al 1%) del aminoácido deseado:
1. L-(+)+-diclorhidrato de Lisina
2. L-(+)+-diclorhidrato de Ornitina
3. L-(+)+-monoclorhidrato de Arginina
pH final: 6,0 + 0,2
El caldo de Möeller es la base que se emplea con mayor frecuencia contiene una pequeña cantidad de
glucosa, de tal manera, que el microorganismo al crecer, fermenta la glucosa y produce ácido (el medio que
originalmente es de color púrpura, cambia a amarillo). Si el aminoácido es decarboxilado, se forman compuestos
alcalinos (aminas) y el medio revierte a su color púrpura original.
Procedimiento:
Inocular el caldo decarboxilasa de Möeller con un cultivo puro del microorganismo de prueba (usar un
inóculo liviano). Con cada batería de investigación, inocular un tubo control de caldo base que contiene glucosa sin
aminoácido (Control de Decarboxilación, DC). Agregar a todos los tubos, incluyendo el control, 1 ml de petrolato
o parafina estéril. En estas condiciones, el oxígeno del medio es consumido por el microorganismo y esto controla
el pH (la reacción sólo ocurre en medio ácido y en anaerobiosis). Incubar los tubos a 35ºC por 24-48 horas. A veces
se necesita una incubación más prolongada (de 6 a 10 días) para demostrar reacciones débiles debidas a la escasa
capacidad de decarboxilación de un organismo.
 Prueba positiva: la reaparición de un color púrpura en el caldo que contiene el aminoácido, indica una prueba
positiva debido a la liberación de aminas por la reacción de decarboxilación.
 Prueba negativa: color amarillo. El microorganismo no posee la enzima decarboxilasa; sólo fermentó la
glucosa.
 Control DC: color amarillo (siempre). La aparición de color amarillo en el control DC indica que el
microorganismo es viable y que el pH del medio ha disminuido en forma suficiente como para activar la
decarboxilación.
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Fenilalanina Deaminasa
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar si un organismo posee la enzima fenilalanina deaminasa, la cual es
capaz de producir la desaminación oxidativa de la fenilalanina con producción de ácido fenil-pirúvico y liberación
de amoníaco (NH3). La reacción se evidencia mediante la detección de ácido fenil-pirúvico en el medio de prueba
a través del agregado de una solución de Cloruro férrico al 10%. Este compuesto actúa como agente quelante con
el ácido fenil-pirúvico para dar un color verde debido a la formación de una hidrazona. La exposición de la prueba
al oxígeno atmosférico después de agregado el FeCl3 incrementa la velocidad de producción y la intensidad de una
reacción positiva.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Fenilalanina
DL-fenilalanina.................................................................................................2,0 g
Extracto de levadura.........................................................................................3,0 g
Fosfato disódico................................................................................................1,0 g
Agar................................................................................................................12,0 g
pH final: 7,3 + 0,2
Reactivo: Cloruro Férrico (FeCl3) al 10%
Cloruro férrico...............................................................................................10,00g
Agua destilada...........................................................................................100,00ml
Procedimiento:
Inocular el bisel del agar fenilalanina. Incubar a 35ºC por 24-48 horas. Transcurrido el tiempo de incubación,
agregar 4 a 5 gotas del reactivo directamente a la superficie del agar sembrado. Hacer rotar suavemente el tubo para
que el reactivo impregne todo el crecimiento bacteriano sobre el bisel. En el término de 1 a 5 minutos se produce
la aparición del color verde en el bisel.
 Prueba positiva: color verde en el bisel; indicando la presencia de ácido fenil- pirúvico; el microorganismo
posee fenilalanina deaminasa. Se debe interpretar la reacción inmediatamente, dado que el color producido es
inestable y se desvanece rápidamente.
 Prueba negativa: no se produce cambio de color, el medio se mantiene amarillo debido al color del reactivo
FeCl3. El microorganismo no posee la enzima fenilalanina deaminasa.
Rojo de Metilo
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para probar la capacidad de un microorganismo de elaborar y mantener productos
finales ácidos estables a partir de la fermentación de la glucosa, superando la capacidad amortiguadora del
sistema.
Esta prueba detecta la producción de ácidos fuertes, tales como: láctico, acético y fórmico, a partir de la
glucosa, mediante la vía de fermentación de ácidos mixtos. Sólo los microorganismos capaces de mantener este pH
bajo después de una incubación prolongada (48-72 horas) superando el sistema amortiguador del pH del medio,
pueden denominarse rojo de metilo positivos.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un espectro entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), detectando
ácido a pH considerablemente más bajos que otros indicadores comúnmente utilizados en medios de cultivo
bacteriológicos. Por ende, para producir un cambio de color, el microorganismo en estudio debe producir grandes
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cantidades de ácido a partir de la fermentación de hidratos de carbono.

Medios y reactivos:
Medio: Caldo MR/VP (Rojo de Metilo/Voges-Proskaüer). Este medio también sirve para efectuar la prueba de
Voges-Proskaüer que se estudiará posteriormente. Consiste en un caldo glucosado amortiguado.
Caldo MR/VP
Polipeptona.....................................................................................................7,00 g
Glucosa...........................................................................................................5,00 g
Fosfato dipotásico (buffer)............................................................................ 5,00 g
pH final: 6,9 + 0,2
Reactivo: Rojo de Metilo
Rojo de metilo..................................................................................................0,1 g
Alcohol etílico (95%)....................................................................................300 ml
Agua destilada...............................................................................................200 ml
Procedimiento:
Sembrar el caldo MR/VP con un inóculo ligero a partir de un cultivo puro. Incubar a 35ºC por un tiempo
mínimo de 48 horas. En ocasiones, es necesario prolongar la incubación hasta por 5 días. Transcurrido este tiempo,
divida el caldo con crecimiento en dos partes (utilice para este fin, tubos estériles), agregar a un tubo, el indicador
de pH rojo de metilo (aproximadamente, 5 gotas) directamente al caldo. La otra parte del cultivo en caldo será
utilizada para la prueba de Voges–Proskaüer.
 Prueba positiva: color rojo estable. La aparición de un color rojo que se mantiene en el caldo indica suficiente
producción de ácido para reducir el pH a 4,4 y constituye una prueba positiva. El microorganismo elabora
productos ácidos estables a partir de la fermentación de la glucosa.
 Prueba negativa: color amarillo en el caldo. Indica que la acidez del medio no se mantiene, sino que los
productos ácidos del metabolismo han sido transformados en otros compuestos.
Voges - Proskaüer
Fundamento:
La prueba de Voges-Proskaüer se basa en la detección de acetoína (acetil-metil-carbinol), un producto final
neutro derivado del metabolismo de la glucosa. La acetoína es un precursor de la producción del 2,3-butanediol.
La formación de acetoína y 2,3-butanediol es un proceso reversible de reducción-oxidación, en el que

la acetoína se convierte por reducción en 2,3-butanediol ó éste es oxidado a acetoína. En presencia de oxígeno
atmosférico y medio alcalino, los productos finales neutros son oxidados a diacetilo, que es el reactante para
el color producido en la reacción. En consecuencia, el diacetilo es un producto de oxidación de la acetoína. El
α-naftol utilizado en la reacción, sirve como intensificador del color para producir un complejo rojo.
La elaboración de productos finales neutros a partir del metabolismo de la glucosa indica que el
microorganismo utiliza la vía fermentativa del 2,3-butanediol (butilen-glicol).
Medios y reactivos:
Medio: Caldo RM/VP (ya descrito en la prueba de rojo de metilo).
Reactivos: α-naftol (5%)
α-naftol...........................................................................................................5,00 g
Alcohol etílico absoluto............................................................................100,00 ml
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KOH (40%):
Hidróxido de potasio....................................................................................40,00 g
Procedimiento:
Inocular el caldo RM/VP con el microorganismo de prueba. Incubar a 35ºC por un tiempo mínimo de 48
horas. Luego de este lapso, pasar una alícuota de 1 ml del caldo a un tubo de prueba estéril. Añadir los reactivos
en el siguiente orden: 0,6 ml (12 gotas) de α-naftol y luego, 0,2 ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo suavemente
para exponer el medio al oxígeno atmosférico, a fin de oxidar la acetoína y obtener una reacción de color. Dejar
descansar el tubo, por lo menos, durante 10 a 15 minutos antes de intentar la interpretación de la prueba. En
ocasiones se requiere una incubación más prolongada, hasta de 10 días.
 Prueba positiva: está representada por la aparición de un color rojo 15 minutos o más después de agregar los
reactivos, lo que indica la presencia de diacetilo, el producto de oxidación de acetoína. El microorganismo
genera productos neutros a partir de la fermentación de la glucosa.
 Prueba negativa: color amarillo en el caldo (el mismo color del reactivo). El microorganismo no genera
productos neutros a partir de la fermentación de la glucosa.
Gas de Glucosa
Fundamento:
Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato específico (glucosa), incorporado
a un caldo base de rojo de fenol, produciendo ácido con gas visible.
Las bacterias que fermentan la glucosa con producción de gas, se denominan aerogénicas y las que no lo
producen, anaerogénicas.
Cuando se utiliza un medio de cultivo en caldo con hidrato de carbono, se coloca un tubo de fermentación
o tubo de Durham en posición invertida, para evidenciar la producción de gas. Una sola burbuja en el tubo de
Durham basta para registrar la producción de gas.
Medios y reactivos:
Medio: Caldo base rojo de fenol con glucosa (1%)
Peptona.........................................................................................................10,00 g
Extracto de carne (opcional)...........................................................................1,00 g
Rojo de fenol................................................................................................0,018 g
Glucosa (1%)................................................................................................10,00 g
pH: 7,4 + 0,2
Procedimiento:
Inocular el caldo glucosa con un cultivo puro del microorganismo en prueba (inóculo denso). Incubar a
35ºC durante 24–48 horas en aerobiosis.
 Prueba positiva: se observan burbujas de gas en el tubo de Durham o el medio se halla completamente
desplazado por el gas, dejando una parte vacía en el tubo invertido. El medio debe observarse ácido (amarillo)
por la fermentación de la glucosa. La bacteria es aerogénica.
 Prueba negativa: no se observan burbujas de gas; aunque debe haber acidez, pues el microorganismo puede
fermentar la glucosa sin liberar gas. La bacteria es anaerogénica (fermenta el carbohidrato sin producción de
gas).
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Coagulasa
Fundamento:
Esta prueba se usa para detectar si el microorganismo posee la enzima coagulasa. La coagulasa es una
proteína de composición química desconocida, con actividad semejante a la protrombina, capaz de convertir el
fibrinógeno en fibrina, produciendo un coágulo visible en un medio con plasma.
La coagulasa está presente en dos formas, libre y ligada (unida), cada una con diferentes propiedades que
requieren el uso de pruebas separadas:
 Coagulasa ligada (Prueba en portaobjetos): la coagulasa ligada, también denominada Factor de Agregación,
está unida a la pared de la célula bacteriana y no se encuentra presente en los filtrados de cultivos. Las hebras
de fibrina se forman entre las células bacterianas suspendidas en el plasma (fibrinógeno), haciendo que se
agrupen en agregados visibles cuando se observan en la prueba del portaobjetos. La actividad de la coagulasa
ligada no es inhibida por los anticuerpos formados contra la coagulasa libre. Tiene la capacidad de convertir al
fibrinógeno en fibrina directamente, sin intervención de los factores plasmáticos.
 Coagulasa Libre (Prueba en tubo): la coagulasa libre es una sustancia semejante a la trombina presente
en el filtrado de cultivos. Cuando una suspensión de bacterias productoras de coagulasa se mezcla con igual
cantidad de plasma en un tubo de prueba, se forma un coágulo visible como resultado del empleo de los factores
plasmáticos de la coagulación, de manera semejante a cuando se agrega trombina.
Medios y reactivos:
Medio: Plasma humano que puede obtenerse de una muestra de sangre fresca o plasma de conejo,
liofilizado, preparado comercialmente, porque es más fácil mantener el control de calidad. No deben usarse
productos de sangre que contengan citrato como anticoagulante, porque aquellos microorganismos que utilizan el
citrato, pueden liberar calcio y causar resultados falsos-positivos.
Procedimiento:
 Prueba en Portaobjetos (Coagulasa Ligada): se coloca una gota de una suspensión bacteriana en SSF estéril
sobre una lámina portaobjetos. Se coloca una gota del plasma reconstituido al lado de la gota de la suspensión
bacteriana. Se mezcla. Imprimir al portaobjetos un suave movimiento de rotación hacia delante y hacia atrás,
observando la inmediata formación de un precipitado granular.
 Prueba en tubo (Coagulasa libre): en forma aséptica, se colocan 0,5 ml de plasma humano o de conejo
reconstituido en el fondo de un tubo de prueba estéril. Se agregan 0,5 ml de un cultivo puro en caldo soya
tripticasa o caldo infusión cerebro-corazón, de 18 a 24 horas del microorganismo en estudio. Alternativamente,
pueden resuspenderse en el plasma varias colonias del microorganismo de prueba. Se mezcla con suavidad
rotando el tubo, con la precaución de no revolver o sacudir la mezcla. Se incuba el tubo a 37ºC por 18-24 horas.
Se recomienda revisar periódicamente la prueba, por ejemplo, cada cuatro horas para evidenciar la producción
de un coágulo visible a simple vista.
Lectura e interpretación:
Prueba en Portaobjetos:
 Prueba Positiva: se detecta, por lo general, en 15 a 20 segundos, con la aparición de un precipitado granular.
Indica que el microorganismo posee coagulasa ligada.
 Prueba negativa: no se observa agregación en 2-3 minutos. Indica que el microorganismo carece de coagulasa
ligada. Esta prueba se considera sólo presuntiva y todos los resultados negativos o positivos tardíos, deben ser
verificados con la prueba en tubo, porque algunas cepas de Staphylococcus aureus producen sólo coagulasa
libre que no reacciona en la prueba en lámina.
Prueba en Tubo: (Lámina 47):
 Prueba positiva: la reacción se considera positiva si se observa cualquier grado de coagulación visible del
plasma. Esta prueba se observa mejor inclinando suavemente el tubo. El coágulo o gel permanecerá en el fondo
de éste si la prueba es positiva. Indica que el microorganismo posee la enzima coagulasa libre.
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Algunos microorganismos pueden formar fibrinolisinas potentes que son capaces de disolver el coágulo
después que éste se ha formado. En consecuencia, pruebas positivas pueden ser pasadas por alto si no se observa
el tubo a intervalos frecuentes.
Otras cepas pueden producir coagulasa suficiente como para dar sólo resultados positivos tardíos después
de 18-24 horas de incubación; por lo tanto, todas las pruebas negativas a las 4 horas deben observarse de nuevo
después de 18 a 24 horas de incubación.
 Prueba negativa: no se evidencia formación de coágulo; es decir, el plasma permanece líquido. La bacteria no
posee la enzima coagulasa libre.
Citocromo-oxidasa
Fundamento:
Esta prueba se fundamenta en determinar la presencia de la enzima intracelular citocromo-oxidasa
en la bacteria; utilizando la capacidad de algunos colorantes como el tetrametil-ρ-fenilendiamina o dimetil-ρ-
fenilendiamina de actuar como sustitutos del oxígeno; es decir, como aceptores artificiales de los electrones
en la cadena respiratoria. Estos colorantes son incoloros en estado reducido y pueden oxidarse rápidamente en
presencia de citocromo-oxidasa y oxígeno atmosférico, produciendo formas coloreadas (azul púrpura o rosado,
respectivamente), lo que indica una reacción positiva.
Los citocromos son proteínas que forman parte de las cadenas transportadoras de electrones, propias del
metabolismo respiratorio. Actúan como el último eslabón en la cadena respiratoria aerobia transfiriendo electrones
(hidrógeno) al oxígeno, con la formación de agua. El sistema de citocromos se halla en microorganismos aeróbicos,
microaerofílicos y anaeróbicos facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar
microorganismos que carecen de la enzima o son anaeróbicos obligados.
La prueba citada anteriormente, no debe realizarse en medios que contengan sangre; ya que los eritrocitos
contienen la enzima citocromo-oxidasa y pueden dar falsos positivos. No deben usarse asas o alambres de
inoculación de acero inoxidable o nichrome para esta prueba porque productos de oxidación superficial formados
al esterilizar el asa o alambre con la llama del mechero de Bunsen pueden dar como resultado reacciones falso-
positivas (emplear asas de platino, o en su defecto, aplicadores de madera estériles). De igual manera, esta prueba
debe efectuarse en medios libres de inhibidores, por lo tanto, no debe realizarse a partir de cultivos en medios
selectivos o diferenciales que contengan una elevada concentración de glucosa, ya que esta puede inhibir la
actividad de oxidasa.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Nutritivo
Digesto pancreático de tejido animal.............................................................1,00 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
Agua destilada.............................................................................................. 1,00Lt.
pH final: 7,3 + 0,2
Reactivos:
Clorhidrato de tetrametil-ρ-fenilendiamina (1%)
Tetrametil-ρ-fenilendiamina dihidrocloruro.....................................................1,0 g
Agua destilada.......................................................................................... .....1,0 Lt.
Clorhidrato de dimetil-ρ-fenilendiamina (1%)

Dimetil-ρ-fenilendiamina monohidrocloruro...................................................1,0 g
Agua destilada............................................................................................... 1,0 Lt.
90
Procedimiento:
Usualmente, la prueba se lleva a cabo por medio de dos métodos:
1. El método directo en placa (Método de Steel), en la que 2 ó 3 gotas del reactivo se agregan directamente a
colonias bacterianas aisladas en un medio de agar nutritivo en placa.
2. El método indirecto (Método de Kovacs) con tira de papel de filtro, en la cual se agregan unas pocas gotas
del reactivo y luego, con un asa o aplicador de madera se coloca una pequeña cantidad del microorganismo
de prueba.
 Prueba positiva: cuando se utiliza el reactivo tetrametil, las colonias bacterianas que tienen actividad de
citocromo-oxidasa desarrollan un color azul intenso en el sitio de inoculación en 10-15 segundos. El color se
va haciendo más intenso hasta que se torna negro, en este punto, la bacteria es no viable. Cuando se utiliza el
derivado dimetil, la reacción oxidasa positiva está indicada por la aparición de un color rosado que se hace más
intenso hasta llegar a negro. El microorganismo posee la enzima citocromo-oxidasa.
 Prueba negativa: no se produce cambio de color en las colonias. El microorganismo carece de la enzima
citocromo-oxidasa.
TSI (Triple Azúcar Hierro)
Fundamento:
Esta prueba utiliza un medio diferencial sólido en tubo que tiene como propósito: 1) demostrar la
fermentación de carbohidratos (glucosa, lactosa y sucrosa) con o sin la producción de gas y 2) demostrar la
producción de H2S.
Un microorganismo puede exhibir las siguientes reacciones: 1) fermentar solamente la glucosa; 2) fermentar
glucosa y lactosa; 3) fermentar glucosa y sucrosa; 4) fermentar glucosa, lactosa y sucrosa y, 5) no fermentar ningún
carbohidrato.
El medio contiene rojo de fenol como indicador de pH, el cual en medio alcalino es de color rojo, en medio
ácido, es amarillo y, en medio neutro, toma una coloración rojo-naranja. Debido a que el medio tiene taco y bisel;
presenta dos cámaras de reacción: una anaeróbica en el taco; ya que no está en contacto con el aire y, una aeróbica
en el bisel, que está en contacto con el oxígeno atmosférico. El medio contiene una proporción de glucosa: lactosa
y sucrosa de 1:10; es decir, que para una concentración de glucosa de 1 g/L; la concentración de sucrosa y lactosa,
será de 10 g/L para cada una.
Si el microorganismo fermenta sólo la glucosa: se observa un TSI con bisel alcalino (Alc, rojo) y taco
ácido (Ac, amarillo). Cuando esto ocurre, la cantidad de ácido producida es poca (debido a que este carbohidrato
se encuentra en una pequeña concentración). Inicialmente, la cantidad de ácido producida por la fermentación
de la glucosa es suficiente para acidificar todo el medio (tanto el taco como el bisel); por lo que el indicador de pH
rojo de fenol cambia a amarillo; sin embargo, el bisel alcalino indica que se ha producido la degradación aeróbica
(vía descarboxilación oxidativa) de las peptonas. Esto obedece a que, después de 18-24 horas de incubación, la
baja concentración de glucosa ha sido consumida y el microorganismo comienza a utilizar las peptonas para su
crecimiento. El catabolismo de las peptonas produce liberación de amoníaco (NH3) dando un pH alcalino con el
rojo de fenol (indicador de pH). Sin embargo, el taco ácido indica degradación anaeróbica de la glucosa. Aquí se
forman productos terminales ácidos, dando un pH ácido.
Si el microorganismo fermenta además de la glucosa, sucrosa y/o lactosa: se observa un TSI Ac/Ac.
Estos carbohidratos se encuentran en una concentración diez veces mayor que la de glucosa. En un período de 18-
24 horas, aún no se han consumido completamente y permanece una condición ácida en el bisel; ya que los álcalis
producidos a partir de la degradación aeróbica de las peptonas no son suficientes para revertir la acidez producida
por la fermentación de los carbohidratos, por lo que todo el medio (taco y bisel) serán de color amarillo (ácido).
Si el microorganismo no fermenta ningún carbohidrato: el TSI se observa ALc/Neutro (ALc/N) ó
Alc/Alc. Algunos microorganismos, sobre todo los BGNNF son incapaces de fermentar los carbohidratos presentes
en el medio, por lo que, recurren a las peptonas para obtener sus nutrientes. Cuando las peptonas son degradadas se
produce un pH alcalino por la liberación de amoníaco que imparte al medio un color rojo intenso. Estas peptonas
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pueden ser degradadas por vía anaeróbica y aeróbica, dando una reacción Alc/Alc ó, por vía aeróbica solamente,
produciendo una reacción Alc/N.
Producción de gas: Se puede determinar si el microorganismo produce gas como producto terminal del
metabolismo de los carbohidratos. La bacteria que produce gas (CO2+H2) se denomina aerogénica, lo que se
manifiesta por el desdoblamiento del medio, la presencia de burbujas de gas, desplazamiento total del medio del
fondo del tubo dejando una línea clara o una ligera muesca del medio en el costado del tubo. Si la bacteria no
produce gas, se denomina anaerogénica.
Producción de H2S: Otro sistema de diferenciación presente en el TSI, está constituido por indicadores
de la producción de H2S (sulfuro de hidrógeno). Este es un gas que producen los microorganismos a través de la
desasimilación, bajo condiciones anaeróbicas, de aminoácidos que contienen azufre (metionina, cistina y cisteína) o
a través de la reducción de compuestos sulfurados inorgánicos (tiosulfato, sulfito y sulfato). Tales microorganismos
poseen enzimas que reducen el átomo de azufre de compuestos inorgánicos sulfurados o remueven el grupo sulfuro
de aminoácidos azufrados, tal como: la cisteína desulfurasa; que hidroliza a la cisteina produciendo H2S. Las sales
de hierro (citrato férrico) y el tiosulfato de hierro reaccionan con el sulfuro de hidrógeno (gas incoloro) para formar
sulfuro ferroso, que se evidencia por la aparición de un precipitado negro.
La producción de H2S puede detectarse en otros medios, además del TSI; como por ejemplo, el Peptona
Hierro Agar (PIA), Kliger Hierro Agar (KIA), Lisina Hierro Agar (LIA) y las tiras impregnadas con sales de plo-
mo. Estas últimas, no son muy utilizadas, debido a su toxicidad.
Medios y reactivos:
Medio: Triple Azúcar Hierro (TSI).
Extracto de levadura.......................................................................................3,00 g
Peptona.........................................................................................................20,00 g
Lactosa..........................................................................................................10,00 g
Sucrosa.........................................................................................................10,00 g
Glucosa...........................................................................................................1,00 g
Citrato férrico amónico...................................................................................0,20 g
Tiosulfato de sodio.........................................................................................0,30 g
Agar..............................................................................................................12,00 g
Rojo de fenol................................................................................................0,024 g
Agua destilada........................................................................................1000,00 ml
pH: 7,4 + 0,2
Procedimiento:
A partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba, inocular el TSI con el asa en punta, punzando
primero el taco y luego, estriando sobre el bisel o viceversa (la punción del taco debe llegar hasta el fondo). Incubar
a 35ºC por 24-48 horas.
Lectura e interpretación: En la lectura del TSI, se debe indicar siempre cual es el taco y cual, el bisel. Además,
se debe leer y reportar la presencia o no de gas y/o H2S (Lámina 49).
 Bisel: Alc; Taco: Ac; H2S: +/-; Gas: +/-: Indica que el microorganismo sólo fue capaz de fermentar la glucosa;
con o sin producción de H2S y con o sin la producción de gas.
 Bisel: Ac; Taco: Ac; H2S: +/-; Gas: +/-: Indica que el microorganismo fue capaz de fermentar la glucosa;
lactosa y/o sucrosa; con o sin producción de H2S y con o sin la producción de gas.
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 Bisel: Alc; Taco: Alc ó Bisel: Alc; Taco: N; H2S: -; Gas: -: Indica que el microorganismo no fermenta ningún
carbohidrato;sin producción de H2S y sin la producción de gas. Ocurrió degradación de las peptonas.
LIA (Lisina Hierro Agar)

Fundamento:
Esta prueba se usa para determinar si un bacilo gramnegativo decarboxila o deamina la lisina. Además,
permite detectar la producción de gas a partir de la fermentación de la glucosa y la formación de ácido sulfhídrico
(H2S). Cuando la glucosa es fermentada, el taco y el bisel se vuelven ácidos (amarillos). Si el organismo produce
lisina decarboxilasa, se forma una amina (cadaverina) que neutraliza los ácidos orgánicos formados por la
fermentación de la glucosa y, el taco revierte al estado alcalino (púrpura). Si no ocurre decarboxilación, el taco
permanece ácido.
Cuando ocurre desaminación oxidativa de la lisina, se forma ácido α-cetocarboxílico, el cual reacciona
con las sales de hierro (citrato férrico amónico) cerca de la superficie del medio (en presencia de oxígeno) y en
presencia de flavina mononucleótido, lo que se evidencia por la aparición de un color rojo (borgoña) en el bisel
del medio.
El medio posee también un sistema para detectar la producción de H2S (citrato férrico amónico y tiosulfato
de sodio); los microorganismos que producen sulfuro de hidrógeno causan el ennegrecimiento del medio debido
a la producción de sulfuro ferroso.
La producción de gas a partir de la fermentación de la glucosa también puede evidenciarse en el medio, de
igual manera, como ocurre en el TSI (ya estudiado anteriormente).
Medios y reactivos:
Medio: Lisina Hierro Agar (LIA)
Peptona...........................................................................................................5,00 g
Dextrosa..........................................................................................................1,00 g
Hidrocloruro de L-lisina...............................................................................10,00 g
Citrato férrico amónico...................................................................................0,50 g
Tiosulfato de sodio.........................................................................................0,04 g
Púrpura de bromocresol..................................................................................0,02 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
pH: 6,7 + 0,2
Procedimiento:
Con un asa en punta, inocular por punción hasta el fondo y estriar el bisel del LIA (o viceversa), teniendo
la precaución de pinchar varias veces el taco. Incubar a 35ºC por 18-24 horas. Transcurrido este tiempo, proceder
a su lectura e interpretación.
Lectura e interpretación: En la lectura del LIA, al igual que en el caso del TSI, se debe indicar siempre cual es el
taco y cual, el bisel. Además, se debe leer y reportar la presencia o no de gas y/o H2S (Lámina 50).
 Bisel: Alc; Taco: Ac; H2S: +/-; Gas: +/-: Se observa el taco ácido (de color amarillo) y el bisel alcalino (de
color púrpura). Indica que el microorganismo no es capaz de decarboxilar, ni deaminar la lisina. Puede o no
haber producción de H2S y gas.
 Bisel: Alc; Taco: Alc o Bisel: Alc; Taco: N; H2S: +/-; Gas: +/-: Se observan alcalinos (púrpura) tanto el taco,
como el bisel. Indica que el microorganismo es capaz de decarboxilar la lisina. Puede o no haber producción
de H2S y gas.
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 Bisel: Rojo; Taco: Ac; H2S: +/-; Gas: +/-:: Esta es la única reacción del LIA que se lee por color, bisel rojo y
taco ácido. Indica que el microorganismo deamina la lisina.
Oxidación Fermentación de la Glucosa (OF-Glucosa)

Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar por cual vía utiliza la glucosa un microorganismo (fermentativa u
oxidativa) o si no la utiliza.
Algunas bacterias catabolizan la glucosa por vía oxidativa, produciendo dióxido de carbono y agua. El
catabolismo oxidativo requiere la presencia de oxígeno molecular (O2). La mayoría de las bacterias; sin embargo,
pueden fermentar la glucosa sin utilizar el oxígeno. El catabolismo fermentativo no requiere oxígeno; aunque
puede ocurrir en su presencia. Los productos finales de la fermentación son generalmente, pequeñas moléculas de
ácidos orgánicos.
En esta prueba se emplea el medio basal de Rudolph Hugh y Einar Leifson al cual se le añade glucosa
(OF-glucosa). El medio de oxidación/fermentación (OF) es un medio semisólido en taco (0,25-1,5% de agar)
que contiene una elevada concentración de glucosa (0,5-1%) y una baja concentración de peptonas (0,2-1%).
Las peptonas sustentarán el crecimiento de las bacterias no oxidativas, no fermentadoras (que no utilizan los
carbohidratos). El medio contiene azul de bromotimol como indicador de pH, el cual se torna amarillo en medio
ácido, evidenciando el catabolismo del carbohidrato. Las condiciones alcalinas debidas al uso de las peptonas y no
de los carbohidratos, se detectan por la aparición de un color azul intenso.
La baja relación peptona-hidratos de carbono, reduce la formación de aminas alcalinas capaces de neutralizar
la escasa cantidad de ácidos débiles que pueden formarse por el metabolismo oxidativo. El contenido relativamente
mayor del carbohidrato permite incrementar la cantidad de ácidos que pueden formarse potencialmente. La
consistencia semisólida del agar permite que los ácidos que se forman en la superficie del agar infiltren todo el
medio, lo que facilita la visualización del cambio de pH del indicador.
Medios y Reactivos:
Medio: Medio basal de Hugh y Leifson
Peptona...........................................................................................................2,00 g
D-glucosa......................................................................................................10,00 g
Azul de bromotimol........................................................................................0,03 g
Agar................................................................................................................2,50 g
Fosfato dipotásico...........................................................................................0,30 g
Agua destilada............................................................................................. 1,00 Lt.
pH: 7,1 + 0,2
Procedimiento:
Para la prueba de OF-glucosa se requieren dos tubos, cada uno inoculado con el microorganismo en
estudio, usando un asa en punta, punzando el taco varias veces (3 a 4) hasta la mitad (sin llegar al fondo). Añadir a
un tubo de cada par, una capa de 1 cm. de aceite mineral o parafina líquida estéril. Ambos tubos se incuban a 35ºC
y se examinan a diario por varios días.
La producción de ácidos se detecta por la aparición de un color amarillo. Los siguientes son los patrones
de reacciones:
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Tubo Tubo Cerrado

Lectura del OF-glucosa Interpretación
Abierto
La bacteria metaboliza la glucosa por vía
Ácido Neutro Oxidativo
oxidativa
La bacteria metaboliza la glucosa por vía
Ácido Ácido Fermentativo
fermentativa
La bacteria no metaboliza la glucosa por
Alcalino ó
Neutro Inactivo ninguna vía; utiliza las peptonas para su
Neutro
crecimiento.
NOTA: Esta prueba también puede hacerse con otros azúcares, tales como: xilosa, maltosa, fructosa y manitol;
entre otros.
Fermentación de Carbohidratos
Fundamento:
Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato específico produciendo ácido.
El carbohidrato puede estar representado por: azúcar, polihidroxialcohol, glucósido o sal de ácido orgánico
específico.
Medios y reactivos:
Medio: Caldo base rojo de fenol
Peptona.........................................................................................................10,00 g
Extracto de carne (opcional)...........................................................................1,00 g
Rojo de fenol................................................................................................0,018 g
Carbohidrato................................................................................................. 0,5-1%
pH: 7,4 + 0,2
Carbohidratos que pueden probarse además de glucosa: manitol, sorbitol, inositol, adonitol, dulcitol,
sucrosa, lactosa, fructosa, xilosa, salicin, ramnosa, galactosa, glucosa, trehalosa, arabinosa, rafinosa, celobiosa,
inulina y melobiosa.
Procedimiento:
Inocular asépticamente los caldos con carbohidratos a partir de un cultivo puro del microorganismo
de prueba. Incubar a 35ºC por 24-48 horas en aerobiosis. En ocasiones, puede requerirse una incubación más
prolongada para considerar negativo un resultado.
 Prueba positiva: se observa acidez en el medio (hay cambio de color, el medio se torna amarillo). El micro-
organismo fermentó el carbohidrato probado.
 Prueba negativa: el medio se observa alcalino (rojo), se produce crecimiento (turbidez); pero no hay cambio
de color del indicador. El microorganismo no fermentó el carbohidrato probado.
Reducción de Nitratos a Nitritos:
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de reducir los nitratos a nitritos
por acción de la enzima nitrato reductasa y mediante el agregado de los reactivos: ácido sulfanílico y α-naftil-
amina. El ácido sulfanílico y los nitritos reaccionan y forman una sal de diazonio. A continuación, la sal de diazonio
se une con la α-naftil-amina para producir un colorante azoico rojo (α-sulfobenceno-azo-α-naftil-amina).
95
Medios y reactivos:
Medio: Caldo Nitrato
Peptona...........................................................................................................5,00 g
Nitrato de potasio (KNO3)............................................................................. 1,00 g
pH: 7,00 + 0,2
α-naftil-amina
α-naftil-amina................................................................................................ 5,00 g
Acido acético (5N), 30%............................................................................. 1,00 Lt.
Acido sulfanílico
Acido sulfanílico............................................................................................8,00 g
Acido acético (5N), 30%............................................................................. 1,00 Lt.
Procedimiento:
Inocular el caldo nitrato con el microorganismo en estudio. Incubar a 35ºC durante 18 a 24 horas. Al
terminar la incubación, agregar 1 ml de cada uno de los reactivos: ácido sulfanílico y α-naftil-amina.
 Prueba positiva: la aparición de un color rojo en los 30 segundos posteriores al agregado de los reactivos,
indica la presencia de nitritos y representa una reacción positiva.
 Prueba negativa: si no aparece color rojo luego del agregado de los reactivos, esto puede indicar que los nitratos
no han sido reducidos (una verdadera reacción negativa) o que han sido reducidos a otros productos, como
amoníaco, nitrógeno molecular (denitrificación), óxido nítrico (NO) u óxido nitroso (N2O) e Hidroxilamina.
Dado que los reactivos de prueba detectan sólo nitritos, este último proceso llevaría a una lectura falsa
negativa. Por ende, es necesario agregar una pequeña cantidad de polvo de zinc a todas las reacciones aparentemente,
negativas. Los iones de zinc reducen los nitratos a nitritos y la aparición de color rojo después del agregado del zinc
indica la presencia de nitratos residuales y confirma una reacción verdaderamente negativa.
Por otra parte, si hay reducción del nitrato a nitrógeno molecular, no hace falta agregar los reactivos y se
observaría desplazamiento de líquido en el tubo de Durham.
Lectura Interpretación
La bacteria posee la enzima nitrato reductasa y redujo los nitratos a

Color rojo al agregar los reactivos: Positivo
nitritos
La bacteria posee la enzima nitrato reductasa y redujo los nitratos a
Burbuja en el tubo de Durham: Positivo
N2
No hay cambio de color al agregar el polvo de Zinc: La bacteria posee la enzima nitrato reductasa y redujo los nitratos a
Positivo compuestos diferentes al N2 y nitritos
La bacteria no posee la enzima nitrato reductasa; fue el polvo de
Color rojo al agregar el polvo de Zinc: Negativo
zinc quien redujo los nitratos a nitritos
Bilis Esculina
Fundamento:
Esta prueba se basa en verificar si la bacteria tiene la capacidad de hidrolizar el glucósido esculina a
96
esculetina y glucosa en presencia de 1-4% de sales biliares (equivalentes a 10-40% de bilis), por acción de la
enzima esculinasa.
La esculetina reacciona con las sales de hierro presentes en el medio (citrato férrico) y forma un complejo
fenólico férrico, de color marrón oscuro o negro que difunde en el medio.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Bilis-Esculina
Peptona...........................................................................................................5,00 g
Esculina..........................................................................................................1,00 g
Sales biliares.................................................................................................40,00 g
Citrato férrico.................................................................................................0,50 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
pH final: 6,6 + 0,2
El medio de Bilis-Esculina habitualmente se prepara en agar inclinado en tubos; aunque también se ha

utilizado con éxito en placas de agar y en caldo.
Procedimiento:
Inocular la superficie del bisel del agar bilis-esculina con un cultivo puro del microorganismo en prueba; o
en su defecto, sembrar la superficie de una placa de agar, o un medio en caldo. Incubar a 35ºC por 24- 48 horas. Si
la prueba es para un presunto enterococo, debe incubarse a 42ºC; pues en este caso, la prueba determina además,
la capacidad del microorganismo de crecer a temperaturas elevadas.
 Prueba positiva: se observa el ennegrecimiento difuso en el medio; o un halo negro o marrón alrededor de las
colonias en la placa de agar. Indica que el microorganismo posee la enzima esculinasa.
 Prueba negativa: no se ha producido el ennegrecimiento del medio. Puede producirse crecimiento; pero
esto no indica la descomposición de la esculina; solamente indica que la concentración de bilis no inhibió el
crecimiento de los organismos; pero carecen de la enzima esculinasa.
Catalasa
Fundamento:
Esta prueba se usa para determinar si un microorganismo posee la enzima catalasa que descompone el
peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno, reacción que se evidencia por el desprendimiento de burbujas
de gas (efervescencia).
El peróxido de hidrógeno es uno de los productos oxidativos finales en el metabolismo aerobio de los
carbohidratos. Si se acumula, el peróxido de hidrógeno es letal para las células bacterianas. Salvo los estreptococos,
la mayor parte de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad de catalasa. La mayoría de las
bacterias anaerobias que descomponen el H2O2 lo hacen mediante enzimas peroxidasas, que actúan en forma
semejante a la catalasa.
Medios y reactivos:
Medio:
Se prefiere utilizar Agar nutritivo (AN)(ya descrito en la prueba de oxidasa). No deben utilizarse medios
que contengan sangre; ya que los eritrocitos poseen la enzima catalasa, pudiendo producir resultados falsos
positivos.
97
Reactivo: Peróxido de Hidrógeno (3%)

Peróxido de hidrógeno, 30% (Superoxol)............................................................10 ml
Agua destilada......................................................................................................90 ml
Procedimiento:
Existen dos métodos para efectuar esta prueba:
1. Prueba en portaobjetos: transferir con el asa o un aplicador de madera, una pequeña porción de una
colonia bien aislada, a la superficie de una lámina portaobjetos. Agregar una o dos gotas del H2O2 (3%).
Se recomienda que el microorganismo no sea agregado al reactivo (revirtiendo el orden), en especial, si se
utilizan asas con contenido de hierro; porque pueden haber resultados falsos-positivos.
2. Prueba en tubo o placa de agar: Agregar unas gotas del reactivo (alrededor de 1 ml) directamente sobre
la superficie del agar en placa o en bisel.
Lectura e interpretación: (Lámina 55a y 55b)
 Prueba positiva: La producción rápida y sostenida de burbujas de gas o efervescencia constituye un
resultado positivo. El microorganismo posee la enzima catalasa.
 Prueba negativa: no hay formación de burbujas (no se libera O2). El microorganismo no posee la enzima
catalasa.
Hidrólisis del Hipurato
Fundamento:
Esta prueba se fundamenta en determinar si el microorganismo posee la enzima hipuricasa (hipurato
hidrolasa), que puede hidrolizar el ácido hipúrico, con la formación de benzoato de sodio y glicina. La hidrólisis
del ácido hipúrico puede detectarse por dos métodos:
1. Prueba lenta para detectar Benzoato (ácido benzoico) usando cloruro férrico al 12%: el cloruro férrico
precipita las proteínas, el hipurato y el benzoato; sin embargo, las proteínas y el hipurato son más solubles
que el benzoato en un exceso de cloruro férrico. Así, la presencia de un precipitado en un caldo de cultivo
con hipurato después de agregar cloruro férrico en exceso, indica la presencia de benzoato y una reacción
positiva para la hidrólisis del hipurato. La cantidad de precipitado depende del grado en que el hipurato sea
hidrolizado.
2. Prueba rápida para detectar glicina usando Ninhidrina como reactivo: la ninhidrina es un fuerte agente
oxidante que deamina los grupos α-amino con liberación de NH3 y CO2. El amoníaco liberado reacciona con
la ninhidrina residual y produce un color púrpura. La ninhidrina puede usarse para detectar glicina, el único
compuesto α-amino formado en la prueba del hipurato, indicando hidrólisis. La prueba es sensible, rápida y a
menudo, puede interpretarse después de 2 horas de incubación.
Medios y reactivos:
 Detección de Benzoato :
Medio: Caldo Hipurato de Sodio:
Caldo infusión corazón.................................................................................10,00 g
Hipurato de sodio.........................................................................................10,00 g
pH final: 7,4 + 0,2
Reactivo: Cloruro Férrico (12%):
FeCl36H2O....................................................................................................12,00 g
Acido clorhídrico concentrado...................................................................40,00 ml
98
 Detección de Glicina :
Medio: Solución acuosa de Hipurato de sodio (1%)
Hipurato de sodio...........................................................................................1,00 g
Reactivo: Ninhidrina:
Ninhidrina.......................................................................................................3,50 g
Acetona/Butanol (1:1)............................................................................. 100,00 ml
Procedimiento:
 Detección de Benzoato: Inocular un caldo hipurato de sodio con el microorganismo en estudio, incubar a 37ºC
durante 18-24 horas. Centrifugar el medio (10 minutos a 2.500 rpm) para compactar las células y trasvasar 0,8
ml del sobrenadante a un tubo de ensayo estéril. Agregar 0,2 ml del reactivo (cloruro férrico) al tubo de prueba
y mezclar bien.
 Detección de Glicina: Hacer una suspensión densa del microorganismo en estudio en 0,4ml de una solución
de hipurato de sodio al 1%. Incubar a 37°C por 2 horas. Agregar 0,2 ml (4 gotas). del reactivo (ninhidrina) y
mezclar bien. Reincubar a 37ºC por 10 minutos.
1.-Detección de Benzoato: después del agregado del cloruro férrico se formará un precipitado denso. El resultado
de la prueba depende del tiempo que se mantenga ese precipitado (Lámina 56a).
 Prueba positiva: si el precipitado persiste después de 10 minutos; indica que se ha formado benzoato a partir
de la hidrólisis del hipurato por la enzima hipuricasa.
 Prueba negativa: si la solución se aclara dentro de los diez minutos siguientes a la adición del reactivo, la
reacción no es específica y se debe a la interacción con el hipurato no hidrolizado o con las proteínas del medio;
por lo tanto, la prueba es negativa. El microorganismo carece de la enzima hipuricasa.
2.-Detección de Glicina: (Lámina 56b)
 Prueba positiva: la aparición de un color púrpura después del agregado de la ninhidrina indica la presencia
de glicina y un resultado positivo para la hidrólisis del hipurato. El color púrpura debe aparecer dentro de los
diez minutos posteriores a la adición del reactivo.
 Prueba negativa: no aparece el color púrpura, el medio permanece del color original. La bacteria no posee
la enzima hipuricasa.
Hidrólisis del Almidón
Fundamento:
Esta prueba se basa en la capacidad de la bacteria de hidrolizar el almidón contenido en el medio por
acción de la enzima amilasa que hidroliza el almidón a glucosa; a fin de que ésta pueda atravesar la membrana
citoplasmática y penetrar al interior de la célula. Una prueba cualitativa para detectar la hidrólisis del almidón
consiste en la aparición de un color azul al añadir una solución de iodo (lugol). Cuando el almidón es hidrolizado,
sus productos de degradación (dextrina, maltosa o glucosa) no dan este color azul a la reacción.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Almidón
Peptona.............................................................................................................5,0 g
Agar................................................................................................................15,0 g
99
Almidón soluble...............................................................................................2,0 g
pH final: 7,4 + 0,2
Las concentraciones de almidón sugeridas varían entre 0,2; 1 y 5%; se recomienda primera para el estudio
de bacterias anaerobias.
Reactivo: Solución de Lugol (Iodo).
Cristales de yodo..............................................................................................1,0 g
Ioduro de Potasio..............................................................................................2,0 g
Procedimiento:
Inocular un agar almidón con el microorganismo de prueba (se recomienda inocular por estría única ya
que se pueden estudiar varios cultivos en una misma placa, si se siembran desde el borde hacia el centro). Incubar
a 35ºC por 18-24 horas. Para evidenciar la hidrólisis del almidón, agregar a la placa, solución de iodo; el almidón
intacto presente en el medio forma un complejo coloreado de azul.
 Prueba positiva: la ausencia de color azul alrededor del crecimiento indica que el almidón ha sido hidrolizado
por acción de la amilasa; mientras que el resto del medio se vuelve azul.
 Prueba negativa: el medio se vuelve azul hasta en la zona inoculada, indicando que el almidón no ha sido
hidrolizado; el microorganismo carece de amilasa.
Hidrólisis de la Caseína
Fundamento:
Esta prueba se fundamenta en detectar si una bacteria posee la enzima caseinasa; que hidroliza la caseína
(principal proteína de la leche que le da una apariencia blanca y opaca), provocando el aclaramiento de un medio
agar leche descremada. Es conveniente refrigerar las placas durante 2 días antes de ser utilizadas para aumentar la
opacidad del medio.
Medios y reactivos:
Medios: Agar leche descremada
Leche descremada en polvo..........................................................................28,00 g
Caseína...........................................................................................................5,00 g
Dextrosa (glucosa)..........................................................................................1,00 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
pH final: 7,0 + 02
Procedimiento:
Sembrar un agar leche descremada con el microorganismo de prueba (se sugiere inocular por estría única).
Incubar a 35ºC por 18-24 horas en aerobiosis.
Lectura e Interpretación: (Lámina 58)
 Reacción positiva: las colonias de microorganismos que digieren la caseína (bacterias proteolíticas) estarán
rodeadas de un halo claro.
 Reacción negativa: si el microorganismo no hidroliza la caseína, el medio permanece opaco.
100
Producción de Hemolisinas
Fundamento:
Esta prueba se emplea para determinar si una bacteria posee enzimas citolíticas con capacidad de degradar
los eritrocitos y la hemoglobina en su interior. Estas enzimas se denominan hemolisinas. Existen tres tipos de
hemólisis: beta-hemólisis (β-hemólisis), alfa-hemólisis (α-hemólisis) y gamma-hemólisis (γ-hemólisis).
El tipo de hemólisis producido en agar sangre es útil para la identificación de patógenos bacterianos,
especialmente, los estreptococos. Estas bacterias producen dos tipos de hemolisinas: la Estreptolisina O, antigénica
y oxígeno lábil, puede ser inhibida mediante la producción de H2O2 por estreptococos creciendo en condiciones
aeróbicas o en presencia de niveles elevados de CO2 y, la Estreptolisina S, no antigénica pero estable al oxígeno.
Estas producen una destrucción total de los eritrocitos, lo que se conoce como beta-hemólisis (β-hemólisis). Si
las colonias estreptocócicas no producen hemólisis, se dice que presentan una gamma-hemólisis (γ-hemólisis),
nombre inapropiado ya que no ocurre destrucción de eritrocitos.
Otro tipo de reacción característica de estos microorganismos es la alfa-hemólisis (α-hemólisis),
evidenciada por la destrucción parcial de la membrana de los eritrocitos y la pérdida de algo de hemoglobina en el
agar, lo que resulta en una coloración verdosa del medio, alrededor del crecimiento bacteriano.
Medios y reactivos:
Medio: La base de agar utilizada en la preparación del medio debe estar libre de azúcares reductores, ya
que éstos suprimen la acción lítica de los estreptococos sobre los eritrocitos, tal vez mediante la disminución del
pH. La estreptolisina O es inactivada a pH bajos; por lo tanto, la presencia de cualquier azúcar reductor en el medio
puede suprimir la expresión de β-hemólisis por las colonias estreptocócicas en la superficie de las placas de agar
incubadas de forma aerobia.
En la actualidad, el medio más usado es agar sangre de carnero (5%); ya que la sangre humana o
de otros animales puede contener anticuerpos (anti-estreptolisinas) que neutralizan el efecto de las hemolisinas,
produciendo en consecuencia, falsos negativos.
Agar Sangre de Carnero (5%)
Extracto de carne........................................................................................500,00 g
Triptosa.........................................................................................................10,00 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
Sangre de carnero desfibrinada estéril.................................................................5%
pH final: 7,3 + 0,2
Procedimiento:
Inocular por estría, la superficie de las placas de ASC con el microorganismo de prueba. Incubar a 35ºC
por 18-24 horas en atmósfera anaeróbica. Alrededor del 2-5% de los estreptococos del grupo A sólo producen
estreptolisina O y pueden perderse en cultivos incubados en una atmósfera aeróbica, salvo que se tomen medidas
para reducir la tensión de oxígeno en, al menos, una parte del medio de cultivo. Se recomienda punzar el agar en
varios puntos con el asa, o colocar una lámina cubreobjetos sobre el área inoculada. Esta manipulación permite
observar mejor la hemólisis debajo de la superficie, donde prevalecen condiciones relativamente anaerobias.
Se ha comprobado que la incubación anaerobia aumenta significativamente la tasa de recuperación de
estreptococos β-hemolíticos de cultivos mixtos. La extensión del período de incubación a 48 horas también mejora
el índice de recuperación de estos microorganismos.
 β-Hemólisis: destrucción (lisis) total de los eritrocitos, las colonias se observan rodeadas de un halo claro,
incoloro y libre de eritrocitos intactos (Lámina 59).
101
 α-Hemólisis: destrucción parcial de los eritrocitos, las colonias aparecen rodeadas de un halo de color verdoso
(Lámina 60).
 γ-Hemólisis (Gamma): no se observa destrucción de los eritrocitos; no hay hemólisis, el medio se conserva
intacto (Lámina 61).
Susceptibilidad a la Bacitracina (Taxo A)
Fundamento:
Esta prueba se usa para determinar el efecto de una baja concentración de bacitracina (0,04 U) sobre un
microorganismo. Los estreptococos del Grupo A son susceptibles a esta concentración del antibiótico polipeptídico;
mientras que otros estreptococos β-hemolíticos; por lo general, son resistentes.
La prueba de bacitracina provee un método fácil y económico para la identificación presuntiva de los
estreptococos β-hemolíticos del Grupo A y B; aunque este método es todavía usado en muchos laboratorios, esta
prueba ha sido suplantada por procedimientos serológicos.
Medios y Reactivos:
Medio: esta prueba debe realizarse en agar sangre de carnero (ASC) 5%; ya descrito en la prueba de
hemólisis.
Taxo A: Taxo diferencial de bacitracina (0,04 Unidades/Disco); no debe emplearse disco de sensibilidad (10
Unidades/Disco)
Procedimiento:
Tomar 3 ó 4 colonias del estreptococo β-hemolítico e inocular a manera de césped, una placa de ASC.
Asépticamente, con ayuda de una pinza estéril, colocar el disco de antibiótico (taxo A) en el área inoculada.
Incubar la placa a 35ºC en aerobiosis por 18-24 horas.
 Positivo: presencia de cualquier halo de inhibición del crecimiento alrededor del disco. Indica que el
microorganismo es sensible o susceptible al antibiótico (S).
 Negativo: presencia de crecimiento alrededor del disco (no hay halo de inhibición). Indica que el
microorganismo es resistente al antibiótico (R).
Limitaciones:
 Sólo es aplicable a estreptococos β-hemolíticos.
 No existe información en relación a que los diámetros del halo de inhibición deban ser medidos.
 El inóculo debe ser confluente. Si éste es muy ligero, provocará que estreptococos β-hemolíticos no Grupo A,
aparezcan como susceptibles a la bacitracina.
Desoxirribonucleasa (DNasa)
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de producir la enzima
desoxirribonucleasa, que hidroliza el ADN.
Para la detección de la enzima pueden utilizarse dos medios: agar verde de metilo o el agar azul de toluidina.
El agar verde de metilo, es de color verde claro debido a la formación de un complejo estable entre el ADN
intacto y el colorante. Si el microorganismo que crece en el medio, hidroliza el ADN, produce oligonucleótidos y
mononucleótidos que liberan el verde de metilo, el cual al no estar combinado con el ADN, palidece, tornando el
medio incoloro alrededor del crecimiento del organismo de prueba.
Si la prueba se realiza en el agar azul de toluidina, la positividad viene dada por una zona rosada intensa
(magenta) alrededor de la zona inoculada donde se ha producido la hidrólisis del ADN; mientras que el resto de
la placa permanece azul. Este cambio de color se debe a que el colorante, con el ADN intacto toma un color azul
rey; mientras que al ser hidrolizado por acción de la DNasa, cambia su espectro de absorción de luz y se colorea
de rosado.
102
Medios y Reactivos:
Medio: Agar DNasa con verde de metilo
Triptosa.........................................................................................................20,00 g
ADN...............................................................................................................2,00 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
Verde de metilo...............................................................................................0,05 g
Agua destilada.............................................................…………..……1.000,00 ml
pH final: 7,3 + 0,2
Agar DNasa con azul de toluidina
Cloruro de calcio........................................................................................ 0,0011 g
ADN...............................................................................................................0,30 g
Cloruro de sodio...........................................................................................10,00 g
Agar..............................................................................................................10,00 g
Azul de toluidina..........................................................................................0,083 g
Tris (hidroximetil) aminometano....................................................................6,10 g
Agua destilada.............................................................…………..……1.000,00 ml
pH final: 9,0 + 0,2
Procedimiento:
Inocular el agar DNasa con el microorganismo de prueba (se recomienda inocular por estría única o en
forma circular ).
Agar DNasa verde de metilo: (Lámina 63a)
 Prueba positiva: el medio se observa incoloro alrededor del crecimiento del microorganismo de prueba.
Indica que el microorganismo posee la enzima DNasa.
 Prueba negativa: si no hay degradación del ADN, el medio permanece del color original (verde claro).
Indica que el microorganismo carece de la DNasa.
Agar DNasa azul de toluidina: (Lámina 63b )
 Prueba positiva: se observa un halo rosado alrededor del crecimiento bacteriano, indicando hidrólisis del
ADN, por acción de la enzima DNasa.
 Prueba negativa: si no hay degradación del ADN, el medio permanece del color original (azul). Indica que
el microorganismo carece de la enzima DNasa.
Prueba de Camp
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para verificar si un microorganismo produce o no el factor CAMP. Este, es una
proteína extracelular difusible que actúa en forma sinérgica con la β-lisina de S. aureus para incrementar la acción
hemolítica sobre los eritrocitos
El fenómeno CAMP fue informado por primera vez en 1.944 por Christie, Atkins y Munch-Peterson, cuya
contribución se reconoce en el acrónimo que identifica la prueba.
Medios y Reactivos:
Medio: esta prueba debe realizarse en agar sangre de carnero (ASC) 5%; ya descrito anteriormente.
103
Cepa: S. aureus β-lisina positiva

Procedimiento:
Esta prueba se realiza inoculando una estría única de los estreptococos a ser identificados, perpendicular a una
estría de S. aureus productora de β-lisina. Las dos estrías no deben tocarse (1 cm. de separación aproximadamente)
(Figura 24). Microorganismo de Prueba
S.aureus Zona de Hemólisis

β-lisina positiva Aumentada
Figura 24: Inoculación de la Prueba de Camp
Las placas inoculadas deben incubarse en atmósfera aeróbica a 37ºC por 18-24 horas. Aunque la incubación
en una atmósfera microaerofílica puede acelerar la reacción, también se observará un mayor número de falsos
positivos.
La prueba también puede realizarse empleando discos impregnados de β-lisina que se colocarán sobre la
placa de ASC para inocular en forma perpendicular, el microorganismo de prueba.
 Prueba positiva: en la intersección de las dos estrías inoculadas, la zona de β-hemólisis aumentada, adquiere
la forma de una punta de flecha; indicando que el microorganismo posee el factor CAMP.
 Prueba negativa: no se observa aumento de la hemólisis; reflejando que el microorganismo no produce el
factor CAMP.
Susceptibilidad a la Optoquina (Taxo P)
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar el efecto de la optoquina sobre un organismo. El clorhidrato de etil-
hidroxicupreína (optoquina), un derivado de la quinina, inhibe selectivamente el crecimiento de Streptococcus
pneumoniae en concentraciones muy bajas (5 µg/ml ó menos).
La optoquina es soluble en agua y difunde con rapidez en el medio de agar. Las células de neumococo
alrededor del disco de antibiótico, son lisadas debido a cambios en la tensión superficial (la optoquina actúa como
detergente), y se produce una zona de inhibición del crecimiento. Este antibiótico también puede inhibir a otros
estreptococos α-hemolíticos; pero sólo a concentraciones más elevadas.
Medios y Reactivos:
Medio: Agar sangre de carnero (5%) (Ya descrito anteriormente)
Disco de Optoquina (5 µg) (Taxo P)
Procedimiento:
Seleccionar 3 ó 4 colonias bien aisladas del microorganismo de prueba e inocular, a manera de césped, un
ASC. Usando una pinza previamente esterilizada a la llama del mechero, colocar el disco de optoquina en el tercio
superior del área sembrada. Con las pinzas, presionar suavemente el disco, para que se adhiera a la superficie del
agar. Invertir la placa e incubar a 35ºC durante 18 a 24 horas en atmósfera microaerofílica. Transcurrido el tiempo
de incubación, proceda a medir el halo de inhibición (incluyendo el diámetro del disco).
 Prueba positiva: se observa una zona de inhibición de 14 mm. ó más alrededor del disco de optoquina de
6 mm ó una de 16 mm. ó más si se utiliza un disco de 10 mm. Indica que el microorganismo es sensible o
susceptible a la optoquina (S).
104
 Prueba negativa: no se observa halo de inhibición del crecimiento, o se observa una zona de inhibición
de diámetro inferior al mencionado anteriormente para la prueba positiva. Indica que el microorganismo es
resistente a la optoquina (R).
Solubilidad en bilis
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para saber si un estreptococo α-hemolítico es sensible o no a las sales biliares. Las
sales biliares, en especial el desoxicolato y el taurocolato de sodio, tienen la capacidad de lisar de forma selectiva
las células de Streptococcus pneumoniae cuando se agrega a células bacterianas en crecimiento activo en un
medio de cultivo artificial. Este microorganismo produce enzimas autolíticas, que son responsables de la depresión
central o umbilicamiento característico de las colonias viejas en medio de agar. Se cree que el agregado de sales
biliares acelera este proceso, aumentando la reacción lítica asociada con la disminución de la tensión superficial
entre el medio y la membrana celular bacteriana.
Medios y Reactivos:
Medio: Agar sangre de carnero 5% (Prueba en agar).
Solución salina fisiológica (Prueba en caldo).
Reactivos: Desoxicolato de sodio (10%)( Prueba en caldo)
Desoxicolato de Sodio..................................................................................10,00 g
H2O destilada.................................................................................................100 ml
También puede utilizarse Taurocolato de sodio al 10% en solución acuosa.

Reactivos: Desoxicolato de sodio (2%)( Prueba en agar)
Diluir el reactivo al 10% en proporción 1:5 con agua destilada.
Procedimiento:
1.-Prueba en Placa (Prueba Rápida):
a) En un cultivo puro del microorganismo de prueba en ASC, marcar un círculo alrededor de una colonia bien
aislada, con un marcador indeleble, sobre el fondo de la placa de Petri, para ayudar a localizarla después
de la prueba. Agregar una gota de desoxicolato de sodio al 2% sobre la colonia.
b) Sin invertir la placa, incubar a 35ºC por 30 minutos en atmósfera aeróbica.
2.-Prueba en tubo:
a) Preparar una suspensión densa del microorganismo de prueba en SSF estéril, a partir de un cultivo de 18
a 24 horas en agar sangre.
b) Marcar dos tubos estériles, uno como muestra y uno, como control.
c) Agregar 0,5 ml de la suspensión bacteriana a cada tubo.
d) Agregar 0,5 ml de desoxicolato de sodio al 10 % al tubo marcado como muestra.
e) Agregar 0,5 ml de SSF estéril al tubo marcado como control.
f) Agitar con suavidad ambos tubos y colocarlos en la incubadora a 35-37ºC o en Baño de María, durante 3
horas, controlando cada hora.
1.-Prueba en agar: (Lámina 66a)
 Prueba Positiva: la colonia se desintegra. Deja un área parcialmente hemolisada en la superficie del medio de
cultivo donde se encontraba la colonia. Indica que el microorganismo es sensible a las sales biliares.
 Prueba Negativa: la colonia se mantiene intacta. Indica que el microorganismo es resistente a las sales
biliares.
2.-Prueba en Caldo: (Lámina 66b)

 Prueba Positiva: los microorganismos solubles en bilis aclaran visiblemente la turbidez del caldo dentro de
las 3 horas. El tubo de control con solución salina debe permanecer turbio. Indica que el microorganismo es
105
sensible a las sales biliares.

 Prueba Negativa: la suspensión se mantiene turbia, igual que el control. Indica que el microorganismo es
resistente a las sales biliares.
Licuefacción de la Gelatina
Fundamento:
Esta prueba se usa para determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas proteolíticas
(gelatinasas) que den como resultado la licuefacción de la gelatina.
La gelatina es una proteína derivada del colágeno encontrado en la piel y tejido conectivo animal. La
degradación enzimática de la gelatina conduce a la pérdida de la capacidad de solidificación de esta proteína.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Gelatina
Peptona...........................................................................................................5,00 g
Gelatina.......................................................................................................120,00 g
pH: 6,8 + 0,2
Procedimiento:
Inocular el medio de agar gelatina por punción con asa en punta a partir de un cultivo puro (inóculo denso).
La punción debe tener una profundidad de 1,5-2,5 cm. Rotular un tubo como control (sin inocular). Incubar ambos
tubos a 35ºC por 24 horas. En ocasiones, se requiere incubación prolongada de hasta 14 días. Observar si hay
crecimiento y licuefacción.
Al término de cada período de incubación (24 horas), colocar ambos tubos en un refrigerador o un baño de
hielo durante un período suficiente (aproximadamente 2 horas) para determinar si se ha producido o no la digestión
de la gelatina (licuefacción). Hacer el traspaso de la incubadora al refrigerador sin agitar los tubos.
 Prueba positiva: medio licuado, indica que el microorganismo posee enzimas proteolíticas (gelatinasas).
 Prueba negativa: el medio se mantiene sólido. Indica que el microorganismo no tiene actividad proteolítica
(gelatinasa).
 Tubo de control: El medio se mantiene sólido.
Crecimiento en presencia de Cetrimida
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de crecer en presencia de
cetrimida (bromuro de cetil-trimetil-amonio), una sustancia tóxica que inhibe el crecimiento de muchas bacterias.
La cetrimida es un detergente catiónico de amonio cuaternario que actúa como agente inhibidor en
medios selectivos para el aislamiento de Pseudomonas aeruginosa, que al entrar en contacto con la bacteria,
produce la liberación del nitrógeno y el fósforo de la célula bacteriana; aunque también puede inhibir otras especies
de Pseudomonas.
El medio de prueba (agar cetrimida) contiene además, cloruro de magnesio y sulfato de potasio para
incrementar la producción de pigmentos (pioverdina y piocianina) en Pseudomonas aeruginosa.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Cetrimida:
Digesto pancreático de caseína.....................................................................20,00 g
K2SO4. ..........................................................................................................10,00 g
106
MgCl2.............................................................................................................1,40 g
Cetrimida........................................................................................................0,30 g
Agar..............................................................................................................13,60 g
Glicerina.....................................................................................................10,00 ml
pH final: 7,2 + 0,2
Procedimiento:
Inocular el bisel de un medio de agar cetrimida con un cultivo puro del microorganismo de prueba. Incubar
aeróbicamente a 35º-37°C hasta 7 días.
 Prueba Positiva: se observa crecimiento. Adicionalmente puede observarse la producción de un pigmento

amarillo-verdoso (fluoresceína o pioverdina) o azul verdoso (piocianina).
 Prueba Negativa: no se observa crecimiento.
Hidrólisis de PYR (L-pirrolidonil-β-naftilamida)

Fundamento:
Esta prueba se usa para detectar si la bacteria posee la enzima L-pirrolidonil-amidasa (PYR); también
denominada pirrolidonasa ó L-pirroglutamil-aminopeptidasa, que desdobla el sustrato L-pirrolidonil-β-naftil-
amida en L-pirrolidona y β-naftilamina libre; una sustancia incolora. Esta última reacciona con el ρ-dimetil-amino-
cinamaldehído, que actúa como un colorante acoplador diazo y forma un color rojo brillante.
El reactivo cinamaldehído es un reactivo acoplado que forma una base de Schiff cuando se combina con
aminas en condiciones ácidas.
Medios y reactivos:
Medio: Caldo PYR:
Caldo basal Tod-Hewitt que contiene (g/L):
Infusión cerebro corazón ...............................................................................3,10 g

Peptona.........................................................................................................20,00 g
Glucosa.........................................................................................................10,00 g
Fosfato disódico..............................................................................................0,40 g
Carbonato de sodio.........................................................................................2,50 g
Sulfato de colistina.......................................................................................0,010 g
Ácido nalidíxico...........................................................................................0,015 g
pH final: 7,8 + 0,2
A este medio se le agrega el sustrato L-pirrolidonil-β-naftilamida (0,01%).
Reactivo:
ρ-dimetil-amino-cinamaldehído (1%):
ρ-dimetil-amino-cinamaldehído ....................................................................1,00 g
HCl concentrado (10%).................................................................................100 ml
Esta solución se debe preparar cada dos meses.
107
Procedimiento:
A partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba, preparar una suspensión densa en el caldo/
sustrato PYR cuya turbidez sea similar al estándar 2,0 de McFarland (3 x 108 UFC/ml). Incubar a 35°C en aerobiosis
por 4 horas. Después de la incubación, agregar 1 gota del reactivo PYR sin mezclar. Observar el cambio de color
después de 2 minutos.
Lectura e interpretación: (Lámina 69):
 Prueba Positiva: la aparición de un color rojo cereza a rojo púrpua oscuro es indicativo de que el PYR ha sido
hidrolizado.
 Prueba Negativa: el desarrollo de un color rosa, naranja o amarillo (sin cambios) después de agregar el reac-
tivo es indicativo que el PYR no ha sido hidrolizado.
Nota: Esta prueba puede efectuarse también utilizando agar PYR (Agar Soya triticasa (AST) con el sustrato al
0,01%) o utilizando sistemas comercialmente disponibles, tales como: discos o tiras impregnadas con el PYR.
Crecimiento a 42°C
Fundamento:
Esta prueba se utiliza determinar la capacidad de un microorganismo de crecer a 42°C.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Soya Tripticasa (AST):
Triptosa.........................................................................................................15,00 g
Peptona...........................................................................................................5,00 g
Glucosa...........................................................................................................5,00 g
Agar.................................................................................................................15,00
pH: 7,2 + 0,2
Procedimiento:
Sembrar por estría, el bisel de dos tubos de AST, con inóculo liviano del microorganismo de prueba.
Incubar uno a 35°C y el otro a 42°C, en atmósfera aeróbica durante 18 a 24 horas.
 Prueba Positiva: se observa buen crecimiento tanto a 35°C como a 42°C.
 Prueba Negativa: ausencia de crecimiento a 42°C; pero buen crecimiento a 35°C.
Prueba de Tolerancia a la Sal (Caldo salado)

Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de crecer en presencia de
concentraciones altas de sal. Se aplica para diferenciar enterococos (positivos) de los estreptococos (negativos).
La alta concentración de sal presente en el medio actúa como agente selectivo, alterando la permeabilidad
de la membrana celular y el equilibrio osmótico de la mayoría de las bacterias; así los microorganismos tolerantes
a la sal crecerán produciendo turbidez en el caldo; mientras que en el caso contrario, el caldo permanecerá claro.
108
Medios y reactivos:
Medio: Caldo Cerebro Corazón con 6,5% de NaCl:
Caldo cerebro corazón....................................................................................50,0 g
Triptosa...........................................................................................................1,00 g
pH: 7,4 + 0,2
Nota: se añade sólo 6,00 gramos de sal; debido a que el caldo cerebro corazón contiene 0,5% de NaCl.
Procedimiento:
Sembrar el caldo salado con un cultivo puro del microorganismo de prueba. Incubar a 35°C en aerobiosis
durante 24-48 horas.
 Prueba Positiva: turbidez visible en el caldo (crecimiento); indica que el microorganismo es tolerante a la
sal.
 Prueba Negativa: ausencia de turbidez en el caldo (sin crecimiento); indica que el microorganismo no es
tolerante a la sal.
Requerimiento de Factores X y V
Fundamento:
Esta prueba se usa para determinar el requerimiento de factores de crecimiento X y V para favorecer el
desarrollo in vitro de especies de Haemophilus.
El requerimiento de los factores X y V es una prueba cualitativa para la diferenciación de especies de
Haemophilus; en la cual, el desarrollo depende de manera parcial de la presencia del factor X, del factor V ó de
ambos.
El factor X es la porción hemo de la hemoglobina (protoporfirina) necesaria para la síntesis de las enzimas
respiratorias, también denominada hemina y hematina; es termoestable; por su parte, el factor V está constituido
por la coenzima nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), es termolábil. Normalmente, ambos factores, X y V, se
encuentran dentro de los glóbulos rojos intactos.
Medios y reactivos
Medio: Agar Müeller Hinton (MH)
Hidrolizado ácido de caseína........................................................................17,50 g
Almidón..........................................................................................................1,50 g
Agar..............................................................................................................17,00 g
pH final: 7,3 + 0,1
Reactivos:
Tiras o discos de papel de filtro impregnados con los factores X y V (Taxo X y V) disponibles
comercialmente.
Procedimiento:
Preparar una suspensión estandarizada al 0,5 de McFarland a partir de un cultivo puro de la cepa de
Haemophilus a probar, utilizando un caldo soya tripticasa (CST).
Preparar una dilución 1:100, tomando 0,1 ml de la suspensión preparada previamente y mezclar con 9,9
ml de SSF estéril. Con esta dilución y con la ayuda de un hisopo estéril, inocular la superficie de una placa de agar
MH a manera de césped. Dejar que la superficie del agar se seque durante unos pocos minutos. Colocar los discos
(taxos) conteniendo los factores X y V sobre el área del inóculo, cuidando dejar una separación de 4-5 cm entre
taxo y taxo.
109
Presionar con suavidad sobre los taxos de manera que se adhieran a la superficie del agar para permitir que
los factores difundan en el medio. Incubar a 35°C durante 18-24 horas en atmósfera microaerofílica. Transcurrido
el tiempo de incubación, inspeccionar visualmente la superficie del agar para determinar el crecimiento visible
entre los taxos o alrededor de ellos.
Lectura e Interpretación: (Figura 25 y Lámina 72)
 Prueba positiva: El crecimiento alrededor del taxo X, sin crecimiento alrededor del taxo V y crecimiento
alrededor del taxo XV; indica que el microorganismo requiere el factor X para crecer.
El crecimiento alrededor del taxo V, sin crecimiento alrededor del taxo X y crecimiento alrededor del taxo
XV; indica que el microorganismo requiere el factor V para crecer.
El crecimiento alrededor del disco XV, sin crecimiento alrededor de los taxos individuales, indica que el
microorganismo requiere ambos factores para crecer.
 Prueba negativa: se observa crecimiento sobre toda la superficie del agar; indicando que el microorganismo
no requiere de los factores probados para crecer.
Figura 25
Lectura e interpretación de la prueba de requerimiento de los
Factores X y V
Tabla 1
Crecimiento de las especies de Haemophilus con los Factores X y V
Factor
Especie de Haemophilus
X V
H. influenzae + +
H. influenzae biotipo aegyptius + +
H. haemolyticus + +
H. parahaemolyticus - +
H. parainfluenzae - +
H. paraphrophilus - +
H. segnis - +
H. ducreyi + -
H. aprophilus - -
Fuente: García L, 2007.
Satelitismo
Fundamento
Esta prueba se usa en cepas de Haemophilus para verificar el fenómeno conocido como satelitismo,
según el cual un microorganismo crece alrededor de un cultivo de S. aureus en agar sangre (5%) que es capaz de
proveerle el factor V (NAD); mientras que el factor X es suministrado por el medio de agar sangre.
H. influenzae requiere del factor X y el factor V para crecer. El medio de agar sangre provee el factor
X; pero no el V; por lo tanto, este microorganismo no puede crecer; a menos que sea hemolítico y libere el NAD
al producir la hemólisis de los eritrocitos; sin embargo, es capaz de crecer alrededor de una colonia de S. aureus
que le provee el NAD, que difunde al medio y estimula el crecimiento de Haemophilus alrededor de la colonia de
estafilococo.
110
Medios y reactivos
Medio: Agar sancre de carnero (5%): ya descrito previamente.
Procedimiento:
Preparar una suspensión estandarizada al 0,5 de McFarland a partir de un cultivo puro de la cepa de
Haemophilus a probar, utilizando un caldo soya tripticasa (CST).
Preparar una dilución 1:100, tomando 0,1 ml de la suspensión preparada previamente y mezclar con 9,9
ml de SSF estéril. Con esta dilución y con la ayuda de un hisopo estéril, inocular la superficie de una placa de agar
sangre a manera de césped. Dejar que la superficie del agar se seque durante unos pocos minutos. Sembrar por estría
única, una cepa de S. aureus productora de β-lisina. Incubar a 35°C x 18-24 horas en atmósfera microaerofílica.
Lectura e Interpretación: (Lámina 73)
 Prueba Positiva: crecimiento de Haemophilus alrededor de la estría del estafilococo.
 Prueba Negativa: no se observa crecimiento de la cepa de Haemophilus.
Prueba de la Hebra (String test)

Fundamento:
La prueba de la hebra permite observar el desarrollo de un filamento mucoso cuando una colonia del
microorganismo de prueba es resuspendida en una solución acuosa de desoxicolato de sodio al 0,5%. Es útil para
diferenciar especies no pertenecientes al género Vibrio, particularmente Aeromonas sp.
Medios y reactivos
Medio: La prueba debe realizarse a partir del crecimiento de un cultivo puro en un medio libre de inhibidores, tal
como agar nutritivo (AN) (ya explicado anteriormente).
Reactivo: Solución de desoxicolato de sodio al 0,5%
Procedimiento:
Esta prueba se puede ejecutar sobre lámina portaobjeto o una placa de Petri, resuspendiendo un cultivo
del microorganismo de prueba de 18 a 24 horas en un medio no selectivo, en una gota de solución acuosa de
desoxicolato de sodio al 0,5%. Si el resultado es positivo, la célula bacteriana puede ser lisada por el desoxicolato
de sodio y se libera el ADN, lo que se evidencia por la formación de un filamento mucoso (hebra) cuando un asa
de inoculación se levanta suavemente por encima de la suspensión.
 Prueba Positiva: formación de una hebra que indica lisis celular y liberación de ADN
 Prueba Negativa: no hay formación de hebra.
Reducción del telurito de potasio
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para diferenciar especies de enterococos en medios con base de agar sangre y una
concentración de telurito de potasio de 0,04%.
El telurito de potasio es una sustancia tóxica que ejerce un efecto bacteriostático, empleado como agente
selectivo para inhibir la gran mayoría de microorganismos grampositivos y gramnegativos que forman parte de
la flora normal del tracto gastrointestinal. Los microorganismos que pueden crecer en su presencia, reducen el
telurito a telurio y producen colonias negras en el agar de prueba.
Medios y reactivos
Medio: Agar sangre telurito
Biopeptonas..........................................................................................................10,00 g
Cloruro de sodio.....................................................................................................5,00 g
Fosfato hidrógeno dipotásico.................................................................................4,00 g
111
Almidón de maíz....................................................................................................1,00 g
Fosfato monopotásico............................................................................................1,00 g
Agar......................................................................................................................10,00 g
Sangre de carnero...............................................................................................50,00 ml
Telurito de potasio..................................................................................................0,40 g
Agua destilada..................................................................................................950,00 ml
pH 7,2 ± 0,2
Procedimiento:
Inocular el bisel de un medio agar sangre telurito con un cultivo puro del microorganismo de prueba.
Incubar en aerobiosis, a 35°C durante 24-48 horas.
 Prueba Positiva: desarrollo de colonias negras, debido a la reducción del telurito de potasio por la bacteria.
 Prueba Negativa: no hay crecimiento; debido a que el microorganismo fue inhibido por el telurito.
A cada grupo de trabajo le será entregado el material y las cepas bacterianas necesarias para proceder a
la ejecución de las pruebas bioquímicas estudiadas en la presente unidad práctica. Proceda según lo aprendido y
registre los resultados obtenidos.
1. ¿Si una bacteria no fermenta la glucosa, por qué no se prueba su capacidad para fermentar otros
carbohidratos?
2. ¿Por qué se utiliza agar y no gelatina como agente solidificante de los medios de cultivo?
3. ¿Puede un microorganismo ser RM y VP positivo?. Explique.
4. ¿Si un caldo con carbohidrato no cambia de color después de ser inoculado, cómo puede usted decir si ha
ocurrido una falla del microorganismo al crecer o al fermentar el carbohidrato?
5. En ausencia de azúcares, ¿la descomposición de proteínas conduce a una alcalinización o acidifación del
medio?. Explique.
6. Enumere dos productos finales del metabolismo de la glucosa en microorganismos VP positivos.
7. ¿Qué diferencia existe entre el reactivo de Erlich y el de Kovacs para la prueba de indol?.
8. Explique brevemente por qué un carbohidrato como la glucosa, no debe añadirse a un medio donde se quiera
determinar denitrificación.
9. ¿Por qué el medio para la prueba de indol no debe contener glucosa?.
10. Indique cuáles son los productos finales de la decarboxilación de ornitina, lisina y arginina, esquematizando
las reacciones.
11. ¿Por qué las pruebas de oxidasa y catalasa no deben realizarse en medios que contengan sangre?.
12. La reducción de los nitratos ocurre con mas frecuencia en presencia o ausencia de oxígeno. Explique.
13. ¿Qué es un agente quelante?.
14. Indique dos consideraciones especiales que debe tener en cuenta para realizar la prueba de oxidasa.
15. Explique ¿por qué en el agar gelosa chocolate (GC) no se puede observar hemólisis?.
16. Describa que ocurriría si inocula un microorganismo aerobio estricto en un caldo tioglicolato pre-reducido.
17. ¿Qué prueba se utiliza en el laboratorio para determinar la capacidad del microorganismo de metabolizar la
glucosa por la vía de los ácidos mixtos?, y ¿en la butilen-glicólica?
18. Indique si los siguientes enunciados son verdaderos o falsos:
 Las amilasas son enzimas que degradan almidón______
 La naturaleza coloidal de la leche sirve de base para interpretar la hidrólisis de la caseina________
 El agar nutritivo es el medio utilizado para detectar la producción de hemolisinas_______
112
 Los tubos de Durham se utilizan para determinar la producción de ácido a partir de la fermentación de
carbohidratos________
 La producción de H2S es una reacción anaeróbica________
 El indol es producto de la desaminación de la fenilalanina______
 Un anaerobio estricto, dará la prueba de oxidasa positiva_______
 La coagulasa contribuye a la patogenicidad bacteriana________
 El empleo del citrato requiere condiciones de aerobiosis________
 El medio de agar úrea contiene púrpura de bromocresol como indicador de pH
 La ninhidrina es el reactivo utilizado en la prueba de hidrólisis del hipurato mediante la detección de ben-
zoato________
 El medio para la prueba de movilidad es sólido_________
 La catalasa se lee mediante la formación de un coágulo visible______
 Las decarboxilasas son enzimas constitutivas__________
113
Laminero Práctica 4.1: Pruebas Bioquímicas para la
Identificación de Bacterias en El Laboratorio
LAMINERO: PRÁCTICA 4.1: PUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE
BACTERIAS EN EL LABORATORIO
Lámina 37: Prueba de Indol Lámina 38: Prueba de Ureasa Lámina 39: Prueba de Citrato
Negativo; Positivo Negativa; Débil Positiva; Positiva Negativo; Positivo
Fuente: Digitalización Fuente: Fuente: De La Maza L, 1997 Fuente: Digitalización
Lámina 40: Prueba de Movilidad Lámina 41: Prueba Decarboxilación de Lámina 42: Prueba de Fenilalanina
Negativa; Positiva Aminoácidos Deaminasa
Fuente: Fuente: De La Maza L, 1997 Negativa; Positiva Negativa; Positiva
Fuente: Digitalización Fuente: Fuente: De La Maza L, 1997
Lámina 43: Prueba de Rojo de Lámina 44: Prueba de Voges- Lámina 45: Prueba de Gas de Glucosa
Metilo Proskaüer Negativa; Positiva
Negativo; Positivo Negativo; Positivo Fuente: Steve A , 2001
Lámina 46: Prueba de Coagulasa Lámina 47: Prueba de Coagulasa Libre Lámina 48: Prueba de Citocromo-Oxidasa
Unida Negativa; Positiva Positiva; Negativa Fuente: Negativa; Positiva Fuente: Fuente: De La
Fuente: Fuente: De La Maza L, 1997 Digitalización Maza L, 1997
117
BISEL: Alc BISEL: Ac BISEL: Ac BISEL: Ac Bisel: Alc BISEL: Alc BISEL:Alc TSI sin
TACO: Alc TACO: Ac TACO: Ac TACO: Ac TACO: Ac TACO: Ac TACO: Ac inocular
H2S:- H2S:- H2S:+ H2S:- H2S:- H2S: - H2S:+
Gas:- Gas:+ Gas:+ Gas:- Gas:+ Gas: - Gas: +
Lámina 49: Diferentes Reacciones en el TSI
Fuente: Digitalización
BISEL: Rojo BISEL: Alc Bisel: Alc BISEL: Alc BISEL:Alc LIA sin
TACO: Ac TACO: Ac TACO: Alc TACO: Alc TACO: Ac inocular
H2S:- H2S:+ H2S:- H2S: + H2S:-
Gas:- Gas:+ Gas:- Gas: - Gas: +
Lámina 50: Diferentes Reacciones en el LIA
118
Fermentativo Oxidativo Inactivo Positivo; Negativo

Lámina 51: Prueba de OF-Glucosa Lámina 52: Fermentación de
Fuente: Digitalización Carbohidratos
Fuente: Mac Faddin, 2000
Positiva Negativa Negativa Positiva Positiva Caldo Nitrato

con Zn con Zn con gas sin inocular Positiva Positiva Negativa
Débil
Lámina 53: Prueba de Reducción de Nitratos a Nitritos Lámina 54: Prueba de Hidrólisis de la Esculina
Fuente: Fuente: De La Maza L, 1997 Fuente: Digitalización
Lámina 55a: Prueba de Catalasa en Tubo Lámina 55b: Prueba de Catalasa en Lámina Lámina 56a: Prueba de Hidrólisis del
Positiva; Negativa Negativa ; Positiva Hipurato (Método Rápido)
Fuente Fuente: De La Maza L, 1997 Fuente: Fuente: De La Maza L, 1997 Negativa; Positiva
Lámina 56b: Prueba de Hidrólisis del Hipurato Lámina 57: Prueba de Hidrólisis del Almidón Lámina 58: Prueba de Caseinasa
(Método Lento) Positiva; Negativa Negativa; Positiva
Positiva ; Negativa Fuente: Steve A, 2001 Fuente: Steve A, 2001
119
Lámina 59: Prueba de Hemolisinas Lámina 60: Prueba de Hemolisinas LáminaLámina 61: Prueba
61: Prueba de Hemolisinas
de Hemolisinas Colonias no
Beta-hemólisis en ASC Alfa-hemólisis en ASC Colonias no hemolíticas
hemolíticas en ASCen ASC
Fuente: Digitalización Fuente: Digitalización Fuente:Digitalización
Lámina 62: Prueba de Taxo A Lámina 63a: Prueba de DNAsa (Verde Lámina 63b: Prueba de DNAsa
Negativa; Positiva de Metilo) (Azul de Toluidina)
Fuente: Digitalización Negativa; Positiva Negativa; Positiva
Fuente: Koneman E, 1997 Fuente: Fuente: De La Maza L, 1997
Lámina 64: Prueba de Camp Lámina 65: Prueba de Taxo P Lámina 66a: Prueba de Solubilidad en Bilis
Positiva; Negativa Positiva; Negativa (Placa)
Fuente: Digitalización Fuente: Digitalización Negativa; Positiva
Lámina 66b: Prueba de Solubilidad en Bilis Lámina 67: Prueba de Hidrólisis de Lámina 68: Prueba de Crecimiento en
(Tubo) Gelatina Cetrimide
Negativa; Positiva Positiva; Negativa Negativa; Positiva
Fuente: Koneman E, 1997 Fuente: De La Maza L, 1997 Fuente: De La Maza L, 1997
Lámina 69: Prueba de Hidrólisis del PYR Lámina 70: Prueba de Crecimiento a 42°C Lámina 71: Prueba de Crecimiento en Caldo
Positiva; Negativa Positiva; Negativa Salado
Fuente: De La Maza L, 1997 Fuente: De La Maza, 1997 Positiva; Negativa
Fuente: Manual HiMedia, 2003
120
Lámina 72: Prueba de Requerimiento de Factores Lámina 73: Prueba de Satelitismo Positiva Lámina 74: Prueba de la Hebra (String test) Positiva
XV: Positivo; V: Positivo; X: Negativo Fuente: De La Maza L, 1997 Fuente: De La Maza L, 1997
Lámina 75: Prueba de Reducción del Telurito

Positiva
Fuente: De La Maza, 1997
121
UNIDAD V
GENÉTICA BACTERIANA
Objetivo Terminal:
 Verificar el proceso de transferencia de material genético por conjugación entre las bacterias.
TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO POR CONJUGACIÓN
1. Demostrar la capacidad de los plásmidos de transferir resistencia antimicrobiana de una bacteria a otra y
expresar dicha resistencia en su nuevo hospedero.
Generalidades
La conjugación bacteriana es el proceso de transferencia de material genético de una bacteria donante a
otra receptora mediante contacto directo entre las células a través de un pilis sexual.
La conjugación está mediada por plásmidos, elementos genéticos extracromosómicos que se replican
independientemente del cromosoma bacteriano y son capaces de codificar diversas funciones en la célula bacteriana,
entre ellas, resistencia a los antibióticos; estos elementos se transfieren fácilmente de una especie bacteriana a otra
lo que permite la rápida diseminación de genes que confieren resistencia a las drogas.
A este fin se utilizará, como receptora, una cepa de Escherichia coli resistente a ácido nalidíxico (E. coli
NAR) pero sensible al resto de los antimicrobianos conocidos; también se utilizará, como donante, una cepa de
Klebsiella pneumoniae resistente a ceftazidima (K. pneumoniae CAZR).
Mediante conjugación, se transferirá el plásmido de la cepa donante (K. pneumoniae CAZR), a la cepa
receptora (E. coli NAR) por lo que las bacterias receptoras después del proceso de conjugación, expresarán
resistencia a CAZ.
1. Inocular un Caldo Soya Tripticasa (CST) con cada una de las cepas (E. coli NAR y K. pneumoniae CAZR).
Incubar en agitación a 37°C hasta alcanzar la fase exponencial del crecimiento, lo cual se logra, generalmente,
después de 2 a 2,5 horas de incubación. Para ese momento, el caldo contiene una población bacteriana de
aproximadamente 2 x 108 UFC/ml
2. A partir de cada uno de estos caldos, realizar un antibiograma para determinar los patrones de susceptibilidad
y resistencia, utilizando el método de Kirby y Baüer, siguiendo los criterios del CLSI (Instituto para la
Estandarización de Laboratorios Clínicos, según sus siglas en inglés). El antibiograma se realizará en agar
Müeller Hinton (MH), preparando una suspensión estandarizada del microorganismo, equivalente al tubo 0,5
de McFarland. Probar los discos de CAZ y NA a ambas cepas; posteriormente, incubar las placas a 37°C por
18-24 horas.
3. Una vez finalizado el período de incubación, se procede a leer el antibiograma, la cepa donante debe ser
resistente a CAZ y sensible a NA; por otra parte, la cepa receptora, debe ser resistente a NA y sensible a CAZ.
4. Para que ocurra la conjugación bacteriana, primero se incuban ambas cepas (donante y receptora) en agitación
a 37°C, una vez alcanzado el crecimiento deseado, se mezclan volúmenes iguales (1 ml), de la cepa donante y
la receptora, en un tubo estéril y se incuban durante la noche a 37°C.
5. A partir de este cultivo, prepar diluciones 1/10, desde 100 hasta 10-6, en 9,00 ml de SSF. Inocular placas de agar
Mac Conkey (MC), Mac Conkey con ácido nalidíxico (MC/NA) y Mac Conkey/ácido nalidíxico/ceftazidima
(MC/NA/CAZ), dispensando 0,01 ml de cada dilución a la placa correspondiente, extendiendo el inóculo sobre
la superficie del medio de cultivo con ayuda de una varilla de vidrio en forma de L, para obtener crecimiento
confluente. Incubar las placas a 37°C por 18 a 24 horas, para luego seleccionar aquellas más apropiadas para
efectuar el contaje de colonias y poder establecer la frecuencia con la cual se transfiere la resistencia.
6. Después de la incubación, en las placas de MC se puede observar el crecimiento tanto de la cepa donante
como de la receptora, ya que el medio no contiene ningún agente antimicrobiano que actúe como inhibidor del
crecimiento. Esta placa sirve para controlar que ambos microorganismos estén viables. En la placa de MC/NA
se observa el crecimiento sólo de la cepa receptora ( E. coli NAR), ya que posee resistencia a NA (antibiótico
agregado al medio); esta placa se utiliza para calcular el número total de células receptoras. Por último, en la
125
placa de MC/NA/CAZ se observa el crecimiento sólo de las cepas receptoras (NAR) que han adquirido resistencia
a CAZ, mediante el proceso de conjugación. Esta placa indica el número total de receptoras resistentes a CAZ
y NA (cepas transconjugantes).
7. La frecuencia de transferencia de los plásmidos de resistencia se expresa como la relación entre el número de
colonias transconjugantes resistentes y el número de colonias receptoras totales.
Frecuencia de No. colonias transconjugantes resistentes
=
Transferencia No. total de receptoras totales
8. Para corroborar la transferencia de resistencia a CAZ producida durante la conjugación, se seleccionan 5

colonias aisladas de la placa de MC/NA/CAZ y se siembran cada una en CST. Incubar durante 2-2,5 horas a
37°C hasta alcanzar una turbidez adecuada; posteriormente, realizar un antibiograma y probar el disco de CAZ.
Incubar las placas a 37°C por 18-24 horas y proceder a leer el antibiograma (la cepa transconjugante debe ser
resistente a CAZ).
1. ¿Por qué es importante probar el disco de ácido nalidíxico en la cepa donante antes de realizar un protocolo
de conjugación?
2. Explique que sucedería en los tres grupos de placas si la cepa donante no tuviese un plásmido conjugativo.
3. ¿Qué ocurriría si durante la conjugación se somete el cultivo a una brusca y violenta agitación?
4. ¿Cuáles son los mecanismos utilizados por las bacterias para la transferencia de material genético?. ¿En qué
consiste cada uno?
5. Si en un experimento de conjugación no ocurre transferencia de resistencia. Explique las posibles razones del
fracaso.
6. Observe los resultados del siguiente proceso de conjugación y realice el calculo de la tasa de transferencia.
No de Colonias
Dilución
MC/Na MC/Na/CFP
10-3
Incontables Incontables
10-4 500 520
10-5 375 360
10-6 170 200
7.-Observe los resultados del siguiente proceso de conjugación y realice el cálculo de la tasa de transferencia.
No de Colonias
Dilución
MC/Na MC/Na/CFP
10-3
10-4 280 300
10-5 154 160
10-6 80 90
8.-Observe los resultados del siguiente proceso de conjugación y realice el cálculo de la tasa de transferencia.
No de Colonias
Dilución
MC/Na MC/Na/CFP
10-3
10-4 900 850
10-5 400 430
10-6 220 200
126
UNIDAD VI
CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
Objetivo Terminal
Al finalizar la unidad, el estudiante estará en capacidad de:
 Aplicar las pruebas de laboratorio que se utilizan para la evaluación de la efectividad de los agentes
antimicrobianos in vitro.
EVALUACIÓN DE MÉTODOS FÍSICOS PARA EL
CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
1. Evaluar el efecto del calor y las radiaciones ultravioletas sobre el crecimiento bacteriano.
Efecto del Calor sobre el Crecimiento Bacteriano

El control de la temperatura es un método ampliamente utilizado para el control del crecimiento bacteriano.
Generalmente, cuando se aplica calor sobre las bacterias, éstas mueren; mientras que cuando se usan bajas
temperaturas, el crecimiento se inhibe.
Al aumentar la temperatura y rebasar la temperatura máxima de crecimiento, aparecen los efectos letales.
La muerte por calentamiento es una función exponencial y ocurre rápidamente a medida que la temperatura se
eleva. Estos hechos tienen importantes consecuencias prácticas. Si se desea eliminar todas las células de un cultivo
(esterilizar una población), tomaría más tiempo a temperaturas bajas que a temperaturas elevadas.
Los objetos pueden ser esterilizados ya sea por calor seco, aplicado en un horno de aire caliente, o por calor
húmedo en forma de vapor. De ambos métodos, se prefiere el calor húmedo por su acción destructiva más rápida.
Una temperatura de 80°C durante 5 a 10 minutos destruye las formas vegetativas de todas las bacterias.
La esterilización por calor húmedo puede hacerse de diversas formas: ebullición, tindalización,
pasteurización y vapor a presión (autoclave). De éstas, el vapor a presión es el más eficaz porque permite
temperaturas por encima del punto de ebullición del agua, tales temperaturas son necesarias debido a la alta
resistencia al calor de las esporas de algunas especies bacterianas.
El procedimiento usual es calentar con vapor de agua a presión de 15 libras, a una temperatura de 121°C,
por 15-20 minutos. Si se esterilizan objetos voluminosos, la transferencia del calor a su interior será lenta y el
tiempo de calentamiento debe ser suficientemente largo para que el material esté a 121°C durante 15 a 20 minutos.
En este procedimiento, los microorganismos son destruidos por la alta temperatura que se alcanza cuando el vapor
es sometido a la presión indicada.
La esterilización con calor seco requiere temperaturas más elevadas y un período de calentamiento más
prolongado. El tipo más ampliamente utilizado de calor seco es el horno de aire caliente. Se requiere un tiempo de
esterilización de 2 horas a 180°C para destruir todos los microorganismos, incluyendo los formadores de esporas.
Materiales
 Placas de Petri conteniendo Agar Nutritivo (2 por grupo).

 Termómetro
 Tubos de ensayo
 Vaso de precipitado
 Baño de María
Cultivos
 Bacillus subtilis (24 horas)
 Bacillus subtilis (72 horas)
 Staphylococcus epidermidis
 Escherichia coli
Procedimiento
1. A cada grupo de estudiantes se le asignará un cultivo en caldo de alguno de los microorganismos arriba men-
cionados y dos placas de agar nutritivo (AN).
129
2. Dividir cada una de las placas en cinco (5) secciones y marcarlas de la siguiente manera: tiempo “0”; “15” seg;
“2” min; “5” min y “15” min. Identificar cada una de las placas con las temperaturas de prueba (63°C y 72°C,
respectivamente).
3. Ajustar la temperatura de dos Baños de María, uno a 63°C y el otro a 72°C.
4. Inocular el microorganismo asignado sobre la sección marcada como tiempo “0”, en el segmento correspondiente
de la placa.
5. Inmediatamente, colocar el caldo inoculado dentro del Baño. Después de 15 segundos, retirar el tubo,
resuspender el cultivo e inocular sobre la sección correspondiente en la placa de AN identificada con el tiempo
correspondiente
6. Colocar nuevamente el caldo en el Baño de María y repetir el procedimiento a los 2; 5 y a los 15 minutos.
7. Este procedimiento debe repetirse dos veces; una para incubar los microorganismos a 63°C y la otra, para
incubarlos en el Baño de María a 72°C.
8. Incubar las placas a 35°C durante 24 horas.
9. Registrar los resultados obtenidos en una tabla, de acuerdo a los siguientes criterios: Negativo: sin crecimiento;
Positivo +: crecimiento escaso; Positivo ++: crecimiento moderado y Positivo +++: crecimiento abundante.
10. Interpretar los resultados
Efecto de las Radiaciones sobre el Crecimiento Bacteriano
El ambiente está bombardeado con radiación electromagnética de varios tipos. Esta radiación actúa como
si estuviese compuesta de ondas que se desplazan en el espacio, como las olas lo hacen sobre la superficie del
agua. La distancia entre dos picos o valles de una onda se denomina longitud de onda. A medida que disminuye
la longitud de onda de la radiación electromagnética, aumenta la energía de la radiación. Los rayos gamma y rayos
X son mucho más energéticos que la luz visible o las ondas de infrarrojo.
La luz solar es la principal fuente de radiación de la Tierra. Comprende: luz visible, radiación ultravioleta
(UV), rayos infrarrojos y ondas de radio.
Muchas formas de radiación electromagnética son perjudiciales para los microorganismos. Esto es
especialmente cierto en el caso de las radiaciones ionizantes, de longitud de onda muy corta o de energía
alta, que puede provocar que los átomos pierdan electrones; es decir, que se ionicen. Dos formas principales de
radiación ionizante son: los rayos X, que se producen artificialmente, y los rayos gamma, que se emiten durante
la desintegración de radioisótopos. Aunque los microorganismos son más resistentes a la radiación ionizante que
los organismos superiores, pueden ser destruidos con una dosis suficientemente elevada.
La radiación ultravioleta es un tipo de radiación no ionizante que puede producir la muerte de todas
las clases de microorganismos, debido a su longitud de onda corta (aproximadamente de 10 a 400 nm.) y alta
energía. Sin embargo, la radiación UV no atraviesa eficazmente el cristal, las películas de suciedad, el agua y
otras sustancias. Debido a este inconveniente, la radiación UV se emplea como agente esterilizante en muy pocas
situaciones. Las lámparas UV se utilizan para descontaminar ambientes, como: quirófanos, áreas de procesamiento
de alimentos y, en cabinas de seguridad biológica, para esterilizar el aire y cualquier superficie expuesta. También
se dispone de unidades de UV comerciales para el tratamiento del agua. La longitud de onda más letal corresponde
a 260 nm, debido a que es absorbida más eficazmente por el ADN. El principal mecanismo de destrucción por
radiación UV es la formación de dímeros de timina que inhiben la replicación y función del ADN.
El ADN dañado se puede reparar mediante diferentes mecanismos. En la fotorreactivación, una enzima
fotorreactivadora emplea la luz azul para separar los dímeros de timina. Este proceso se produce en ausencia de
luz y se denomina reactivación oscura. Cuando la exposición a UV es demasiado fuerte, el daño es tan extenso
que no es posible repararlo.
Muchos microorganismos usan pigmentos carotenoides para protegerse frente a la fotooxidación. Los
carotenoides inactivan eficazmente el oxigeno en estado de singlete (molécula con gran poder oxidante, que
destruye rápidamente una célula); es decir, absorben energía de éste y lo convierten de nuevo en estado elemental
no excitado.
130
Materiales
 Placas de Petri conteniendo Agar Nutritivo (2 por grupo).

 Hisopos de algodón estériles
 Materiales de cobertura: gasa, papel, tela, papel aluminio, vidrio transparente, plástico.
 Lámpara UV (265 nm).
Cultivos
 Serratia marcescens
 Bacillus subtilis
 Staphylococcus aureus
 Escherichia coli
Procedimiento
1. Asignar a cada grupo de estudiantes, uno de los cultivos arriba mencionados.
2. Inocular con un hisopo, la superficie de cada placa de AN, con el cultivo en caldo del microorganismo de
prueba. Para garantizar una completa cobertura de la superficie del agar, rayar la superficie del medio en dos
direcciones. Rotular las placas como: “A” y “B”.
3. Retirar la tapa de las placas inoculadas y cubrir la mitad con uno de los materiales de cobertura.
4. Colocar cada placa directamente debajo de la luz UV, dejando aproximadamente 24 cm. entre la lámpara y la
cobertura.
Placa A: Exponer por 30 seg
Placa B: Exponer por 15 seg
5. Incubar las dos placas, a 22°C o a temperatura ambiente durante 24 horas (la placa B en oscuridad).
6. Transcurrido el tiempo de incubación, examinar todas las placas y anotar los resultados.
7. Interprete los resultados obtenidos.
1. Compare la sensibilidad al calor del cultivo joven de Bacillus subtilis y el cultivo viejo de éste mismo
microorganismo, explique y razone su respuesta.
2. ¿Qué ventajas presenta un microorganismo pigmentado frente a uno no pigmentado en relación a la exposición
a la luz UV?
3. Explique el mecanismo de acción bactericida de la luz UV.
4. Explique ¿por qué la placa B fue incubada en oscuridad, razone su respuesta?
131
EVALUACIÓN DE DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS
1. Evaluar la efectividad del lavado y cepillado de las manos.

2. Explicar la importancia de las medidas de asepsia en el laboratorio de Bacteriología.
Generalidades
La estructura de la piel y la capa grasa que recubre las manos, dificultan la remoción de los microorganismos
presentes en ella; por lo que el uso de jabón y cepillo ayudan a eliminar la capa oleaginosa y por ende, las bacterias
existentes.
El personal que labora en instituciones dispensadoras de salud, debe lavarse las manos antes y después
de atender a un paciente. Estas recomendaciones también deben ser seguidas por las personas que trabajan en
laboratorios donde se manipulan muestras biológicas. El lavado y cepillado de las manos con agua y jabón durante
10 a 15 minutos, remueve la microflora transitoria.
En este ejercicio, se evaluará la efectividad del lavado de la piel de las manos con agua y jabón.
Materiales
 Agar Nutritivo en placa (AN).(2 por grupo)

 Cepillo de lavado.
 Diferentes tipos de jabones antisépticos y de tocador.
Procedimiento:
1. Tomar dos placas de AN y rotularlas, una como agua y la otra como jabón, colocando el nombre del jabón a
evaluar; dividir cada una de las placas en cuatro cuadrantes y marcarlas del 1 al 4.
2. Comenzar con la placa rotulada como agua, tocando la primera sección con los dedos sin lavar; lavar las
manos solo con agua, escurrir el exceso y tocar la sección 2.
3. Sin secar sus dedos, repetir el lavado efectuado en la sección 2 y tocar la sección 3; lavar por tercera vez las
manos sólo con agua y tocar la sección 4.
4. Para trabajar con la placa marcada como jabón, se emplea la otra mano. Lavar con agua y jabón, enjuagar y
escurrir el exceso y tocar la sección 1.
5. Repetir el procedimiento efectuado en el paso anterior y tocar la sección 2.
6. Usando un cepillo, cepillarse las manos con agua y jabón, por 2 minutos enjuagar bien, eliminar el exceso, y
tocar la sección 3.
7. Efectuar el mismo procedimiento del paso 6 pero durante 4 minutos, y colocar los dedos en la sección 4.
8. Incubar las placas a una temperatura de 35-37°C, durante 24 horas, observar el crecimiento y reportarlo de
la siguiente forma: Negativo: sin crecimiento; Positivo +: crecimiento escaso; Positivo ++: crecimiento
moderado y Positivo +++: crecimiento abundante.
9. Interprete los resultados obtenidos.
1. ¿En qué difiere la microflora normal de la transitoria?

2. Compare los resultados obtenidos en el laboratorio entre un jabón en barra y uno líquido y entre un jabón líqui-
do y un gel antibacterial.
3. Si la mayoría de la microbiota normal y la transitoria no son dañinas, explique ¿por qué las manos deben ser
lavadas y cepilladas antes de cualquier cirugía?.
132
PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD Y RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ANTIBIÓTICOS
Objetivos específicos:
1. Realizar apropiadamente los diferentes métodos para determinar la susceptibilidad y resistencia de las
bacterias a los antibióticos.
2. Interpretar los resultados obtenidos por los métodos utilizados.
3. Reportar adecuadamente los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos.
Generalidades
El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las funciones más
importantes de los laboratorios de Microbiología Clínica. Esto se realiza mediante las pruebas de sensibilidad o
antibiograma, cuyo principal objetivo es evaluar la respuesta de un microorganismo frente a varios antibióticos.
El antibiograma define la actividad in vitro de un antibiótico frente a un microorganismo determinado
y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una población bacteriana. El resultado de la prueba de
susceptibilidad, la farmacología del antimicrobiano, el sitio de la infección y los aspectos clínicos del paciente,
sustentan la elección de las drogas adecuadas para el tratamiento de las enfermedades infecciosas.
El panorama actual de la resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos hace ineludible su
determinación. Cada laboratorio de microbiología establecerá según su estructura, demanda asistencial y política
de antibióticos, un esquema de organización y técnicas de trabajo que aseguren la realización e información
posterior de los antibiogramas.
Los ensayos de sensibilidad deben estar estandarizados y sujetos a procesos de control de calidad que
aseguren su reproducibilidad. En la presente actividad, se estudiarán los métodos básicos utilizados para el estudio
de la sensibilidad, así como los criterios para su interpretación y control de acuerdo al CLSI.
Indicaciones para la realización de las Pruebas de Susceptibilidad
Es preciso realizar en el laboratorio las pruebas de sensibilidad antimicrobiana porque son una ayuda
invaluable para la selección del agente apropiado para el tratamiento de la infección. Como en los últimos años se
ha venido observando una mayor frecuencia de resistencia bacteriana, es menester, hacer un estudio de cuál es el
agente causal de la infección y cuál es la droga indicada para éste. Sin embargo, algunos tratamientos se hacen de
manera empírica, sin conocer estos dos factores y las consecuencias pueden ser: 1) crear resistencia a las drogas,
y 2) destruir la flora normal bacteriana.
Existen microorganismos que mantienen su sensibilidad original a algunas drogas, por lo que en esos
casos, la terapia empírica es totalmente reconocida y no es necesario realizar pruebas de sensibilidad. Por
ejemplo, los estreptococos Grupo A han permanecido sensibles a penicilina G, al igual que los meningococos;
desafortunadamente, esto es cada vez menos común.
Las pruebas de sensibilidad pueden ser necesarias cuando aún, conociéndose la sensibilidad del
microorganismo a drogas altamente efectivas, el paciente no puede recibir dicho tratamiento. Por ejemplo, en
casos de infecciones por estreptococo grupo A, en pacientes alérgicos a penicilina, se debe probar la sensibilidad
a otros antibióticos alternativos como eritromicina y otros macrólidos.
Sin embargo, los patrones de resistencia cambian en forma constante. No importa cuan rápidamente se
introduzcan los nuevos agentes terapéuticos, las bacterias parecen estar dispuestas a sobrepasarlos.
Métodos para determinar la Susceptibilidad Bacteriana a los Antibióticos
a. Dilución en caldo
b. Dilución en agar
c. Difusión del disco en agar
d. Métodos de Gradiente de Antibióticos
e. Otras pruebas
133
A. Método de dilución en caldo

Este método fue descrito en los años 1940 y a pesar de ser una de las primeras técnicas en ser descritas, es
aún considerada como método de referencia. En este método se colocan concentraciones decrecientes del agente
antimicrobiano, generalmente diluciones al doble (1:2), en tubos que contienen un medio de cultivo líquido (caldo)
que sostendrá el desarrollo del microorganismo de prueba. El caldo más comúnmente utilizado para estas pruebas
es el Müeller-Hinton suplementado con cationes magnesio y calcio.
Los agentes antimicrobianos se preparan en soluciones concentradas en un solvente adecuado, y luego
se diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones apropiadas. Los solventes más utilizados para preparar las
soluciones madre de los antibióticos a probar son: buffer fosfato pH 6,0 ó 8,0/0,1 M; etanol, HCl 0,04-0,05 N;
metanol; NaOH 1 M ó 2,5 M. Los diluyentes más empleados son: agua destilada y buffer fosfato.
Un inóculo estándar del microorganismo (1 x 105 UFC/ml) se agrega a un volumen igual (por lo general,
1 ml) de cada concentración de antibiótico y a un tubo con caldo sin antimicrobiano que servirá de control de
crecimiento. Luego de la incubación adecuada, se observa la turbidez de los caldos, que indicará desarrollo del
microorganismo. La bacteria crecerá en el tubo control y en todos los caldos que no contengan suficiente antibiótico
como para inhibir su desarrollo.
El método de dilución es un método cuantitativo para determinar la Concentración Inhibitoria Mínima
(CIM) y la Concentración Bactericida Mínima (CBM) del antibiótico probado. La CIM se define como la
menor concentración del antibiótico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano. Se expresa en microgramos por
mililitro del antibiótico (µg/ml). Por CBM, se entiende la mínima concentración del antibiótico que destruye el
99,99% de las bacterias probadas. Se conoce también como Concentración Letal Mínima (CLM).
Si la concentración del antimicrobiano representada por la CIM puede ser alcanzada fácilmente en el suero
del paciente por las vías normales de administración, se dice que el microorganismo es sensible a ese agente. Por
el contrario, si la CIM es mayor que el nivel alcanzable, o se encuentra dentro de los límites de toxicidad para el
hospedador, se dice que el microorganismo es resistente a este agente antimicrobiano.
Existen dos modalidades de las pruebas de dilución en caldo: la macrodilución y la microdilución.
Método de Macrodilución:
Procedimiento
1. Rotular con números del 1 al 10, diez tubos estériles.
2. Agregar a los tubos 2 al 10, 0,5 ml de Caldo Soya Tripticasa (CST).
3. Agregar a los tubos 1 y 2, 0,5 ml de una dilución previamente preparada del antibiótico con una concentración
de 100 µg/ml ó de 200 µg/ml (tubo 1: control del antibiótico; siempre deberá estar claro).
4. Mezclar bien el contenido del tubo 2 y traspasar 0,5 ml al tubo 3. Mezclar bien y traspasar 0,5 ml para el tubo
4 y, así sucesivamente, hasta llegar al tubo 9. De este último tubo, tomar 0,5 ml y descartarlos. De esta manera,
se obtienen diluciones seriadas al doble, desde 100 µg/ml hasta 0,4 µg/ml; ó de 200 µg/ml hasta 0,8 µg/ml. El
tubo 10 no contiene antibiótico y servirá como control de crecimiento microbiano.
5. Agregar a todos los tubos 0,5 ml de una suspensión bacteriana estandarizada*(105 bacterias/ml).
6. Incubar los tubos de prueba a 35°C por 18-24 horas.
7. Una vez transcurrido el período de incubación, se examinan los tubos en busca de crecimiento, el cual se
evidencia por la presencia de turbidez. La CIM se interpreta como la concentración del antibiótico, contenida
en el primer tubo de la serie, que inhibe el crecimiento bacteriano (Figura 26).
*Estandarización del inóculo

Inocular un CST a partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba (4 ó 5 colonias) e incubar
a 35°C por 18-24 horas. Transcurrido este tiempo, comparar la turbidez con el estándar 0,5 de McFarland que
contiene aproximadamente 1,5 x 108 células bacterianas/ml Ajustar la turbidez si es necesario, utilizando para ello,
CST ó SSF estéril). De esta dilución, preparar una dilución 1:100, tomando 0,1 ml de la suspensión estandarizada
y traspasarla a un tubo que contenga 9,9 ml de SSF (la concentración bacteriana será ahora de 106 células/ml,
aproximadamente). De aquí, preparar una dilución 1:10, tomando 1 ml de la suspensión anterior y traspasarlo a un
134
tubo conteniendo 9,00 ml de CST. Mezclar bien. Esta dilución contiene un estimado de 105 células bacterianas/ml
y será utilizada para la inoculación de las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos por el método de dilución
en caldo. 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml
Descartar
Solución del
Antibiótico
1024 µg/ml
0,5 ml
Caldo MH
Concentración 512 256 128 64 32 16 8 4 2 0
del ATB
µg/ml
0,5 ml Inóculo estandarizado
Figura 26: Método de Macrodilución
Digitalización
Preparación de los Estándares Nefelométricos de McFarland
1. Preparar 10 tubos de ensayo de igual tamaño y buena calidad que hayan sido cuidadosamente lavados y
enjuagados.
2. Preparar ácido sulfúrico puro al 1%.
3. Preparar una solución acuosa de cloruro de bario puro al 1%. Mantenga la suspensión en agitación continua
mientras agrega el BaCl2.
4. Colocar en los tubos, las cantidades de cada solución indicadas en el cuadro siguiente, completando un volumen
final de 10 ml por tubo:
Tubo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Cloruro de Bario (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Ácido Sulfúrico (ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0
Densidad celular aproximada (108UFC/ml) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
Para preparar el inóculo estandarizado, diluir a la mitad (1:2) el tubo Nº 1 de McFarland. Verificar la densidad
óptica del estándar, usando un espectrofotómetro con un paso de luz de 1 cm. El estándar 0,5 de McFarland debe
tener una absorbancia de 0,08-0,13 a 625 nm. Mantenga los estándares herméticamente cerrados a temperatura
ambiente y al abrigo de la luz. Agite vigorosamente el estándar en agitador mecánico (vórtex) antes de su uso para
logar una turbidez homogénea. Este estándar contiene aproximadamente 1,5 x 108 UFC/ml
Método de Microdilución
Los métodos descritos anteriormente, pueden ser utilizados para estudiar muchos tipos de bacterias tanto
aerobias como anaerobias; pero son lentos y laboriosos. Para cada sistema bacteria-antibiótico debe prepararse
una serie completa de tubos, lo cual hace prohibitivo probar más de unos pocos antimicrobianos frente a cada cepa
aislada de un paciente. Sin embargo, la adaptación del método de dilución en caldo a una técnica de microdilución
ahorra reactivos y tiempo del operador.
Este procedimiento es semejante, en principio, al método de macrodilución en caldo, excepto en que
la susceptibilidad de los microorganismos a los antibióticos es determinada en una serie de orificios que están
moldeados en una placa plástica. Cada placa puede contener 80, 96 ó más orificios.
Las ventajas de este método son el uso de pequeños volúmenes de reactivos y el gran número de bacterias
que pueden ser probadas de forma simple y poco costosa.
El examen de las microplacas se efectúa directamente sobre una fuente de luz o se leen observando el fondo
sobre un lector con espejo. Aunque las microplacas se preparan empleando el mismo medio de crecimiento y las
135
mismas concentraciones de antimicrobianos, existe una diferencia importante. El inóculo bacteriano, 5 x 105 UFC/
ml, disminuye considerablemente en cada microcubeta, dado el pequeño volumen sembrado. Estas microcubetas,
por lo general, tienen una capacidad de 0,1 ml, por lo tanto el inóculo final será 5 x 104 UFC/ml
El inóculo pequeño también hace difícil determinar la CBM, ya que el número de UFC puede no ser
suficiente para permitir la determinación del 99,99% de destrucción bacteriana; por lo que se recomienda que los
micrométodos se empleen sólo para la determinación de la CIM y que los resultados de la CBM, se obtengan por
la técnica de macrodilución.
Ventajas y Limitaciones de los Métodos de Dilución en Caldo

Se consideran de referencia para la determinación cuantitativa de la actividad de los antimicrobianos.
Son los métodos adecuados, cuando además de la actividad inhibitoria, se quiere determinar también, la actividad
bactericida. En comparación con los métodos de difusión, son técnicamente más complejos y casi siempre más
costosos, en particular cuando se utilizan paneles comerciales de microdilución.
Proceda a realizar la determinación de la CIM por el método de dilución en caldo a los microorganismos
de prueba. Registre los valores de CIM obtenidos para cada microorganismo y antibiótico.
B. Método de Dilución en Agar

Este método ha sido exitosamente adaptado para su uso de rutina en los laboratorios. Consiste en probar
concentraciones seleccionadas de antibióticos. Se diferencia del anterior, únicamente en el medio de cultivo; aquí,
se utiliza agar. Se inocula una suspensión estandarizada de bacterias en una serie de placas, cada una con una
concentración determinada de antibiótico. Aquellos microorganismos susceptibles a la concentración dada de
antibiótico, no crecen; mientras que los organismos resistentes, crecerán produciendo colonias.
Procedimiento
1. Rotular las placas de Petri con las concentraciones de antibióticos que se desean probar, incluyendo una marcada
como 0 µg/ml (libre de antibiótico, control de crecimiento bacteriano). Para cada serie de concentraciones, se
debe incluir al comienzo y al final de la misma, placas de medio sin antibiótico que servirán para controlar el
crecimiento y la posibilidad de contaminación.
2. Preparar el medio de cultivo a utilizar, generalmente agar Müeller-Hinton; pero en función de los
microorganismos y de sus necesidades nutritivas puede ser necesario, añadir algún suplemento a este medio
o utilizar un medio diferente.
3. Previo a la esterilización, el agar fundido es distribuido en tubos estériles con tapa de rosca, en alícuotas
que permitan obtener las diluciones deseadas del antibiótico (generalmente, 19 ml de medio por 1 ml de
la correspondiente concentración del antibiótico); de manera que, para placas de 100 mm de diámetro son
necesarios, 20 ml de medio con antibiótico).
4. Esterilizar los tubos conteniendo el medio a 121ºC a 15 libras de presión por 15 minutos y estabilizar luego
en Baño de María a 45-50ºC. Añadir los suplementos (si es necesario).
5. Agregar el antibiótico a cada tubo. Mezclar por inversión.
6. El medio conteniendo antibióticos, se vierte cuanto antes en las placas de Petri estériles, evitando la formación
de burbujas que dificultaría la posterior inoculación de las placas.
7. Dejar solidificar el medio en las placas, las cuales se utilizarán inmediatamente o se almacenarán en
refrigeración a 4-8°C, en bolsas plásticas.
8. Antes de la inoculación, las placas se deben dejar a temperatura ambiente unos 30 minutos, comprobando que
no existe agua de condensación en la superficie de las mismas.
9. Preparación del Inóculo: el inóculo recomendado se prepara con una suspensión bacteriana estandarizada
con el tubo 0,5 de McFarland que contiene aproximadamente 108 UFC/ml, que posteriormente se diluye 1:10
para ajustar la concentración a 107 UFC/ml
136
10. Una vez que se ha preparado el inóculo, las placas debe sembrarse antes de los 15-30 minutos, para evitar que
la demora pueda provocar cambios significativos en el tamaño del inóculo. La inoculación puede hacerse de
dos maneras: utilizando un asa calibrada estéril o un dispositivo de inoculación (replicador), el cual dispensa
0,001 ó 0,002 ml de la suspensión bacteriana en la superficie de las placas de agar. De esta forma, se depositan
cerca de 1 x 104 UFC por gota sobre la superficie del agar que contiene las diferentes concentraciones de los
agentes antimicrobianos. Para la inoculación, se deben preparar las series de placas de modo que se comience
inoculando un control sin antibióticos, se continúa inoculando a partir de la placa con mayor concentración de
antibiótico y se finaliza sembrando una nueva placa de control sin antibiótico.
11. Cada una de las cepas a probar, se debe sembrar por rayado en una placa sin antibiótico para comprobar la
pureza de las mismas.
12. Las placas inoculadas se dejarán a temperatura ambiente hasta que las gotas de inóculo estén secas.
13. Incubar las placas a 35ºC durante 16-24 horas.
14. Luego de la incubación en condiciones apropiadas, los microorganismos se desarrollarán en aquellas placas
que no contengan suficiente concentración de antibiótico para inhibir su crecimiento. La CIM es la mayor
dilución (menor concentración) del antibiótico que inhibe el crecimiento bacteriano.
Ventajas y Limitaciones del Método de Dilución en Agar

Es un método bien estandarizado con resultados confiables y reproducibles que puede utilizarse como
referencia para evaluar la exactitud de otros sistemas de prueba. Adicionalmente, permite probar simultáneamente
varios aislamientos y detectar más fácilmente, contaminación de los cultivos que los métodos de dilución en
caldo. La mayor desventaja es que consume mucho tiempo y es muy laborioso. Además, no permite determinar la
CBM.
C. Método de Difusión del Disco en Agar (Método del Disco Unico de Alta Potencia o Método de Baüer y
Kirby)
Es el método estandarizado debido a que se economiza tiempo y dinero, hay facilidad y reproducibilidad
en los resultados, además, da un margen de seguridad del 96%.
Fundamento
Este método utiliza discos de papel de filtro impregnados con antibiótico. Inmediatamente que los discos
son colocados sobre la superficie del medio de cultivo, previamente inoculado con el microorganismo de prueba,
el antibiótico difunde de manera radial, creando una reducción logarítmica en la concentración del antibiótico. Si
la bacteria es sensible al efecto del antibiótico, se producirá un halo de inhibición del crecimiento alrededor del
disco; en caso contrario, la bacteria crecerá normalmente.
Los diámetros de los halos de inhibición han sido correlacionados con las CIM de los antibióticos, obtenidas
por pruebas de dilución seriada con inóculos bacterianos estandarizados.
El método de difusión del disco en agar es utilizado de rutina para la determinación de la susceptibilidad
antimicrobiana; pero la CIM y la CBM determinadas mediante pruebas de dilución se están convirtiendo en rutinarias,
especialmente cuando existen infecciones severas en pacientes hospitalizados y se requiere una información más
exacta; siendo particularmente útiles en pacientes sépticos, inmuno-comprometidos, con meningitis o endocarditis
bacteriana, en pacientes que no responden al tratamiento de elección y en aquellos que requieren altas dosis de
antibióticos potencialmente tóxicos para el tratamiento de la infección.
Procedimiento
1. Se toman 4 ó 5 colonias de la bacteria aislada en cultivo puro y se inocula un CST (3-4 ml).
2. Incubar el CST a 35°C por 18-24 horas (mínimo 2-8 horas), con el objeto de obtener una suspensión bacteriana
de 108 UFC/ml, aproximadamente. Dicha concentración es similar al tubo N° 0,5 de McFarland.
3. Si es necesario, ajustar la turbidez del CST, empleando para ello SSF estéril o CST.
4. Cuando se obtiene esta concentración aproximada de bacterias, se procede a inocular el medio de cultivo. Se
recomienda el Agar Müeller-Hinton (MH)*, el cual se ambienta 30 minutos antes de su inoculación. Para este
137
fin, la suspensión bacteriana se toma con un hisopo de algodón estéril, el cual se rota contra las paredes del tubo,
antes del sembrarlo en forma masiva, para eliminar el exceso de líquido.
*Nota: se recomienda el agar MH para las bacterias no exigentes; en caso de estreptococos pueden emplearse
modificaciones como el MH enriquecido con 5% de Sangre (MHS) y para microorganismos más exigentes como
Haemophilus, se recomienda el Haemophilus Test Medium (HTM) y para Neisseria, el Gelosa Chocolate Isovitalex
(GCI). Lo ideal es tener un medio de cultivo de bajo contenido de cationes (magnesio y calcio); ya que éstos
afectan la actividad de los ciertos antibióticos, tales como: aminoglicósidos y tetraciclinas; y además, el medio no
debe presentar variación entre lotes.
5. Inocular a manera de césped toda la superficie del agar, rotando la placa en ángulos de 60°, al igual que el
hisopo.
6. Después de 3-5 minutos el inóculo está seco y con ayuda de una pinza flameada a la llama del mechero, colocar
cada uno de los discos de antibióticos sobre la superficie del agar. Hacer ligera presión con la pinza para
asegurar la adherencia del disco a la superficie del agar. Puede utilizarse un dispensador de discos, que es un
instrumento que permite colocar varios discos simultáneamente.
7. Una vez colocados todos los discos, incubar las placas en la estufa a 35°C por 18-24 horas.
8. La lectura e interpretación de las zonas de inhibición se hace de acuerdo al diámetro de la zona donde no ha
crecido la bacteria, la cual se determina al medir con una regla por la parte dorsal de la placa de Petri.
8. Los resultados se expresan de manera cualitativa en tres categorías, como: Resistente (R), Sensible (S) o
Intermedio (I), según los resultados obtenidos en las tablas correspondientes del CLSI (ver anexo 1).
La categoría sensible implica que una infección dada por las cepas en estudio puede ser tratada
apropiadamente con la dosis de antibiótico recomendada para el tipo de infección y el agente causal, a menos que
existan contraindicaciones.
La categoría intermedio, incluye cepas que pueden ser inhibidas por concentraciones más elevadas del
antibiótico, siempre que la dosis usada pueda ser incrementada (por ejemplo, β-lactámicos) o que sean concentrados
fisiológicamente en el tejido infectado, por ejemplo, β-lactámicos y quinolonas en orina. También indica una zona
“buffer” que debería evitar que pequeños factores técnicos difíciles de controlar causen mayores discrepancias de
interpretación, especialmente, para drogas con limitado margen fármaco-tóxico.
La categoría resistente indica que las cepas no son inhibidas por las concentraciones séricas normalmente
alcanzadas a las dosis habituales y la eficacia clínica no ha sido comprobable.
Interpretación de los resultados:

El tamaño de la zona de inhibición que se observa en una prueba de difusión en agar no tiene significado
por sí mismo. Las normas interpretativas provistas por el CLSI, derivan de una correlación entre las medidas de las
zonas y las CIM de aquellas especies que pueden ser estudiadas mediante un método de difusión en agar.
Ventajas del Método de Difusión en Agar

1. Su técnica es de fácil ejecución y sus resultados son reproducibles.
2. Los reactivos utilizados son relativamente económicos.
3. No requiere equipos especiales.
4. Sus resultados son de fácil interpretación.
5. Presenta flexibilidad en la selección de los antibióticos a probar.
Limitaciones del Método de Difusión en Agar

1. Ha sido estandarizado para un reducido espectro de microorganismos.
2. Sus resultados son de carácter cualitativo y no cuantitativo.
3. Sólo permite probar una concentración de cada antibiótico.
138
Figura 27 Método de Difusión en Agar

Digitalización
Proceda a realizar un antibiograma por la técnica de Kirby & Baüer a una bacteria gramnegativa y uno
grampositiva, según le indique su profesor. Registre los diámetros de los halos de inhibición obtenidos para cada
microorganismo y antibiótico (mm). Interprételos y reporte correctamente los resultados obtenidos.
D. Métodos de Gradiente de Antibióticos

Estos métodos combinan los principios de la técnica de difusión del disco y la dilución en agar. Utilizan
tiras de plástico no poroso, de 6 cm de largo x 5 mm de ancho, impregnadas de antibiótico, presentes en un
gradiente de concentración predefinido, las cuales son colocadas en la superficie del medio de cultivo previamente
inoculado y que, una vez incubadas en condiciones apropiadas por el tiempo conveniente, van a producir zonas de
inhibición del crecimiento con forma elipsoidal y simétrica. El punto donde la elipse toca la escala graduada de la
tira, indica directamente, la CIM del antibiótico en cuestión.
Estos métodos incluyen: E-TEST® (PDM-Epsilometer Test, Ab Biodisk; Suecia) y el M.I.C.E: Minimal
Inhibitory Concentration Evaluator (OxoidTM).
Procedimiento
1. Preparar un inóculo estandarizado de manera similar al utilizado en el método de Kirby & Baüer (1,5 x 108
UFC/ml).
2. Durante los 15 minutos posteriores al ajuste del inóculo, introducir un hisopo estéril dentro de la suspensión
y al retirarlo, rotar varias veces contra la pared del tubo por encima del nivel del líquido con la finalidad de
eliminar el exceso de inóculo. Inocular las placas de agar MH uniformemente, sin dejar ninguna zona libre.
3. Dejar absorber el inóculo de 10-15 minutos para asegurarse que la superficie del agar esté completamente seca
antes de aplicar las tiras. Este punto es crítico para optimizar la realización de la prueba.
4. Tanto si se utiliza el aplicador de las tiras como las pinzas, se debe asegurar que la escala de CIM esté
orientada hacia arriba y que la máxima concentración esté cercana al extremo de la placa. Asegúrese que la
tira contacte completamente con la superficie del agar. Elimine las gotas de aire que puedan encontrarse por
debajo de la tira presionándola ligeramente con las pinzas. Es importante no mover la tira una vez que han
sido colocadas en la superficie del agar; ya que el antibiótico empieza a difundir rápidamente.
5. Cuando se utiliza una placa de Petri de 100 mm. de diámetro, deposite sólo dos tiras por placa; mientras que
cuando se utilizan placas de 150 mm. No se deben colocar más de 6 tiras y siempre deben disponerse de
manera radial.
6. Por lo general, las placas son incubadas inmediatamente. La temperatura, tiempo y atmósfera de incubación
utilizadas deben ser óptimas para el crecimiento de la especie bacteriana en estudio.
7. Lectura de los resultados: después del período de incubación, leer la CIM en el punto de intersección entre
el extremo de inhibición de la elipse y la tira con el antibiótico.
8. Cuando el crecimiento tiene lugar a lo largo de toda la tira y no se observa formación de la elipse de inhibición,
la CIM se informará como superior al valor máximo de la escala de lectura y, por el contrario, cuando la elipse
139
de inhibición se encuentre por debajo de la tira, debe ser informado como inferior al valor mínimo de la escala
de lectura (Figuras 28 y 29).
CIM CIM
Figura 28: Método de Gradiente de Antibióticos (E-test®) Figura 29: Método de Gradiente de Antibióticos (M.I.C.ETM)
Ventajas y Limitaciones de los Métodos de Gradiente

En contra de lo que ocurre en el método de difusión de Kirby & Baüer, donde la orientación del disco no
tiene importancia; en los métodos de gradiente si la tira está al revés, no se observa elipse de inhibición ya que el
gradiente de concentraciones se sitúa sólo sobre una de las caras de la tira.
Los métodos de gradiente, se consideran como un método alternativo para el estudio cuantitativo de la
sensibilidad antimicrobiana. Del mismo modo, cabe destacar, su sencillez y buena correlación con la técnica
estándar de dilución en caldo o agar para el estudio de la CIM. Esta es una técnica sumamente fácil de ejecutar y
de interpretar; pero tiene la desventaja que las tiras son sumamente costosas.
Proceda a realizar la determinación de la CIM por el método de gradiente de antibióticos a los

microorganismos que le indique su profesor. Registre los valores de CIM obtenidos para cada microorganismo y
antibiótico. Repórtelos correctamente e interprete los resultados.
E.- Otras pruebas
Pruebas para detectar beta-lactamasas
Las beta-lactamasas (β-lactamasas) son enzimas bacterianas heterogéneas que rompen el anillo β-lactámico
de las penicilinas, cefalosporinas y otros antibióticos del grupo, dando lugar a compuestos sin actividad
antibacteriana. Se encuentran en una amplia variedad de especies bacterianas Gram positivas y Gram negativas.
Pueden estar localizadas en los cromosomas bacterianos o en los plásmidos que pueden transferirse de una bacteria
a otra. Se dice que son constitutivas, cuando están presentes en ausencia del antibiótico, a menudo en grandes
cantidades; o inducibles, cuando son producidas sólo después que la bacteria ha tenido contacto con el antibiótico.
Algunas afectan de forma predominante a las penicilinas; otras, a las cefalosporinas; mientras que algunas poseen
una actividad más amplia.
La presencia de estas enzimas puede detectarse rápidamente, indicando en forma temprana que el
aislamiento no responderá a los antibióticos β-lactámicos.
La mayoría de los métodos para detectar la presencia de β-lactamasas, se basan en los cambios químicos
producidos en la molécula de penicilina y cefalosporinas al ser hidrolizado el anillo β-lactámico:
a) Por formación de un grupo carboxílico extra que da un compuesto diácido (ácido penicilinoico) que puede
ser detectado usando un indicador de pH o por su habilidad para reducir el yodo.
b) Por detección microbiológica de la baja actividad antibacteriana del producto formado.
c) Por cambio en la disposición de electrones en la molécula de una cefalosporina cromogénica al ser
hidrolizada, observándose un cambio de color atribuido al producto formado.
De estos métodos, el más utilizado es el de la cefalosporina cromogénica que se explica a continuación:
140
Método de la Cefalosporina Cromogénica (Nitrocefina):

La nitrocefina es una cefalosporina cromogénica, cuyo color amarillo es atribuido al sustituyente dinitrotirilo
en la posición 3 de su molécula. Al ser hidrolizada por las β-lactamasas, cambia su color al rojo intenso debido a
la formación de una base de Shiff cromogénica dada por la fuerte conjugación del anillo β-lactámico y la doble
ligadura en el anillo dihidrotiazina con el grupo dinitrotiril.
El método cromogénico es altamente específico; aunque está limitado por la capacidad de hidrólisis que
ejerzan las β-lactamasas sobre la nitrocefina; la cual generalmente, se comercializa en forma de discos. Estos
deben colocarse sobre un portaobjetos de vidrio o placa de Petri y rehidratarse con 1 ó 2 gotas de agua destilada.
La aparición de un color rojo intenso en 1-2 minutos después de colocar 2-3 colonias de un cultivo puro del
microorganismo de prueba sobre la superficie de los discos, indicará la presencia de β-lactamasa.
En ocasiones, se emplea una solución de nitrocefina 0,5 mM que se prepara disolviendo 2,56 mg de
nitrocefina en 9,5 ml de búffer fosfato 0,1 M, pH 7,0 y 0,5 ml de dimetilsulfóxido. La prueba suele realizarse
emulsionando las colonias del microorganismo a estudiar en 20 µl de la solución de nitrocefina. La aparición de un
color rojo intenso en 1-2 minutos, indicará la presencia de β-lactamasa.
También existen sistemas comerciales en los que la nitrocefina viene prefijada en barritas plásticas que son
impregnadas con el microorganismo de prueba y en caso de que el microorganismo sea β-lactamasa positivo, se
observará la aparición de un color rojo en el extremo de la barrita. Este es el caso del β-lactamase Touch Strip
(OXOIDTM) (Figura 30).
Figura 30: Detección de β-lactamasas

(β-lactamase Touch Strip (OXOIDTM)
Negativa; Positiva
Digitalización
Proceda a investigar la producción de β-lactamasas, por el método de la cefalosporina cromogénica, en las
cepas bacterianas que le indique su profesor. Registre e interprete los resultados.
1. Defina: a) Antibiograma; b) CIM y c) CBM

2. ¿El método de difusión en agar determina actividad bacteriostática o bactericida?. Explique brevemente.
3. Indique en qué fase del crecimiento un microorganismo es más sensible a los antibióticos.
4. ¿Por qué el método de difusión en agar no es un indicador perfecto de cómo actuará la droga in vivo?¿Qué otros
factores deben ser considerados antes de usar un agente quimioterápico in vivo?
5. Explique ¿Qué efecto tendría la administración de tetraciclina durante el curso de una terapia con penicilina?
6. Señale las ventajas y desventajas de los diferentes métodos utilizados para determinar la susceptibilidad de
las bacterias a los antibióticos. Indique ¿Por qué debe utilizarse un inóculo estandarizado en las pruebas de
susceptibilidad?
7. ¿Cuáles son los controles que se utilizan en la determinación de la CIM?. ¿Para qué sirven?
8. ¿En qué casos está indicado realizar pruebas de sensibilidad antimicrobiana?
9. En una prueba de dilución seriada en caldo, se obtuvo los siguientes resultados que fueron registrados como (+)
si hubo crecimiento y (-) sin crecimiento. Indique: ¿Cuál es la CIM?¿Cuál es la CBM? ¿Qué antibiótico es más
efectivo contra el microorganismo probado?
141
Antimicrobiano Dilución Crecimiento Subcultivo

1:10-1:70 - -
1:80 - -
A 1:90 - +
1:100 - +
1:200-1:500 + +
1:10-1:150 - -
1:160 - +
B 1:170 + +
1:180 + +
1:190-1:500 + +
142
UNIDAD VII
INTERACCIÓN BACTERIA-HOSPEDERO
Objetivo Terminal:
 Verificar la presencia de flora normal en diferentes sitios anatómicos del cuerpo humano.
FLORA NORMAL
1. Observar las formas bacterianas de la flora normal presentes en diversas muestras de origen humano.
Generalidades
Normalmente, los microorganismos crecen abundantemente dentro y en la superficie del cuerpo humano.
Esta población microbiana se conoce como “flora normal, autóctona, indígena o habitual”.
Según las condiciones de permanencia y colonización en el organismo, dentro de la flora habitual, se
pueden considerar dos grupos: la “flora residente”, constituida por microorganismos relativamente constantes
en un área determinada y la “flora transitoria”, que incluye microorganismos, generalmente provenientes del
ambiente, no específicos, que pueden permanecer en piel o mucosas, durante un período relativamente corto (horas,
días o semanas) y de poca significación desde el punto de vista ecológico.
En el útero, el feto es estéril; la colonización microbiana del recién nacido comienza inmediatamente
después del nacimiento, en el paso a través del canal del parto, por el contacto con la madre, medio ambiente y
otros seres humanos. Inicialmente, es colonizado por una gran variedad de microorganismos, dependiendo de
diversos factores ambientales; sólo semanas después, la flora microbiana del infante es similar a la del adulto.
La relación entre la microflora normal y una persona saludable puede ser clasificada como una de dos
tipos de simbiosis (asociación estrecha entre dos organismos): comensalismo o mutualismo. En una relación
de comensalismo, un organismo es beneficiado y el otro resulta ileso. Por ejemplo, muchas bacterias que viven
en el intestino grueso, utilizan como nutrientes algunos productos de la digestión de los alimentos; mientras el
hospedero no es beneficiado, ni dañado.
En una relación de mutualismo, ambos organismos son beneficiados. Por ejemplo, los miembros de la flora
residente intestinal reciben un suministro constante de nutrientes, a la vez que sintetizan vitamina K, intervienen en
la producción de pigmentos y de ácidos biliares, absorción de nutrientes y desdoblamiento de productos, así como
en el antagonismo a patógenos microbianos.
Un tercer tipo de asociación biológica es el parasitismo. En esta relación, uno de los organismos se
beneficia y el otro, se perjudica. En la enfermedad infecciosa, el microorganismo es un parásito que produce daño
al hospedador. Este microorganismo recibe el nombre de patógeno.
Algunos miembros de la microflora normal se convierten en patógenos bajo ciertas condiciones. Estos
organismos se conocen como oportunistas.
Flora Normal del Cuerpo Humano
Las regiones anatómicas del cuerpo humano colonizadas por microorganismos comprenden: piel y mucosas,
oído externo, tracto respiratorio superior, tracto gastrointestinal y parte externa del aparato genito-urinario.
Los órganos y regiones del cuerpo generalmente libres de microorganismos (áreas anatómicas normalmente
estériles) son: el tracto respiratorio inferior, uretra posterior, cérvix, sangre y otros líquidos orgánicos, sistema
nervioso y huesos, entre otros.
No existe un patrón sobre la distribución de los microorganismos en el cuerpo humano, ya que esto depende
de una serie de variables difícilmente controlables. En la tabla 2 aparecen los microorganismos más frecuentemente
encontrados formando parte de la flora normal de las diferentes zonas anatómicas.
145
Tabla 2
Flora Normal predominante en diferentes Áreas Anatómicas
Sitios del cuerpo Microflora
S. aureus (escaso)
S. epidermidis
Piel y mucosas
Streptococcus grupo viridans
Bacillus sp.
Corynebacterium sp.
Oído Externo S. aureus
S. epidermidis
Corynebacterium sp.
Moraxella sp.
Ojo Neisseria sp.
S. epidermidis
Neisseria sp.
Lactobacillus sp.
S. epidermidis
Corynebacterium sp.
Bacteroides sp.
Fusobacterium sp.
Tracto Respiratorio Superior Prevotella sp.
Cantidades menores de los siguientes cuando se acompañan de los microorganismos antes
mencionados:
Haemophilus influenzae
Streptococcus pneumoniae
S. aureus
Bacilos Gram negativos
N. meningitidis.
Enterobacterias, excepto Salmonella, Shigella y Yersinia,
Streptococcus α hemolíticos y no hemolíticos.
Bacteroides sp.
Bacillus sp.
Clostridium sp.
Tracto Gastro intestinal
Fusobacterium sp.
Lactobacillus sp.
Peptostreptococcus sp.
Bacilos Gram negativos no fermentadores de la glucosa.
Enterococcus sp.
Corynebacterium sp.
Lactobacillus sp.
Streptococcus α hemolíticos y no hemolíticos.
Enterococcus sp.
Tracto Genito-urinario
Enterobacterias
S. epidermidis
Anaerobios (Prevotella, Clostridium, Bacteroides, Peptostreptococcus)
146
Materiales
 Placas conteniendo agar sangre humana (una por grupo)

 Hisopos con torunda de algodón estériles
 Tubos conteniendo SSF
 Depresores linguales
 Colorantes de Gram
 Láminas portaobjeto
Procedimiento
A cada grupo le corresponderá la toma y procesamiento de muestras provenientes de diferentes áreas
anatómicas. Para la obtención de dichas muestras, proceda según se describe a continuación:
Exudado Faríngeo
1. Seleccionar para la toma de muestra a un estudiante que no presente signos de faringitis; es decir, aparentemente
sano.
2. Bajo visión directa, con la ayuda de un depresor lingual, presionar la lengua hacia abajo para observar los
pilares de la faringe y el área tonsilar.
3. Utilizando un hisopo, frotar las criptas tonsilares y la pared posterior de la faringe, evitando tocar la mucosa
oral, lengua o úvula.
4. Inocular directamente una placa de agar sangre, e incubar en aerobiosis a 35-37°C durante 24 horas.
5. Pasado el período de incubación, realizar la lectura del cultivo, observando los diferentes tipos de colonias
presentes. Seleccionar varias colonias y realizar un frotis coloreado con Gram de cada una de ellas. Anote los
resultados.
Boca
1. Con la ayuda de un hisopo estéril, frotar varias zonas de la boca.
2. Inocular directamente una placa de agar sangre. Incubar a 35-37°C, durante 24 horas en aerobiosis.
3. Pasado el período de incubación, observar la morfología colonial y seleccionar varios tipos de colonias a partir
de las cuales debe realizar frotis coloreados con Gram. Observar y anotar los resultados.
Piel
1. Utilizando un hisopo, previamente humedecido en SSF, frotar un área determinada de la piel (cuello, axilas).
2. Inocular directamente sobre una placa de agar sangre, e incubar en aerobiosis a 35-37°C durante 24 horas.
presentes. Seleccionar varias colonias y realizar un frotis coloreado con Gram de cada una de ellas. Anotar los
resultados.
Exudado Nasal
1. Inserte un hisopo, previamente humedecido en SSF, dentro de las fosas nasales. Rotar el hisopo contra la
mucosa nasal.
2. Inocular directamente sobre una placa de agar sangre, e incubar en aerobiosis a 35-37°C durante 24 horas.
presentes. Seleccionar varias colonias y realizar un frotis coloreado con Gram de cada una de ellas. Anote los
resultados.
1. Mencione los tipos de microflora normal y diga en qué se diferencian.
2. Mencione tres microorganismos que forman parte de la flora normal de piel, tracto respiratorio superior y
tracto gastrointestinal.
3. Mencione tres áreas anatómicas normalmente estériles.
4. Defina microorganismos oportunistas.
5. De acuerdo a los resultados obtenidos en la práctica, indique en cuales sitios anatómicos, se observó mayor
cantidad de flora normal. Razone y justifique su respuesta.
147
UNIDAD VIII
CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO
Objetivo Terminal:
 Aplicar correctamente el control de calidad en la preparación de medios de cultivo

PREPARACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO
1. Preparar adecuadamente medios de cultivo utilizados para el crecimiento de bacterias.

2. Identificar las posibles causas de error en la preparación de medios de cultivo.
3. Practicar correctamente las pruebas de control de calidad de medios de cultivo en el laboratorio de
Bacteriología.
Generalidades
Para estudiar debidamente los microorganismos se requiere cultivarlos en condiciones de laboratorio.
Para lograr esto, es preciso conocer cuales son los nutrientes y las condiciones físicas que requieren para su
crecimiento. Mediante investigaciones extensas se han determinado las necesidades nutricionales de las bacterias,
y esta información ha permitido el desarrollo de numerosos medios de cultivo. Ya que las necesidades nutricionales
de las bacterias varían de manera muy amplia, existen diferencias importantes en cuanto a la composición de los
medios empleados. Las bacterias también presentan notables diferencias en lo que respecta a las condiciones del
ambiente que favorecen su proliferación.
Medios de Cultivo
Son sustancias de origen natural o sintético, sólidos o líquidos, que le proporcionan a los microorganismos,
los nutrientes necesarios para su crecimiento.
Algunas bacterias pueden crecer bien en cualquier medio de cultivo; otras, son más exigentes y requieren
medios especiales que contengan factores de crecimiento y, algunas, no son capaces de desarrollarse en ninguno
de los medios artificiales disponibles hasta ahora.
Los microorganismos que se multiplican en o sobre la superficie de un medio de cultivo, constituyen un
cultivo.
Características de los Medios de Cultivo
a) Contener los nutrientes esenciales en la proporción adecuada para soportar el crecimiento de los
microorganismos: fuente de energía, de carbono y de nitrógeno, oligoelementos, factores de crecimiento y
agua.
b) Poseer una cantidad adecuada de sal (generalmente, en forma de cloruro de sodio) para estabilizar el medio.
c) Tener humedad suficiente para permitir la proliferación de las formas vegetativas de los microorganismos.
d) Estar libre de sustancias inhibidoras para el microorganismo a cultivar.
e) Poseer un pH adecuado para el metabolismo del microorganismo. La mayoría de las bacterias crecen mejor
a pH neutro o cercano a la neutralidad (6,8-7,1); pero los hongos crecen a pH más ácidos.
f) El medio, originalmente, debe ser estéril (libre de toda forma de vida) a fin de garantizar que sólo los
microorganismos inoculados estén presentes en el medio.
g) Poseer una consistencia adecuada (sólido, semisólido o líquido).
h) Finalmente, debe ser incubado en condiciones apropiadas: temperatura, atmósfera y tiempo.
Conservación de los medios de cultivo deshidratados

Una amplia variedad de medios de cultivo está actualmente disponible para el crecimiento de los
microorganismos en el laboratorio. La mayor parte de estos medios, poseen componentes pre-mezclados que sólo
requieren la adición de agua y esterilización. Constantemente, estos medios son evaluados para optimizar su uso
en el aislamiento e identificación de microorganismos de interés en los diferentes campos microbiológicos de
aplicación.
151
Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos y la absorción de agua del exterior, así como la
formación de agua dentro de la botella, como consecuencia de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente,
favorecen el crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al consumo de nutrientes, variaciones de pH y cambios
en el color del medio. Además, la exposición a la luz puede llevar a importantes alteraciones en los constituyentes
del medio. En consecuencia, los medios de cultivo deshidratados deben conservarse siempre en sitio fresco y seco,
protegidos de la luz. Los frascos con tapa de rosca, deben cerrarse bien después de cada toma.
Utilizando condiciones de almacenamiento adecuadas, los medios deshidratados tienen una vida útil de
al menos 1 año. Si se observan alteraciones sustanciales, tales como: hidratación, endurecimiento, presencia de
grumos y cambio de color, deben descartarse.
Precauciones Especiales en la Preparación de los Medios de Cultivo
La preparación de medios de cultivo para uso en el laboratorio, a partir de medios deshidratados, es
esencialmente una simple manipulación dirigida por unos cuantos principios de sentido común. El procedimiento
requiere precisión, exactitud y atención hacia la pureza y la esterilidad, las cuales son consideraciones rutinarias
para el personal de Bacteriología. Debe tenerse especial cuidado en relación con:
 Medios deshidratados: Registrar en el recipiente, la fecha de recepción y de apertura. Almacénelos como
se indica en la etiqueta, con escasa luz, baja humedad ambiental y con el recipiente correctamente tapado.
Asegúrese de que las características físicas del polvo son las típicas y adecuadas antes de su empleo.
 Equipo: Utilizar material de vidrio, en perfectas condiciones, totalmente limpio, y que haya sido aclarado
con agua destilada o desionizada. Los equipos utilizados como dispositivos de medida, escalas, medidores
de pH y autoclaves, deben ser frecuentemente calibrados con precisión.
 Agua: usar agua destilada o desionizada libre de plomo, cloro, cobre y detergentes.
Técnica de Preparación de Medios de Cultivo
 Pesar con exactitud la cantidad de medio deshidratado requerido, según las indicaciones del fabricante.
 El grado de disolución de un medio deshidratado, así como la eficacia del mismo ya preparado, depende
en gran medida del procedimiento empleado en la rehidratación. Se recomienda disolver completamente
en el volumen adecuado de agua, utilizando recipientes con capacidad que duplique el volumen final del
medio a preparar. Si el medio va a distribuirse en tubos, debe agitarse constantemente para asegurar una
adecuada homogenización al momento de repartirlo.
 Calentar a temperatura de ebullición los medios que contienen agar o gelatina para disolverlos
completamente. Los medios con agar, particularmente aquellos que lo contienen en poca cantidad, pueden
hervir de forma inesperada y repentina y derramarse fuera de la fiola. Durante el calentamiento, se debe
agitar frecuente pero suavemente, para evitar el sobrecalentamiento del medio y la pérdida de su valor
nutritivo. Los medios líquidos (no contienen agar) no requieren calentamiento.
 Verificar el pH del medio y, si es necesario, ajustarlo
 Cuando se va a esterilizar deben seguirse las instrucciones de tiempo, presión y temperatura para la
obtención de medios de cultivo óptimos: 121°C, 15 libras de presión, por 15 minutos, son suficientes
para la mayoría de los medios. Cuando se preparan medios termolábiles deben utilizarse otros métodos de
esterilización, por ejemplo: filtración o tindalización.
 Estabilizar el medio en Baño de María a una temperatura entre 45-55°C para disminuir gradualmente
la temperatura y evitar la solidificación del agar y la formación de agua de condensación. Los medios
líquidos, luego de repartidos, se esterilizan en el autoclave y no requieren estabilización.
 Añadir asépticamente las sustancias enriquecedoras o aditivos. Estos suplementos (sangre, hemoglobina,
entre otros), son sensibles al calor, se añaden al medio después de la esterilización y la estabilización para
evitar el deterioro del enriquecimiento debido al calor. Mezclar cuidadosamente, evitando la formación de
burbujas o espuma.
 Repartir asépticamente el medio en las placas de Petri o en tubos de ensayo.
 Dejar solidificar a temperatura ambiente (si el medio contiene agar).
152
 Rotular todos los medios preparados, tanto en placas como en tubos, indicando la fecha de preparación.
 Almacenar el medio preparado a la temperatura indicada por el fabricante. El almacenamiento a 4°C es
adecuado para la mayoría de los medios. Sin embargo, medios de cultivo como el caldo tioglicolato y
agar sangre anaerobiosis deben guardarse a temperatura ambiente. Deben ajustarse bien las tapas, una vez
cerrados los tubos y colocar las placas preparadas, de forma invertida, en bolsas plásticas para evitar la
evaporación excesiva de la humedad del medio.
 Los medios deben mantenerse preferiblemente en sitios oscuros, ya que la luz puede afectar algunos de
sus componentes.
Fuentes de Error en la Preparación de Medios de Cultivo
 Medio inadecuado: dado que los medios suelen estar dispuestos por orden alfabético en un estante, es
posible seleccionar inadvertidamente un frasco equivocado o un suplemento inadecuado, con lo cual el
medio resulta no apto para su uso. Es siempre importante leer el rótulo, particularmente cuando se recibe
en el laboratorio un nuevo lote de medios.
 Agua: se debe medir cuidadosamente la cantidad de agua que se añade al reconstituir el medio. Dado
que las impurezas hacen inapropiada el agua corriente para la mayoría de los medios biológicos, los
laboratorios deben usar agua destilada, desionizada o que haya recibido ambos tratamientos.
 Pesaje: emplear balanzas adecuadas para pesar los medios deshidratadados (en polvo). Los errores de
pesaje alteran significativamente la composición y el pH final del medio.
 Distribución de los medios: los medios deben repartirse exacta y asépticamente en placas y tubos. La
medición errónea de la cantidad a dispensar, puede ocasionar, por ejemplo, un medio de agar con espesor
demasiado fino o grueso, siendo ambos inadecuados para su empleo.
 Esterilización: un error común en la preparación de los medios de cultivo es la esterilización a una
temperatura demasiado elevada y/o durante un período demasiado largo. Esto puede producir el deterioro
o descomposición de algunos componentes de los medios haciéndolos inadecuados.
 Material de vidrio: se debe tener la precaución de utilizar material de vidrio limpio; ya que los residuos
adheridos al vidrio pueden inhibir, particularmente, algunos microorganismos exigentes.
Control de Calidad de Medios de Cultivo
Todo programa de control de calidad para medios de cultivo persigue asegurar que un medio respalde
el desarrollo de los microorganismos de interés, exhibir una respuesta bioquímica típica, ser estable y tener un
tiempo de preservación razonable.
La calidad de cada lote de medio de cultivo preparado se prueba antes de su uso, mediante la inoculación
de microorganismos cuyas reacciones se conocen. Las cepas de control deben verificarse para corroborar su
pureza, sembrándolas en placas de agar.
Los procedimientos en Bacteriología dependen de que los microorganismos viables en el cultivo sean
capaces de mantener sus características morfológicas, fisiológicas y que sean típicas, estables y reproducibles.
Existen varias fuentes de cultivos de referencia que pueden utilizarse para el Control de Calidad:
 American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, USA.
 National Collection of Type Culture (NCTC), Inglaterra.
 Nacional Collection of Industrial Bacteria (NCIC) Survey, Inglaterra.
 Japanese Federation of Culture Collection of Microorganisms (JFCC), Japón.
 Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos (CVCM) en Caracas, Venezuela.
También pueden utilizarse cepas puras aisladas en el laboratorio, si son conservadas, se les caracteriza
adecuadamente y sus reacciones son bien verificadas y reproducibles.
El Control de Calidad de un medio de cultivo incluye:
 Prueba de esterilidad
 Prueba de desarrollo
 Prueba de inhibición
153
 Prueba de respuesta bioquímica

Prueba de Esterilidad:
Todos los medios deben ser estériles cuando se inoculan. Cada lote de medio preparado en el laboratorio,
debe ser controlado para asegurar su esterilidad. Esta prueba se realiza incubando una muestra (1-5%) del lote de
medio preparado, en la estufa durante 24-48 horas a 35ºC. Si al efectuar la prueba no se produce crecimiento, la
prueba de esterilidad es positiva.
Si aparece contaminación en el medio, la prueba de esterilidad es negativa, pues hubo crecimiento en el
medio (sin inocular) como resultado de esterilización inadecuada. En estos casos, debe repetirse el procedimiento
con otro porcentaje igual del lote y si el resultado persiste, el medio se descarta, no puede ser utilizado. En caso
contrario, si puede utilizarse el medio; ya que la contaminación pudo ser accidental.
Los medios utilizados para realizar las pruebas de esterilidad deben descartarse al ser completada la
prueba; ya que son inadecuados para la inoculación a causa de la deshidratación producida luego de 24-48 horas
de incubación.
Prueba de Desarrollo
Tiene por finalidad determinar la capacidad del medio de cultivo, de respaldar el crecimiento de
microorganismos, inoculándolos con un típico aislamiento de reserva. Cuando se prueba la capacidad del medio
de respaldar desarrollo, debe utilizarse una suspensión diluida. Esta suspensión va a dar mayor seguridad de que el
medio es adecuado para el desarrollo de un pequeño número de microorganismos presentes en una muestra.
Este inóculo se prepara resuspendiendo varias colonias en SSF hasta obtener una turbidez igual a la del
estándar 0,5 de McFarland, posteriormente, se realiza una dilución 1/100 (0,1 ml de la suspensión estandarizada +
9,9 ml de SSF). Inocular el medio con 10 µl de la suspensión.
Posteriormente, incubar a 35°C x 24-48 horas; transcurrido este tiempo debe observarse el medio, para
buscar el desarrollo de colonias en la superficie del agar si es un medio sólido; o la presencia de turbidez en el
caldo, si es un medio líquido; en cuyo caso la prueba se considerará como positiva. Un resultado positivo indica
que el medio es capaz de respaldar el crecimiento (desarrollo) de un microorganismo aunque se encuentre presente
en una baja concentración.
Por el contrario, si la prueba es negativa (no hay crecimiento bacteriano) debe proceder a repetirse la
prueba, verificando cada una de las variables intervinientes, como por ejemplo: la viabilidad del microorganismo
de prueba y las condiciones de incubación de la prueba, entre otras. Si el resultado negativo persiste, el medio debe
descartarse. Si el resultado es positivo, el resto del lote de medio preparado, puede utilizarse en el laboratorio para
el cultivo de muestras biológicas.
En ciertos medios de cultivo selectivos, como es el caso del MC, XLD, SSA y TCBS, la prueba de
desarrollo lleva implícita una prueba de respuesta bioquímica ya que el microorganismo al desarrollarse en el
medio, puede producir diferentes tipos de colonias de acuerdo a sus características metabólicas.
Prueba de Inhibición
Se aplica a los medios selectivos y de enriquecimiento. Para demostrar el efecto inhibidor del medio se
utiliza un inóculo abundante; ya que si el medio va a impedir el desarrollo de un gran inóculo, va a inhibir el
pequeño número de microorganismos que pueden estar presentes en la muestra primaria.
Este inóculo se prepara suspendiendo varias colonias en SSF hasta obtener una turbidez igual a la del
estándar 0,5 de McFarland. Posteriormente, se realiza una dilución 1/10 (1 ml de la suspensión estandarizada +
9,00 ml de SSF). Inocular el medio con 10 µl de la suspensión.
Posteriormente, incubar a 35°C x 24-48 horas; transcurrido este tiempo debe observarse el medio, para
verificar la ausencia de crecimiento; en cuyo caso, la prueba se considerará como positiva. Un resultado positivo,
indica que el medio es capaz de inhibir el crecimiento (desarrollo) de un microorganismo aunque se encuentre
presente en alta concentración.
Por el contrario, si la prueba es negativa (presencia de crecimiento bacteriano) debe proceder a repetirse
la prueba. Si resultado negativo persiste, el medio debe descartarse. Si el resultado es positivo, puede utilizarse en
el laboratorio para el cultivo de muestras biológicas.
154
Prueba de Respuesta Bioquímica

Al inocular medios empleados para verificar una reacción específica, tal como fermentación de
carbohidratos o producción de H2S, por ejemplo, es necesario usar cepas puras de características bioquímicas
conocidas, a fin de verificar que esas características puedan ser expresadas por el microorganismo al desarrollarse
en un medio de cultivo determinado.
Generalmente, se utilizan cepas que permitan verificar las diferentes reacciones potencialmente observables
en un determinado medio de prueba y no debe realizarse dilución de las mismas; ya que lo importante, es detectar
la reacción metabólica expresada por el microorganismo, más no, su crecimiento o desarrollo.
La Tabla 3 puede considerarse como guía a la hora de efectuar el Control de Calidad a un medio de cultivo
en particular:
Tabla 3
Pruebas de control de calidad de Medios de Cultivo
Prueba de Control de Calidad

Medio Respuesta
Esterilidad Desarrollo Inhibición
Bioquímica
Basal x x
Selectivo* x x x
Diferencial x x
Enriquecido x x
Indicador x x
Enriquecimiento x x x
Transporte x x
* Nota: Para ciertos medios de cultivo selectivos, que contienen carbohidratos e indicadores de pH en su
composición, tales como: MC, XLD, SSA y el TCBS, la prueba de desarrollo, lleva ímplicita la de respuesta
bioquímica; puesto que pueden evidenciarse distintas reacciones metabólicas del microorganismo en el medio de
cultivo.
A cada grupo le corresponderá la preparación de uno o varios medios de cultivo. Prepárelos según las
indicaciones del fabricante y efectúe las pruebas de control de calidad correspondientes según el tipo de medio.
Reporte e interprete los resultados obtenidos.
1. Explique los pasos para la preparación de un medio de cultivo, resaltando las diferencias entre los medios de
cultivo líquidos y sólidos.
2. ¿Por qué los medios de cultivo líquidos no requieren estabilización?
3. Indique ¿por qué los suplementos deben ser añadidos al medio después de la estabilización.
4. Mencione algunos medios de cultivo que no pueden esterilizarse en autoclave.y explique ¿por qué?
5. ¿Qué importancia tiene el control de calidad de medios de cultivo en el laboratorio de Bacteriología?
6. Explique ¿por qué a los medios selectivos y diferenciales se les aplica pruebas de inhibición y respuesta
bioquímica?.
7. ¿Qué finalidad tiene la aplicación de la prueba de desarrollo en medios enriquecidos?
8. ¿Por qué algunos medios de cultivo no requieren esterilización?.
155
ANEXOS
ANEXO 1: TABLA DE INTERPRETACIÓN DEL DIÁMETRO DE LA ZONA DE INHIBICIÓN PARA
DISCOS DE ANTIBIÓTICOS
Potencia del Interpretación del diámetro de la zona de inhibición (mm)
Agente antimicrobiano Código
disco Resistente Intermedio Susceptible
Amikacina AN-30 30µg
Enterobacteriaceae, P. aeruginosa
Acinetobacter y staphylococcus ≤ 14 15 - 16 ≥ 17
Amoxicilina/Ac Clavulánico AMC-30 20/10µg
Enterobacteriaceae ≤ 13 14 – 17 ≥ 18
Staphylococcus spp. ≤ 19 --- ≥ 20
Ampicilina AM-10 10µg
Enterobacteriaceae y V. cholerae ≤ 13 14 - 16 ≥ 17
Staphylococcus spp. ≤ 28 --- ≥ 29
Enterococcus spp ≤ 16 --- ≥ 17
Listeria monocytogenes ≤ 19 --- ≥ 20
Haemophilus spp. ≤ 18 19 - 21 ≥ 22
Ampicilina/Sulbactam SAM-20 10/10µg
≤ 11 12 - 14 ≥ 15
Acinetobacter y staphylococci
Azitromicina AZM-15 15µg
Staphylococcus spp. ≤ 13 14 - 17 ≥ 18
Haemophilus spp --- --- ≥ 12
Aztreonam ATM-30 30µg ≤ 16 --- ≥ 17
Enterobacteriaceae, P. aeruginosa Acinetobacter ≤ 16 --- ≥ 17
Carbenicilina CB-100 100µg
Enterobacteriaceae y Acinetobacter ≤ 19 20 - 22 ≥23
P. aeruginosa ≤ 13 14 - 16 ≥ 17
Cefaclor CEC-30 30µg ≤ 13 14 - 16 ≥ 17
Enterobacteriaceae y stapylococci ≤ 14 15 - 17 ≥ 18
Haemophilus spp 30µg ≤ 16 17 - 19 ≥ 20
Cefamandol MA-30 30µg

Cefazolina CZ-30 30µg
Cefdinir CDR-5 5µg
Haemophilus spp. --- --- ≥ 20
Enterobacteriaceae y staphylococci ≤ 16 17 - 19 ≥ 20
Cefepime FEP-30 30µg
Acinetobacter y staphylococci ≤ 14 15 - 17 ≥ 18
N. gonorrhoeae --- --- ≥ 31
Streptococci (no-S. pneumoniae) ≤ 23 24 - 25 ≥ 26
Cefixima CFM-5 5µg
Enterobacteriaceae ≤ 15 16 - 18 ≥ 19
Cefmetazol CMZ-30 30µg
159
N. gonorrhoeae ≤ 27 28 - 32 ≥ 33
Cefonicid CID-30 30µg
Haemophilus spp ≤ 16 17 - 19 ≥ 20
Cefoperazona CFP-75 75µg
Cefoperazona/sulbactam CFP/S 75/30µg
Cefotaxima CTX-30 30µg
Streptococci (no-S pneumoniae) ≤ 25 26 - 27 ≥ 28
Cefotetan CTT-30 30µg
N. gonorrhoeae ≤ 19 20 - 25 ≥ 26
Cefoxitina FOX-30 30µg
N. gonorrhoeae ≤ 23 24 - 27 ≥ 28
Cefpodoxima CPD-10 10µg
Cefprozil CPR-30 10µg
Ceftazidima CAZ-30 30µg
Ceftibuten CTB-30 30µg
Ceftizoxima ZOX-30 30µg
Enterobacteriaceae,P. aeruginosa
Acinetobacter y staphylococci ≤ 14 15- 19 ≥ 20
Ceftriaxona CRO-30 30µg
160

Cefuroxima(sodio) CXM-30 30µg
N. gonorrhoeae ≤ 27 28 - 32 ≥ 33
Cefalotina CF-30 30µg
Enterobacteriaceae y staphylococci ≤ 14 15- 17 ≥ 18
Cloranfenicol C-30 30µg
Acinetobacter y staphylococci
Enterococci y V. cholerae ≤ 12 13 - 17 ≥ 18
S. pneumoniae ≤ 20 --- ≥ 21
Cinoxacina CIN-100 100µg
Ciprofloxacina CIP-5 5µg
Acinetobacter, staphylococci y enterococci ≤ 15 16 - 20 ≥ 21
N. gonorrhoeae ≤ 27 28 - 40 ≥ 41
Claritromicina CLR-15 15µg
Stapylococcus spp ≤ 13 14 - 17 ≥ 18
Streptococci ≤ 16 17 - 20 ≥ 21
Clindamicina CC-2 2µg
Stapylococcus spp ≤ 14 15 - 20 ≥ 21
S pneumoniae y otros streptococci ≤ 15 16 - 18 ≥ 19
Colistina CL-10 10µg ≤8 9 - 10 ≥ 11
Enoxacina ENX-10 10µg
N. gonorrhoeae ≤ 31 32 - 35 ≥ 36
Eritromicina E-15 15µg
Staphylococcus spp y enterococci ≤ 13 14 - 22 ≥ 23
Fosfomicina FOS-200 200µg
E. coli y E. faecalis solamente ≤ 12 13 - 15 ≥ 16
Gentamicina
Enterococcus spp. GM-120 120µg ≤6 7-9 ≥ 10
Para alto nivel de resistencia
P. aeruginosa, Acinetobacter y staphylococci ≤ 12 13 - 14 ≥ 15
N. gonorrhoeae ≤ 27 28 - 36 ≥ 37
Imipenem IPM-10 10µg
161
Kanamicina K-30 30µg
Enterobacteriaceae y staphylococci. ≤ 13 14 - 17 ≥ 16
Levofloxacina LVX-5 5µg
Acinetobacter, staphylococci y enterococci. ≤ 13 14 - 16 ≥ 17
Haemophilus spp.
Lomefloxacina LOM-10 10µg
Enterobacteriaceae
Acinetobacter y stapylococci ≤ 18 19 - 21 ≥ 22
N. gonorrhoeae ≤ 26 27 - 37 ≥ 38
Loracarbef LOR-30 30µg
Meropenem MEM-10 10µg
Acinetobacter y stapylococi ≤ 13 14 - 15 ≥ 16
Mezlocilina MZ-75 75µg
Enterobacteriaceae y Acinetobacter ≤ 17 18 - 20 ≥ 21
P. aeruginosa ≤ 15 --- ≥ 16
Minociclina MI-30 30µg
Moxalactam
Acinetobacter y stapylococci ≤ 14 15 - 22 ≥ 23
Nafcilina NF-1 1µg
Staphylococcus aureus ≤ 10 11 - 12 ≥ 13
Acido Nalidíxico NA-30 30µg
Neomicina N-30 30µg ≤ 12 13 - 15 ≥ 16
Netilmicina NET-30 30µg
Nitrofurantoina F/M-300 300µg
Enterobacteriaceae, staphylococci y enterococci ≤ 14 15 - 16 ≥ 17
Norfloxacina NOR-10 10µg
Novobiocina NB-30 30µg
Enterobacteriaceae y staphylococci. ≤ 14 15 - 16 ≥ 17
Ofloxacina OFX-5 5µg
162
N. gonorrhoeae ≤ 24 25 - 30 ≥ 31
S pneumoniae y otros streptococci no β-hemolíticos ≤ 12 13- 15 ≥ 16
Oxacilina OX 1µg
S. aureus; S. lugdunensis < 10 11 - 12 >13
SCN (excepto S. lugdunensis) < 24 - > 25
Penicilina P-10 10U
Stapylococcus spp ≤ 28 --- ≥ 29
Enterococcus ≤ 14 --- ≥ 15
L. monocytogenes ≤ 19 20- 27 ≥ 28
N. gonorrhoeae ≤ 26 27 - 46 ≥ 47
Streptococci (no-S pneumoniae) ≤ 19 20 - 27 ≥ 28
Piperacilina PIP-100 100µg
Piperacilina/ Tazobactam TZP-110 100/10µg
Staphylococcus spp y P. aeruginosa ≤ 17 --- ≥ 18
Polimixina B PB-300 300U ≤8 9 - 11 ≥ 12
Rifampina RA-5 5µg
Staphylococcus spp y Enterococcus ≤ 16 17 - 19 ≥ 20
S pneumoniae ≤ 16 17 - 18 ≥ 19
Sparfloxacina SPX-5 5µg
Staphylococcus ≤ 15 16 - 18 ≥ 19
S pneumoniae ≤ 15 16 - 18 ≥ 19
Espectinomicina SPT-100 1µg
N. gonorrhoeae ≤ 14 15- 17 ≥ 18
Estreptomicina
Enterococci S-300 300µg ≤6 7- 9 ≥ 18
Para altos niveles de resistencia
Enterobacteriaceae S-100 10µg ≤ 11 12- 14 ≥ 15
Sulfisozaxol G-25 25µg
Acinetobacter, staphylococci y V. cholerae ≤ 12 13 - 16 ≥ 17
Tetraciclina Te-30 30µg
Enterobacteriaceae P. aeruginosa
Acinetobacter, staphylococci
Enterococci y V. cholerae ≤ 14 15 - 18 ≥ 19
N. gonorrhoeae ≤ 30 31 - 37 ≥ 38
Ticarcilina TIC-75 75µg
Ticarcilina/ Acido
TIM-85 75/10µg
Clavulánico
163
Staphylococcus spp ≤ 22 --- ≥ 23
Tobramicina NN-10 10µg
Trimetoprim TMP-5 5µg
Trimetoprim/ 1,25µg
SXT-100
Sulfametoxazol 23,75µg
Acinetobacter, staphylococci y V. cholerae ≤ 10 11 - 15 ≥ 16
S pneumoniae ≤ 15 16 - 18 ≥ 19
Vancomicina Va-30 30µg
Staphylococcus spp --- --- ≥ 15
Enterococcus spp ≤ 14 15 - 16 ≥ 17
S. pneumoniae y otros streptococci --- --- ≥ 17
164
ANEXO 2: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO DE USO FRECUENTE EN
BACTERIOLOGÍA
AGAR SANGRE HUMANA (ASH):
(Usando como base agar soya tripticasa).
Fórmula en gramos/litro):
Digesto pancréatico de caseína.....................................................................15,00 g

Digesto pancréatico de harina de soya...........................................................5,00 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
pH final: 7,3 + 0,2
Preparación:
1. Suspenda 40 gramos en 950 ml de agua destilada o desionizada y caliente hasta la ebullición, mezclando
suavemente para que se disuelva por completo.
2. Esterilice en autoclave a 121ºC durante 15 minutos a 15 libras de presión.
3. Enfríe hasta 45–50ºC y añada asépticamente 5% (50 ml) de sangre humana defribrinada estéril.
4. Mezcle a fondo, evitando la formación de burbujas de aire y dispense en placas de Petri estériles.
Uso:
El ASH es usado para el aislamiento y cultivo de los estreptococos y otros microorganismos de crecimiento
fastidioso. Permite también, la detección de la actividad hemolítica. Este medio deriva sus nutrientes de la infusión
de peptonas que suministra compuestos nitrogenados y de carbono, azufre, vitaminas e ingredientes traza. El
cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico del medio.
Control de Calidad:
 Streptococcus pyogenes: crecimiento, β-hemólisis.

 Streptococcus pneumoniae: crecimiento, α-hemólisis.
 Staphylococcus aureus: crecimiento
 Escherichia coli: crecimiento.
AGAR GELOSA CHOCOLATE (GC)

Fórmula en gramos/litro:
Digesto pancreático de caseína.........................................................................7,5 g

Digesto péptico de tejido animal......................................................................7,5 g
Almidón de maíz..............................................................................................1,0 g
Fosfato dipotásico.............................................................................................4,0 g
Fosfato monopotásico.......................................................................................1,0 g
Agar................................................................................................................10,0 g
pH: 7,2 + 0,2
165
Preparación:
1. Suspenda 72 gramos del polvo deshidratado en 900 ml de agua destilada para preparar una base de doble
concentración. Mezcle vigorosamente.
2. Caliente con agitación frecuente y deje hervir un minuto para que se disuelva completamente el agar.
3. Esterilice por autoclave a 121ºC por 15 minutos a 15 libras de presión.
4. Esterilice por autoclave 100 ml de una solución de Hemoglobina (2%).
5. Enfríe la solución a 50ºC en Baño de María.
6. Añada 2 ml de Isovitalex a la base y luego añada la solución de Hemoglobina.
7. Mezcle cuidadosamente y reparta en placas de Petri (aproximadamente 20 ml por placa) evitando la formación
de burbujas.
Uso:
Es un medio enriquecido usado para el aislamiento y cultivo de microorganismos fastidiosos, especialmente
Neisseria y Haemophilus. Contiene peptona de caseína y de carne como fuente de nutrientes, buffer fosfato
para controlar el pH y almidón de maíz para neutralizar los ácidos grasos tóxicos que pudieran estar presentes
en el agar. Se añade como suplemento: hemoglobina e isovitalex. El primero, provee el factor X (hemina) para
especies de Haemophilus y el segundo, provee el factor V (nicotamida-adenina- dinucleótido) para especies de
Haemophilus y además, vitaminas, aminoácidos, coenzimas, glucosa, iones férricos y otros factores que mejoran
el crecimiento de neiserias patógenas.
Control de Calidad:
 Neisseria gonorrhoeae: crecimiento

 Neisseria meningitidis: crecimiento
 Haemophilus influenzae: crecimiento
 Streptococcus pneumoniae: crecimiento
AGAR MC CONKEY (MC)

Digesto pancreático de gelatina........................................................17,0 g

Digesto pancreático de caseína...........................................................1,5 g
Digesto péptico de tejido animal.........................................................1,5 g
Lactosa..............................................................................................10,0 g
Mezcla de sales biliares.......................................................................1,5 g
Cloruro de sodio..................................................................................5,0 g
Agar.....................................................................................................3,5 g
Rojo neutro........................................................................................0,03 g
Cristal violeta..................................................................................0,001 g
pH final: 7,1+ 0,2
Preparación:
1. Suspender 50 gramos del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Mezcle hasta que se obtenga una
suspensión uniforme.
2. Calentar suavemente, agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC y
15 libras de presión por 15 minutos.
3. El medio estéril fundido se estabiliza a 45–50°C, en Baño de María y se dispensa en placas de Petri estériles.
Uso:
Es un medio selectivo que permite sólo el crecimiento de bacilos Gram negativos. La concentración de
166
sales biliares en el medio es relativamente baja en comparación con otros medios para bacterias entéricas (SSA,
entre otros), el colorante cristal violeta inhibe los organismos grampositivos, especialmente, enterococos y
estafilococos.
La diferenciación entre los organismos entéricos se logra por la combinación de lactosa y el indicador de pH
rojo neutro. Las colonias incoloras (no fermentadoras de la lactosa, NFL) o rosadas (colonias fermentadoras de la
lactosa, CFL) se producen dependiendo de la habilidad del microorganismo para fermentar o no la lactosa.
Control de Calidad:
 Escherichia coli: crecimiento, CFL.

 Proteus mirabilis: crecimiento, CNFL.
 Salmonella typhimurium: crecimiento, CNFL.
 Enterococcus faecalis: inhibición (parcial o total).
 Staphylococcus aureus: inhibición (parcial o total).
TIOSULFATO CITRATO BILIS SUCROSA (TCBS)

Peptona de caseína..............................................................................5,0 g
Peptona de carne.................................................................................5,0 g
Extracto de levadura............................................................................5,0 g
Citrato de sodio.................................................................................10,0 g
Tiosulfato de sodio............................................................................10,0 g
Oxgall (bilis de buey)..........................................................................5,0 g
Colato de sodio....................................................................................3,0 g
Sucrosa..............................................................................................20,0 g
Cloruro de sodio................................................................................10,0 g
Citrato férrico......................................................................................1,0 g
Azul de timol.....................................................................................0,04 g
Azul de bromotimol..........................................................................0,04 g
Agar...................................................................................................14,0 g
pH: 8,4 + 0,6
Preparación:
1. Suspender 88 gramos del medio en polvo en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente. Calentar con
agitación frecuente. Hervir por un minuto para que se disuelva completamente el polvo.
2. Enfriar a 45–50ºC en Baño de María y repartir en placas de Petri estériles.
3. NO AUTOCLAVAR.
4. Dejar solidificar a temperatura ambiente.
Uso:
Es un medio altamente selectivo (de único propósito) para el aislamiento de V. cholerae y otras especies del
género, a partir de una variedad de especímenes. La inhibición de las bacterias grampositivas se logra mediante la
adición de bilis de buey y colato de sodio. El tiosulfato de sodio sirve como fuente de carbono y, en combinación
con el citrato férrico detecta la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S) (aunque los miembros del género
Vibrio no producen H2S; por lo tanto, esta no es la finalidad principal del medio). La sucrosa se incluye como
carbohidrato fermentable para el metabolismo de los vibrios. El pH alcalino del medio aumenta la recuperación
de V. cholerae. El doble indicador de pH (azul de timol y de bromotimol) facilita la detección de la producción de
ácido a partir de la sucrosa; aún a pesar del pH alcalino del medio.
167
Control de Calidad:
 V.cholerae: colonias amarillas (CFS, colonias fermentadoras de la sucrosa).
 V. parahaemolyticus: colonias azul-.verdosas o verde-azuladas (CNFS)
 E.coli: inhibición parcial o completa.
 P. aeruginosa: inhibición parcial o completa.
AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD)

Xilosa................................................................................................3,50 g
Lactosa..............................................................................................7,50 g
Sucrosa..............................................................................................7,50 g
L-Lisina.............................................................................................5,00 g
Extracto de levadura..........................................................................3,00 g
Rojo de fenol.....................................................................................0,08 g
Agar.................................................................................................13,50 g
Desoxicolato de sodio.......................................................................2,50 g
Citrato de Hierro y Amonio..............................................................0,80 g
pH final:7,5 + 0,2
Preparación:
1. Realizar una suspensión con 55 gramos del material deshidratado en un litro de agua destilada. Calentar para
disolver el agar, agitando frecuentemente, dejar hervir un minuto. Evitar el sobrecalentamiento. NO AUTO-
CLAVAR.
2. Estabilizar en Baño de María a una temperatura de 50-55ºC. El medio debe tener un color rojizo claro, sin
precipitado. El calentamiento excesivo o la permanencia prolongada en el Baño de María puede producir
precipitación.
3. Repartir asépticamente en placas de Petri y dejar solidificar a temperatura ambiente.
Uso:
Recomendado para el aislamiento y diferenciación de enteropatógenos, especialmente especies de Shigella
y Salmonella. Es un medio selectivo que utiliza el desoxicolato de sodio como agente selectivo y, por lo tanto,
inhibe el crecimiento de las bacterias grampositivas. La xilosa se incorpora al medio, puesto que, este carbohidrato
es fermentado por, prácticamente, todas las enterobacterias, excepto por especies de Shigella y esta propiedad
incrementa la diferenciación de especies de este género. La lisina se incluye para diferenciar Salmonella del grupo
de los no patógenos; ya que sin lisina, las salmonelas rápidamente fermentan la xilosa y serían indistinguibles
de las especies no patógenas. Después que las salmonelas agotan el suministro de xilosa, la lisina es atacada vía
enzimática, a través de la lisina decarboxilasa, con reversión al pH alcalino que enmascara la reacción de las
shigelas. Para prevenir tal reversión por coliformes lisina-positivos, se añade al medio, sucrosa y lactosa para
lograr la producción de ácido en exceso.
La adición de un sistema indicador de pH, aumenta la capacidad diferencial del medio. Este consiste en
tiosulfato de sodio y citrato férrico-amónico, los cuales se incluyen para la visualización del H2S producido,
resultando en la formación de colonias con centros negros. Los no enteropatógenos productores de sulfuro de
hidrógeno, no decarboxilan la lisina.
168
Control de Calidad:
 S. thyphimurium: colonias rojas con H2S.

 S. flexneri: colonias rojas sin H2S.
 S. aureus: inhibición parcial
 E. coli: inhibición parcial; colonias amarillas sin H2S.
 Salmonella Grupo III: colonias amarillas con H2S.
SALMONELLA- SHIGELLA AGAR (SSA)

Extracto de carne de res......................................................................5,0 g
Peptona polipeptona............................................................................5,0 g
Lactosa..............................................................................................10,0 g
Sales biliares.......................................................................................8,5 g
Citrato de sodio...................................................................................8,5 g
Tiosulfato de sodio..............................................................................8,5 g
Citrato de hierro..................................................................................1,0 g
Agar...................................................................................................13,5 g
Verde brillante.................................................................................0,003 g
Rojo neutro (indicador)...................................................................0,025 g
pH final: 7,0 + 0,2
Preparación:
1. Suspender 60 gramos del medio en un litro de agua destilada. Calentar frecuentemente y dejar hervir por un
minuto para que se disuelva completamente.
2. Enfriar el medio, aproximadamente hasta 45-50ºC, en Baño de María y dispensar en las placas de Petri.
3. Permita que las placas se sequen por aproximadamente dos horas con la tapa entreabierta. NO
AUTOCLAVAR.
Uso:
Es un medio selectivo para aislamiento de bacilos enteropatógenos, especialmente, los pertenecientes al
Género Salmonella. Este medio no es recomendado para el aislamiento primario de Shigella.
Es considerado un medio moderadamente selectivo, basado en el grado de inhibición del crecimiento de los
grampositivos, que son inhibidos por el contenido de sales biliares, verde brillante y citrato. La diferenciación de
los bacilos entéricos se logra mediante la incorporación de lactosa en el medio. Los organismos que fermentan
este carbohidrato, producen ácidos que en presencia del indicador de pH, rojo neutro, provocan la aparición de
colonias rosadas. Los no fermentadores, producen colonias incoloras. Este último grupo, abarca la mayoría de los
patógenos intestinales, incluyendo Salmonella y Shigella. El tiosulfato de sodio y el citrato férrico permiten la
detección de H2S que se evidencia por la aparición de centros negros en las colonias.
Control de Calidad:
 S. thyphimurium: colonias no fermentadoras de la lactosa con H2S.

 S. flexneri: colonias no fermentadoras de la lactosa sin H2S.
 Salmonella Grupo III: colonias fermentadoras de la lactosa con H2S.
 E. coli: inhibición parcial.
 S. aureus: inhibición completa.
169
SABOUROUD DEXTROSA AGAR (SB)

Digesto péptido de tejido animal.......................................................5,0 g
Dextrosa............................................................................................40,0 g
Agar...................................................................................................15,0 g
pH final: 5,6 + 0,2
Preparación:
1. Suspender 65 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Calentar con agitación frecuente y dejar hervir
por un minuto para que se disuelva completamente el polvo.
2. Esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos a 15 libras de presión.
3. Si se desea agregar cloranfenicol, añadir 0,05 g del antibiótico a los ingredientes anteriores.
Uso:
Es un medio de propósito general desarrollado para el cultivo de hongos. El bajo pH de aproximadamente 5,6
es favorable para el crecimiento de los hongos, especialmente los dermatofitos, y ligeramente inhibitorio para las
bacterias contaminantes en las muestras clínicas. Este medio se recomienda para el recuento total de hongos. La
adición de cloranfenicol es una modificación diseñada para incrementar la inhibición bacteriana.
Es un medio a base de peptona suplementado con dextrosa para soportar el crecimiento de los hongos. Las
peptonas proporcionan los factores nitrogenados de crecimiento; la dextrosa provee la energía para el crecimiento
fúngico. El cloranfenicol es un antibiótico de amplio espectro, inhibidor para una amplia variedad de bacterias
grampositivas y gramnegativas, cuando se añade a su formulación.
Control de Calidad:
 C. albicans: crecimiento.
 T. mentagrophytes: crecimiento
 E. coli: inhibición parcial o completa (sólo si contiene cloranfenicol)
BASE DE PEPTONAS PARA PREPARAR INDOL

Peptona..............................................................................................10,0 g
pH: 7,0 + 0,2
Preparación:
1. Rehidratar 10 gramos de peptona en un litro de agua destilada. Añadir cloruro de sodio a una concentración de
10 %. Dispensar un volumen de 3 ml en cada tubo (13 x 100).
2. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presión a una temperatura de 121ºC.
3. Dejar enfriar y conservar en refrigeración hasta su empleo.
Uso:
Peptona, es un término químicamente indefinido que se utiliza para describir los productos hidrosolubles
obtenidos después de la hidrólisis de las proteínas. Contienen una mezcla de áminoácidos libres y polímeros de
aminoácidos (péptidos) que van hasta péptidos de mayor tamaño, capaces de permanecer en solución después de
calentarlos a 100ºC.
Las peptonas se fabrican utilizando enzimas o ácidos minerales fuertes para hidrolizar las proteínas que
pueden ser de origen animal (peptona de carne: incluye la caseína y gelatina) o de origen vegetal (peptona de soya).
Las peptonas producidas a partir de estas diversas fuentes se pueden subdividir ulteriormente en las producidas
170
por ácidos o por enzimas, tales como: tripsina, pepsina o papaína.

Las distintas enzimas rompen los enlaces peptídicos de las moléculas de proteínas en lugares diferentes,
liberando así una variedad de péptidos y de aminoácidos libres. Por su parte, la hidrólisis ácida, rompe todos los
enlaces peptídicos de forma que produce solamente aminoácidos libres. Desafortunadamente, destruye también
algunos aminoácidos valiosos, como el triptófano. Así, las peptonas ricas en triptófano se seleccionan para las
pruebas de producción de indol.
El caldo triptofano se ha desarrollado especialmente, como sustrato para la producción de indol. Debido a su
alto contenido de triptofano, es más fiable que el caldo peptonado para este propósito.
Control de Calidad:
 E. coli: indol positivo.

 K. pneumoniae: indol negativo.
AGAR UREA DE CHRISTENSEN

Peptona..............................................................................................1,00 g
Glucosa..............................................................................................1,00 g
Fosfato monopotásico.......................................................................0,80 g
Fosfato disódico................................................................................1,20 g
Rojo de fenol...................................................................................0,012 g
Agar.................................................................................................15,00 g
Agua destilada..........................................................................1.000,00 ml
pH final: 6,8 + 0,2
Preparación:
1. Disolver 24 gramos del polvo en 950 ml de agua destilada.
2. Calentar en agitación suave y frecuente. Dejar hervir.
3. Esterilizar en autoclave a 15 libras de presión (121°C) por quince minutos.
4. Dejar enfriar a 50°C y asépticamente añadir 50 ml de una solución estéril de urea al 40% y mezclar bien.
5. Dispensar 3-5 ml. en tubos estériles (13 x 100) y permitir solidificar para la formación del plano inclinado.
Uso:
El agar urea permite la rápida diferenciación de las especies de Proteus y otros bacilos gram negativos
urea positivos. Debe utilizarse un inóculo fuerte. Cuando la urea es hidrolizada, la liberación de aminas durante
la incubación, alcaliniza el medio, mostrando un color rosado producto del viraje del indicador de pH, rojo de
fenol, que puede abarcar sólo el bisel (en cuyo caso, la prueba será débil positiva); o tanto, el taco como el bisel,
(entonces, la prueba será fuertemente positiva).
Esta prueba también puede realizarse en placas o en medio líquido (caldo urea).
Control de Calidad:
 E. coli: negativa
 P. mirabilis: positiva
171
AGAR MOVILIDAD
Extracto de carne.................................................................................3,0 g
Digesto pancreático de gelatina........................................................10,0 g
Agar.....................................................................................................4,0 g
pH final: 7,3 + 0,2
Preparación:
1. Disolver 22 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Calentar en agitación suave y frecuente. Dejar
hervir. Dispensar en tubos (3 ml) y esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos a 15 libras de presión.
2. Si se desea, se puede añadir al medio 0,05 gramos de trifenil-tetrazolium (TTC, colorante vital) antes de la
esterilización (o alternativamente, añada 5 ml de una solución al 1 % de TTC asépticamente después de la
esterilización).
Uso:
Se emplea en la detección de la movilidad de los bacilos gramnegativos entéricos. Esta puede ser observada
directamente por examen de los tubos posterior a la incubación. El crecimiento se disemina desde la línea de
inoculación, si el microorganismo es móvil. Organismos con gran movilidad producen turbidez en todo el tubo. El
crecimiento de los microorganismos no móviles, sólo ocurre a lo largo de la línea de inoculación.
El uso opcional de TTC en el medio, permite la visualización del crecimiento bacteriano. Este se incorpora
al interior celular durante el metabolismo. El color rojo impartido a las células ayuda en la determinación de la
movilidad.
Control de Calidad:
 E. coli: móvil
 K. pneumoniae: no móvil.
AGAR CITRATO DE SIMMONS

Sulfato de magnesio............................................................................0,2 g
Fosfato dihidrógeno de amonio...........................................................1,0 g
Fosfato dipotásico...............................................................................1,0 g
Citrato de sodio...................................................................................2,0 g
Agar...................................................................................................15,0 g
Azul de bromotimol..........................................................................15,0 g
pH final: 6,8 + 0,2
Preparación:
1. Para rehidratar el medio, suspender 24,2 gramos en un litro de agua destilada o desionizada y calentar hasta la
ebullición mezclando suavemente para que se disuelva por completo. Distribuir en tubos de ensayo.
2. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos a 15 libras de presión. Dejar solidificar en forma inclinada
para que se forme taco y bisel.
172
Uso:
Se emplea en la investigación de bacilos gramnegativos usando como base el empleo del citrato. Los
organismos capaces de utilizar el citrato de sodio y el fosfato de amonio como fuente de carbono y nitrógeno,
respectivamente, crecerán en el medio y producirán una reacción alcalina evidenciada por el cambio de color del
indicador azul de bromotimol, de verde (neutro) a azul (alcalino).
Control de Calidad:
 K. pneumoniae: positivo (crecimiento, el medio se torna azul)
 E. coli: negativo (sin crecimiento)
CALDO BASE ROJO DE FENOL CON MANITOL

Digesto pancreático de caseína.........................................................10,0 g

D-manitol............................................................................................5,0 g
Rojo fenol........................................................................................0,018 g
pH final: 7,3 + 0,2
Preparación:
1. Resuspender 20 gramos del polvo en un litro de agua.

2. Dispensar en tubos (13 x 100), a razón de 3 ml por tubo, aproximadamente.
Uso:
Se emplea para determinar la habilidad de un microorganismo para fermentar o no, el manitol, este es el
único carbohidrato fermentable en el medio, puesto que la peptona de caseína no contiene carbohidratos. Los
fermentadores del manitol producen una reacción ácida en el medio que causa el cambio de color del indicador
rojo de fenol (del rojo al amarillo). Si se quiere evidenciar la producción de gas, se añade un tubo de Durham al
medio.
Control de Calidad:
 E. coli: positivo (crecimiento con producción de gas)
 S. aureus: positivo (crecimiento con producción de ácido)
 P. vulgaris: negativo.
 S. epidermidis: negativo.
AGAR NUTRITIVO (AN)

Digesto pancreático de gelatina..........................................................5,0 g
Agar...................................................................................................15,0 g
pH final: 6,8 + 0,2
Preparación:
1. Suspender 23 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente. Calentar con agitación
frecuente y hervir por un minuto para que se disuelva por completo el agar.
173
3. Repartir asépticamente en las placas.

Uso:
Es usado para el cultivo de bacterias y para el recuento de organismos en agua, heces y otros materiales.
Su composición, relativamente simple, provee los nutrientes necesarios para la replicación de gran cantidad de
microorganismos que no son exigentes para crecer. El extracto de carne contiene sustancias solubles en agua,
incluyendo carbohidratos, vitaminas, compuestos de nitrógeno orgánico y sales. Las peptonas constituyen la
principal fuente de nitrógeno orgánico, particularmente, aminoácidos y péptidos de cadena larga.
Control de Calidad:
 S. aureus: crecimiento moderado a fuerte.
 E. coli: crecimiento moderado a fuerte.
AGAR THAYER MARTIN (VCN)
Peptona de carne.................................................................................7,5 g
Almidón de maíz.................................................................................1,0 g
Fosfato dipotásico...............................................................................4,0 g
Fosfato monopotásico.........................................................................1,0 g
Agar...................................................................................................12,0 g
Hemoglobina.....................................................................................10,0 g
Isovitalex.........................................................................................10,0 ml
VCN suplemento.............................................................................10,0 ml
pH final: 7,2 + 0,2
Preparación:
1. Disolver la base GC en la cantidad conveniente de agua destilada (ver preparación de GC). Mezclar
vigorosamente.
2. Calentar hasta que hierva.
3. Esterilizar en autoclave a 121ºC a 15 libras de presión por 15 minutos.
4. Estabilizar en Baño de María a 50ºC por 30 minutos.
5. Agregar una solución de Hemoglobina al 2%, Isovitalex al 1% y el suplemento VCN (1%).
6. Mezclar cuidadosamente y repartir en placas estériles.
Uso:
Es usado en el aislamiento de especies de Neisseria patógenas en especímenes que conllevan flora asociada.
Tiene como base el GC. Adicionalmente contiene los agentes antimicrobianos: vancomicina, colistina y nistatina,
que constituyen el suplemento inhibidor del medio. La vancomicina es activa primariamente contra bacilos
grampositivos. La colistina inhibe los bacilos gramnegativos, incluyendo especies de Pseudomonas; pero no,
especies de Proteus. La nistatina inhibe los hongos que pudieran estar presentes en la muestra.
Control de Calidad:
 N. gonorrhoeae: crecimiento.
 N. meningitidis: crecimiento.
 N. sicca: inhibición completa.
 C. albicans: inhibición completa.
174
 S. aureus: inbibición completa

 E. coli: inhibición completa
AGAR MÜELLER-HINTON (MH)

Hidrolizado ácido de caseína............................................................17,5 g
Almidón..............................................................................................1,5 g
Agar...................................................................................................17,0 g
pH final: 7,3 + 0,1
Preparación:
1. Disolver 38 gramos del medio en un litro de agua destilada.
2. Calentar con agitación constante. Dejar hervir por un minuto para que se disuelva completamente.
3. Esterilizar por autoclave a 121ºC por 15 minutos a 15 libras de presión. No sobrecalentar.
4. Estabilizar en Baño de María a 45-55ºC.
5. Añadir los suplementos, tales como: 5 % de sangre defibrinada estéril (MHS). Mezclar bien.
6. Repartir en placas de petri estériles.
Uso:
Recomendado para las pruebas de susceptibilidad por el método de difusión del disco de Baüer y Kirby,
procedimiento estandarizado por el CLSI. El suplemento con sangre o isovitalex se ha sugerido para su uso en
pruebas para Haemophilus y Streptococcus.
Control de Calidad:
 MH: S. aureus ATCC 25923
 MHS: S. pneumoniae ATCC 6305
 MH: E. coli ATCC 25922
 MH: P. aeruginosa ATCC 27853
CALDO SOYA TRIPTICASA (CST)
Digesto papaico de soya......................................................................3,0 g
Fosfato dipotásico.............................................................................. 2,5 g
Dextrosa..............................................................................................2,5 g
pH final: 7,3 + 0,2
Preparación:
1. Suspender 30 gramos del medio en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente.
2. Calentar gentilmente hasta disolución completa.
3. Dispensar en tubos de 13 x 100, a razón de 3 ml por tubo.
Uso:
Es un medio basal o simple, de propósito general, usado en procedimientos cualitativos para el cultivo
de microorganismos fastidiosos y no fastidiosos a partir de una variedad de muestras de diferente origen. Los
componentes peptídicos proveen los aminoácidos y otros compuestos nitrogenados. La dextrosa actúa como
fuente de energía. El NaCl mantiene el equilibrio osmótico del medio. El fosfato dibásico actúa como buffer para
controlar el pH.
175
Control de Calidad:
 B. subtilis: crecimiento
 C.albicans: crecimiento
 S. aureus: crecimiento
 E. coli: crecimiento
CALDO THIOGLICOLATO (CT)

Digesto papaico de soya......................................................................3,0 g
Dextrosa..............................................................................................6,0 g
Thioglicolato de sodio.........................................................................0,5 g
Agar.....................................................................................................0,7 g
L- cisterna...........................................................................................0,1 g
Sulfito de sodio....................................................................................0,1 g
Hemina............................................................................................0,005 g
Vitamina K......................................................................................0,001 g
pH final: 7,0 + 0,2
Preparación:
1. Suspender 30 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente.

2. Calentar con agitación frecuente y dejar hervir un minuto para que se disuelva completamente el polvo.
3. Dispensar en tubos (16 x 150) con tapa de rosca (hasta más de la mitad, aproximadamente 8-10 ml).
5. Almacenar el medio preparado a 15-30º C. Después de almacenamiento prolongado, se debe recalentar el
medio una vez y hervirlo (100ºC por 10 minutos) para eliminar el oxígeno absorbido antes de su uso.
6. Los suplementos deben añadirse asépticamente, después de la esterilización.
Uso:
Es un medio enriquecido que se usa para el cultivo de microorganismos fastidiosos y no fastidiosos a partir de
diferentes tipos de muestras. El tioglicolato de sodio, como agente reductor, mantiene una baja tensión de oxígeno
en el medio. La vitamina K sirve como factor de crecimiento para algunos microorganismos, incrementando el
crecimiento de ciertas especies de anaeróbicos y esporulados. La hemina es una fuente de factor X que estimula el
crecimiento de organismos exigentes.
Control de Calidad:
 B. fragilis: crecimiento
 C. perfringens: crecimiento
 E. coli: crecimiento
 P. aeruginosa: crecimiento.
CALDO SELENITO F
Selenito ácido de sodio............................................................................................4,0 g
Digesto pancreático de caseína...............................................................................5,0 g
176
Lactosa....................................................................................................................4,0 g
Fosfato disódico......................................................................................................3,0 g
Fosfato monopotásico.............................................................................................7,0 g
pH final: 7,0 + 0,2
Preparación:
1. Suspender 23 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente.
2. No requiere esterilización, si el medio es usado inmediatamente. Si va a ser almacenado, calentar a 100ºC por
30 minutos. El exceso de calor es dañino. NO AUTOCLAVAR.
3. Almacenar el medio a una temperatura de 2- 8ºC. La pequeña cantidad de precipitado coloreado no es
perjudicial.
Uso:
Es usado en el enriquecimiento para el aislamiento de Salmonella y algunas especies de Shigella, a partir de
muestras de heces, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. Las peptonas de caseína y carne proveen
los compuestos esenciales de nitrógeno y carbón. La lactosa en el medio sirve para mantener un pH uniforme.
Cuando el selenito es reducido por el crecimiento de la bacteria se produce alcalinidad; un incremento
en el pH podría disminuir la toxicidad del selenito y resultaría en el sobrecrecimiento de bacterias extrañas. En
realidad, el ácido producido por la fermentación de la lactosa sirve para mantener un pH neutral o ligeramente
disminuido.
La función del fosfato es doble: sirve para mantener estable el pH y también, disminuye la toxicidad
del selenito, aumentando la capacidad de enriquecimiento del medio. El selenito ácido de sodio inhibe muchas
especies de bacterias grampositivas y gramnegativas, incluyendo enterococos y coliformes.
Los subcultivos deben hacerse entre las 6-18 horas de incubación; de lo contrario, el efecto inhibidor de
las sales de selenito disminuye.
Control de Calidad:
Crecimiento en MC después de subcultivar el Selenito F

Microorganismo
0 horas 24 horas
S. typhimurium Crecimiento escaso a moderado de colonias Crecimiento moderado a fuerte de colonias
incoloras incoloras
S. sonnei Crecimiento escaso a moderado de colonias Crecimiento moderado a fuerte de colonias
incoloras incoloras
E. coli Crecimiento moderado a fuerte de colonias Crecimiento moderado a escaso de colonias
rosadas rosadas
MEDIO DE TRANSPORTE CARY & BLAIR

Thioglicolato de sodio.........................................................................1,5 g
Fosfato disódico..................................................................................1,1 g
Agar.....................................................................................................5,0 g
pH final: 8,0 + 0,5
177
Preparación:
1. Suspender 12,6 gramos del medio en 991 ml de agua destilada. Mezclar vigorosamente.
2. Calentar en agitación constante y dejar hervir por un minuto para que se disuelva completamente.
3. Enfriar a 50ºC y añadir 9 ml de una solución al 1% de cloruro de calcio (BaCl2). Ajustar el pH si es necesario
(8,4).
4. Dispensar en tubos con tapa de rosca (aproximadamente, 7 ml en cada tubo). Vaporizar por quince minutos.
Enfriar y ajustar la tapa.
Uso:
Se emplea para la colección y conservación de especímenes clínicos. Contiene un mínimo de nutrientes
para incrementar la supervivencia del microorganismo; sin replicación. El tioglicolato de sodio se añade para
proporcionar un bajo potencial redox. El pH relativamente alto, minimiza la destrucción de las bacterias debido a
la producción de ácido.
Control de Calidad:
 S. aureus: crece cuando se subcultiva a un agar nutriente después de 18 horas.
 E. coli: crece cuando se subcultiva a un agar nutriente después de 18 horas.
AGAR TRIPLE AZUCAR-HIERRO (TSI)

Extracto de carne...............................................................................3,00 g
Peptona............................................................................................20,00 g
Lactosa............................................................................................10,00 g
Sucrosa............................................................................................10,00 g
Glucosa..............................................................................................1,00 g
Citrato férrico amónico.....................................................................0,20 g
Agar.................................................................................................12,00 g
Rojo de fenol...................................................................................0,024 g
Agua destilada...........................................................................1000,00 ml
pH: 7,4 + 0,2
Preparación:
Disolver 65 g del medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada. Calentar hasta ebullición para disolver
completamente el agar. Mezclar bien y distribuir en los tubos de prueba (16 x 150 ), a razón de 8-10 ml por tubo.
Esterilizar en autoclave a 15 lbs de presión, 120°C por 15 minutos. Inclinar los tubos para permitir la formación
del bisel sobre el taco de agar.
Uso:
Es un medio desarrollado para la identificación de bacilos gramnegativos, como las enterobacterias. Las
peptonas, extracto de carne y de levadura, proveen a la bacteria de compuestos nitrogenados, azufre, elementos
traza y vitaminas del complejo B, entre otros nutrientes. El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico del
medio. Contiene lactosa, sucrosa y glucosa como carbohidratos fermentables. El indicador de pH del medio es el
rojo de fenol. Posee un sistema indicador de la producción de H2S, constituido por el tiosulfato de sodio y el citrato
férrico amónico.
Control de Calidad:
 C. freundii: Ac/Ac; H2S positivo; Gas: positivo.
 E. coli: Ac/Ac; H2S negativo; Gas: positivo.
 P. vulgaris: Alc/Ac; H2S positivo; Gas: positivo.
178
 Shigella flexneri: Alc/Ac; H2S negativo; Gas: negativo.
 P. aeruginosa: Alc/Alc ó Alc/N; H2S negativo; Gas: negativo.
AGAR LISINA HIERRO (LIA)

Peptona..............................................................................................5,00 g
Glucosa..............................................................................................1,00 g
Hidrocloruro de L-lisina..................................................................10,00 g
Citrato férrico amónico.....................................................................0,50 g
Púrpura de bromocresol....................................................................0,02 g
Agar.................................................................................................15,00 g
Agua destilada............................................................................1.000,0 ml
pH: 6,7 + 0,2
Preparación:
Disolver 34,56 g del medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada. Calentar hasta ebullición para disolver
completamente el agar. Mezclar bien y distribuir en los tubos de prueba (13 x 100 ), a razón de 5-7 ml por tubo.
Esterilizar en autoclave a 15 lbs de presión, 120°C por 15 minutos. Inclinar los tubos para permitir la formación
del bisel sobre el taco de agar.
Uso:
Este medio se utiliza para determinar si un bacilo gramnegativo decarboxila o deamina la lisina. Además,
permite detectar la producción de gas a partir de la fermentación de la glucosa y la formación de ácido sulfhídrico
(H2S). Las peptonas y el extracto de levadura, proveen a la bacteria de compuestos nitrogenados, azufre, elementos
traza y vitaminas del complejo B, entre otros nutrientes. Contiene glucosa como carbohidrato fermentable. El
indicador de pH del medio es el púrpura de bromocresol. Posee un sistema indicador de la producción de H2S,
constituido por el tiosulfato de sodio y el citrato férrico amónico.
Control de Calidad:
 P. mirabilis: Rojo/Ac; H2S negativo; Gas: negativo.
 Shigella flexneri: Alc/Ac; H2S negativo; Gas: negativo.
 Salmonella spp: Alc/Alc; H2S positivo; Gas: positivo.
179
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181

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COLECCIÓN

El Vicerrectorado Académico de la Universidad del Zulia, consciente de la importancia que el

Profa. Judith Aular de Durán

Jorge Palencia Piña

Judith Aular de Durán

María Guadalupe Núñez

Consejo de Publicaciones del

Judith Aular de Durán

Universidad del Zulia

Colección Textos Universitarios

Segunda Edición, 2011.

Diseño y cuidado de edición:

Hecho el Depósito de Ley:

Reservados todos los derechos

Este libro ha sido arbitrado por las instancias correspondientes.

Actividad Práctica 1.1: Introducción al Trabajo Práctico de Bacteriología 17

Actividad Práctica 1.2: Observación de Bacterias y otros Microorganismos in vivo 25

Actividad Práctica 1.3: Examen al Fresco y técnica de la Gota Pendiente 26

UNIDAD II: MORFOLOGÍA Y ULTRA-ESTRUCTURA DE LA CÉLULA BACTERIANA 29

Actividad Práctica 2.1: Técnicas de Coloración. Examen microscópico de Preparaciones Coloreadas 31

Unidad III: Nutrición y Crecimiento Bacteriano 53

Actividad Práctica 3.1: Técnicas de Siembra y Morfología Colonial 55

Actividad Práctica 3.2: Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano 67

Actividad Práctica 3.3.: Medición del Crecimiento Bacteriano 72

UNIDAD IV: METABOLISMO BACTERIANO 79

Actividad Práctica 4.1: Pruebas Bioquímicas utilizadas en la Identificación de Bacterias en el Laboratorio 81

UNIDAD V: GENÉTICA BACTERIANA 123

Actividad Práctica 5.1: Transferencia de Material Genético por Conjugación

UNIDAD VI: CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO 127

Actividad Práctica 6.2: Evaluación de Desinfectantes y Antisépticos 132

UNIDAD VII: INTERACCIÓN BACTERIA-HOSPEDERO 143

Actividad Práctica 7.1: Flora Normal 145

UNIDAD VIII: CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO 149

Actividad Práctica 8.1: Preparación y Control de Calidad de Medios de Cultivo 151

Al finalizar la Unidad, el participante estará en capacidad de:

 Aplicar las normas de bioseguridad que rigen el trabajo en el Laboratorio de Bacteriología.

1. Aplicar las normas de bioseguridad en el Laboratorio de Bacteriología.

Normas de Bioseguridad en el Laboratorio de Bacteriología

A.- Material de vidrio

El material de vidrio utilizado en los Laboratorios de Bacteriología está representado por:

1. Defina Normas de Bioseguridad.

Material y Equipo Utilidad Práctica

1. Observar la presencia de bacterias y otros microorganismos en diferentes tipos de muestras biológicas.

Observación de bacterias y otros microorganismos vivos provenientes de diferentes ambientes naturales:

Figura 1: Preparación de la suspensión bacteriana

Figura 2: Inversión de la lámina excavada sobre la laminilla cubreobjetos

Figura 3: Gota pendiente (Observación al microscopio)

1. ¿Qué valor práctico tienen estas técnicas?

Al finalizar la Unidad, el participante estará en capacidad de:

 Reconocer la morfología microscópica de las bacterias en preparaciones coloreadas.

1. Interpretar los fundamentos de las coloraciones de uso más frecuente en Bacteriología.

Figura 4: Preparación de un frotis o extendido

4. Esterilizar nuevamente el asa a la llama del mechero.

Figura 5: Secado del frotis

Figura 6: Fijación del frotis a la llama del mechero

Alternativamente, puede calentarse la preparación en un dispositivo adecuado (plancha de calentamiento) a

4. Coloración Propiamente dicha

Figura 7: Aplicación de colorantes (Tinción propiamente dicha)

Solución Madre de Oxalato

Disolver completamente en 5 ml de agua destilada, luego agregar:

Mezclar y conservar en una botella de vidrio color ámbar.

2.- Sulfato de Cobre (20 %):

en que la tinción primaria resulta débil.

Disolver el verde de malaquita en agua destilada.