Matériel et méthodes

 Matériels
 Le matériel biologique (le sol) ;
 Le matériel de terrain (sachets, flacons stériles, bouchons stériles, spatule
stériles) ;
 Le matériel de laboratoire.
Matériel courant de laboratoire (verrerie, balance analytique, agitateur
chauffant pH-mètre et autoclave).
- Micropipettes et embouts stériles, pipette Pasteur ;
- Incubateurs réglés à 37 °C, réfrigérateur réglé à 4 °C,
- Compteur de colonies, microscope optique et bac de coloration ;
Pissette : eau distillée, eau de javel et alcool
 Méthodes
Parmi les méthodes utilisées lors de l’analyse microbiologique du sol, on distingue :
Echantillonnage
L’échantillonnage est un processus de collectes des échantillons destinés à une analyse
microbiologique. L’echantillon à analyser doit etre representatif, homogène et obtenu
sans aucune modification de ces caracteres physico-chimiques.
De ce fait, le prélèvement et la préparation de l’échantillon doivent se faire suivant une
certaine précaution. Celle d’être réalisé en conditions stériles : il est donc nécessaire de
disposer de :
 Flacon stérile, rempli un quelconque matériel (broc, entonnoir, pipette…) à moins d’avoir
été désinfecté ; dans le cas d’une désinfection chimique, attention aux résidus de produit ;
 Bouchon stérile ;
 Flambage du col de la bouteille.
 Après le prélèvement, maintien de l’asepsie : interdiction stricte d’ouvrir le flacon jusqu’à
l’analyse ;
 Ouverture de l’échantillon seulement sous hotte à flux laminaire ou à proximité directe de
la flamme bleue du bec Bunsen

Dénombrement
Le dénombrement est une technique qui a pour but de déterminer la concentration en
bactéries ou moisissures dans un produit alimentaire afin de contrôler la qualité des
produits destinés à la consommation. Afin de réaliser un bon dénombrement, il faut
tout d'abord réaliser un bon nombre de dilutions en milieu liquide du produit allant
d'un facteur 100 à 10. Ensuite, l’observation et le comptage des colonies sont effectués
sur différents types de milieux.

 Technique de dilution
Une dilution en série est tout simplement une dilution répétée d'une solution originale afin
d'amplifier rapidement le facteur de dilution

- Protocole expérimental d'une dilution décimale :

Le principe :
 Etiqueter à l'avance les tubes à essai pour éviter par la suite toute confusion. (Exemple :
10-1 ; 10-2 ; 10-3 ; 10-4 , 10-5 ; 10-6 ).
 Chaque tube dilué aura une concentration dix fois plus faible que le précédent . Le
premier tube contiendra une solution diluée au dixième, le deuxième, au centième, le
troisième, au millième, etc.)
Déterminez à l'avance le nombre de dilutions pour ne pas préparer plus de tubes que
nécessaire et gaspiller inutilement le diluant.

Réalisez des dilutions

 Avec une pipette, prélevez 1 ml de la solution mère dans le tube à essai marqué « SM »
pour l’échantillon liquide et Quant à l’échantillon solide, celui-ci nécessite un broyage
dans un diluant stérile à l’aide des broyeurs de laboratoire. Cet ensemble, échantillon et
diluant constitue la dilution mère (DM).
 Ensuite transférez cette quantité dans le tube à essai marqué 1/10 qui contient déjà 9 ml
de liquide de dilution. Mélangez pour obtenir une solution homogène (agitation par
mouvements circulaires pendant 10 secondes environ ou à l’aide d’un vortex). Dans ce
tube, il y a désormais 10 ml de solution : 1ml de solution mère et 9 ml de liquide de
dilution. Cette nouvelle solution est dix fois moins concentrée que la précédente.
 Ne pas introduire la pipette dans la suspension de plus de 1 cm.
Flamber et refermer le tube. Il est conseillé de replacer le tube sur le portoir à une place
montrant qu’il a déjà été prélevé (en retrait par exemple).

changement ne se produise dans leur composition entre le prélèvement et l’analyse

De documenter cette variabilité en rapport
 Ensemencement en surface
 Marquer les boîtes de pétri en correspondance avec les dilutions mis en évidence
(exemple : 10-0, 10-1, 10-2).
 Verser environ 15 ml de la gélose en surfusion par boites de Pétri (2 boites pour
chaque dilution à tester), le couvercle légèrement déplacé (ne pas excéder 10 mm) ;
 Laisser solidifier ;
 Transférer à l’aide d’une micropipette 0,1 ml de la solution-dilution à la surface de la
gélose solidifiée (pour chacune des deux boîtes de pétri correspondant à cette
dilution). Avec cette même micropipette, procéder de manière identique pour les
autres dilutions.
 Étaler l'inoculum uniformément sur toute la surface à l'aide d'un étaleur (râteau) ;
 Incuber au temps / température approprié au microorganisme (boites renversées).

- Culture a l’étuve
Elle consiste en une augmentation coordonnée des constituants cellulaires, se traduisant par
une augmentation de la taille des colonies dans certains cas permettant d’évaluer les
populations des micro-organismes présentes dans l’échantillon. La croissance aboutit à
l’accroissement du nombre de cellules sous l’effet de la température et du temps.
Les bactéries peuvent être classées selon leur température optimale de croissance :
- Bactéries mésophiles (Ex. : Escherichia coli) : température de croissance proche de celle
du corps humain (37°C)
- Bactéries thermophiles (Ex. : Thermus aquaticus) : températures de croissance comprises
entre 45°C et 70°C.
- Bactéries hyperthermophiles (Ex. : Archaea) : températures de croissance supérieures à
80°C
Bactéries psychrophiles (Ex. :) : Températures proches de 0°C (optimum à 10-15°C).-
Bactéries psychrotrophes (Ex. : Pseudomonas) : températures de croissance proches de
0°C avec optimum de croissance proche des bactéries mésophiles

- Comptage et Observation des colonies

  Comptage des colonies
Cette technique permet de quantifier l’ensemble des microorganismes présent dans le volume
de l’échantillon ensemencé. La numération prend en compte toutes les colonies apparues sur
la gélose. On parle d’UFC : Unité formant Colonie. En effet, chaque colonie est issue de la
multiplication d’un seul germe initialement présent dans la suspension introduite dans la boîte
de Pétri. Donc, le nombre de colonies correspond exactement au nombre de germes présents
dans le volume d’échantillon ensemencé. Un nombre de colonie significatif est comprise entre
30-300 : Milieu ordinaire et 15-150 : Milieu spécifique.

Le calcul du nombre UFC / ml ou par g d’échantillon se fait de la manière suivante :

UFC/ ml= N / v.d : cas d’une seule boite d’une seule dilution

N.B : Avec N est la somme des colonies, v est le volume (qui est égal 0,1 ml pour un
ensemencement réaliser en surface et 1ml pour l’ensemencement en masse) et le d est
le facteur de dilution ou le facteur de concentration correspondant à la préparation de
l’échantillon. Les résultats seront rendus en écriture scientifique avec deux chiffres
significatifs.
 Observation des colonies
L’observation des colonies permet d’identifier des nombreux caractères phénotypiques d’une
bactérie, déjà isolé à l’état pur : Caractères culturaux, morphologiques, biochimique
physiologiques et autres. Parfois cette seule étude permet de connaître le germe qu’on a en
présence car les colonies sont typiques.
 Caractères morphologiques : morphotype
Les caractères culturaux comprennent :
La taille : elle correspond au diamètre des colonies. On distingue :
 Colonies punctiformes : Colonies à peine visibles, dont la taille est inférieure au millimètre
 petites colonies : Colonies dont le diamètre est compris entre 1 et 2 mm
 Colonies moyennes : Colonies dont le diamètre est compris entre 3 et 5 mm
 Grosses colonies : Colonies dont le diamètre est supérieur à 5mm
la forme : (plan, relief, bord) centre parfois surélevé, ombiliqué en creux
la couleur (pigmentation) : sur des géloses ordinaires, les colonies sont habituellement
crème, alors que sur des milieux sélectifs, les colonies, sont d’une couleur différente, ceci est
dû à divers pigments de couleur jaune, rouge, orange, violet, etc.
l’opacité : Les colonies opaques ne laissent pas passer la lumière contrairement aux
translucides : laisse passer la lumière mais on ne voit pas les formes au travers, comme le
verre dépoli). Certaines sont très transparentes, car ils laissent passer la lumière.
la surface : peut-être lisse, rugueuse, brillante.
la consistance : Elle se juge au moment du prélèvement. On distingue les colonies crémeuses
des sèches et des muqueuses (gluantes).
 Purification et isolement
- Purification