Introducere în microscopia optică

În lucrarea practică de azi

• Vom afla ce este histologia şi cum o vom
studia în cursul acestui an
• Vom recapitula pe scurt elemente de
microscopie optică utile în studiul
histologic al celulelor şi ţesuturilor
• Vom învăţa să studiem imagini 2D prin
prisma unei structuri 3D
• Vom învăţa coloraţii noi
Introducere în histologie
• Histologia este știinţa care studiază organizarea
microscopică a ţesuturilor şi organelor

• Ramuri:
• Histologia generală – studiul și diagnosticul
microscopic al ţesuturilor fundamentale şi al
subtipurilor lor
• Histologia specială – studiul arhitecturii
tisulare a organelor și stabilirea
diagnosticului microscopic de organ
Ţesuturi
• Un ţesut este un grup de celule semănătoare,
specializate pentru a îndeplini una sau mai multe
funcții caracteristice
• Pentru studiul țesuturilor folosim secțiunile
histologice (preparate microscopice permanente),
colorate pentru a crește contrastul dintre
componentele sale

• Componente:
• Celule
• Matricea extracelulară – rezultatul activității
secretorii a celulelor componente
 Recapitulare – preparatul microscopic
permanent
• Etapele obținerii:
• Recoltare
• Fixare
• Includere
• Secționare
• Colorare
• Montare și etichetare
 Artefacte
• Imagini false care apar în preparatele microscopice
permanente în urma pregătirii acestora
• Exemple:
• Spații goale care pot apărea în urma deshidratării
excesive a preparatului în etapa de includere
• Contaminare cu alte țesuturi
• Crăpături în preparat, dislocarea țesuturilor, cutarea
secțiunilor
• Dizolvarea unor componente în solvenții organici și
spălarea lor de pe preparat – ex., lipidele se pierd de
obicei în cursul preparării, în locul lor rămânând spații
goale, necolorate
• Pete de colorant
Artefacte apărute în timpul etapei de fixare

J Oral Maxillofac Pathol. 2018 May-Aug; 22(2): 279.

Artefacte induse de secționare

J Oral Maxillofac Pathol. 2018 May-Aug; 22(2): 279.

Artefacte induse de colorare

Precipitat de
colorant

https://www.tamucet.org/product/evaluating-blood-smears-and-analyzing-erythrocyte-morphology/
Artefacte induse de folosirea solvenților
organici
 Ce artefacte puteţi identifica pe aceste
imagini?

https://www.semanticscholar.org/paper/A-review-of-artifacts-in-histopathology-Taqi-Sami/cec6d7742a9e5a9c0772749c2a5d112090e847cf
Ce artefacte puteţi identifica pe
această imagine?

J Oral Maxillofac Pathol. 2018 May-Aug; 22(2): 279.

 Colorația hemalaun-eozină (HE)
• Este colorația histologică cea mai frecvent utilizată.Este o colorație topografică
care evidențiază structura generală a celulelor și țesuturilor fără a evidenția
componente specifice celulare.
• Hemalaunul este un colorant bazic, deci se va lega de un substrat bazofil, de
natură acidă – ex., acizi nucleici; nucleul celular va fi colorat în violet, datorită
legării hemalaunului de ADN;
• Eozina este un colorant acid, deci se va lega de un substrat acidofil, de natură
bazică; citoplasma conține o proporție mare de proteine bazice (au resturi de
aminoacizi cu grupări funcționale bazice – ex., Lys), deci se va colora de regulă
în roz-roșu, prin legarea eozinei la aceste proteine
• În cărțile/publicațiile în limba engleză, veți întâlni denumirea „colorație
hematoxilină-eozină”; aceasta denotă aceeași colorație și este folosită aceeași
abreviere (HE sau H&E); hematoxilina este colorantul care se extrage din
lemnul unui arbore; pentru a se ajunge la un colorant funcțional, care are
capacitatea de a colora substratul celular, hematoxilina trece printr-o serie de
reacții chimice în urma cărora rezultă hemalaunul
N.B. acid≠acidofil, bazic≠bazofil
Colorația HE
Nucleu bazofil Celulă Citoplasmă bazofilă Nucleu bazofil

Citoplasmă acidofilă Matrice extracelulară bazofilă

Pancreas exocrin Cartilaj traheal

http://www.histologyguide.com/slidebox/slidebox.html
Microscopul optic
Principiu de funcţionare: Oculare

Lentilele se găsesc în
oculare (1) şi obiective (3) Obiective

Mărirea se poate schimba

Vize
cu ajutorul revolverului (2)
Sursa
de
Imaginea se focalizează cu lumină
ajutorul macrovizei (4) şi
microvizei (5)
 Introducere în histologie
• Când se examinează un preparat la microscop,
nu se începe niciodată cu obiectivul cu
puterea de mărire cea mai mare (40x), ci cu
cel de 4x sau 10x
• Se focalizează imaginea cu ajutorul
macrovizei, iar pentru observarea detaliilor
celulare, se trece la obiectivul de 40x, în acest
caz utilizându-se numai microviza pentru
fixarea imaginii
 Introducere în histologie

4x – orientarea 10x – detalii tisulare 40x – detalii celulare

http://histologyolm.stevegallik.org/node/31
Introducere în histologie

• Elementele pe care le studiem pe lame

sunt, în realitate, tridimensionale!

• Imaginea pe care o observăm este una

bidimensională, dată de incidenţa
planului de secţiune
Tipuri de secţiuni
Secţiune prin Secţiune prin tub
tub drept curbat

http://www.ansci.wisc.edu
 Introducere în histologie

• În orice secțiune, în primul rând ne uităm

după nuclei – imagini punctiforme, bazofile
• Forma şi modul de organizare a nucleilor ne
orientează asupra tipurilor celulare şi
arhitecturii tisulare
Introducere în histologie

www.studyblue.com
 Cum folosim nucleii pentru a ne orienta pe
preparat – exemplu

Diferite tipuri de
nuclei = diferite
tipuri de celule

Limitele celulei nu
se pot observa
distinct.

http://www.lab.anhb.uwa.edu.au
Cum folosim nucleii pentru a ne orienta pe
preparat – exemplu

Nuclei aliniaţi într-un singur strat

Nuclei grupaţi concentric

secure.health.utas.edu.au
Cum folosim nucleii pentru a ne orienta pe
preparat – exemplu

Nuclei răspândiţi
în ţesut

Nuclei dispuși în strat

https://histology.medicine.umich.edu/
 Exemplu de secţiune la nivelul unui
ţesut bogat celular

Secţiune perpendiculară

Secţiune oblică

www.bluehistology.com
 Exemplu de secţiune la nivelul unui
ţesut bogat celular

Secţiune oblică

Secţiune perpendiculară
https://histology.medicine.umich.edu/
 Exemple de colorații
• Colorații tricrome (cu 3 componente) – pentru obținerea unui contrast bun între
celule și fibrele de colagen din matricea extracelulară; rezultate: fibre de colagen
albastre (colorația HE cu albastru de metilen; colorația Azan, Mallory, Masson etc.),
roșii (colorația van Gieson), verzi (colorația Masson)
• Colorații speciale – pentru evidențierea anumitor structuri tisulare (incluziuni
lipidice, structuri specifice țesutului nervos etc.)
• Fibre elastice – brun-roșcate (colorare cu orceină)
• Fibre reticulare – brun-negre (impregnare argentică)
• Lipide – colorația Sudan (incluziunile lipidice apar roșii-portocalii); în colorația
HE, lipidele nu apar colorate, deoarece s-au spălat în solvenții organici utilizați
în timpul obținerii preparatului; lipidele se pot evidenția și cu OsO4 – culoare
neagră
• Glicoproteine – colorația PAS (periodic acid Schiff) – roșu purpuriu; în colorația
HE, componenta glucidică apare incoloră, deoarece a fost spălată în cursul
obținerii preparatului
• Cu ajutorul impregnării argentice se pot evidenția și alte componente: membrana
bazală a celulelor epiteliale, prelungirile celulelor nervoase
• Colorații specifice de țesut: May-Grünwald-Giemsa sau Wright (sânge), Heidenhain
(țesut muscular), Nissl (țesut nervos)
• Anumite incluziuni (melanină, lipofuscină) au o culoare brună care permite
identificarea lor la microscop fără coloraţie prealabilă
Colorații pentru fibre conjunctive, col.HE

Fibre de colagen roz-roșii

http://www.histologyguide.com/
Colorații pentru fibre conjunctive, col.HE

Nucleu bazofil

Fibre de colagen roz-roșii

http://www.histologyguide.com/
 Colorații pentru fibre
conjunctive, col. HEAM

Fibre de colagen albastre

Colorații pentru fibre conjunctive, col. Azan

https://memim.com/heidenhain%27s-azan-trichrome-stain.html Fibre de colagen albastre

Colorații pentru fibre conjunctive, col. van
Gieson Fibre de colagen roșii

https://www.shutterstock.com/image-photo/submucosa-layer-esophagus-showing-abundant-bundles-743928874
 Colorații pentru fibre conjunctive

Fibre și lamele elastice

din peretele unui vas
colorate cu orceină

Fibre reticulare
dintr-un ganglion
limfatic evidențiate
prin impregnare
argentică

http://www.uff.br/atlashistovet/FibraElastica.jpg http://www.histologyguide.com/slidebox/03-connective-tissue.html
 Impregnare argentică – alte aplicații

Prelungiri ale celulelor nervoase

Membrana bazală epitelială
http://cases.renalpathsoc.org/wp-content/uploads/2015/07/com201508_2.jpg http://www.doctorc.net/Labs/Lab2/Examples/exgolstn.htm
 Alte colorații Glicoproteine din
celule ale mucoasei
intestinale
Lipide din
celule adipoase

Colorație Sudan Colorație PAS

http://slideplayer.pl/slide/10370173/ https://www.fishersci.ca/shop/products/pas-staining-kit/m1016460001
Incluziuni de melanină
Exerciţii
1. Desenaţi o secţiune longitudinală, apoi una transversală printr-
un ou (fiert tare ☺).
Anexă – colorații
Colorație Rezultate
Hemalaun-eozină Nuclei – albastru închis
cu albastru de Citoplasma – albastru-cenușiu
metilen (HEAM) Fibre de colagen – albastru intens
Azan (azocarmin- Nuclei – roșu intens
anilină) Citoplasma – roșu
Fibre de colagen – albastru
van Gieson Nuclei – negru
Citoplasmă – galben
Fibre de colagen – roșu intens

Orceină Fibre elastice – brun-roșcat

Impregnare Membrana bazală; fibre reticulare; prelungiri nervoase – brun-
argentică negru
Sudan III Lipide – roșu-portocaliu
PAS (periodic acid Polizaharide, glicoproteine – roșu purpuriu
Schiff)