(12) SOLICITUD INTERNACIONAL PUBLICADA EN VIRTUD DEL TRATADO DE COOPERACION EN MATERIA DE PATENTES (PCT) (19) Organizacién Munc Intelectual Oficina internacional de la Propiedad (43) Fecha de publicacién internacional PCT (10) Ntimero de Publicacién Internacional 2 de Agosto de 2007 (02.08.2007) WO 2007/085679 Al (51) Clasifcacién Internacional de Patentes: CHAPARRO RONDA, Carolina [ES/ES}; Into, de Fer COD S714 2006.01) AGIK 314837 (2006.01) rmentaciones Industriales, Consejo Superior de Investiga COTD 209158 2006.01) AGLP 39/06 (2006.01) ciones Ciontificas, Juan De La Cierva, 3, E-28006 Madrid CO7D 221/06 2006.01) AGLP 25/00 (2006.01) (BL) Estados designados (a menos que se indique otra cos, QI) Namero de ta solicitud internacional: para toda clase de proteccién nacional admisible). AE, PCTAES2007/070016 AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, (22) Fecha de presentacién Internacional: EC, FE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HIN, HR, 23 de Bnero de 2007 (23.01.2007) HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, CLK.LRLS N,LY, MA, MD, MG, MK, MN, (25) Idioma de presentaetsn espaol MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO. NZ, OM, PG, PH, PL, PT, RO, RS, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, SV, (26) Idioma de publicacton: expatol 1, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC. VN, ZA, 7M, ZW. (30) Datos relatives a la prioridad: (84) Estados designados (4 menos que se indique otra cosa, 200600175 26 de Enero de 2006 (26.01.2006) ES Para toda clase de proteccidn regional admisible): ARIPO (BW, GH, GM, KE, LS, MW, MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ UG, ZM, ZW), euroasidtiea (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), europea (AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, BS, Fl, FR, GB, GR, HU, TE, 18, IT, LT, LU, LV, MC, NL, PL. PI, RO, SE, SI, SK, TR), OAPI (BE, BJ, CF, CG, CLCM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TO). Solitante (para todos los Estados designados salvo US) CONSEJO. SUPERIOR DE_ INVESTIGACIONES CIENTIFIC J; CF Serrano, 117, F-28006 Madrid (BS), wentores;€ Publcada: enfores/Sollctantes(para US solamente: HERRAIZ — £0 informe de isqueda intemacional Poms [ESIESI; nso, de Formettacones i — nts de a expiracin del place para modificar la revin- dlntales Conejo Superior de Tovesigacionce Cleat, —_dleaclones para ser epublicada a se rectben madifea- ESI; Insto. de Para cédigos de dos letras y otras abreviaturas, véase la seccién ciones Industrales, Consejo Superior de Investigaciones "Guidance Notes on Codes and Abbreviations” que aparece al Ciontficas, Juan De La Cierva, 3, B-28006 Madrid (ES). principio de cada numero regular de la Gaceta del PCT. (S4) Tite: PREPARATION OF BBTA-CARBOLINE FROM NATURAL PRODUCTS AND. FOODS HAVING MONOAMINOOXIDASE (MAO) INHIBITING ACTIVITY (54) Titulo: PREPARACION DE BETA.CARBOLINAS DE PRODUCTOS NATURALE’ COMO INHIBIDORES DE MONOAMINOOXIDASA (MAO) $ Y ALIMENTOS CON ACTIVIDAD (57) Abstruct: The invention relates to the preparation of bets-carboline ype molecules from amino acids from natural products and Food, which aet as reversible inhibitors of the enzytne monoatsinooxidase (MAO). The reversible MAO inhibitors are used forthe prevention and therapeutic treatment of diseases and conditions associated with neurological disorders, suchas depression, adetion, endocrine disorders, and for neuroprotection against degenerative diseases. The beta-carbolne preparations can be used as pharmaceutical prparations, nutrceutical preparations and in funetional foods or dietary supplements (57) Resumen: Procedimiento de preparacisn de moléculs dl ipo bets-carbolina a partirde aminodcidos de alimentos y productos naturales, ue setan como inhibidores reversibles de la enzima monoaminooxidasa (MAO). Los inhibidores reversbles de MAO se-emplean en prevencisn y tratamiento terapéutic de enfermedades o condiciones relacionadas con desGrdenes neuroligicos como catalizada por enzimas peroxidasas. Las beta-carbolinas logradas pueden tener actividad psico-farmacolégica 0 neuroprotectora, por ser inhibidores de MAO y también por su accién potencial sobre otros receptores neuronales. Los inhibidores de la MAO pueden actuar reduciendo la formacién de especies reactivas de oxigeno (H20> y otras), y ala vez, elevando los niveles de neuroaminas del cerebro. Por ello, las beta- carbolinas obtenidas por el procedimiento de la presente invencién podrian tener utilidad potencial como agentes farmacéuticos, _nutracéuticos, complementos dietéticos o alimentos funcionales, sdlos o en combinacién con otras sustancias o férmacos, en una variedad de condiciones que tienen que ver con la actividad de MAO, como depresién, desordenes emocionales y de estado de animo, enfermedades neurodegenerativas (Parkinson y Alzheimer),10 15 20 25 WO 2007/085679 PCT/ES2007/070016 6 abuso de drogas, antiadiccién (tabaquismo, y otros), dependencia, y desordenes de la alimentaci6n. DESCRIPCION DE LA INVENCION - Breve descripcién de la invencién La presente invencién se caracteriza por describir un procedimiento de ‘obtencién de compuestos con estructura de beta-carbolinas de la Formula |, basado en una reaccién en medios acuosos y oxidacién limpia con H.O2 catalizada por una enzima peroxidasa, Ry N H Rg Formula | donde los sustituyentes Ry, Re, pueden ser hidrégeno (H), halégeno (F, Cl, Br, 1), alquilo (CH), 0 metoxilo (OCHs), y Rs_H, CHs 0 resto alquilo (CHs-(CH2)er. Se realiza a partir de sustratos aminodcidos como precursores naturales, y se caracteriza porque los preparados obtenidos son de utilidad por sus propiedades como inhibidores reversibles de las enzimas MAO A y B. Como punto caracteristico central de esta invencién, la preparacién de las sustancias de la Formula | 0 extractos crudos que las contengan, se realiza a partir los dcidos tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxilico (Figura 1) utilizados como precursores directos que se tratan con HzO2 en presencia de una enzima peroxidasa procedente de plantas, microorganismos o de origen animal, en un medio tamponado entre pH 5-8, y temperatura entre 20 y 45 °C, durante varias horas, para obtener las beta-carbolinas, de la Formula |, que finalmente se secan y purifican por procedimientos convencionales.10 15 20 25 30 WO 2007/085679 PCT/ES2007/070016 7 Los precursores acidos tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxilico utilizados por la peroxidasa se pueden aislar desde alimentos o productos naturales, 0 se producen por reaccién desde triptéfano o sus analogos por reaccién con ‘compuestos aldehidos alifaticos, preferiblemente formaldehido y acetaldehido, en medios acuosos Acidos preferiblemente entre pH 1 y 3, por calentamiento entre 30 y 60 °C, con posterior secado con métodos convencionales. Al actuar como inhibidores reversibles de MAO, y también por su unién a varios receptores del sistema nervioso central, los productos beta-carbolina anteriores puros, en extractos o preparados que los contengan, podrian utilizarse en preparados 0 formulaciones farmacéuticas para la prevencién y el tratamiento terapéutico de enfermedades 0 condiciones relacionadas con desérdenes neurolégicos como depresién, adiccién, trastornos endocrinos, y en neuroprotecccién contra enfermedades degenerativas. Una vez probada su ausencia de toxicidad, los nuevos preparados podrian aplicarse en productos farmacéuticos, de parafarmacia, en nuevos alimentos _funcionales, complementos nutricionales y preparados nutracéuticos. BREVE DESCRIPCION DEL CONTENIDO DE LAS FIGURAS Figura 1. Reaccién de Pictet-Spengler, que se produce en alimentos y en productos naturales para la generacién de acidos 1, 2, 3, 4 tetrahidro-beta- carbolina-3-carboxilico (A). Su posterior oxidacién con una peroxidasa (B) da lugar a las beta-carbolinas aromaticas, con propiedades de inhibidores de MAO (C). Riy Re son H, F, Cl, Br, |, OCHs 0 resto alquilo y Rs es un resto alquilo. Figura 2. Curvas de inhibicién en funcién de la concentracién de beta- carbolinas Inhibicién de MAO (enzimas A y B) por las beta-carbolinas (9H-pirido-3,4-b- indol) .10 15 20 25 30 WO 2007/085679 PCT/ES2007/070016 8 - Descripcién detallada de la invencién Esta invencién describe un procedimiento enzimatico de preparacién de los compuestos beta-carbolina simples de la Formula | en medios acuosos. Estos se preparan por oxidacién de los intermedios Acidos tetrahidro-beta-carbolina- 3-carboxilico mediante una catdlisis enzimatica limpia con utilizacién de H2O>. Los compuestos obtenidos se analizaron mediante HPLC-fluorescencia- absorbancia y espectrometria de masas. Se utilizaron dos sistemas acoplados en serie para la deteccién: fluorescencia (270 nm excitacién y 343 nm emisién; © 300/433) y absorbancia a 254 nm. Los productos se caracterizaron por HPLC-MS can ionizacién de electrospray en modo positivo y RMN. El proceso de obtencién propiamente dicho se realiza en dos etapas: Etapa 1. Se preparan los acido 1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxilico en fase acuosa/acida partiendo de aminoacidos naturales como L-triptéfano o ‘sus andlogos como triptéfano con sustituyentes en 5 6 6 del anillo bencénico (alquilo, Cl, Br, OCHs), por reaccién con aldehidos, mediante una condensacién denominada de Pictet-Spengler realizada en un solo paso en medio acuso- Acido entre pH 1 y pH 3, y temperatura entre 20 y 90°C, preferiblemente entre 35 y 60 °C. El aminoacido L-triptéfano reacciona con aldehidos alifaticos, preferiblemente formaldehido 0 acetaldehido, dando lugar a las correspondientes dcidos tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxilico (Figura 1). Esta reaccién es conocida y ocurre por una ciclacién intramolecular de la base de Schiff que da lugar a_tetrahidro-beta-carbolinas-1,3-disustituidas con diferentes sustituyentes en el C-1 del anillo de tetrahidropirido dependiendo del aldehido implicado, Las tetrahidro-beta-carbolinas 1,3-disustituidas contienen dos diastereoisémeros (18,38 y 1R,3S) que pueden resolverse por RP-HPLC y asi obtenerse de manera pura. En esta reaccién de condensacién se puede utilizar el aminodcido L-tript6fano, © andlogos de éste como triptéfano 5 0 6-susiituido en compuestos puros o provenientes de extractos naturales 0 subproductos, por reaccién con los aldehidos simples acetaldehido y formaldehido, para dar los acidos tetrahidro- beta-carbolina-3-carboxilico. Como procedimiento general el aminoacido (L-10 15 20 25 30 WO 2007/085679 PCT/ES2007/070016 9 triptéfano 0 derivados) disuelto en 0.05 N H,SO, se agita con el correspondiente aldehido durante varias horas, a una temperatura entre 25-80 °C para dar una mezcla de reaccién que se seca por procedimientos convencionales de secado como por ejemplo, secado en aire caliente, por calor a vacio, atomizacién, 0 liofilizacién, y se purifica por procedimientos convencionales de purificacién como cromatografia preparativa y cristalizacién. Como alternativa en esta etapa 1, los acidos 1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolina- 3-carboxilico de la figura 1, que se utilizan como productos de partida en la oxidacién con agua oxigenada y peroxidasa segin la etapa 2, pueden obtenerse y aislarse de alimentos o productos naturales. Etapa 2. Los compuestos puros o preparados obtenidos en la etapa anterior, se adicionan con solucién de KOH 0 NaOH, 0 se redisuelven en una disolucion tamponada para obtener un pH entre 5 y 8, preferiblemente pH 6 0 7, y se tratan en el medio de reaccién con una enzima peroxidasa proveniente de plantas, microorganismos o de origen animal que puede obtenerse comercialmente, en una concentracién entre 10-500 mg/L (concentracién de proteina en bruto del preparado). La reaccién de oxidacién comienza al agregar una disolucién fresca de H.O2 para dar una concentracién en el medio de reaccién de 0.05-10 mM, preferiblemente entre 0.1 y 1_mM, y se sigue la reaccién por HPLC, hasta la obtencién de las beta-carbolinas aromaticas formadas desde los correspondientes Acido tetrahidro-beta-carbolina-3- carboxilico segin la figura 1. El rendimiento de la conversién puede incrementarse adicionando mas agua oxigenada y/o enzima peroxidasa si fuera necesario. Una vez obtenidos los preparados finales, estos se tratan en medio dcido/alcohol y se centrifugan a 15000 g para separar la enzima correspondiente. Los productos finales se secan por procedimientos convencionales de secado; como por ejemplo, secado en aire caliente, por calor a vacio, atomizacién, o liofilizacién, y se purifican por procedimientos convencionales como cristalizacién, cromatografia preparativa. También se pueden obtener puros mediante la extraccién con disolventes orgdnicos10 15 20 25 30 WO 2007/085679 PCT/ES2007/070016 10 (acetato de etilo, diclorometano, y otros) en medio pH 8-9, y la consiguiente eliminacién del disolvente a vacio. Actividad como inhibidores de MAO de las beta-carbolinas formadas Para medir la actividad como inhibidores de MAO se utilizaron enzimas MAO A. y B recombinantes (BD Biosciences, Wobum, MA, USA). Para medir la actividad enzimatica de las enzimas monoaminooxidasa (MAO-A y MAO-B), las. fracciones de proteinas de membrana con las actividades de MAO A 0 B se diluyen convenientemente en 100 mM de tampén fosfato (pH 7.4). Una mezcia de reaccién de 0.2 mL con 0.01 mg/mL de enzima y 0.25 mM de sustrato kinuramina en 100 mM de tampén fosfato, se incuba a 37 °C durante 40 min de reaccién. Después del periodo de incubacién la reaccién se para con 75 pL NaOH 2N seguido de la adicién de 25 ul de Acido perciérico al 70%. Seguidamente, la muestra se centrifuga (10000 g ) durante 5 min y se determina la formacién del producto de la reaccién de desaminacién de kinuramina como 4-hidroxiquinolina, mediante RP-HPLC con DAD (absorbancia a 320 nm). Para determinar la inhibicién, las beta-carbolinas de la Formula | preparadas segun el procedimiento, se afiaden al medio de reaccién conteniendo sustrato kinuramina, y enzima MAO A o B y se determina la actividad de MAO, comparando con un control en el que no hay inhibidor. De esta manera se puede calcular la ICs (concentracién de inhibidor que produce un 50% de inhibicién de la actividad de MAO), Para determinar el tipo de inhibicién se construyen curvas de Michaelis-Menten y de Lineweaver-Burk en distintas concentraciones de inhibidor. La reversibilidad se determiné mediante comparacién de la actividad de la enzima después de incubar las beta- carbolinas frente a un control en ausencia de incubacién. La ICs) se calculé mediante ajuste a curvas de regresién no lineal de la actividad frente a la concentracién de inhibidor. El andlisis cromatogréfico se realiz6 por RP-HPLC, para determinar la desaminacién de kinuramina utilizando un HPLC 1050 (Hewlett Packard) que lleva un detector Array de diodos (DAD) y un detector fluorescente. Se utiliza una columna Nova-pak C18 (Waters, Milford, MA, USA) para la separacién10 15 20 25 30 WO 2007/085679 PCT/ES2007/070016 1 cromatogréfica en un gradiente de tampén fosfato pH 3-acetonitrilo, @ inyectando 20 pl. La deteccién por absorbancia a 320 nm y la identificacion de 4-hydroxiquinolina se lleva a cabo por espectros de UV y fluorescencia, asi ‘como por coinyeccién con estandares. Los preparados de beta-carbolinas descritas en la presente invencién son inhibidores de la MAO. Estos datos sugieren su utilidad potencial para la prevencién y tratamiento de condiciones de depresién, y como neuroprotectores. Los compuestos de partida de los que derivan son compuestos naturales que estén presentes en alimentos y productos naturales como plantas y otros (triptéfano, y andlogos como metoxitriptéfano), y su obtencion es mediante una reaccién en medio acuoso-dcido y posterior ‘oxidacién enzimatica. Por ello, pueden generarse en extractos de alimentos, ‘en preparados de tipo nutracéutico, o para la obtencién de alimentos con propiedades funcionales en el alivio, prevencién o tratamiento de depresién, adicciones, obesidad, y en las enfermedades neurodegenerativas. Estos compuestos podrian ser utiles en productos alimenticios, cosméticos o ‘componentes farmacéuticos. EJEMPLO DE REALIZACION DE LA INVENCION Ejemplo 1. 1. Procedimiento de obten« n de 1-metil-B-carbolina (1-melil-9H-pirido-(3,4- b}indol, harmano) a partir del precursor acido tetrahidro-beta-carbolina-3- carboxilico por oxidacién con enzima peroxidasa. 1.1. Preparacién del dcido (1S,3S)- y (1,3S)-1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-B- carbolina-3-carboxilico, Como productos de partida se utilizan el aminodcido L- Triptofano (1 mmol), y acetaldehido (4 mmoles), que se obtienen comercialmente, y se disuelven en un medio acuoso-dcido de 0.05 N HzSOx, y se hacen reaccionar en un matraz agitando a 30-40° C para dar el producto Acido (18,38)- y (1R,3S)-1-metil-1 ,2,3,4-tetrahidro-B-carbolina-3-carboxilico, en el medio de reaccién con un rendimiento superior al 90%. El correspondiente diastereoisémero (1S,3S) precipita como compuesto muy mayoritario (12:1).10 15 20 25 30 WO 2007/085679 PCT/ES2007/070016 12 Este producto intermedio se caracteriza por RP-HPLC-DAD, fluorescencia, RMN y MS. 1.2. Oxidacién_por peroxidasa_del_compuesto dcido_1S,3S-1-metil-1,2,3,4- tetrahidro-B-carbolina-3-carboxilico para dar lugar _a_1-metil-beta-carbolina. El compuesto adcido 1S,3S-1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-B-carbolina-3-carboxilico obtenido en el paso anterior 1.1) se disuelve (0.5 mM) en un medio tamponado de fosfato a pH 7 y se adiciona con una enzima peroxidasa (peroxidasa de rabano picante, tipo II comercial de Sigma Cemical Co., 150-250 u/mg sélido) y utilizada sin previa purificacién, en una concentracién de liofilizado de 25 mg/L, y con HO, en concentracién de 50 uM H20>2. Se incuba a 37 °C durante 40 min y se sigue la reaccién por RP-HPLC con deteccién a 254 nm, para obtener un medio de reaccién que contiene 1-metil-beta-carbolina (75 uM) (14 % conversién). La utilizacién de 100 mg/L de enzima y 250 uM de H.0, eleva la conversion hasta el 60 % con 250 yM de sustrato obtenido en 1.1). Ejemplo 2. 1. Procedimiento de obtencién -carbolina (9H-pirido-(3,4-b)-indol_ 0 norharmano) a partir del precursor acido tetrahidro-beta-carbolina-3- carboxilico por oxidacién con enzima peroxidasa. 1.1. Preparacién del Acido 1,2,3,4-tetrahidro-B-carbolina-3-carboxilico.. Como productos de partida se utilizan el aminodcido L-Triptéfano (1.5 mmoles) y formaldehido (4 mmoles), que se obtienen comercialmente, se disuelven en un medio acuoso-Acido de 0.05 N H2SO, y se hacen reaccionar en un matraz agitando 30-40° C_ para dar el producto Acido 1,2,3,4-tetrahidro-8-carbolina-3- carboxilico, en el medio de reaccién en un rendimiento de 90%. El producto precipita en frio y se caracteriza por RP-HPLC-DAD, fluorescencia, RMN y MS. 1.2 Oxidacién del compuesto Acido 1,2,3,4-tetrahidro-8-carbolina-3-carboxilico gatalizada_por_una_peroxidasa. El compuesto dcido 1,2,3,4-tetrahidro-B- carbolina-3-carboxilico obtenido en el paso anterior 1.1) se disuelve (0.5 mM) ‘en medio tamponado de fosfato a pH 7 y se adiciona con una enzima peroxidasa (peroxidasa de rdbano, tipo Il, Sigma; 150-250 u/mg sélido), obtenida comercialmente y utilizada sin previa purificacion, en una concentracién de liofilizado comercial de 25 mg/L, y con H2O2en concentracion10 15 20 25 30 WO 2007/085679 PCT/ES2007/070016 13 de 100 uM H,0;. Se incuba a 37 °C durante 40 min y se sigue la reaccién por RP-HPLC con deteccién a 254 nm, para oblener un medio de reaccién que contiene beta-carbolina (101 uM) (20 % conversién). La utilizacién de 250 mg/L de peroxidasa comercial de rébano y 100 uM de H20> eleva la conversion hasta el 45 % de conversién cuando se utiliza 250 uM de sustrato obtenido en 1.1). Ejemplo 3. 1. Procedimiento de obtencién de 6-metoxi-1-metil pirido-(3,4-b)-indol) a partir del precursor acido 6-metoxi- -carbolina (6-metoxi-9H- ,2,3,4-tetrahidro- beta-carbolina-3-carboxilico por oxidacién con enzima peroxidasa. 1.1. Preparacién del _acido _6-metoxi-1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-f-carbolina-3- carboxilico Como productos de partida se utilizan el aminodcido 5-metoxi-D,L-Triptéfano (1.5 mmoles) y acetaldehido (6 mmoles), que se obtienen comercialmente, se disuelven en un medio acuoso-Acido de 0.05 N H2SOs y se hacen reaccionar en un matraz agitando a temperatura ambiente para dar el producto acido 6- metoxi-1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-B-carbolina-3-carboxilico, en una mezcla de diastereorismeros en el medio de reaccién en un rendimiento superior al 90%. El producto precipita en frio y se caracteriza por RP-HPLC-DAD, fluorescencia. 1.2. Oxidacién del compuesto Acido _6-metoxi-1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-B- 3,4-tetrahidro-B- carbolina-3-carboxilico obtenido en el paso anterior 1.1) se disuelve en medio tamponado de fosfato a pH 7 (0.5 mM) y se adiciona con una enzima peroxidasa (peroxidasa de rabano picante, tipo Il; 150-250 u/mg sélido), carbolina-3-carboxilico. El compuesto acido 6-metoxi obtenida comercialmente y utiizada sin previa purificacién, en una concentracién de liofilzado comercial de 25 mg/L, y con HzOzen concentracién de 100 uM H,O2. Se incuba a 37 °C durante 40 min y se sigue la reaccién por RP-HPLC con deteccién a 254 nm, para obtener un medio de reaccién que contiene 6-metoxi-1-metil-beta-carbolina.10 15 20 25 WO 2007/085679 PCT/ES2007/070016 14 Resultados de la inhibicién de la MAO A y B por beta-carbolinas. a) Las beta-carbolinas se evallian como inhibidores de las enzimas recombinantes MAO A y B. Para ello, medios de reaccién (0.2 mL) que contienen 0.01 mg/mL de proteina de membrana, kinuramina (0.25 mM), y tampon fosfato 100 mM pH7.4, se incuban en ausencia (control) 0 en presencia de diferentes concentraciones del inhibidor beta-carbolina, y a 37 °C durante 40 min. Se determina la formacién del producto de la reaccién de desaminacién de kinuramina resultante como 4-hidroxiquinolina. Se obtienen los siguientes valores de ICs de la Tabla 1, calculados desde curvas de inhibicién de la Figura 1 Tabla 1. Valores de ICs de la inhibicién de algunas beta-carbolinas sobre MAO. Compuesto MAO A (uM) | MAO B (uM) beta-carbolina (norharmano) 65 47 1-metil-beta-carbolina (harmano) 0.34 >10 uM 7-metoxi-1-metil-beta-carbolina (harmina) 0.009 = La inhibicion por las beta-carbolinas obtenidas seguin el procedimiento de invencién es competitiva como se deduce de los resultados de la inhibicién a distintas concentraciones de sustrato @ inhibidores y se construyen curvas de Lineweaver-Burk. La inhibicién de las beta-carbolinas result ser reversible al comparar la actividad de la enzima cuando ha sido incubada en presencia del inhibidor frente a los correspondientes controles. b) En un segundo test, se evalué la actividad como inhibidores de MAO de los Acids 1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxilico (precursores de beta- carbolinas en la reaccién con peroxidasa), después de la oxidacién con peroxidasa, para dar las correspondientes beta-carbolinas. En este experimento, los compuestos dcido 1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolina-3- carboxilico se tratan con peroxidasa (25 mg/L peroxidasa de rabano picante tipo Il Sigma) durante 40 min a 37 °C, en presencia de H,O2 50 uM, y se sigue la actividad inhibidora de MAO de la mezcla obtenida sobre la5 10 15 WO 2007/085679 PCT/ES2007/070016 15 desaminacién de kinuramina (250 UM), incubando otros 40 min a 37 °C. Los datos se recogen en la tabla 2. Tabla 2. Inhibicion sobre MAO de los productos obtenidos en la reaccién de peroxidasa con precursores dcido tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxilico. Concentracién | Inhibicién del producto resultante Compuesto de compuesto | sobre MAO frente al control sin (uM) peroxidasa (%) cido 1,2,3,4-tetrahidro-beta- i 25 60% (MAO A) irbolina-3-carboxilico 4cido 1-metil-1,2,3,4-tetrahidro- 25 90% (MAO A) beta-carbolina-3-carboxilico cido 1,2,3,4-tetrahidro-beta- 25 71 % (MAO B) carbolina-3-carboxilico Concluyendo, el procedimiento descrito permite obtener compuestos y preparados conteniendo beta-carbolinas que tienen actividad de inhibicién de MAO A y B. La inhibicién de las beta-carbolinas sobre MAO es reversible y, en principio, carecerian de los riesgos ocasionados en la inhibicién irreversible asociada a crisis hipertensivas debidas a la ingestion de aminas vasoactivas (tiramina). La invencién describe un procedimiento para obtener beta- carbolinas previamente descritas en productos naturales y alimentos, que mimetiza las rutas biosintéticas que conducen a estos compuestos, con la incorporacién de una etapa singular de oxidacién enzimatica catalizada con enzimas peroxidasas. Los preparados obtenidos por este procedimiento sencillo padrian tener utilidad como preparados dietéticos o medicinales.10 15 20 25 WO 2007/085679 PCT/ES2007/070016 16 REIVINDICACIONES 1. Un procedimiento de obtencién de compuestos beta-carbolina de productos naturales y alimentos inhibidores de la enzima monoaminooxidasa MAO, caracterizadas por ser compuestos de acuerdo a la Formula |, Ry donde los sustituyentes Ri, Re, son hidrégeno (H), halégeno (F, Cl, Br, |), alquilo (CHs, CHs-(CHz),-) 0 metoxilo (OCHs), y Rs es H, CHs 0 alquilo (CHs- (CHe)nei Por utilizar como biocatalizador una enzima peroxidasa por ser producides por reaccién de oxidacién con H,O2 a partir de los precursores dcido 1,2,3,4-tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxilico proveniente de plantas, microorganismos o de origen animal, y Y por realizarse la reaccién en un medio acuoso tamponado entre pH 5 y 8, y temperatura entre 20 y 50°C 2. Un procedimiento de obtencién de compuestos beta-carbolina de productos naturales y alimentos inhibidores de la enzima monoaminooxidasa MAO, segun la reivindicacién 1 caracterizadas porque los precursores dcidos §1,2,3,4- tetrahidro-beta-carbolina-3-carboxilico utilizados , son producidos por reaccién del triptéfano 0 sus andlogos, con aldehidos alifaticos, preferiblemente formaldehido y acetaldehido, en medios acuosos-acidos preferiblemente entre pH 1 y 3, con temperatura entre 30 y 80 °C. 3. Un procedimiento de obtencién de compuestos beta-carbolina de productos naturales y alimentos inhibidores de la enzima monoaminooxidasa MAO, segun la reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque los precursores aminodcidos10 15 WO 2007/085679 PCT/ES2007/070016 17 iniciales se obtienen desde extractos de plantas, alimentos, subproductos alimentarios 0 microorganismos. 4. Un procedimiento de obtencién de compuestos beta-carbolina de productos naturales y alimentos inhibidores de la enzima monoaminooxidasa MAO, segun la reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque los compuestos de la férmula 1 se concentran, purifican total o parcialmente y se secan, mediante procedimientos convencionales de concentracién, purificacién y secado. 5. La utilizacién de los compuestos compuestos beta-carbolina de productos naturales y alimentos inhibidores de la enzima monoaminooxidasa MAO de la formula | obtenidos segin las reivindicaciones 1 a 4, por sus propiedades como inhibidores reversibles de la monoaminooxidasa (MAO) en preparados farmacéuticos, productos de parafarmacia, nutracéuticos, y alimentos funcionales, para la prevencién, alivio o mitigacion de diversas condiciones que tienen que ver con la actividad de MAO como depresién, adiciones, dependencias, trastomos de la alimentacién, y neuroproteccién.WO 2007/085679 PCT/ES2007/070016 12 Figura 1. R 9 YL I Ri OH ao ‘OH Ry oH = = I NH we Re sae bu N Nos A 1,0, B Me ~ ro NLS N H R3WO 2007/085679 PCT/ES2007/070016 2i2 Figura 2. 1 & 3. 2 2 Pecooine (8 Bearbotna (iM) 1 Inhibiclén de MAO A (14) 8 hari (0M) ‘et -carbotina (M)INTERNATIONAL SEARCH REPORT Intemational aplication No, PCT/ES 20071070016 A. CLASSIFICATION OF SUBIECT MATTER see extra sheet According 1 International Patent Classification (PC) orto both national clessification and TPC. B. FIELDS SEARCHED Minimum documentation searches (classification system followed by eussification symbols) CO7D, COTC, AGIK, AGIP Documentation searched ober than minimom documentation tothe extent that such documents ae included in the fields scorched Electronic data base consulted during the intemational search (aame of data base and, where practicable, search terms used) (CIBEPAT.BPODOC,WPI.CAPLUS, ‘© DOCUMENTS CONSIDERED TOBE. RELEVANT Category® | Citation of document, with indication, where appropriate, ofthe relevant passages | Relevant co claim No, x T. ONTA etal, "Fluorometric determination of T hydrogen peroxyde with peroxydase and I-methyl- 1,23 Atetrahydro-B-carboline-3-carboxylic acid”, Fresenius J, Anal. Chem, 1992, vol, 343, n° 6, pages 550-552 x W. A. JACOBS et al., "The Ergot alkaloids. VII 24 ‘The synthesis of 4-catboline carbonic acids", J. Biel. Chem, 1936, vol. 113, n° 3, pages 759-765, see pages 761-762 x ‘T. HERRAIZ ct al., “Analysis of monoamine oxidase 5 enzymatic activity by reversed-phase high performance iquid chromatography and inhibition by b-carboline alkaloids occurring in foods and plants’, J. Chromatography A, 2006 [accesible on line 28.12.2005), vol, 1120, n° 1-2, pages 237-243 Be Fore dosomes we Ted he onto of Box Bi spe ay ancn at aga al oom Fame pT aor eerste ing a A> cheamet ning eel othe a wich et cosiered pt a al tin nice whe pti tobe of paniculelevance Sdertnd the principle theory wnerying the invention avi docurcet bat published on or afer th temasiona ing te “I docamont which may sho doutts om prety clings) or whichis X" —documert of paniular wlevance he claimed inveationcamot be tied to establish the publication date of anther citation oe other conidered noel or cannot be considered to favolee an iavenive Special anon os specified) Sp oben th docursets en lone “07 dcamsatrefeing 0 a8 orl dicks exe, exibition, oF othe “Y" —dovemert of pause evens th clsimed invetion ean be ‘ee comered to involve aa imentive sep when the document 1° ocumeat bist roe othe iterations ing date bu ae han Combined ith one o more oer Sceument such combination theta date claimed being cvious oa person silo in th at 2° document member ofthe sane pet fanly Tae of Te aval competion of ie Ttematonal seach Date of mailing ofthe inteational search Tepam 10 May 2007__(10.05.2007) (2atas/2007) ‘Name and wailing adress ofthe ISA/ Rthoriesd oficee ODM. B. Dévila Muro Pasco de la Castellana, 75 28071 Madd, Espa Facsimile No. 3491 3495308 ‘Telephone No +34 91 349 55 45 Fonn PCTISA/IO (second shoei (ApaISO0T)INTERNATIONAL SEARCH REPORT Intemational application No PCTIES 2007/070016 € (continuation) DOCUMENTS CONSIDERED TOBE. RELEVANT Category (Citation of documents, with indication, where appropriate, ofthe relevant passages Relevant to lai No, a F. ZHANG ct al, "Oxidation chemistry and biochemistry of the central mammalian alkaloid 1- methyl-6-hydroxy- 1,2,3.tetrahydro-B-carboline”, J, Med. Chem,, 1992, vol. 35, n° 1, pages 82-93, see page 86 T. HERRAIZ et al, “L-Tryptophan reacts with naturally ‘occurring and food-occurring phenolic aldehydes to give phenolic tetrahydro-B-carboline alkaloids: Activity as antioxidants and free radical scavengers", J. Agric, Food Chem, 2008, vol. 51, n° 8, pages 2168-2173 TS 1s Fonn PCTISA/3I0 (continuation of second sheet) (ApH 2007)INTERNATIONAL SEARCH REPORT Information on patent family members International application No, PCI/ ES 2007/070016 Pateat document cited Publication, Patent family | Publication date inthe search report, date member(s) 82211295 5 AB 01.07.2004 NONE Fon PCTISAVSIO (patent Family annex) (Apa BOOTINTERNATIONAL SEARCH REPORT Intemational aplication No, PCT/ ES 2007/070016 CLASSIFICATION OF SUBJECT MATTER CO7D 471/04 (2006.01) CO7D 209/58 (2006.01) CO7D 221/06 (2006.01) AGIK 31/437 (2006.01) AGIP 39/06 (2006.01) AGIP 25/00 (2006.01) Fonn PCTISA/2I0 (extra shoes (Apa 2007)INFORME DE BUSQUEDA INTERNACIONAL Solicitud intemacional n? PCT/ BS 2007/070016 A. CLASIFICACION DEL OBIETO DE LA SOLICITUD Ver hoja adicional De seuero cou la Clasifeaci6n Internacional de Patentes (CIP) o sen Ia clasificacia nacional y CIP. 1B, SECTORES COMPRENDIDOS POR LA BUSQUEDA ‘Documentacién minima buscade (sistema de clasificaci soguido de los simbolos de clasificacisn) OTD, CUTC, AGIK, AGLP ‘Ora docomentacidn consultada,ademés dela documentsen minim, en la medida ea que tales documentos formen parte de Ios sectores ‘omprvedis por la bisquoda [Bases de datos clectnnicas consultadas durante Ia bisquods intemecional (nombre de la base de datos y, si es posible, tminos de Disquede utlizados) CIBEPAT,EPODOC,WPICAPLUS ©, DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES Categorta® Documentos ctalos, com indieaea, si procede, ke las partes relevantes Relovante para as reivindicasiones x T. OHTA et al,, "Fluorometric determination of 1 hydrogen peroxyde with peroxydase and I-methyl- 1,2,3.4-tetrahydro-B-carboline-3-carboxylic acid”, Fresenius J. Anal, Chem., 1992, vol. 343, 0° 6, Paginas 550-552 x W. A. JACOBS et al., "The Ergot alkaloids, VIL. 24 ‘The synthesis of 4-carboline carbonic acids", J. Biol. Chem, 1936, vol. 113, n° 3, péginas 759-765, x ‘T. HERRAIZ et al., "Analysis of monoamine oxidase 5 enzymatic activity by reversed-phase high performance chromatography and inhibition by B-carboline alkaloids occurring in foods and plants’, J. Chromatography A, 2006 [accesible en Iinea el 28.12.2005), vol. 1120. 1-2, paginas 237-243 Eq Fn ts continuacién del Recuatio C se relacionan otros documentos EX) Los documentos de fami de potentes se indican ene ‘Avex 7 Cagis eperais de cacao dos =F drcumento_oeioe pando com posal + iba Je -A° docunwato qe define leo gnc ea nice ao comsdrndo presenti etrttonl'© de peed que no peenece ‘tuo prclarmeate vei. ‘Sto defo sie patients po qo ola por pee It Ee Sole de pete open amcor pco pubis ca aka de SENS del emi ena be conti I Be de resent terns en feshe psi inversion 1" acumen qu puss pater ds sabe ang wivindcackn de "documento patclamente elevate inven vinden Pond ge seit pra derma I fovha de palcacin eos FACIE cnscruse neva o go inpigne Ua atid inven [Sno porn repeal como sind), foreseen lJciment suns conser co” Sonne qu se fa uu dimigiie ol, oun iiaci6n,« “Y_dreomeno piles elevante ainenei elias 9 tna expose os cue oo mee estima pnts and init “Pam piled ane dee fcs de greats iran cumento fe ase 8 fo Ws decumets dea ism ero cn ontrack de prod ein, tu ce conc el ei pw xo ee documento qe Forms sted amin fami de ptt Taha cu qe wha consid eesvameate a Binge aeracTona, [Fecha de expen Jel iafonne de biqueds inemeconal 10 Mayo 2007__10.05.2007) 24 de mayo de 2007 _ (24/05/2007) ‘Nombre y diecida postal dele Adminis eneaiada dT Fncionaro auoeizado bisqueda internacional OEPM. Paseo de la Castellana, 75 28071 Mads, Expat, Nee fax 3491 3495308 ‘Fonolario PCT/ISA10 eegunda baja (ADAT SOOTY E, Davila Muro N°de teléfona +34 91349 55 45INFORME DE BUSQUEDA INTERNACIONAL Solicit intemacional PCTIES 2007/070016 €(eontianseia), DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES Categorie® Documentos itodos con indica, si prooede, de las partes relevantes Relevant pars as reivindicavionesn* A F, ZHANG et al, "Oxidation chemistry and biochemistry 1s of the central mammalian alkaloid 1- methyl-6-hydroxy- 1,2,3.Htetrahydro-B-carboline”, J. Med. Chem, 1992, vol. 35, n° 1, paginas 82-93, ver pagina 86 A T. HERRAIZ ct al.,“L-Tryptophan reacts with naturally 1s occurring and food-occurring phenolic aldehydes to give phenolic tetrahydro-B-carboline alkaloids: Activity as antioxidants and free radical scavengers". J. Agric, Food Chem. 2008, vol. 51, n° 8, péginas 2168-2173 Fonnlario PCTNA/2I0 (continoacia de a egunda baja (AbaT SOOT)INFORME DE BUSQUEDA INTERNACIONAL Tnformacin reatva a miembros de familias de patentes Solicit internacional»? PCT/ ES 2007/070016 Documenta de patente ctado Fecha de Miembro(s) dela Fecha de ‘enel informe de bésqueda publicseién familiade patentes | publeacién 82211295 5 AB 01.07.2004 NINGUNO| Fonulaio PCTS A/3I0 (anexo familia de patentes) (AAT 2007)INFORME DE BUSQUEDA INTERNACIONAL Solicited intemasional 1? PCT/ ES 20071070016 CLASIFICACION DEL OBJETO DE LA SOLICITUD CO7D 47 1/04 (2006.01) CO7D 209/58 (2006.01) .CO7D 221/06 (2006.01) AIK 31/437 (2006.01) AGIP 39/06 (2006.01) A61P 25/00 (2006.01) Formalario PCT/SASIO hoje adicfonal) (AbAT 3007)