République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Faculté de Médecine
Département de Pharmacie
Laboratoire de Toxicologie

MANUEL DES TRAVAUX

PRATIQUES DE TOXICOLOGIE

EQUIPE PEDAGOGIQUE

Pr. REZK-KALLAH H.
Pr. Chefirat B. Dr. Saadi F.-Z.
Dr. Lachgueur N. Dr. Saadi R.
Dr. Bendjamaa A. Dr. Adjal S.
Dr. Belabbaci N. Dr. Arab F.-Z.
Dr. Abdaoui A. Dr. Chabane AEH.
Dr. Djelad S. Dr. Messaoudi K.

ANNEE UNIVERSITAIRE
2022-2023
 Manuel des travaux pratiques de Toxicologie

RECOMMANDATIONS AUX ETUDIANTS

1) Il est impératif de respecter la répartition des groupes de TP.

2) La présence aux TP est obligatoire. Les étudiants doivent se présenter 10 minutes
avant l’horaire prévu du TP. Aucun retard n’est toléré après le lancement des TP.
3) L’absence non justifiée est sanctionnée par une note de 00/20 sans accès à une
séance de remplacement.
4) L’absence non justifiée au tiers des TP entraîne l’exclusion du module.
5) L’absence justifiée à la moitié des TP entraîne l’exclusion du module.
6) La justification de l’absence doit être visée dans les 72 h au Département de
Pharmacie et déposée au niveau du laboratoire de Toxicologie.
7) Aucun TP de rattrapage ne peut être organisé en dehors des TP prévus dans le
programme affiché.
8) Chaque étudiant doit porter une blouse blanche bien fermée et une paire de gants.
9) Les téléphones mobiles doivent être rangés et maintenus en position éteinte durant
les TP.
10) Un manuel de TP est mis à la disposition des étudiants et contient les fiches
techniques de chaque TP. Ce manuel sert à la préparation des fiches de travail et ne
doit pas être utilisé au cours de la séance de TP.
11) Chaque étudiant doit préparer au préalable son TP à partir du manuel, sous forme
d’une fiche de travail individuelle qui sera évaluée au cours de la séance de TP.
12) Les manipulations aux TP doivent se faire soigneusement et avec beaucoup de
précautions en respectant les règles de sécurité.
13) Les étudiants doivent nettoyer leurs paillasses ainsi que le matériel utilisé avant de
quitter la salle.
14) A la fin du TP, les résultats doivent être rapportés sur une fiche de compte-rendu et
remis à l’enseignant.

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 Manuel des travaux pratiques de Toxicologie

LISTE DES TRAVAUX PRATIQUES

1) Recherche qualitative des médicaments alcalins : amitriptyline, phénothiazines

2) Recherche qualitative de l’acétaminophène
3) Dosage spectrophotométrique des salicylés par la méthode de Trinder
4) Recherche qualitative des cannabinoïdes par chromatographie sur couche mince
(CCM)
5) Recherche qualitative des alcaloïdes
6) Dosage colorimétrique de la carboxyhémoglobine par la méthode de Wolff
7) Dosage colorimétrique des cyanures par la réaction de Guignard
8) Dosage spectrophotométrique de la méthémoglobinémie par la méthode d’Evelyn-
Malloy
9) Dosage qualitatif de la G6PD
10) Dosage de l’activité cholinestérasique du sang total par la méthode de Vincent-
Segonzac

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RECHERCHE QUALITATIVE DES MEDICAMENTS ALCALINS :

AMITRIPTYLINE, PHENOTHIAZINES
I. PRINCIPE

Les médicaments à caractère alcalin, tels que l’amitriptyline et les phénothiazines, sont extractibles par des
solvants organiques comme le dichlorométhane ou le chloroforme, après leur transformation en forme non-
ionisée par alcalinisation des milieux biologiques.
L’amitriptyline, antidépresseur tricyclique actuellement très impliqué dans les intoxications
médicamenteuses, développe ainsi que ses métabolites une coloration en présence de l’acide sulfurique
concentré.
Les phénothiazines, telles que la chlorpromazine et la lévomépromazine aux propriétés neuroleptiques, ont
un pouvoir donneur d’électron très prononcé, leur permettant de donner un complexe ou des radicaux
cationiques colorés avec un accepteur d’électron dans un milieu acide fort. La benzoparaquinone (BPQ),
utilisée comme accepteur d’électron dans un milieu d’acide phosphorique, donne une coloration en fonction
du substituant.

II. REACTIFS

– Solvant d’extraction : dichlorométhane (DCM) – Acide phosphorique H3PO4 (d = 1,71)

– Solution aqueuse de NaOH à 40% – Solution 10-3 M de BPQ dans du DCM
– Acide sulfurique H2SO4 (d = 1,83)

III. MODE OPERATOIRE

III.1. Extraction liquide-liquide :

Dans une ampoule à décantation, alcaliniser 5 mL d’échantillon (liquide de lavage gastrique ou d’urines)
par 1 mL de NaOH à 40 %. Ajouter 8 mL de DCM et agiter vigoureusement pendant 3 minutes. Après
décantation, recueillir la phase organique (en dessous). Diviser cette phase organique en deux parties :
– La première est transférée dans une capsule blanche en porcelaine et sera utilisée pour la caractérisation
de l’amitriptyline.
– La deuxième partie (~ 2 mL) est transférée dans un tube à essai et sera utilisée pour l’identification des
phénothiazines.

III.2. Caractérisation de l’amitriptyline :

La phase organique transférée dans la capsule en porcelaine est évaporée au 1/5e du volume sur un bain de
sable. Après refroidissement, ajouter 3 mL d’acide sulfurique pur et effectuer des mouvements circulaires
avec la capsule. En présence de triptylines, il se développe une coloration :
– Jaune orangée dans le liquide de lavage gastrique (présence d’amitriptyline).
– Lie de vin dans les urines (présence des métabolites d’amitriptyline).

III.3. Caractérisation des phénothiazines :

Dans le tube à essai contenant la phase organique, ajouter 1 mL d’acide phosphorique pur et agiter
énergétiquement pendant une minute. Une coloration se développe sous forme d’un anneau en présence de
phénothiazines. Ajouter alors 1 mL de BPQ et agiter vigoureusement pendant 30 sec. La coloration
s’intensifie dans la phase acide inférieure ; elle dépend de la molécule présente dans l’échantillon :
– Rose pour la chlorpromazine. – Violacée pour la lévomépromazine.

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RECHERCHE QUALITATIVE DE L’ACETAMINOPHENE

I. PRINCIPE

L’acétaminophène (ou paracétamol) est un antalgique du palier I.

Après hydrolyse de l’échantillon par l’acide chlorhydrique à chaud, on identifie le 4-aminophénol libéré par
diazocopulation avec le phénol en présence de l’ammoniaque. Il résulte de cette réaction une coloration
bleue, dont l’intensité dépend de la quantité du paracétamol présente dans l’échantillon.

II. REACTIFS

– Solution aqueuse d’acide chlorhydrique 4 N

– Ammoniaque concentrée (d = 0,90)
– Solution aqueuse de phénol à 5 g pour 100 mL

III. MODE OPERATOIRE

III.1. Hydrolyse :

– Dans un tube gradué, introduire :

Echantillon 2 mL
Eau distillée 1,5 mL
HCl 4 N 0,5 mL
– Chauffer pendant 15 minutes au bain-Marie à 60 °C.
– Après refroidissement, compléter -si nécessaire- à 4 mL avec de l’eau distillée et agiter.

III.2. Caractérisation :

– Dans un tube à essai, introduire :

Hydrolysat 2 mL
Eau distillée 5 mL
Ammoniaque concentrée 1 mL
Solution de phénol à 5% 1 mL
– Un résultat positif se traduit par le développement au bout de 10 minutes d’une coloration bleu roi
intense.

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DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DES SALICYLES PAR LA

METHODE DE TRINDER
I. PRINCIPE

Tous les dérivés salicylés utilisés sont des dérivés de l’acide salicylique.
En milieu chlorhydrique et en présence de chlorure mercurique, l’acide salicylique réagit, par son
groupement hydroxyle phénolique, sur les ions ferriques, en développant une coloration violette
proportionnelle à la quantité d’acide salicylique présent. Avec le réactif de TRINDER, on se trouve
exactement dans ces mêmes conditions.

II. REACTIFS

– Réactif de TRINDER (chlorure mercurique mélangé au nitrate ferrique dissout dans l’acide
chlorhydrique)
– Solution aqueuse étalon d’acide salicylique à 250 mg/L

III. MODE OPERATOIRE

Dans des tubes à essai de 10 mL, introduire successivement :

Tube 01 (blanc) Tube 02 Tube 03

Eau distillée 2 mL 1 mL /
Echantillon (plasma ou urine) / 1 mL 1 mL
Solution étalon à 250 μg d’acide salicylique / mL / / 1 mL
Réactif de TRINDER 5 mL 5 mL 5 mL
Agiter vigoureusement, centrifuger puis rapidement les densités optiques au spectromètre à 535 nm
(zéro de DO à faire sur le tube 1)
Densités optiques mesurées Blanc DO2 DO3

IV. EXPRESSION DES RESULTATS

𝟐𝟓𝟎 . 𝐃𝐎𝟐
𝐂𝐨𝐧𝐜𝐞𝐧𝐭𝐫𝐚𝐭𝐢𝐨𝐧 𝐞𝐧 𝐦𝐠 𝐝′ 𝐚𝐜𝐢𝐝𝐞 𝐬𝐚𝐥𝐢𝐜𝐲𝐥𝐢𝐪𝐮𝐞/𝐋𝐢𝐭𝐫𝐞 =
𝐃𝐎𝟑 − 𝐃𝐎𝟐

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RECHERCHE QUALITATIVE DES CANNABINOÏDES PAR

CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM)
I. PRINCIPE

La recherche du cannabis peut se faire par la caractérisation de ses principes actifs, les cannabinoïdes, dont
le principal est le tétrahydrocannabinol (THC).
Les cannabinoïdes peuvent être détectés de manière sélective et sensible par chromatographie sur couche
mince (CCM) en utilisant un révélateur, le Fast Blue RR.
Pour rappel, la CCM est une technique permettant de séparer et d’identifier les espèces chimiques
constituant un échantillon. L’échantillon à analyser est spoté sur un support solide appelé phase
stationnaire dont le bas sera trempé dans un mélange de solvants, appelé phase mobile ou « éluant ». Les
constituants de l’échantillon sont traînés par l’éluant et migrent à des vitesses différentes selon leur nature.

II. REACTIFS

– Ether diéthylique – Hydroxyde de sodium NaOH 1%

– Ethanol – Solvants d’élution :
– Réactif Fast Blue RR 0,5% fraîchement préparé Méthanol ............................ 20 mL
Ammoniaque .................... 300 µL

III. MODE OPERATOIRE

III.1. Extraction :

– Dans un tube gradué, introduire 1,5 mL de l’échantillon avec 2 mL d’éther diéthylique.

– Agiter pendant 2 mn au vortex et laisser décanter.
– Recueillir la phase organique (phase supérieure) dans une capsule en porcelaine.
– Evaporer à sec sur un bain de sable et récupérer le résidu avec l’éthanol.

III.2. Préparation de la plaque CCM :

– Sur la plaque d’aluminium recouverte de gel de silice, tracer au crayon à papier un trait horizontal à
environ 1 cm du bas de la plaque, c’est « la ligne de base ». Indiquer ensuite les dépôts des échantillons
et les identifier à l'aide d'un numéro.
– Tracer un autre trait à environ 1 cm du haut de la plaque.
– A l’aide de tubes capillaires, déposer une microgoutte de l’extractum reconstitué sur la ligne de base
(séparer les dépôts d’environ 1 cm l’un de l’autre).
– Laisser sécher et placer la plaque verticalement dans la cuve à élution de manière à ce que l'éluant
n'atteigne pas les dépôts d'échantillon sur la ligne de base.
– Laisser éluer.
– Retirer la plaque de la cuve lorsque l'éluant arrive au front du solvant, et laisser sécher.

III.3. Révélation :

Après séchage, pulvériser la plaque avec le réactif de Fast Blue RR 0,5% fraîchement préparé puis la solution
de NaOH 1%. L’apparition de tâches orange-rougeâtres révèle la présence de cannabinoïdes dans
l’échantillon.

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RECHERCHE QUALITATIVE DES ALCALOÏDES

I. PRINCIPE

Les alcaloïdes sont des principes actifs très puissants qui s’utilisent à doses infinitésimales. Ils constituent
une des sources les plus importantes de nos médicaments. Ce sont des composés azotés qui présentent des
propriétés alcalines plus ou moins marquées et fournissent un certain nombre de réactions colorées.

II. REACTIFS

– Chloroforme – Réactif de Bouchardat :

– Hydroxyde de sodium 40%
– Acide chlorhydrique 0,5%
– Acide sulfurique concentré
– Bichromate de potassium en cristaux
– Réactif de Dragendorff :
Bismuth ........................................................... 2,08 g
Iode bisublimé .............................................. 3,81 g
Iodure de sodium ............................................20 g
Eau distillé q.s.p. .......................................100 mL
Iode bisublimé .................................................... 2 g
Iodure de potassium cristallisé................... 2 g
Eau distillé q.s.p. ...................................... 100 mL
– Réactif de Valser-Mayer :
Iodure de potassium ........................................ 5 g
Chlorure mercurique ................................. 1,35 g
Eau distillé q.s.p. ...................................... 100 mL
– Réactif de Marquis :
Formol pur 35% ........................................ 3,5 mL
Acide sulfurique pur q.s.p.................... 100 mL

III. EXTRACTION

Dans une ampoule à décantation, alcaliniser 5 mL d’urine par 0,5 mL de NaOH 40%. Ajouter 5 mL de
chloroforme et agiter vigoureusement, laisser reposer puis renouveler l’opération 2 à 3 fois. Recueillir le
chloroforme après décantation en 5 parties qu’on évapore à sec sur :
– 3 verres de montre pour la recherche des alcaloïdes par des réactions générales.
– 2 capsules pour la recherche spécifique de la morphine et de la strychnine.

IV. RECHERCHE DES ALCALOÏDES PAR LES REACTIONS GENERALES

IV.1. Réaction de Dragendorff (Réactif iodobismuthique) :

Reprendre le résidu d’un verre de montre par 0,5 mL d’HCl 0,5% puis y ajouter une goutte du réactif de
Dragendorff : il se forme un précipité rouge-orangé d’iodobismuthite d’alcaloïde.

IV.2. Réaction de Bouchardat (Réactif iodo-ioduré) :

Reprendre le résidu d’un verre de montre par 0,5 mL d’HCl 0,5% puis y ajouter une goutte du réactif de
Bouchardat : il se forme un précipité jaune à brun-noir de periodure d'alcaloïde.

IV.3. Réaction de Valser-Mayer (Réactif iodomercurique) :

Reprendre le résidu d’un verre de montre par 0,5 mL d’HCl 0,5% puis y ajouter une goutte du réactif de
Valser-Mayer : il se forme un précipité blanc ou jaune de mercuriiodate d'alcaloïde.

V. RECHERCHE SPECIFIQUE DE LA MORPHINE ET DE LA STRYCHNINE

V.1. Recherche de la Morphine par la réaction de Marquis (Réactif sulfoformolé) :

Reprendre le résidu d’une capsule par 3 gouttes du réactif de Marquis : il se développe une coloration
pourpre qui vire au violet puis au bleu.

V.2. Recherche de la Strychnine par la réaction d’Otto (Réaction d’oxydation) :

Reprendre le résidu d’une capsule par 3 gouttes d’acide sulfurique concentré puis y ajouter 2 ou 3 cristaux
de bichromate de potassium et agiter la capsule : il se développe des stries violettes qui virent au rouge puis
au jaune avant de disparaitre.

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DOSAGE COLORIMETRIQUE DE LA CARBOXYHEMOGLOBINE

PAR LA METHODE DE WOLFF
I. PRINCIPE

La carboxyhémoglobine (HbCO), plus résistante à la dénaturation que l’hémoglobine, peut être séparée de
celle-ci et ultérieurement dosée. En effet, le chauffage à 55°C pendant 5 minutes d’une dilution de sang
tamponnée à pH 5 précipite l’hémoglobine tandis que la carboxyhémoglobine reste en solution ; une simple
filtration permet de séparer ces deux combinaisons.
La carboxyhémoglobine donne au filtrat une coloration allant du rose au rouge selon le taux. Cette
coloration peut être appréciée au spectrophotomètre à 540 nm.
Un sang exempt de monoxyde de carbone, soumis au même traitement, présente un filtrat légèrement teinté
en jaune.

II. REACTIFS

– Solution aqueuse d’acide acétique 5 M : – Solution aqueuse d’acétate de sodium 3 N :

Acide acétique ............................................... 300 g Acétate de sodium 3H2O ........................... 408 g
Eau distillée q.s.p................................... 1000 mL Eau distillée q.s.p. .................................. 1000 mL

– Au moment du dosage, préparer la solution tampon de Wolff (pH ~ 5) :

Solution d’acide acétique 5 N ..................................... 1 volume
Solution d’acétate de sodium 3 M ........................... 3 volumes

III. MODE OPERATOIRE

– Faire une dilution sanguine de l’échantillon au 1/5ème avec de l’eau distillée et mélanger par
retournements (non violents) pour provoquer l’hémolyse.
– Dans un tube à essai, mélanger doucement (sans agitation) 1 mL de la dilution sanguine avec 4 mL de la
solution tampon.
– Porter le mélange au bain-marie à 55 °C durant 5 minutes exactement.
– Refroidir immédiatement sous un courant d’eau et filtrer ou centrifuger.
– Le filtrat ainsi obtenu est passé au spectrophotomètre à 540 nm contre le blanc réactif (1 mL d’eau
distillée + 4 mL de la solution tampon).

IV. RESULTATS ET INTERPRETATION

Le pourcentage en carboxyhémoglobine est déterminé en se reportant à une courbe d’étalonnage.

Une relation est décrite entre le pourcentage de saturation en CO et l’effet toxique :

HbCO (%) Effet

10% Effet inappréciable, sauf respiration plus rapide en cas d’effort musculaire violent
Effet inappréciable, en général, sauf respiration rapide en cas d’effort, même modéré
20%
Léger mal de tête dans quelques cas
30% Mal de tête, irritabilité, fatigue facile, jugement troublé
40-50% Mal de tête, confusion, collapsus et syncope en cas d’efforts
60-70% Perte de connaissance, arrêt de la respiration et mort si le séjour est prolongé
80% Rapidement mortel
Plus de 80 % Immédiatement mortel

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DOSAGE COLORIMETRIQUE DES CYANURES PAR LA

REACTION DE GUIGNARD
I. PRINCIPE

L’ion cyanure donne avec l’acide picrique et en milieu alcalin de l’isopurpurate de K rougeâtre.

II. REACTIFS

– Solution saturée d’acide picrique à 15 g/L

– Solution de Na2CO3, 10H2O à 5 g pour 100 ml d’eau distillée
– Solution étalon de cyanure à 10 mg de HCN/L

III. MODE OPERATOIRE

Pour la préparation de la gamme d’étalonnage, introduire dans 08 tubes à essai de 10 ml, la solution étalon
de cyanure aux volumes indiqués sur le tableau ci-dessous et compléter à 5 ml avec de l’eau distillée (la
courbe d’étalonnage est prête, le protocole est donné juste à titre indicatif).
Pour le dosage dans l’échantillon, mélanger 5 mL de l’échantillon directement avec 1 mL de la solution de
carbonate et 2 mL de la solution d’acide picrique.

[CN-] (mg/L) Blanc 2 4 6 8 Echantillon

Sol étalon 10 mg/L (mL) 0 1 2 3 4

Prendre directement 5
Eau distillée (mL) 5 4 3 2 1
mL de l’échantillon
Agiter puis ajouter

Na2CO3, 10H2O 5% (mL) 1 1 1 1 1 1

Acide picrique 15‰ (mL) 2 2 2 2 2 2

– Agiter et placer les tubes dans un bain marie à 55°C pendant 15 minutes.
– Refroidir et lire la densité optique de chaque tube à 535 nm contre le blanc réactif
– Extrapoler la DO de l’échantillon pour trouver sa concentration en mg de CN-/L

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DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DE LA
METHEMOGLOBINEMIE PAR LA METHODE
D’EVELYN-MALLOY
I. PRINCIPE

La méthode d’Evelyn-Malloy est basée sur la mesure de l’absorbance à 630 nm d’une dilution sanguine,
avant et après transformation totale de l’hémoglobine en méthémoglobine et en cyanméthémoglobine,
sachant que l’oxyhémoglobine et la cyanométhémoglobine n’absorbent que très peu la lumière à cette
longueur d’onde.
L’opération comporte le dosage de la méthémoglobine d’une part et celui de l’hémoglobine totale d’autre
part. L’addition de KCN dans une partie de l’hémolysat de l’échantillon transforme toute la méthémoglobine
présente en cyanométhémoglobine. La différence de l’absorbance de l’hémolysat, avant et après addition
de KCN, est proportionnelle à la quantité de méthémoglobine présente.
Dans une autre partie de l’hémolysat de l’échantillon, l’addition de ferricyanure de potassium convertit
toute l’hémoglobine présente en méthémoglobine. La mesure de l’absorbance avant et après addition de
KCN permet de connaître le taux d’hémoglobine totale.

II. REACTIFS

– Solution de phosphate diacide de potassium – Solution de phosphate disodique (solution II) :

(solution I) : Na2HPO4, 2H2O .......................................... 35,81 g
KH2PO4 .......................................................... 13,61 g Eau distillée q.s.p. ..................................1000 mL
Eau distillée q.s.p................................... 1000 mL
– R1 : solution tampon phosphate 1 à pH = 6,8 (extemporanée) : mélanger un volume de la solution I
avec un volume de la solution II, puis ajuster le pH à 6,8
– R2 : solution tampon phosphate 2 à pH = 6,9 (extemporanée) : mélanger deux volumes de la solution
tampon 1 avec trois volumes d’eau distillée puis ajuster le pH à 6,9
– R3 : solution aqueuse de ferricyanure de potassium à 4 g pour 100 ml (extemporanée)
– R4 : solution de cyanure de potassium (extemporanée) : dissoudre 0,5 g de cyanure de potassium dans
10 mL de tampon 2

III. MODE OPERATOIRE

Introduire 300 μL de sang total homogénéisé dans un tube à centrifuger conique, puis compléter à 6 ml avec
de l’eau distillée. Mélanger et incuber 5 minutes. Ajouter 4 mL de R1 puis mélanger et centrifuger (3000
tours/mn, 10 mn). Dans 4 tubes à essai, introduire :

Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4

Eau distillée 0,5 mL 0,5 mL — —
Surnageant — 3 mL — 3 mL
Ajout du R2 3 mL — 3 mL —
Ajout du R3 — — 0,5 mL 0,5 mL
Incubation Laisser agir pendant 10 mn
Lire la DO à 630 nm Blanc pour A1 A1 Blanc pour A3 A3
Ajout du R4 Ajouter 30 µL dans chaque tube
Incubation Laisser agir pendant 2 mn
Lire la DO à 630 nm Blanc pour A2 A2 Blanc pour A4 A4

IV. EXPRESSION DES RESULTATS

Le résultat est exprimé en pourcentage de méthémoglobine par rapport à l’hémoglobine totale de

l’échantillon, selon l’équation suivante :
𝐀𝟏 − 𝐀𝟐
𝐌𝐞𝐭𝐇𝐛 (%) = 𝟏𝟎𝟎
𝐀𝟑 − 𝐀𝟒

La méthémoglobinémie normale est ≤ 2 %

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DOSAGE QUALITATIF DE LA GLUCOSE-6-PHOSPHATE

DESHYDROGENASE (G6PD) PAR LE TEST DE REDUCTION DE
LA METHEMOGLOBINE (TEST DE BREWER)
I. PRINCIPE

Le déficit en G6PD est également appelé le favisme en raison de risque survenu lors de l’ingestion de la fève
(Vicia faba) d’une anémie hémolytique. Il s’agit de l’enzymopathie érythrocytaire la plus fréquente qui
touche plus que 7% de la population mondiale.
Le test de réduction de la méthémoglobine (test de Brewer) est la technique la plus couramment utilisée
pour dépister un déficit en G6PD. Ce test consiste en l'oxydation de l'hémoglobine en méthémoglobine par
le nitrite de sodium suivie d’une reconversion enzymatique en hémoglobine en présence de bleu de
méthylène. Cela se produit par la stimulation de la voie des pentoses phosphates et par l’activation de la
NADPH-méthémoglobine-réductase.

II. REACTIFS

– Blue de méthylène 0,4 mM

– Nitrite de sodium 0,18 M

III. MODE OPERATOIRE

Contrôle positif (mL) Contrôle négatif (mL) Echantillon (mL)

2 2 2
NaNO2 — 0,1 0,1
Bleu de méthylène — — 0,1
Mélanger les trois tubes par inversion et incuber à 37 °C pendant 1 h 30
Diluer au 1/100e
Mélanger les trois tubes dilués par inversion 15 fois

IV. INTERPRETATION DES RESULTATS

Le contrôle positif doit donner une coloration brune.

Le contrôle négatif doit donner une coloration rougeâtre.
Concernant le test :
– Si la coloration est rouge : le sujet n’est pas déficitaire.
– Si la coloration devient brune : le sujet est déficitaire.

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DOSAGE DE L’ACTIVITE CHOLINESTERASIQUE DU SANG

TOTAL PAR LA METHODE DE VINCENT-SEGONZAC
I. PRINCIPE

Après réaction de l’enzyme sur le substrat à 38°C, à pH 7,4 et pendant 30 minutes, on dose l’acétylcholine
en excès. L’action de l’hydroxylamine, en milieu alcalin, sur l’acétylcholine donne l’acide
acétylhydroxamique. Celui-ci donne, en milieu acide et en présence du chlorure ferrique, un complexe de
couleur rouge se prêtant à un dosage photométrique à 520 nm.

II. REACTIFS

– Tampon véronal pH 7,4 : 1 Vol de solution de véronal sodique 2,06 g% est mélangé extemporanément
avec 5 Vol de solution de véronal 0,367 g%
– Solution d’acide trichloracétique 10 g%
– Solution de chlorhydrate d’acétylcholine 1g/L dans du tampon pH 7,4 (conservée à +4°C)
– Solution d’hydroxylamine 2 M (conservée à +4°C durant, deux semaines max)
– Solution de soude 3,5 N
– Solution alcaline d’hydroxylamine : 1 Vol de solution d’hydroxylamine 2M est mélangé
extemporanément avec 2 Vol de solution de soude 3,5 N (conservée à température ambiante, trois
heures max)
– Solution d’acide chlorhydrique 4 N
– Solution acide de chlorure ferrique 6,024 g% dans de l’acide chlorhydrique 0,1 N

III. MODE OPERATOIRE

Tube 1 : échantillon Tube 2 : étalon Tube 3 : blanc réactif

Sang total dilué au 1/10 et hémolysé 0,20 mL — —

Tampon véronal pH 7,4 0,80 mL 0,80 mL 1,80 mL

Laisser 5 minutes à 38°C

Chlorhydrate d’acétylcholine 1 g/L 1 mL 1 mL —

Laisser incuber 30 minutes à 38°C puis ajouter immédiatement :

Acide trichloracétique 10% 1 mL 1 mL 1 mL

Sang total dilué au 1/10 et hémolysé — 0,20 mL 0,20 mL

Agiter et centrifuger. Prélever ensuite 1,5 mL du surnageant

Solution alcaline d’hydroxylamine 0,40 mL 0,40 mL 0,40 mL

Attendre 2 minutes

Acide chlorhydrique 4 N 0,30 mL 0,30 mL 0,30 mL

Solution acide de chlorure ferrique 0,20 mL 0,20 mL 0,20 mL

Eau distillée 2 mL 2 mL 2 mL

Lire la DO à 520 nm DO1 DO2 Blanc réactif

IV. EXPRESSION DES RESULTATS

𝐃𝐎𝟐 − 𝐃𝐎𝟏
𝐀𝐜𝐭𝐢𝐯𝐢𝐭é 𝐜𝐡𝐨𝐥𝐢𝐧𝐞𝐬𝐭é𝐫𝐚𝐬𝐢𝐪𝐮𝐞 𝐭𝐨𝐭𝐚𝐥𝐞 = 𝟏𝟎𝟎
𝐃𝐎𝟐
(exprimée en µg d’acétylcholine hydrolysé en 01 heure à 38°C par 1 µL de sang total)

Les valeurs usuelles sont de 51,2 [38,4-70,9]

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 Manuel des travaux pratiques de Toxicologie

RISQUES CHIMIQUES ET SECURITÉ AU LABORATOIRE

Les travaux pratiques de toxicologie impliquent l’utilisation des produits

chimiques qui ne sont pas démunis de toute toxicité. Une erreur de manipulation
peut être à l’origine de dommages physiques et/ou organiques, immédiats ou
retardés. De ce fait, il faut faire preuve de prudence et de bon jugement.

Règles de sécurité :
• Suivez toutes les instructions données par l'encadreur.
• Signalez à l’encadreur tout problème de santé et d’allergie.
• Toute boisson ou nourriture sont interdites au poste de travail.
• Attachez les cheveux longs.
• Evitez de porter des lentilles de contact.
• Restez à votre poste de travail.
• Portez des gants avant toute manipulation.
• Suivez précisément les procédures décrites.
• Travaillez soigneusement et surveillez vos expériences.
• Considérez tous les produits chimiques comme étant dangereux.
• Ne mélangez jamais des produits chimiques hors indication des modes opératoires.
• N’aspirez jamais les produits chimiques avec votre bouche.
• Versez les produits chimiques correctement et en toute sécurité.
• Gardez l'extrémité ouverte des récipients des réactifs loin des visages.
• Gardez les couvercles sur les contenants de produits chimiques lorsqu'ils ne sont pas
utilisés.
• Signalez tout déversement de produits ou cassures de verrerie à l'encadreur.
• Ne regardez jamais dans un récipient que vous chauffez.
• Laissez les brûleurs et les plaques chauffantes refroidir avant de les toucher.
• Ne jamais laisser sans surveillance une source de chaleur.
• Ne jamais toucher tout équipement, produit chimique ou d'autres matériaux avant
d'y avoir permission.
• Nettoyez complètement la zone de travail quand vous aurez fini et rangez tout le
matériel tel que trouvé au début de la séance de TP.
• Eliminez les déchets conformément aux instructions.
• Lavez-vous les mains avant de quitter le laboratoire.

En cas d’accident :
• Prévenez immédiatement l'encadreur au sujet de tout accident.
• Rincez immédiatement les substances entrant en contact avec la peau ou les
vêtements.
• Si des produits chimiques entrent en contact avec les yeux, rincez-les immédiatement
et abondamment avec de l'eau pendant plusieurs minutes.
• Traitez les brûlures sous un flux d'eau froide.

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