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  • Capítulo 3 - Conceito de Doença, Sintomatologia e Diagnose

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    Capítulo 3 - Conceito de doença, sintomatologia e diagnose

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    lor Lo 3 CONCEITO DE DOENCA, SINTOMATOLOGIA E DIAGNOSE Jorge Alberto Marques Rezende, Nelson Sidnei Massola Junior e Ivan Paulo Bedendo INDICE 3.1. Doengas de plantas... 3.1.1. Caractristicas basicas das doencas de plantas 3.1.2, Causa da doengs 3.2. Sintomatologia. 7 7 8 1 33.Diagnos. 3.3.1. Diagnose de doencas conhecidas.. 3.3.2, Diagnose de doengas desconhecidas 3.4, Bibliografia consultada.. 3.1, DOENCAS DE PLANTAS doenga € 0 objeto central da Fitopatologia, um fendmeno exclusive dos seres vivos e, como tal, atéria de estudo da Biologia, a cigncia da vida Enire as diferentes especialidades da biologa esta patologia, que a disciplina através da qual os principios bsicos que caracterizam 2 natureza da doenga slo estudados. A patologia, a exemplo da fisiologia, trata do estudo das fungGes ou processos vitis dos seres vivas,e a diferenea entre estas duas diseiplinas esta no sew enfoque. A fsiologia busca o entendimento dos mecanismos que levam & competéncia funcional plena dos seres vivos, enquanto que a patologiaprocura elucidar @ que acontece quando os sistemas vivos nfo sfo capazes de manter a competéncia funcional em sua plenitude. A razo da falta desta competéncia funcional éa doenga, cujo conceito deve ser aplicado para tados os seresvivos (planta, animais e 0 proprio homem) nos diferentes ramos da patologia (Fitopatologia, Medicina Veterndria ¢ Medicina Humana). Estes ‘amos, por outro lado, desenvolveram-se independentemente como Aisciplinas aplicadas, cada um com suas partculaidades pritias. Estas duasvisdes, a tbric,bisica,cientfica ou biologic, por um lado, ea pritics, aplicada ou agrondmica, por outro, aliadas & complexidade dos sistemas vivos, trazem a tonaalgumas questOes ‘quando se discute 0 conceito de doenga dentro da drea vegetal, refletindo ponts de vista diferentes, is vezes aéconfliantes. Ao tentar definie doenga, 0s ftopatologisls esbarram em algumas dificuldades, entre elas como estabelecer os limites entre 0 que 6 normal ou sadio © o que é anormal ou doente; como separar ddoenga de uma simples injiriafisica ou quimice; como distinguir (lupa seyuido da coleta dessus estruturas posterior observagl0 de lus, frequentemente permite a identifica ‘estan facilmente visiveis, pode-se colocar 0 ma ide 24h. Isso normal jacteristicas do ics tal doce em camara imida por cere cestruturss reproautivas © prendugion Fimgens necrotuiticus, & possivel a sme di agente em new de cultura, con sus posterior be de infecyan buacteriann pads lang uspeitan ds chornuda “varnida bicteriana’, de preparaydes que peanitann bb vioualizuyies da bueterna at niictinwOpio de Hug os mest cho shan urd cultura A vlcvtticay oda Dac 614 para complementar a diagnose e, neste caso, rer uso de métodos culturais, bioquimicos, sorolégi ser ne pode-se e moleculares, Caso a suspeita de que o agente causal seja um molicute, Fiolo como as bactérias, 05 procedimentos inddo-se de fitoplasmas, que no sig \vcis em meios de cultura, a demonstragao da sua ocorréncia, sintomaticas pode scr Feita por meio do uso de micros- Je transmissiio (MET) ou da técnica molecular de ppolimerase ("Polymerase Chain Reaction siio bastante iteis para a detecgio de fitoplasmas, téenica de PCR vem sendo empregada de forma roi nncira para esta finalidade. A presenga de sintomas caracteristicos ha planta doente e a detecgao de fitoplasmas nos seus tecidos tem sido suficientes para confirmar a diagnose de doengas associadas a cesses agentes fitopatogénicos. No entanto, quando ha interesse em se identificar 0 fitoplasma detectado, é necessirio que se aplique a técnica de polimorfismo no comprimento de fragmentos de restr gio (“Restriction Fragment Lenght Polymorphism ~ RFLP") ou 0 Sequenciamento de nucleotideos da regido do genoma correspon- dente a0 16S rDNA. Para o caso de espiroplasmas, apesar de serem cultivaveis em meios de cultura, a sua detecgao nos tecidos vege- lais segue procedimentos idénticos aqueles adotados para os fito- plasmas, ou seja uso de microscopia eletronica e de técnicas mole- cculares, embora a microscopia de luz (campo escuro ou contraste de fase) possa também ser utiizada para detecsio do patégeno, ‘A diagnose de doengas causadas por virus ¢ viroides também inicia-se pela observacdo dos sintomas, que so distintos daqueles causados por fungos € bactérias. Caso nio seja possivel ‘a identificagdo da doenga com base apenas nos sintomas, a diagnose e identificago do virus é feita por meio dos seguinte procedimentos: a) teste de transmissio do virus para espécies hospedeiras e/ou indicadoras por meio de transmissio mecinica ‘ou por enxertia, ou até usando-se o vetor do virus quando conhecido (inseto, écaro, nematoide, fungo): b) exame do material ‘vegetal ao MET para observar a morfologia das particulas virais ¢ 05 tipos de inclusées citoplasmaticas. As particulas virais poder ser visualizadas em extratos ou cortes ultra-finos de tecidos infectados, enquanto as inclusdes somente sto vistas no MET em cortes ultra-finos de tecidos. Outro procedimento relativament simples e de grande valor na identificaao de particulas de virus especificos em suspensio aquele que combina a especificidade dos testes sorol6gicos com a possibilidade de visualizar © antigeno (particula) viral no MET. Diversas téenicas podem ser emprezadas com essa finalidade, sendo a mais simples denominada micros- copia eletrénica imuno-especifica; ¢) testes sorologices podem ser empregados para os casos em que hi antissoros espe isponiveis. O teste sorologico.m wm € o de ELISA (’Enzyme-Linked Immunosorbent Assay") nas suas diferentes Variagdes (Figura 3.32). Outros testes que empregam a sorologia, como dupladifusto em agar, “westem blot”, “dot blot”, ete tamber ed) outra ferramenta ttl & a diagnose molecular saracterizayao do dcido nucleiee viral de Fitovirases embo um proca ‘slo um pouco diferentes. Tra cult cem plant podem ser tte buseada 9 Existem varias teenieas ial de i slot blot, Southern blot e Nordiern blot ¢ as wecnicas de PCR, part virus de DNA © RE (Reverse Transeription) PCR para virus d& RNA Ha, ainda, & possibilidade de usar a PCR em tempo veal wot aeniominala PCR quantitativa (qPCR REAPER), 1a qual anmolgcula de DNA ampliicada © quanti wolecullares para dente eas a bibs Figura 82 HLISA onde corse a reagio.antigenoe pe As cavidaes em amarelo indicam reagio Pevstva, ca avai Wo € Feita quantificando-se @ shserbincia em espectrofixomet (leitor de ELISA) Diferente da PCR © RT-PCR, nas quais a amplificagao do leaco viral ocorre em um termociclador, com alternnia dle femperaturas, essa amplificagdo também pode ser aleangada sob ‘conigin 1solGrmica, portanto sem a necessidade do termocielador, por mei dx téeniea denominada “Loop-mediated isolthermal amphitication — LAMP". O fragmento amplificado pode ser visualizado a olho nu, dirclamente no microtubo onde ocorreu a smplificago, via anlise da turbider. ou por meio da fluorescéncia produsida (Fura 3.33). A técnica de LAMP, além de menor eusto, tem potencial de amplificagdo 10-100 vezes superior & PCR. O tempo da reagio € de 45-60 min a 60-65 °C, Essa técnica também tem sido til na deteegao de fungos e bactérias, Atualmente hi equipamento port e kit para a reago que permitem aplicar a teemea de LAMP para a diagnose da doenga no campo, Figura 3.33 - Detecgo do begomovirus Tomato severe rugose virus (ToSRV) através do LAMP. Os primeiros dois tubos representam amostras de mosca branca © tomateiro infectados ¢ 0s trés thimos os respectivos controles rneyativos (inset, tomateiro ¢ égua) Crédita da foto: T Mita ‘Se 05 sintomas exibidos pela plantas sio indicativos de infecydo por nematoides, a identificagdo destes agentes pode ser feita com base em earacteristicas morfoldgicas que podem ser ‘obidas pelo exame dos &-emplares em microscépio de luz (até 1.000 vezes de aumento). Ea chamada identificagdo descritiva clissica, que € eomposta de és etapas: a extragdo dos nematoides das amostras, @ oblenglo de preparagdes. mieroseépicas © o exame das preparaydes em microscopio. Muitas vezes, porém, no é possivel a identificago dessa maneira, Por exemplo, pura ‘demificayao especifiea dos nematoides das palhas (Meloidogyne spp.) que sio 0s mais importantes fitonematoides do ponto de vista eeondmico, recession 0 uso de cletroforese de isoensimas. Atualmente, as técnicas moleculares também jé esto sendo empreyadas com essa finale frequentemente & Conceito de Doenga, Sintomatologia e Diagnose Firctanto, em algumas ocasiBes. os processos até agora descritosndo permitem a diagnose segura. Um exemplo tpico €0 aso de uma doenga nova, ainda nio descrita na literatura, Nesta situagio, as etapas do Postulado de Koch devem ser realizadas para que se possa estabelecer a relagdo causal entre uma doenga € um determinado agente. A aplicagio do Postulado de Koch encontra-se descrita a seguir. Porém, existem ainda algumas otras situagdes nas quais no possivel uma diagnose conclusiv3, mesmo em se atando de doenga ji descrita, como por exempl. «quando os sinas nfo esti evidentes ou quando os sintomas no correspondem exatamente agueles deseritosa literatura, Nesses ‘asos, ndo é necessirio realizar todas as etapas do postulado para se chegar a diagnose. Quando se suspeita de agente bidtico necrottéfico, basta proceder a isolamento do pat6geno em meio de cultura, para posterior identificagdo. Eventualmente, pode-se também realizar inoculagées no hospedeiro sadio com o intito de reproduzir os sintomas. Os procedimentos para isolamento « ioculagdo de patégenos fingicos esto deserios juntamente com 0 Postulado de Koch. No entanto, se 0 isolamento do agente eausa ndo€ possivel (por exemplo, virus), pode-se ainda recorrer aos exames complementares que permitem a diagnose segura, como 0s testes sorol6gieos e moleculares, comentados anteriormente 'No easo de nova doenga hi ainda a possibilidade de identiicagao através do “Next generation sequencing” (NGS) ‘ou “deep sequencing” que é uma técnica de sequenciamento de DNA que tem revolucionado os estudos genémicos. Por meio dessa tecnologia, o genoma completo de um organismo pode ser sequenciadoem apenas um dia. Ha vias plataformas de NGS que utilizam diferentes téenicas de sequenciamento, embora todas elas executem sequenciamento de milhdes de pequenos fragmentos ‘de DNA em paralelo,Posteriormente,anlises de bioinformstica ‘agrupam esses fragmentos por meio do mapeamento com um genoma referencia. Hé, portato, numerosas possibilidades de uso do NGS, entre as quais a diagnose de doengas de plantas, sejam elas conhecidas ou desconhecidas. Entre as vantagens dessa tecnologia estio:)aplcavel para fungos, procariotos(bactériase molicutes),vius vroides, pois todos contém RNA e lou DNA: bjaplicével paraagentespatogénicos, bem como paraantagonistas ‘ou outros mierorganismos associados planta; ¢) aplicével para organismos cultiviveis endo cultivaveis (biotrficos): @ «permit aidetficaraode ptégenos inesperados, completamente novos. A principal desvantagem dessa tecnologia & a necessidade 4e infaestrtura computacional adequada e profissionais especia- lizados para analisar e interpretar corretamente 0 conjunto dos resultados. Para os procedimentos de diagnose de doengas abioticas ‘consultar o Capitulo 33 ~ Doengas abidticas e injuris, desta obra, 3.3.2. Diagnose de Doengas Desconhecidas © item anterior atou da diagnose de doengas ja descrtas na literatura, Como se deve proceder, no entanto, quando rnenhurna evidéneia de doenga conhecida & encontrada no material aanalisado? Ou, ainda ugnosticadas as doenyas ‘quando apareceram pela primeira vez, ao passado? Ocstabelecimento da reaydo causal entre uma doengae um microrganismo s6 pode ser conimmado apés © eumpeimento de uma série de etapas, que compdem o “postulado de Koch”, Este postulado, deserito pelo mnédico alemdo Robert Koch, em L881, para 0 carbineuto, causado pelo Bacillus anthracis, foi adaptado como foram 0 apaoligin © €, até haye, uilizade coma inode clission de ingmose de doengns de plantas Assim & emumeinda « postulade de Koch, + Assoeiefloconstante ppatigene Ihoxpedein © suspeite paiygene sJeve estar presente em todas as plantas de umn mesma espée ve apresenam o mesmo tipa de santo Em outras palavras, um eterminadssimtama deve estar constamtemente associade a um suspeito patogena, sempre que a doengs for observ ada + Isolamento do patigeno 0 onga nism associads a0 sintoma deve xer wslado da planta doente, mul- Tipheads axenicamente © ter suas ccaracteristicas descritas, + Inaculago do patogeno repro: 0 dos simtomas © suspeito patogeno, obtide em cultura pura seve ser maculado em plantas sadias da mesma especie e variedade e pro- vocar o mesmo sintome observado ‘as plantas inicialmente doentes. * Reisolamento do patdgeno - 0 ‘microrganismo deve ser reisolado das plantas submetidas & inocula. ‘experimental e suas caracteris- lucas devem ser as mesmas observa das na segunda etapa do postulado Somente se todas as citadas etapas ‘orem cumpnidas, © organismo isolado pode Se wonsiderads como 0 agente patogénieo, exponsavel pelo simtoma abservado. No fentamto, pans o tsolamento e 3 inoculagio 6 gente cause! so necessirins técnicas specifica de onalino, deserts & seguir, 3.3.2.1, Isolamento de agentes fitopatogenicos i+ plants docnte possui una oflore vomposta pelo parasite prima (agente epifiti al da ducngs) © de ony slgumas vezes wt are solar agentes patos urs, con fut sprottcan sro separi-lo da muctoltons epiita apne: fia, raves de ee desenolvii hes que favereyany etn detriment meno dos outten. Diveraas etapun iso vento de ui agerite pa No caso de pa tun Jolates, peg tetirades da plants docile Nesta stew v wo das esGes, normaliette uy encontiad ‘organuannos saprotiticus, os dlevetn set cumpridas dn Jenico pura 834 © Figuia 4.35) Naymentos de tei da eyo lunitrofe ene tea levionaa ¢ 4 a WRENN Be erUNIN Mmuior whvidade, enquanto na ates nectotica, hnaleada me eee has populaydes de as esto deseavers Manual de Fitopatologia ‘rd amc oe ‘superteal or Neston, seclecvoge Deainetagte 3° Deainatagte supertie embers ‘4 24-th roping de clenns Figura 3.95 Isotamcuto de bacteria a pat de evi ola wo (Os tragientosfoliares da regio limitrote do tevido doerte ‘eve cnt, sotter unuadesintestagdosupetticial atime vit cousideraveliiente, ‘ou po anette ada even ver 0 saprotitas preset {ian lo auctols muatsatiicados wa desinestaydo superical Je cts dos agimentos selecionados eit W0 de soxio a 0,5% por Conceito de Doenga, Sintomatologia e Diagnose (raizes ou frutos), pode-se aumentar a concentragdo do agente Uma variagdo no método de isolamento, conhecido por desinfestante, 0 tempo de exposigdo, ov ambos. isolamento dirto, compreendeo isolamento de agentes patogénices ‘Apés a desinfestacdo superficial, os 1 partir das suas estruturas que esto colonizando os tecidos do ser transferidos, em condigées assépticas, para um meio de hospedeir Alguns fungos produzem estruturs de reprodugdo cultura pobre em nutrientes (Boxe 3.7), Nessa situago, apenas 0 (esporos ou corpos de frutificaglo) na superficie do hospedeiro, mais ‘organismo que esté no interior dos tecidos deve crescer, favorecido _precisamente sobre a dea lesionada. Quando estas estruturas esto pelos nutrientes fomecidos pelo tecido vegetal do préprio hos presentes em grande quantidade, pode-se proceder ao isolamento pedeiro. Apés 24-48 horas de incubaglo, pequenas porgSes por meio da coleta das mesmas (sob mierescopio esteeoscépico), ‘etd dos bors das colonia fingcas ou bacteranas que se sequid detanferéca deta para o meio de ura erence sineria dor ain peels "Nem todos os agentes fitopatogénicas sto capazes de crescer Um meio culture para outro &designada,em Foptlogia pais Tumse ctu, Muito paras biweas, como gs nes temo repicagem. Em meio nutritive adequadoesobcondgSes deeds foplas se devenvovem soment em eu vias incubagio (temperatura e luz) favoriveis, omicrorganismo isolado Yu no AS tengo, 0 isolamento ¢ a obtengo dee smile cl ps. Pan ge vars, ESS A utiliza-se uma variagéo do procedimento acima descrit vesse_ ie ees jopaomenices 280 [nin aa eevee um 7 aa bot ieesaraat at fa aur © _hospedeiros especificos, os quais devem ser mantidos em locais imersio em alcool etilico e realiza-se uma flambagem ripida da adequados, como casas de vegetapio ¢ telados. syescveea! eaepacieeteanar aris seer aca Em ais oman sia cfamiac,—3.3..tneuade de mirorgninos Sapo Siren saree do he, Eee Segoe Gat A nec evolve teas em qe page © submetidos uma solugdo de hipoclorito de sédio a 0,5% por 2a _hospedeiro sfo colocados em contato, sob condigSes favoraveis & i ianors Gass paatmsfasteie eal ecto serait ee Me tena uy ‘meio de cultura um preparado nutritivo que permite o crescimento de microrganismos. Os meios podem ser solidificados ou liquidos de acordo com a adigao de gar ou nao. Alguns meios sio inteiramente sintéticos, preparados com quantidades conhecidas de produtos quimicos bem definidos, e usualmente bastante especificos para certos patégenos. Os meios de cultura mais uilizados, no entanto, sio semi-sintéticos, pois contém na sua composi¢io fonte natural de carbono, como um a¢iicar ouamido. Para ocultivo de fungos itopatogénicos,utliza-se, com frequéncia, 0 meio de batata-dextrose-égar (BDA), enquanto que, para bactérias, usa-se o meio denominado caldo nutritivo, composto de extrato de carne e peptona. Existem numerosos protocolos para preparo de meios de cultura para microrganismos, todos eles devendo ser esterilizados antes de seu uso (Figura 3.36). O meio de cultura pobre em nutrientes, utilizado logo apés a desinfestacio superficial do material doente, referido no texto, éo égar-égua, constituido apenas destes dois ‘componentes. j20.gem dos componentes Dilulgfo om Enteriizagho Melo vertido om do melo de cultura ‘gua destiads fem autoclave placa de Petri 0 6 9 ° Figura 3.36 ~ Preparo de meio de cultura 4 Manual de Fitopatologia Para fungas e baetérias de parte agrea, a inoculagao & feita pela pulverizagaio de uma suspensio de esporas ou cétulas bacte- rianas na superficie da planta, Logo apés a inoculagdo, as plantas devem ser submetidas a uma cdmara timida por, pelo menos, 24 horas, periodo necessério para que ocorra a germinagaio dos espo~ ros ea penetragao das estruturas fimgicas e das células bacterianas ‘no hospedeiro. Em condigdes naturais a camara timida é represen tada por periodos em que as plantas permanecem com agua livre sobre as folhas. Iso ocorre pela irigagdo por aspersio, ocorrén- cia de periodas chuvsos e. principalmente, deposicio de orvalho. Para bactérias ¢ fungos que penetram no hospedeiro através de aberturas naturais, € recomendivel que as plantas sejam mantidas sob cimara tmida ¢ em condigdes de escuro por 12 horas, antes da inoculagao. para garantia da abertura dos estmatos, Quando o fungo & um parasita de raizes, recomenda-se cul- Aivlo previamente em substrato que permita sua incorporaglo a0 solo no momento da inoculagio. Normalimente sfo utilizados diversas tipos de grios como substrato, como por exemplo, trigo ‘ou sorgo. Nesse caso, a inoculagdo consiste em incorporar a0 solo

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