Machine Translated by Google

Bioquímica 2001, 40, 9215-9225 9215

Estruturas do Citocromo c-549 e Citocromo c6 da Cyanobacterium

Artrospira máxima†,‡
Michael R. Sawaya, § David W. Krogmann,| Ahmed Serag,§ Kwok Ki Ho,| Todd O. Yeates,§ e Cheryl A.
Kerfeld*,§
Instituto de Biologia Molecular, Universidade da Califórnia, Los Angeles, Box 951570, Los Angeles, Califórnia 90095-1570, e Departamento de
Bioquímica, Universidade Purdue , West Lafayette, Indiana 47907

Recebido em 22 de novembro de 2000; Manuscrito revisado recebido em 31 de maio de 2001

RESUMO: O citocromo c6 e o citocromo c-549 são pequenos citocromos monoheme (89 e 130 aminoácidos,
respectivamente) que funcionam na fotossíntese. Eles parecem ter descendido há relativamente pouco tempo
do mesmo gene ancestral, mas divergiram para desempenhar funções funcionais muito diferentes, sublinhadas
pela grande diferença entre os seus potenciais de ponto médio de quase 600 mV. Determinamos as estruturas
cristalinas de raios X de ambas as proteínas isoladas da cianobactéria Arthrospira maxima. As duas estruturas
são notavelmente semelhantes, sobrepondo-se aos átomos da estrutura principal com um rmsd de 0,7 Å. A
comparação das duas estruturas sugere que as diferenças na exposição ao solvente do heme e no ambiente
eletrostático dos propionatos de heme, bem como na ligação do ferro heme, são os principais determinantes do
potencial do ponto médio nas duas proteínas. Além disso, o empacotamento cristalino do citocromo c-549 e do
citocromo c6 de A. maxima sugere que as proteínas oligomerizam. Finalmente, o dímero do citocromo c-549
que observamos pode ser facilmente ajustado ao modelo recentemente descrito do fotossistema II de cianobactérias.

Um citocromo tipo C parece funcionar no lado doador de todos os
centros de reação fotossintética bacteriana. Nas cianobactérias, o
citocromo c6 (também conhecido como c-553) e o citocromo c-549
(também conhecido como c-548 e c-550) estão associados ao
fotossistema I e ao fotossistema II, respectivamente (Figura 1). O
citocromo c6 de alto potencial transfere elétrons do complexo
citocromo b6f ligado à membrana para o fotossistema I (1). O
citocromo c-549 de baixo potencial é uma das subunidades
extrínsecas do fotossistema II envolvidas na evolução do oxigênio.
Embora a deleção do gene que codifica o citocromo c-549 resulte
em instabilidade estrutural do fotossistema II, crescimento prejudicado
e evolução diminuída do oxigênio (2-5), o papel, se houver, do grupo
prostético heme do citocromo c-549 na evolução do oxigênio É
desconhecido. Nem o citocromo c-549 nem o citocromo c6 são
encontrados em plantas superiores. As subunidades extrínsecas do
fotossistema II da planta não apresentam homologia com o citocromo
c-549 nem contêm heme (resumido na ref 2). O citocromo c6 é
substituído pela plastocianina nas plantas superiores (1).
Tanto o citocromo c6 quanto o citocromo c-549 parecem suportar
múltiplas funções nas cianobactérias. Além de seu papel na
fotossíntese, o citocromo c6 também atua na
† CAK agradece ao Departamento de Agricultura dos EUA pelo apoio
a esta pesquisa (USDA1999-01759). MRS e TOY reconhecem o apoio
dos Institutos Nacionais de Saúde (Grant 31299). ‡ As coordenadas da
estrutura
cristalina estão disponíveis no Brookhaven Protein Data Bank (PDB):
1F1C (citocromo c-549); 1F1F (citocromo c6); 1IGK (citocromo
c-549:fotossistema II). A estrutura primária do citocromo c-549 de A.
maxima foi depositada no Protein Identification Resource (Número de
Acesso P82603).
* Para quem a correspondência deve ser endereçada. E-mail: kerfeld@
mbi.ucla.edu. Telefone: 310 825-7417. Fax: 310 206-3914. §
Universidade da Califórnia, Los Angeles.
| Universidade de Purdue.
respiração, reduzindo a citocromo c oxidase (6, 7). Da mesma forma,
o citocromo c-549 pode ter diferentes funções funcionais dependendo
do estado fisiológico ou ambiental do organismo. Embora o gene
para o citocromo c-549 codifique uma sequência de sinal para
direcionamento para o lúmen do tilacóide, consistente com um papel
como componente do fotossistema II, outros dados experimentais
localizam o citocromo c-549 no citoplasma ou no periplasma
(resumido na ref 1) . Além disso, múltiplas funções para a proteína
são consistentes com observações de que a abundância do
citocromo c-549 parece variar com diferentes condições de luz, a
idade da cultura (8) ou a relação fotossistema II/fotossistema I (9).
Por exemplo, duas populações de citocromo c-549, uma solúvel e
outra ligada à membrana, foram detectadas em Anacystis nidulans.
Ambos pareciam ser competentes na transferência de elétrons, mas
eram distintos em sua ligação na cromatografia de troca iônica e nos
espectros EPR (10). Também foi observado que o citocromo c-549
é especialmente abundante em flores naturais densas ou culturas
comerciais onde é acompanhado por uma ferredoxina ou flavodoxina
que não é encontrada em células cultivadas em laboratório.
Este ambiente escuro e anaeróbico é semelhante à hibernação de
inverno, durante a qual as cianobactérias fermentam os estoques de
carboidratos para sobreviver. Neste contexto, sugere-se que o
citocromo c-549 aceita elétrons da flavodoxina/ferredoxina e reduz
a hidrogenase (11). Outras funções propostas para o citocromo
c-549 incluem um papel semelhante ao da ferredoxina na
fotofosforilação cíclica (12) ou na oxidação do NADPH (13).
O reconhecimento de duas regiões de similaridade entre as
estruturas primárias do citocromo c-549 (~130 aminoácidos) e do
citocromo c6 (~90 aminoácidos) levou à sugestão de que as duas
proteínas divergiram há relativamente pouco tempo do mesmo gene
(11, 14) . Um arranjo em tandem dos genes para

10.1021/bi002679p CCC: $20,00 © 2001 American Chemical Society Publicado na Web

em 10/07/2001
Machine Translated by Google
9216 Bioquímica, Vol. 40, nº 31, 2001
FIGURA 1: Esquema das funções do citocromo c-549 e citocromo c6 em cianobactérias. Nas plantas, o citocromo c-549 e a subunidade
extrínseca de 12 kDa são substituídos por duas proteínas não heme de 23 e 17 kDa. A transferência de elétrons entre o complexo citocromo
b6f e o fotossistema I é realizada pela plastocianina nas plantas.
o citocromo c6 e o citocromo c-549 foram considerados evidências
adicionais de um evento de duplicação genética na evolução dessas
proteínas (15). No entanto, uma diferença de ~600 mV entre os
potenciais de oxidação/redução dos grupos prostéticos heme destes
citocromos sublinha a sua divergência funcional. Aqui relatamos as
estruturas cristalinas do citocromo c6 e do citocromo c-549 da
mesma cianobactéria, Arthrospira (anteriormente Spirulina) maxima.
O citocromo c-549 de A. maxima tem um potencial de ponto médio
mais baixo (-260 mV; 16) do que qualquer outro citocromo
monoheme de estrutura conhecida. No entanto, descobrimos que a
sua estrutura é notavelmente semelhante à do citocromo c6 de A.
maxima , cujo potencial de ponto médio é muito mais elevado (+314
mV; 17). A comparação das estruturas destes produtos genéticos
parálogos revela várias diferenças estruturais que podem estar
subjacentes às suas funções divergentes e à sua grande diferença
no potencial do ponto médio. Além disso, descobrimos que a
estrutura dimérica observada do citocromo c-549 pode estar
relacionada com a sua função como componente do fotossistema II.
MATERIAIS E MÉTODOS
Purificação e Caracterização Bioquímica. As células de A. maxima
foram adquiridas na Earthrise Farms (Calapatria, CA).
O citocromo c6 (“não fracionado”) foi purificado pelo método de Ho
et al. (18). As isoformas (“monômero” e “dímero”) da proteína foram
subsequentemente separadas por cromatografia de exclusão de
tamanho em uma coluna Superose 12 e uma coluna Superose 6 em
série, equilibradas em Tris 50 mM, pH 8,0, glicina 100 mM e 0,02. %
de azida sódica. A eluição foi monitorizada a 280 nm.
A estimativa do peso molecular foi feita por comparação com o
comportamento de eluição de uma mistura padrão de filtração em
gel (Bio-Rad, Hercules, CA), com o citocromo c de coração de cavalo
e com o citocromo c-551 de Pseudomonas (Sigma, St. Louis, MO).
Para identificação das isoformas do citocromo c6 , as amostras
foram preparadas para espectroscopia de massa por pulverização
de íons, concentrando e dialisando contra 5 volumes de água em
células de concentração Centricon 10 (Amicon, Beverly, MA). Os
dados de espectrometria de massa foram registrados no Centro de
Espectroscopia de Ciências Moleculares e Médicas da UCLA.
A. maxima citocromo c-549 foi purificado como descrito (18, 19).
A sequência de aminoácidos foi obtida por degradação de Edman
conforme descrito para o citocromo c-550 de baixo potencial da
cianobactéria Microcystis aerugenosa (14).
Os péptidos foram preparados digerindo o citocromo com peptidases
Endo Asp N e Endo Arg C (Boehringer, Mannheim, Alemanha). A
sequência resultante deu uma
Sawaya et al.
massa calculada de acordo com aquela determinada por
espectrometria de massa MALDI com a correção para a massa do
heme.
Cristalização. O citocromo c-549 e a fração de citocromo c6 que
eluiu como um dímero na filtração em gel foram dialisados em Tris 5
mM, pH 7,5, antes da cristalização.
A concentração final de proteína foi de 10 mg/mL para o citocromo
c6 e 11,7 mg/mL para o citocromo c-549. Ambos foram cristalizados
por difusão de vapor; as gotas suspensas continham uma mistura
1:1 de proteína e solução reservatório.
A. maxima citocromo c6 cristalizou sobre um reservatório contendo
Tris 0,1 M, pH 7,8, sulfato de amônio 2,4 M, sulfato de lítio 0,5 M e
glicerol a 1%. Os cristais difrataram raios X com resolução de 2,7 Å
e indexados no grupo espacial P212121, com dimensões de célula
unitária de a ) 79,4 Å, b ) 67,8 Å e c ) 49,7 Å, com três moléculas na
unidade assimétrica.
O citocromo c-549 foi cristalizado sobre uma solução reservatório
de acetato de amônio 0,4 M, pH 4,5 e 5% de metilpentanodiol
(MPD).1 O grupo espacial é P21 com dimensões de célula unitária
de a ) 36,6 Å, b ) 84,2 Å e c ) 44,2 Å, ) 95,5°, com duas moléculas
na unidade assimétrica.
Coleta de dados de raios X, determinação de estrutura e
refinamento. Os dados de difracção de raios X foram recolhidos
numa placa de imagem Rigaku RAXIS-II equipada com um gerador
de raios X de ânodo rotativo RU-200 (Molecular Structure Corp.,
Wood-lands, TX).
A estrutura do citocromo c6 de A. maxima foi resolvida por
substituição molecular no programa AMORE (21) usando o citocromo
c6 de Chlamydomonas reinhardtii (22) como modelo de busca. A
estrutura do citocromo c-549 foi resolvida por substituição molecular
utilizando EPMR (23). Vários modelos de busca baseados na
estrutura do citocromo c6 de A. maxima foram testados. O modelo
bem sucedido continha 501 átomos e foi baseado em um alinhamento
manual de estruturas primárias do citocromo c-549 e citocromo c6
que assumiu que a estrutura do citocromo c-549 continha três
segmentos helicoidais comuns a todos os citocromos fotossintéticos
do tipo c (24).
As estruturas do citocromo c6 e do citocromo c-549 foram
refinadas com XPLOR/CNS (25). Os modelos atômicos foram
construídos e visualizados usando O (26). Restrições de simetria
não cristalográfica (NCS) foram usadas inicialmente no refinamento
do dímero c-549, e mapas de diferenças médias de NCS foram
produzidos por RAVE (27). No ultimo
1 Abreviaturas: MPD, metilpentanodiol; NCS, simetria não cristalográfica;
rmsd, raiz do desvio quadrático médio; PDB, Banco de Dados de Proteínas.
Machine Translated by Google
Estruturas do Citocromo c-549 e Citocromo c6 Bioquímica, Vol. 40, nº 31, 2001 9217

Tabela 1: Estatísticas de Coleta de Dados e Refinamento moléculas distintas foram mantidas durante todo o refinamento.
As estatísticas de coleta e refinamento de dados são fornecidas na Tabela
citocromo c6 citocromo c-549 1.
coleção de dados
resolução (Å)a ÿI/ 2,7 2.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO
ÿÿb 5,0 3.3
R-mergec (%) 8,6 7.6
redundância 3,2 8.4 Qualidade e Completude dos Modelos. Todos os resíduos em
completude geral (%) conclusão 80,8 73,8 as estruturas do citocromo c-549 e do citocromo c6 caem
de shell de alta resolução (%) 74,0 60,0
dentro das regiões permitidas das parcelas de Ramachandran, e todos
grupo espacial P212121 P21
moléculas/refinamento do modelo 3 2 resíduos estão dentro do limite de confiança de 95% sugerido por
de unidade assimétrica ERRATA (28). Devido à desordem, o modelo do citocromo c-549
Trabalho R (%)d 23,2 21.7
está faltando dois resíduos do terminal N e do
R-free (%)e 25,5 26,0
rmsd ponderado da idealidade Terminal C, bem como átomos da cadeia lateral dos resíduos Arg105
ligações (Å) 0,011 0,008 em uma molécula da unidade assimétrica e de Arg47 e
ângulos (graus) 1,22 1,29
Asn53 na segunda molécula na unidade assimétrica. O
fator B médio (Å2 )
cadeia lateral da 25,2 35,5 O resíduo N-terminal está faltando no modelo do citocromo c6 .
cadeia principal 27,3 40,1 As estatísticas de refinamento são fornecidas na Tabela 1.
b
a Usando todos os dados (sem corte ÿI/ÿÿ). ÿI/ÿÿ é a razão média do Citocromo c6: dobra geral e evidências de oligomerização. A estrutura
intensidade observada ao desvio padrão estimado para o maior do citocromo c6 de A. maxima
shell de resolução. c R-merge ) 100(ÿ|Ii - ÿIÿ|/ÿiIi), onde a soma é
(Figura 2a) assemelha-se ao de outras algas e cianobactérias
assumido as reflexões únicas e ÿIÿ é o valor médio do
citocromos c6; é composto por quatro hélices R envolvendo
múltiplas medições da i-ésima intensidade. d R-trabalho) 100(ÿ|Fo -
Fc|/ÿ|Fo|). e R-free foi calculado como R-work usando 5% das reflexões quase 6% da superfície do grupo protético heme (29).
(citocromo c6) ou 10% das reflexões (citocromo c-549). Uma característica única do citocromo c6 de A. maxima é uma
inserção de três resíduos consecutivos de ácido aspártico (44-
rodadas de refinamento, restrições NCS entre os dois 46) precedendo a terceira hélice R (Figura 2a).
moléculas na unidade assimétrica foram substituídas por restrições. Como os cristais do citocromo c6 de A. maxima foram cultivados
Na estrutura do citocromo c6 , as restrições entre os três a partir de uma fração proteica que eluiu como um dímero na filtração em gel,

FIGURA 2: (a) Estrutura do citocromo c6 de A. maxima . Duas moléculas cristalograficamente relacionadas são mostradas. As cadeias laterais para resíduos
44-46, a inserção exclusiva da estrutura do citocromo c6 de A. maxima está representada. Os átomos heme com maior exposição superficial, os
CBC e átomos de oxigênio propionato D são rotulados. A interface intermolecular envolve Asp2, Val3, Ala15, Ala16, Met19, Val24, Ile25,
Asp45, Asp46, Ala47, Val48, Asn60, Ala61, Lys83 e a borda pirrol C do heme de um dos monômeros. (b) Estrutura do A.
dímero máximo do citocromo c-549 contido na unidade cristalina assimétrica. Aminoácidos que são absolutamente conservados na estrutura primária
do citocromo c-549 são mostrados na representação de bola e bastão. Esta figura e as Figuras 3, 6 e 7 foram desenhadas com SETOR (53).
Machine Translated by Google
9218 Bioquímica, Vol. 40, nº 31, 2001
FIGURA 3: Superposição estéreo do citocromo c-549 e citocromo c6 mostrando ligantes axiais do citocromo c-549 (His41 e His92) e
citocromo c6 (His18 e Met62).
todos os contatos pares no cristal ortorrômbico foram
pesquisado para um arranjo dimérico. No cristal existem
várias regiões distintas de contato intermolecular com
área superficial por monômero variando de 188 a 481 Å2
maior quantidade de área de superfície enterrada em um intermolecular
interface é entre uma molécula na unidade assimétrica
(denotada aqui como molécula B) e um cristalograficamente
cópia relacionada da molécula B (Figura 2a). Esta interface enterra
481 Å2 /monômero ou 10,1% da superfície de um citocromo
molécula c6 . O segundo maior contato intermolecular dentro
a célula unitária, enterrando 411 Å2 ou 8,5% da superfície de
o citocromo c6 está entre um par distinto de moléculas cristalograficamente
relacionadas (A:A). A interface A:A é quase
idêntica à interface B:B (todos os átomos do A:A e B:B
dímeros se sobrepõem com um rmsd de 0,97 Å). Quantidade
da área de superfície enterrada na interface A:A ou B:B é
comparável ao ocluído em outro dímero do citocromo c6
estruturas: 368 Å2/monômero na “forma 2” de C. reinhardtii
citocromo c6 (22), 386 Å2 na forma oxidada de
Scenedesmus obliquus citocromo c6 (30) e 334 Å2 pol.
A. nidulans citocromo c6 (31; M. Ludwig, comunicação pessoal).
No citocromo c6 de A. maxima a maior interface é
entre moléculas relacionadas por um eixo de parafuso duplo. A cabeça
arranjo "cauda" (Figura 2a) de um par de citocromo c6
moléculas resulta em cadeias de moléculas de citocromo c6 em
o cristal. Normalmente, alguém desconsideraria esse encadeamento como
um efeito do eixo do parafuso duplo. No entanto, uma vez que este
tipo idêntico de gaxeta ocorre duas vezes independentemente no
cristal (A:A e B:B), sugerimos que pode ser um biologicamente
interação relevante sob algumas condições (por exemplo, alto teor de proteína
concentrações).
Citocromo c-549: Dobra Geral, Resíduos Conservados,
e comparação com o citocromo c6. A estrutura do citocromo c-549 é
mostrada na Figura 2b. Apesar de apenas 32%
identidade entre suas estruturas primárias, as estruturas de
sobreposição de citocromo c-549 e citocromo c6 (mais de 263
átomos da espinha dorsal) com um rmsd de apenas 0,7 Å (Figura 3).
As estruturas de outros citocromos de classe I são muito mais
remotamente relacionado: o citocromo c-549 se sobrepõe à levedura
citocromo c (32) com rmsd de 3,4 Å, em Rhodobacter
sphaeroides citocromo c2 (33) com um rmsd de 4,2 Å (mais de
281 átomos de espinha dorsal), no citocromo c2 de Rhodopseudomonas
Viridis (34) com um rmsd de 3,5 Å (mais de 281 átomos de espinha dorsal
átomos), e no citocromo c-551 de Pseudomonas (35) com
um rmsd de 3,5 Å (mais de 273 átomos de backbone). O estrutural
Sawaya et al.
Tabela 2: Exposição ao átomo Heme (Å2)
citocromo c6 citocromo c-549
átomo de heme monômero B:B paira monômero dimera
.O
CMC 16,0 3,0 0
hemograma completo 28,0 0 0 7,0
DMC 0 21,0 0
CDB 0 0
DCC 0 0
O1D 00 4 0
O2D 0 4,0 6,0 2 22,0 3,0 4,0 0 21,08
% da superfície 6.3 2,0 9.7 2.7
expor
a Para o citocromo c6, “par” é definido como a interface A:A ou B:B
que se repete para formar a cadeia do citocromo c6 observada nas formas cristalinas
ortor-hômbicas. Apenas uma das duas moléculas heme em qualquer
par está envolvido na interface de oligomerização. Calculado com
areaimole (54) usando um raio de esfera de 1,4 Å para solvente.
comparação reforça assim a ideia de que essas proteínas
com potenciais de ponto médio muito diferentes estão realmente próximos
parentes.
O núcleo helicoidal do citocromo c-549 de A. maxima é muito
semelhante ao do citocromo c6 de A. maxima (Figura 2a). O
segmentos helicoidais mais longos se sobrepõem estreitamente aos quatro
hélices do citocromo c6 (Figura 3). A dobra dos dois
proteínas na vizinhança do primeiro ligante axial (His40 em
c-549, His18 no citocromo c6) é surpreendentemente semelhante (Figura
3). O citocromo c-549 tem um terminal N adicional 22
resíduos (Tabela 3). Em parte, eles formam uma cadeia curta de duas cadeias
-folha que precede a primeira hélice e o heme CXXCH
sequência de coordenação (resíduos 37-41; Tabela 3). Um segundo
A principal diferença entre as duas estruturas é a inserção em
a estrutura primária do citocromo c-549 que não foi encontrada
no citocromo c6 (entre os resíduos 89 e 103; Tabela 3). Isto
contém o sexto ligante axial, His92. A inserção falta
estrutura secundária com exceção da volta formada
pelos resíduos 102-104. A conformação da espinha dorsal da proteína
na região adjacente ao sexto ligante axial (His92 em
citocromo c-549, Met61 no citocromo c6) nos dois
estruturas é bastante diferente (Figura 3).
Aminoácidos que são altamente conservados no primário
estruturas do citocromo c-549 (Tabela 3) agrupam-se em três
diferentes regiões da proteína. Eles são predominantemente
encontrado no interior da proteína, próximo ao terminal N, ou
na parte inferior da molécula na vista mostrada em
Figura 2b. No interior da proteína os resíduos Val115
Gly117, Leu120 e Lys124 parecem ser importantes em
Machine Translated by Google

Estruturas do Citocromo c-549 e Citocromo c6 Bioquímica, Vol. 40, nº 31, 2001 9219

Tabela 3: A. maxima Citocromo c6 e Citocromo c-549a Alinhamento da Estrutura Primáriab

a O sinal de direcionamento do tilacóide N-terminal foi removido. b A numeração é dada para a sequência do citocromo c-549 de A. maxima . Os resíduos
que formam as três hélices R conservadas na estrutura do citocromo c6 de A. maxima estão sublinhados. Os resíduos conservados estão em negrito. A (ÿ)
está abaixo de cada um dos ligantes axiais. Os organismos para os quais são apresentadas sequências do citocromo c-549 (Números de Acesso entre
parênteses) são abreviados como se segue: A. maxima, Arthrospira maxima (P82603); A. flos., Aphanizomenon flos-aquae (P56151); M. aer., Microcystis
aeruginosa (P19129); Sin. sp2, Synechococcus sp. 2 (Q55210); G. theta, Guillardia theta (O78454); P. purp., Porphyra purpurea (P51200); O. sin., Odontella
sinensis (P49510); C. para., Paradoxo de Cyanophora (P48263).

estabilizando interações inter-hélices. Outros, Thr46, Arg47,
Thr48 e Asn49, protegem os anéis pirrol A, D e C do heme e
seriam expostos à superfície em um monômero do citocromo
c-549. Leu3, Glu5, Thr9 e Thr18 estão expostos na superfície
na alça que precede a folha. Estes e quatro outros
aminoácidos hidrofóbicos altamente conservados possuem
cadeias laterais expostas ao solvente (Val73, Leu91 e Ile100).
Quando o citocromo c-549 de A. maxima é modelado na
estrutura do fotossistema II (38), parece que pelo menos
alguns desses resíduos (por exemplo, Thr18) parecem ser
importantes na interação com outras subunidades do
fotossistema II (Figura 4; discutido abaixo).
O ponto isoelétrico do citocromo c-549 isolado de diferentes
espécies de cianobactérias é uniformemente ácido (19). A
estrutura do citocromo c-549 de A. maxima tem uma
distribuição de carga assimétrica com superfícies
pronunciadas com carga positiva e negativa (Figura 5). Os
resíduos conservados 64-68, 73-75 e 78-83 formam três
alças adjacentes expostas à superfície na superfície “inferior”
carregada negativamente da molécula (Figuras 2b e 5). Em
contraste, existem poucos (com exceção de Arg105) resíduos
altamente conservados na superfície “superior” carregada
positivamente do dímero (Figuras 2b e 5). Esta superfície da
molécula interagiria com porções de PSII salientes da superfície da não nativo no citocromo c-549 (39), sugerindo que há alguma flexibilidade n
(Figuras 1 e 4). Estas alças extrínsecas das subunidades
integrais da membrana ainda não foram modeladas (36).
A metionina 104 é outro resíduo altamente conservado
nas estruturas primárias do citocromo c-549 (Tabela 3). Esta
cadeia lateral está a menos de 10 Å do sexto ligante axial
His92, e isso pode ser importante no (re) dobramento da proteína.
Ligantes heme não nativos estão envolvidos no redobramento
do citocromo c de cavalo após desnaturação ácida (37, 38).
Muitos citocromos do tipo C apresentam desnaturação ácida
reversível em pH baixo, e o citocromo c-549 é particularmente
lábil (Krogmann, resultados não publicados), talvez explicando
a dificuldade em detectá-lo e purificá-lo. Em contraste, o
citocromo c6 é relativamente estável em pH baixo. Como o
citocromo c-549 e o citocromo c6 são muito semelhantes em
estrutura perto de His18 e His41 (Figura 3), a menor
estabilidade do citocromo c-549 pode ser devida à
acessibilidade e protonação do sexto ligante axial, His92. Em
pH 5,5, o citocromo c-549 de baixo potencial começa a
perder sua absorção de luz visível e o pico de Soret muda
para 392 nm. Contudo, a proteína pode ser redobrada; a
adição de tampão Tris 100 mM, pH 7,8, e ditionito restaura a
absorção àquela do citocromo nativo reduzido. O monóxido
de carbono também foi observado como outro ligante axial
membrana
Machine Translated by Google

9220 Bioquímica, Vol. 40, nº 31, 2001 Sawaya et al.

os últimos quatro resíduos estão dentro da região de inserção do

citocromo c-549 que não está presente no citocromo c6. A interface
do dímero é predominantemente hidrofóbica (Figura 6a), exceto por
uma rede de ligações de hidrogênio formada entre Thr48, Asn49, um
átomo de oxigênio propionato D e Glu90 (Figura 6b). Os átomos de
oxigênio da cadeia lateral do Glu90 estão ambos envolvidos em duas
ligações de hidrogênio com a molécula adjacente. Um resíduo Glu /
Gln ou Asp é conservado nesta posição nas estruturas primárias do
citocromo c-549 de baixo potencial (Tabela 3), sugerindo que esta
dimerização e esta rede de ligação de hidrogénio podem ser
encontradas em outras estruturas do citocromo c-549.
A interface de dimerização do citocromo c-549 é semelhante em
alguns aspectos àquela observada nas estruturas do citocromo c6 de
C. reinhardtii (22), citocromo c6 de A. nidulans (31) e citocromo c5 de
Azotobacter Vinelandii (41). Em cada um, parte das bordas expostas
do anel pirrol C é enterrada por dimerização, com distâncias
interatômicas semelhantes (átomo CBC) (6,3 Å no citocromo c5, 7,9 Å
no citocromo c6 de C. reinhardtii , 8,3 Å no citocromo c-549). No
entanto, a orientação das duas moléculas do par difere entre as
espécies. Por exemplo, se um monômero do citocromo c6 de C.
reinhardtii for sobreposto a um monômero do citocromo c-549, e a
orientação da segunda molécula em cada par for comparada, uma
rotação de 59° é necessária para sobrepor as posições CR da segunda
molécula de os dois dímeros. Da mesma forma, a segunda molécula
do citocromo c6 de A. nidulans e da interface do dímero do citocromo
c5 de A. Vinelandii é girada em 156° e 100°, respectivamente, em
relação à do dímero do citocromo c-549.

A disponibilidade de uma estrutura preliminar para o PSII (36)

permitiu-nos modelar as interações do dímero do citocromo c-549 com
o PSII. No modelo recentemente relatado, uma única molécula de
citocromo foi colocada no complexo posicionando a estrutura
conhecida do citocromo c do coração de cavalo no mapa preliminar de
densidade eletrônica. Em nosso modelo do complexo PSII,
posicionamos nosso dímero do citocromo c-549 de modo que uma
molécula de proteína se sobreponha à única molécula do citocromo c
FIGURA 4: Modelos do complexo fotossistema II. (a) A estrutura do coração de cavalo relatada (Figura 4). Essa superposição foi
recentemente determinada de PSII (36; código PDB 1FE1) inclui realizada automaticamente por meio de um programa de computador,
uma molécula de citocromo c de cavalo no lado luminal do sem qualquer intervenção manual ou viés. Múltiplas linhas de raciocínio
complexo. (b) No modelo aqui apresentado, o dímero do citocromo sugerem que este modelo resultante de PSII com o dímero do
c-549 foi colocado de modo que uma molécula de proteína se
sobreponha precisamente à única molécula do citocromo c do citocromo c-549 pode estar essencialmente correto.
cavalo . Este modelo orienta o dímero c-549 quase paralelo à Nossa colocação do dímero do citocromo c-549 coloca a segunda
membrana com a segunda molécula adjacente à subunidade PsbO. molécula de proteína (especificamente os resíduos 15-22) adjacente,
Modelo depositado no PDB (1IGK). Figura desenhada com MOLSCRIPT (54).
mas não sobreposta, à subunidade PsbO periférica (Figura 4). O
modelo PSII recentemente relatado deixa uma grande lacuna entre o
para o heme.
citocromo e o PsbO, enquanto estudos de reticulação mostraram que
Citocromo c-549: Embalagem de Cristal. As duas moléculas na as duas moléculas de proteína são adjacentes (42, 43). Um outro
unidade assimétrica do cristal do citocromo c-549 estão relacionadas argumento circunstancial favorece o presente modelo. Nossa colocação
por um eixo de rotação de 2 vezes e formam um dímero através da do dímero do citocromo c-549 foi totalmente ditada pelo modelo
borda exposta do heme (Figura 2b). A dimerização enterra 701 Å2 de existente e não admitiu nenhuma entrada do usuário. No entanto, esta
superfície por monômero, uma área superficial enterrada comparável colocação organiza o dímero quase plano em relação à membrana
àquela observada em interfaces de oligômeros e complexos proteína- (Figura 4). De fato, o eixo de simetria da díade do dímero do citocromo
proteína conhecidos (40). A distância entre os átomos de ferro nos c-549 cai dentro de 7° da membrana normal (deduzido do arranjo das
hemes adjacentes é de 18,4 Å. As reações de transferência de elétrons hélices transmembranares no modelo PSII).
interproteínas normalmente ocorrem em distâncias de 10-25 Å,
sugerindo que os dois hemes no dímero poderiam interagir em um A probabilidade de isso ocorrer por acaso (por exemplo, com um
processo de transferência de elétrons. dímero incorreto ou orientado arbitrariamente) é inferior a 1%. O
A interface intermolecular é formada pela borda C do heme e Thr48, dímero c-549 2 vezes é aproximadamente paralelo aos eixos 2 vezes
Asn49, Phe85, Ile88, Glu90, Leu91 e Ile100 (Figura 6); esses resíduos e pseudo-2 vezes do PSII. Devemos ser cautelosos quanto às
são altamente conservados na estrutura primária do citocromo c-549 implicações da nossa colocação do dímero do citocromo c-549 porque
(Tabela 3). O a subunidade de 12 kDa ainda não foi
Machine Translated by Google

Estruturas do Citocromo c-549 e Citocromo c6 Bioquímica, Vol. 40, nº 31, 2001 9221

FIGURA 5: Potencial de superfície eletrostático do dímero do citocromo c-549. A barra de escala está em unidades de kB, onde 1 kB ) 0,6 kcal/
mol. A vista é aproximadamente a mesma mostrada na Figura 1b. O grupo protético heme é representado em forma de bola e bastão. Os
potenciais eletrostáticos foram calculados usando GRASP (55). Constantes dielétricas de 80 e 2 foram utilizadas para o interior do solvente e da
proteína, respectivamente, e a força iônica do solvente foi considerada 0 M.

FIGURA 6: Detalhe da interface de dimerização do citocromo c-549 mostrando (a) a rede de ligações de hidrogênio e (b) o núcleo hidrofóbico.
modelado em PSII. No entanto, nosso modelo PSII-citocromo c-549 Heme EnVironment e Midpoint Potential of Cytochrome apresenta algumas
características atraentes que agora podem ser c-549 e Cytochrome c6. Apesar de uma impressionante estrutura geral testada experimentalmente.
similaridade, os potenciais de ponto médio do citoplasma de A. maxima
Machine Translated by Google
9222 Bioquímica, Vol. 40, nº 31, 2001
Tabela 4: Ligação de Hidrogênio ao Oxigênio Propionato de Heme
Átomos e ligantes axiais
citocromo c6 citocromo c-549
átomo de heme
O1A nenhum água 614 (O) 2,8 Å
O2A Thr30 (O) 2,5 Å Asn53 (O) 2,5 Å Lys59 (NZ)
O1D 2,8 Å Tyr82 (N) 2,9 Å água 609 (O) 2,5 Å
Asn60 (ND2) 2,7 Å
O2D Glu90 (OE1) 2,5 Å Lys59 (NZ) 3,1 Å (apenas em
dímero)
ligantes axiais
His18/41 (NE2) heme (Fe) 2,0 Å Arg22 heme (Fe) 2,2 Å
ND1 (O) 2,9 Å heme Val45 (O) 2,5 Å NA
Met62 (SD) (Fe) 2,3 Å NA NA
His92 (NE2) heme (Fe) 2,2 Å
His92 (ND1) Pro (O) 2,7 Å
o cromo c-549 e o citocromo c6 diferem em quase 600 mV.
Acredita-se que o potencial do ponto médio seja estabelecido por
vários fatores, incluindo os ligantes axiais do heme, a exposição
superficial do heme e as ligações de hidrogênio aos átomos de
oxigênio propionato. A comparação das estruturas do citocromo
c-549 e do citocromo c6 oferece várias pistas estruturais para o
controle do potencial do ponto médio nas duas proteínas.
Mais obviamente, existe a diferença na natureza do sexto ligante
axial: His92 no citocromo c-549 e Met 61 no citocromo c6. Em geral,
a coordenação da bis-histidina correlaciona-se com a redução do
potencial do ponto médio. A substituição experimental de histidina
por metionina como sexto ligante axial no citocromo c3 aumenta o
potencial do ponto médio em aproximadamente 150 mV (44), mas
isso representa apenas cerca de um quarto da diferença de potencial
do ponto médio entre o citocromo c6 e o citocromo c-549.
A polaridade das cadeias laterais compactadas ao redor do heme
também é considerada importante no estabelecimento do potencial
do ponto médio (45). A este respeito, contudo, as estruturas do
citocromo c6 e do citocromo c-549 são muito semelhantes. Existem
vários aminoácidos hidrofóbicos que são conservados estruturalmente
nas duas proteínas; Leu54, Leu59 e Val115 no citocromo c-549 se
sobrepõem a Leu31, Leu36, Val55 e Val77 do citocromo c6,
respectivamente. Moléculas de água enterradas perto do heme
também foram consideradas importantes no que diz respeito às
propriedades de transferência de elétrons (resumidas na ref 46). As
moléculas de água enterradas na estrutura do citocromo c-549 estão
tabuladas nas Informações de Apoio.
Acredita-se também que a ligação de hidrogênio aos ligantes
axiais influencia o potencial do ponto médio. As interações de ligação
de hidrogênio dos ligantes axiais em A. maxima citocromo c6 e
citocromo c-549 estão resumidas na Tabela 4. Especialmente
interessante no contexto do potencial de ponto médio é uma
comparação da ligação de hidrogênio ao átomo Nÿ do quinto ( His)
ligante axial nas duas estruturas. No citocromo c6 este átomo forma
uma ligação de hidrogênio com o átomo de oxigênio carbonílico de
Arg22; no citocromo c-549, ele se liga ao mesmo átomo da estrutura
principal do Val45. Os átomos da espinha dorsal desses dois resíduos
se sobrepõem intimamente na sobreposição das estruturas. Os
efeitos eletrostáticos das cadeias laterais destes dois resíduos
podem contribuir para a maior estabilidade do citocromo c6 no estado
reduzido.
A ligação de hidrogênio análoga ao átomo Nÿ da histidina no
citocromo c2 e no citocromo c mitocondrial é formada com o átomo
de oxigênio da carbonila de um resíduo de prolina conservado
(resumido na ref 24). Não está claro por que o aminoácido
Sawaya et al.
a cadeia lateral nesta posição é conservada nessas espécies.
Curiosamente, no citocromo c-549, o átomo de oxigênio carbonílico
do Pro93 conservado (Tabela 3) forma uma ligação de hidrogênio
com o átomo Nÿ de His92.
As diferenças na exposição ao solvente dos átomos de oxigênio
do propionato D podem desempenhar um pequeno papel na
diferenciação do potencial do ponto médio. Ao contrário dos átomos
de oxigênio do propionato A que estão enterrados no interior da
proteína com ambientes semelhantes (Figura 7a, b), o ambiente do
propionato D difere mais substancialmente entre as duas estruturas (Figura 7c, d).
No citocromo c-549, um dos átomos de oxigênio do propionato D é
exposto ao solvente (Tabela 2). No citocromo c6, ambos os átomos
de oxigênio do propionato D estão expostos à superfície (Tabela 2),
embora em menor grau do que nas estruturas do citocromo c6 de
algas (por exemplo, 13,4 e 14,3 Å2 nas estruturas do citocromo c6
de C. reinhardtii , potencial de ponto médio) 370 mV ; 22).
Assim, o aumento da exposição dos átomos de oxigênio do
propionato D parece correlacionar-se com o aumento do potencial
do ponto médio. A correlação é oposta à observada ao tabular a
exposição global ao heme, conforme discutido mais abaixo.
As diferenças nas ligações de hidrogênio aos átomos de oxigênio
do propionato D nas duas estruturas podem explicar ainda mais as
diferenças no potencial do ponto médio (Tabela 4). Os átomos de
oxigênio do propionato D do citocromo c6 estão ligados por
hidrogênio aos Lys29 e Lys59 carregados positivamente (Figura 7c).
A carga positiva no ambiente heme do citocromo c6 pode ajudar a
estabilizar o elétron ganho pela redução do heme e, assim, contribuir
para o alto potencial de ponto médio do citocromo c6. Em contraste,
os átomos de oxigênio do propionato D do citocromo c-549 estão
ligados por hidrogênio à estrutura amida de Tyr82 e água (Figura
7d), não proporcionando equilíbrio eletrostático para o heme reduzido.
Tais tendências são consistentes com estudos de mutagênese nos
quais a alteração do caráter de retirada de elétrons de uma cadeia
lateral ligada por hidrogênio ao grupo propionato pode alterar o
potencial do ponto médio do citocromo c mitocondrial em
aproximadamente 50 mV (45).
Pela mesma tendência, esperaríamos que o potencial do ponto
médio fosse ainda mais reduzido no dímero do citocromo c-549 pela
introdução de uma ligação de hidrogênio adicional entre o átomo de
oxigênio propionato D e a cadeia lateral de Glu90 do parceiro dímero
(Figura 7e) . Esta carga negativa adicional na vizinhança do grupo
heme pode desestabilizar a carga negativa no heme, reduzindo
ainda mais o carácter de retirada de electrões do ambiente imediato.
Consistente com esta tendência, no citocromo c-553 do DesulfoVibrio
Vulgaris , a proteína monoheme com o potencial de ponto médio
mais próximo do citocromo c-549 (+20 mV), o ambiente propionato
D é similarmente carregado negativamente (Figura 7f; 47).
Em geral, entre os citocromos monoheme, o aumento da
acessibilidade ao solvente do heme se correlaciona com uma
diminuição no potencial do ponto médio (48, 49). No citocromo c6 de
A. maxima a exposição superficial do grupo protético heme (6,6%) é
semelhante à observada em outras estruturas do citocromo c6 ,
sendo a borda do anel pirrol C e os átomos de oxigênio propionato
D os mais acessíveis ao solvente (Tabela 2) . No monómero do
citocromo c-549, uma porção significativamente maior do heme é
acessível ao solvente (9,7%), consistente com o seu potencial de
ponto médio inferior. Em comparação com outros citocromos
monoheme, a correlação entre o potencial do ponto médio e a
exposição ao heme é boa. Por exemplo, Rhodospirillum rubrum
ferricitocromo c2 (50) exibe menos exposição ao heme (6,3%) do
que A. maxima citocromo c6, e previsivelmente seu ponto médio
Machine Translated by Google

Estruturas do Citocromo c-549 e Citocromo c6 Bioquímica, Vol. 40, nº 31, 2001 9223

FIGURA 7: Ambiente dos átomos de oxigênio do propionato A em A. maxima (a) citocromo c6 e (b) citocromo c-549. (c e d) ambiente de
átomo de oxigênio propionato D de (c) citocromo c6 e (d) um monômero de citocromo c-549. (e) Ambiente de átomos de oxigênio propionato
D no dímero do citocromo c-549. (f) Ambiente do átomo de oxigênio Propionato D no citocromo c-553 do DesulfoVibrio Vulgaris (44).

o potencial é maior (323 mV). Por outro lado, a correlação com
citocromos multiheme é fraca; o diheme de Desol-foromonas
acetoxidans ferricitocromo c7 está mais exposto que o heme de A.
maxima citocromo c-549, mas seu potencial de ponto médio é maior
em quase 160 mV (51).
Se o potencial do ponto médio for criticamente dependente da
exposição ao heme, esperaríamos que o potencial do ponto médio
aumentasse com a dimerização do citocromo c-549. Após a dimerização,
a exposição é substancialmente diminuída, para 2,7% de sua
superfície total (Tabela 2). Espera-se que a diminuição na exposição
superficial do heme aumente o potencial do ponto médio do citocromo
c-549; no entanto, a dimerização também altera o ambiente heme.
A introdução acima mencionada da cadeia lateral Glu90 no ambiente
heme como resultado da dimerização (Figura 7e) pode compensar
os efeitos da perda de exposição ao heme após a dimerização. Além
disso, redução
Machine Translated by Google
9224 Bioquímica, Vol. 40, nº 31, 2001
de um dos grupos protéticos heme no dímero poderia, através de efeitos
eletrostáticos, diminuir o potencial do ponto médio do segundo grupo
protético heme. Dois potenciais de ponto médio diferentes foram medidos
para o citocromo c-549 isolado de A. nidulans (10). Presumiu-se que os
valores correspondiam à forma solúvel e ligada à membrana da proteína;
a proteína solúvel tinha um potencial de oxidação-redução de -260 mV,
enquanto o citocromo c-549 preparado a partir de uma lavagem de
membranas com alto teor de sal tinha um potencial redox de ~-300 mV. A
dimerização, ao afetar o potencial do ponto médio, poderia estender a
faixa funcional do citocromo c-549 como transportador de elétrons.
CONCLUSÕES
É notável que as estruturas do citocromo c6 e do citocromo c-549
sejam tão surpreendentemente semelhantes, dadas as suas grandes
diferenças no potencial do ponto médio. Aparentemente, eles divergiram
há relativamente pouco tempo. O estado oligomérico do citocromo c-549
assemelha-se ao previamente observado nas estruturas do citocromo c6
de A. nidulans e C. reinhardtii .
A estrutura dimérica pode ser colocada no contexto da estrutura emergente
do fotossistema II das cianobactérias e de estudos bioquímicos anteriores.
A prevalência de dímeros de proteínas periplasmáticas de transferência
de elétrons e seus parceiros enzimáticos foi recentemente observada
(52). Um padrão semelhante pode estar surgindo em relação aos
citocromos envolvidos no transporte fotossintético de elétrons em
cianobactérias; o fotossistema I, o fotossistema II e o complexo citocromo
b6f , bem como o citocromo c-549 e o citocromo c6 parecem funcionar
como oligômeros.
A descrição da estrutura do citocromo c-549 aqui apresentada sugere
uma série de experimentos de mutagênese para entender melhor sua(s)
função(ões) como componente do fotossistema II e como proteína ativa
em redox. Além disso, a comparação da estrutura com a do citocromo c6
revela uma série de diferenças estruturais que podem estar subjacentes
às suas propriedades redox muito diferentes. Estas observações poderiam
informar experiências de mutagénese dirigida ao local para testar
hipóteses sobre a base estrutural do potencial do ponto médio.
INFORMAÇÕES DE APOIO DISPONÍVEIS
Uma descrição das moléculas de água enterradas na estrutura do
citocromo c-549. Este material está disponível gratuitamente na Internet
em http://pubs.acs.org.
REFERÊNCIAS
1. Morand, LZ, Cheng, RH e Krogmann, DW (1994)
Catalisadores solúveis de transferência de elétrons de cianobactérias,
em The Molecular Biology of Cyanobacteria (Bryant, DA, Ed.) pp
243-269, Kluwer Academic, Dordrecht, Holanda.
2. Shen, J.-R., Ikeuchi, M., e Inoue, Y. (1992) FEBS Lett. 301,
145-149.
3. Shen, J.-R., e Inoue, Y. (1993) Bioquímica 32, 1825-
1832.
4. Shen, J.-R., Vermaas, W., e Inoue, Y. (1995) J. Biol. Química. 270,
6901-6907.
5. Shen, J.-R., Burnap, RL, e Inoue, Y. (1995) Biochemistry 34,
12661-12668.
6. Gonzalez de la Vara, L. e Gomez-Lojero, C. (1986)
Fotossíntese. Res. 8, 65-78.
7. Schmetterer, G. (1994) Cyanobacterial Respiration, em The Molecular
Biology of Cyanobacteria (Bryant, DA, Ed.) pp 409-435, Kluwer
Academic, Dordrecht, Holanda.
Sawaya et al.
8. Krogmann, DW e Smith, S. (1990) em Current Research in
Photosynthesis (Baltscheffsky, M., Ed.) Vol. II, pp 687-690, Kluwer
Academic Publishers, Boston, MA.
9. Melis, A. (1991) Biochim. Biofísica. Atos 1058, 87-106.
10. Hogansen, CW, Lagenfelt, G., Andreasson, L.-E., e Vanngard, T.
(1990) em Current Research in Photosynthesis (Baltscheffsky, M.,
Ed.) Vol. III, pp 319-322, Kluwer Academic Publishers, Boston, MA.
11. Krogmann, DW (1991) Biochim. Biofísica. Atos 1058, 35-
37.
12. Kienzel, PF e Peschek, GA (1983) FEBS Lett. 162,
76-80.
13. Pulich, W. (1977) J. Phycol. 13, 40-45.
14. Cohen, CL, Sprinkle, JR, Alam, J., Hermodson, MA, Meyer, TE, e
Krogmann, DW (1989) Arch. Bioquímica.
Biofísica. 270, 227-235.
15. Katoh, H., Itoh, S., Sheni, J.-R. e Ikeuchi, M. (1999)
Conferência Europeia de Pesquisa sobre a Bioenergética Molecular
de Cianobactérias, Gmunden, Áustria, junho de 1999, Resumo p 73.
16. Holton, RW e Myers, J. (1967) Biochim. Biofísica. Atos 131, 375-381.
17. Cho, YS, Wang, OJ, Krogmann, DW e Whitmarsh, J. (1999) Biochim.
Biofísica. Atos 1413, 92-97.
18. Ho, KK, Ulrich, EL, Krogmann, DW e Gomez-Lojero, C. (1979) Biochim.
Biofísica. Atos 545, 236-248.
19. Alam, J., Sprinkle, JR, Hermodson, MA, e Krogmann, DW (1984)
Biochim. Biofísica. Atos 766, 317-321.
20. Matthews, BW (1968) J. Mol. Biol. 33, 491-497.
21. Navaza, J. (1994) Acta Crystallogr., Sect. A 50, 157-163.
22. Kerfeld, CA, Anwar, HP, Interrante, R., Merchant, S., e Yeates, TO
(1995) J. Mol. Biol. 250, 627-647.
23. Kissinger, CR, Gehlhaar, DK e Fogel, DB (1999)
Acta Crystallogr., Seção. D 55, 484-491.
24. Kerfeld, C. (1997) Fotossintetizador. Res. 54, 81-98.
25. Brunger, AT, Adams, PD, Clore, GM, DeLano, WL, Gros, P., Grosse-
Kunstleve, RW, Jiang, JS, Kuszewski, J., Nilges, M., Pannu, NS,
Read, RJ , Rice, LM, Simonson, T., e Warren, GL (1998) Acta
Crystallogr., Sect. D 54, 905-921.
26. Jones, TA, Zou, JY, Cowan, SW e Kjeldgaard, M.
(1991) Acta Crystallogr., Sect. A 47, 110-119.
27. Kleywegt, GJ e Jones, TA (1994) Halloween ... máscaras e ossos, em
Do primeiro mapa ao modelo final (Bailey, S., Hubbard, R., e Waller,
D., Eds.) pp 59 -66, Laboratório SERC Dares-bury, Warrington, Reino
Unido
28. Colovos e Yeates, TO (1993) Protein Sci. 2, 1511-1519.
29. Kerfeld, CA e Krogmann, DW (1998) Annu. Rev. Fisiol Vegetal. Planta
Mol. Biol. 49, 397-425.
30. Schnackenberg, J., Than, M., Mann, K., Wiegand, G., Huber, R., e
Reuter, W. (1999) J. Mol. Biol. 290, 1019-1030.
31. Ludwig, ML, Pattridge, KA, Powers, TB, Dickerson, R.
E. e Takano, T. (1982) em Transporte de elétrons e utilização de
oxigênio (Ho, CH, Ed.) pp 27-32, Elsevier Science Publishers,
Amsterdã.
32. Louie, GV e Brayer, GD (1990) J. Mol. Biol. 214, 527-
555.
33. Axelrod, HL, Feher, G., Allen, JP, Chirino, AJ, Day, MW, Hsu, BT, e
Rees, DC (1994) Acta Crystallogr., Sect. D 50, 596-602.
34. Sogabe, S. e Miki, K. (1995) J. Mol. Biol. 252, 235-247.
35. Matsuura, Y., Takano, T., e Dickerson, RE (1982) J. Mol.
Biol. 156, 389-409.
36. Zouni, A., Witt, H.-T., Kern, J., Fromme, P., Krauss, N., Saenger, W.,
e Orth, P. (2001) Nature 409, 739-743.
37. Brems, DN, e Stellwagen, E. (1983) J. Biol. Química. 258, 3655-3660.
38. Sosnick, TR, Mayne, L., Hiller, R. e Englander, SW
(1994) Nat. Estrutura. Biol. 1, 149-156.
39. Holton, RW e Myers, J. (1963) Science 142, 234-235.
40. Jones, S. e Thornton, JM (1996) Proc. Nacional. Acad. Ciência.
EUA 93, 13-20.
Machine Translated by Google
Estruturas do Citocromo c-549 e Citocromo c6
41. Carter, DC, Melis, KA, O'Donnell, SE, Burgess, BK, Furey, WF,
Wang, B.-C., e Stout, CD (1985) J. Mol.
Biol. 184, 279-295.
42. Han, K.-C., Shen, J.-R., Ikeuchi, M., e Inoue, Y. (1994)
FEBS Lett. 355, 121-124.
43. Kuhl, H., Rogner, M., van Breemen, JFL, e Boekema, EJ (1999)
Eur. J. Bioquímica. 266, 453-459.
44. Dolla, A., Florens, L., Bianco, P., Haladjian, P., Voordouw, G.,
Forest, E., Guerlesquin, F., e Bruschi, M. (1994) J. Biol.
Química. 269, 6340-6346.
45. Cutler, RL, Davies, AM, Creighton, S., Warshel, A., Moore, GR,
Smith, M., e Mauk, G. (1989) Biochemistry 28, 3188-3197.
46. Qi, PX, Urbauer, JL, Fuentes, EJ, Leopold, MF e Wand, AJ
(1994) Nat. Estrutura. Biol. 1, 379-383.
47. Blackledge, MJ, Guerlesquin, F. e Marion, D. (1996)
Proteínas: Struct., Funct., Genet. 24, 178-194.
48. Bertrand, P., Mbarki, O., Asso, M., Blanchard, L., Guerlesquen,
F., e Tegoni, M. (1995) Biochemistry 34, 11071-11079.
Bioquímica, Vol. 40, nº 31, 2001 9225
49. Tezcan, FA, Winkler, JR e Gray, HB (1998) J. Am.
Química. Soc. 120, 13383-13388.
50. Salemme, FR, Freer, ST, Xuong, NH, Alden, RA, e Kraut, J.
(1973) J. Biol. Química. 248, 3910-3921.
51. Assfalg, M., Banci, L., Bertini, I., Bruschi, M., Giudici-Orticoni,
MT, e Turano, P. (1999) Eur. J. Bioquímica. 266, 634-643.
52. Pettigrew, GW, Gilmour, R., Goodhew, CF, Hunter, DJ
B., Devreese, B., Van Beeumen, J., Costa, C., Prazeres, S.,
Krippahl, L., Palma, PN, Moura, I., e Moura, JJG
(1998) Eur. J. Bioquímica. 258, 559-566.
53. Evans, SV (1993) J. Mol. Gráficos 11, 134-138, 127-
128.
54. Kraulis, PJ (1991) J. Appl. Cristalogr. 24, 946-950.
55. Nicholls, A., Sharp, KA, e Honig, B. (1991) Proteínas 11,
281-296.
BI002679P