UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN

MACROPROCESO DE RECURSOS E INFRAESTRUCTURA ACADÉMICA

FORMATO PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Fecha: Abril de 2011 Código: GRL-006 Versión: 4.0

INFORMACIÓN BÁSICA
NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Diluciones PRÁCTICA No.: 6
ASIGNATURA: Microbiología Ambiental
TEMA DE LA PRÁCTICA: Diluciones seriadas y recuento en placa
LABORATORIO A UTILIZAR: Microbiología
CONTENIDO DE LA GUÍA

OBJETIVOS.
 Comprender la importancia de realizar correctamente las diluciones seriadas.
 Reconocer la importancia del uso de diluciones seriadas para conocer la población microbiana
aproximada en un cultivo con una alta densidad poblacional.
 Aprender a realizar los cálculos correspondientes para determinar la concentración inicial de una
solución stock o cultivo madre.

INTRODUCCIÓN.
Muchas áreas de la ciencia tal como la microbiología, biotecnología, química entre otras, usan las diluciones
seriadas en las preparaciones para diversos experimentos ya que en algunos de ellos es necesario el uso de
cantidades muy pequeñas de ciertas sustancias, razón por la que se recurre a la preparación de diluciones
seriadas a partir de soluciones madre o soluciones stock (de mayor concentración). En algunas ocasiones el
suministro de ciertos fármacos a pacientes, está antecedido por la preparación de diluciones, ya que por
indicaciones de formulación es necesario el suministro de dosis muy pequeñas las cuales comercialmente no
vienen preparadas. Otra de las metodologías importantes es en la evaluación de la acción de ciertos
medicamentos, hormonas, antibióticos, desinfectantes, así como también para conocer la población
microbiana de una muestra indiferentemente del origen de la misma.

MARCO TEORICO
En el área de microbiología las diluciones son importantes para el aislamiento de microorganismos a partir
poblaciones densas y para determinar cantidad aproximada de estos en una muestra. En la naturaleza, la
mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. El
aislamiento de los diferentes microorganismos contenidos en una muestra problema, se lleva a cabo
mediante la técnica de dilución seriada en medio líquido introducida por Lister.

Diluciones
Se parte de una solución concentrada, de concentración conocida y se preparan series de diluciones al
décimo o al medio. De esta manera se obtiene una serie de soluciones relacionadas por ejemplo por un
factor de dilución 10 es decir 1/10; 1/100; 1/1000, etc. O la otra serie es 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32 etc. Una
solución tiene dos componentes, el soluto que es la sustancia que es disuelta y el solvente que es el líquido
en el cual está disuelto. Una solución entonces puede estar expresada en términos de la cantidad de soluto
siendo disuelto en un volumen dado de solvente, por ejemplo: UFC/ml, µg/ml, g/ml, mg/ml, entre otros. El
solvente en estas circunstancias es llamado diluyente. El diluyente no contiene ningún soluto. La dilución es
el proceso de adicionar una solución a un diluyente.
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Las diluciones son comúnmente expresadas como una unidad de

la solución siendo diluido el número total de unidades de la
solución final. Por ejemplo 1ml de la solución es adicionado a
9ml del diluyente es decir 1:10 ó 1/10 (se lee 1 en 10) Factor de
dilución es una medida del grado en el que una solución ha sido
atenuada, este valor se puede calcular dividiendo el volumen
final obtenido/volumen de la alícuota (Tabla 1).

Ejemplo: ¿Cuál es el Factor de dilución si adiciona 0.1ml de

alícuota de un cultivo a 9.9ml de un diluyente?

1. El volumen final es igual al volumen de la alícuota mas el

volumen del diluyente: 0.1ml + 9.9 ml = 10 ml
2. El factor de dilución es igual al volumen final dividido por el Figura 1. Dilución
volumen de la alícuota: 10ml/0.1ml = 1:100 dilución (10 2) Fuente:www.brooklyn.cuny.edu
Figura 1.

mL de solución
mL de
Tubo Concentración (medio+inóculo) Dilución
medio liquido

1 0.1 (10-1) 9 ml 1 ml de la solución 1/10

2 0.01 (10-2) 9 ml 1 ml de la solución 1/100

3 0.001 (10-3) 9 ml 1 ml de la solución 1/1000

4 0.0001 (10-4) 9 ml 1 ml de la solución 1/10000

Tabla 1. Diluciones Seriadas
Turbidimetría:
La medición de la turbidez es un método práctico para controlar el crecimiento microbiano, puesto que
cuando las bacterias se multiplican el medio se vuelve turbio por el aumento en la cantidad de células. El
instrumento usado para medir la turbidez es el espectrofotómetro, en él un haz de luz se transmite a través
de una suspensión bacteriana a una fotocélula eléctrica. Cuando la cantidad de bacterias aumenta, menos luz
alcanza esta fotocélula. Este cambio se registra en la escala de medición del instrumento como porcentaje de
transmisión. También se puede determinar como una medición logarítmica del instrumento denominada
absorbancia. La absorbancia se usa para graficar el crecimiento bacteriano, cuando las bacterias están en
fase logarítmica de crecimiento o de declinación la representación de la absorbancia frente al tiempo forma
una línea casi recta.La cantidad de luz que llega a la célula fotoeléctrica en espectrofotómetro es
inversamente proporcional al número de bacterias presentes en condiciones estandarizadas. Cuanto menor
es la cantidad de luz transmitida mayor es la cantidad de bacterias en la muestra.
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CONSULTA PREVIA
Elabore a mano un infograma con base en el artículo: Campuzano, S; Mejia, D; Madero, C; Pabón, P.
Determinación de la calidad microbiológica y sanitaria de alimentos preparados vendidos en la vía pública de
la ciudad de Bogotá D.C. NOVA. 2015; 13 (23): 81-92. Enfatícese en la metodología y resultados.

METODOLOGIA
Esta práctica de laboratorio se va a realizar en grupos de máximo 4 estudiantes quienes siguiendo
las indicaciones del procedimiento prepararan una solución madre (concentrada) y a partir de ella harán
una serie de diluciones con el fin de cuantificar los microorganismos presentes en una muestra problema.
Cada dilución será sembrada en medio solido con el fin de facilitar el recuento luego de incubar por 48 horas.
Para mayor información, puede consultar el siguiente video:
https://www.youtube.com/watch?v=pmRUBYlPMBM

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS A UTILIZAR

Materiales y Equipos Reactivos Materiales Estudiante*

9ml de Solución salina estéril ó Agua destilada Laminas - Laminillas
Agua Peptonada al 0.1%
90ml de Caldo Nutritivo con Gorro
cultivo bacteriano
Erlenmeyer Guantes
Pipeteadores Tapabocas
Pipetas de 2ml, 5ml, 10ml estériles Toallas de papel
Tubos de ensayo Gafas de seguridad
Gradilla Bata blanca manga larga
Cajas de Petri con Agar 2 hojas de papel milimetrado
Nutritivo o Plate Count
Espectrofotómetro
Celdas

*El estudiante debe traer todos los elementos mencionados en la guía, de lo contrario no podrá entrar al
laboratorio.

PRECAUCIONES Y MANEJO DE MATERIALES Y EQUIPOS. CONSULTA DE EQUIPO ESPECIALIZADO.

 Siempre que se trabaje en el laboratorio se deben seguir las normas universales de bioseguridad.
 USAR EL PIPETEADOR, No pipetear con la boca.
 Realizar las diluciones en condiciones de esterilidad.
 Consulte sobre el manejo del espectrofotómetro.
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PROCEDIMIENTO A UTILIZAR

1. Preparación de diluciones seriadas y siembre en placa

Realice las diluciones sucesivas sin olvidar trabajar siempre junto al mechero. Con una pipeta estéril de 2ml
tome 1ml de la solución madre o cultivo inicial y transfiéralo a un tubo con 9ml de solución salina ó agua
peptonada al 0.1%, de esta manera usted obtendrá la primera dilución 10-1, tome otra pipeta estéril y
transfiera 0.1ml del tubo de la dilución 10-1 al agar proporcionado (Agar Plate Count) y distribuya la muestra
de manera uniforme sobre la superficie del agar, utilizando la misma pipeta, transfiera 1ml de la dilución 10-1
a otro tubo con 9ml de solución salina ó agua peptonada al 0.1% obteniendo la dilución 10 -2 ; utilice otra
pipeta estéril y realice el mismo procedimiento hasta realizar la dilución 10-4.

Figura 2. Preparación de las diluciones

Fuente: Tortora et al. 2007

Nota * Incube las cajas de agar en posición invertida, durante 24-48h, a 37ºC.
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2. Determinación de población por densidad óptica

 La densidad óptica de un medio de cultivo es proporcional a la masa celular ó a la población microbiana.

Éste método se basa en la ley de Beer Lambert y en este caso se asume que la absorción del rayo
incidente es proporcional a la concentración de células presentes (Martínez, 1990).
 Después de haber realizado las siembras realice las mediciones espectrofotométricas de cada una de las
diluciones realizadas. Con ayuda del espectrofotómetro realice la medición de absorbancia
correspondiente a cada una de las diluciones realizadas y realice la gráfica
 Determine la absorbancia a 540nm de las diluciones obtenidas utilizando como blanco el medio de cultivo sin
inocular.
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA.

 BROCK, T. (1996). Microbiología 8ª. Ed. Prentice may. New Jersey.

 ESCOBAR, M. Fundamentos de Microbiología, 1998.
 GÓMEZ, G. J. ARACÍL; B, & GIL, Y. (2009). Comparación entre dilución en agar y otras 3 técnicas para la
determinación de la sensibilidad de 228 aislamientos clínicos de bacilos gramnegativos no
fermentadores. Vol. 27. Núm. 06. Junio 2009. En. http://zl.elsevier.es/es/revista/enfermedades-
infecciosas-microbiologia-clinica-28/articulo/infecciones-el-pie-diabetico-importancia-13139083
 BLANCO, L; MARQUINA, M; CASTRO, Y.(2013). Respuestas a la aplicación de carbamatos en dos aislados
rizobianos provenientes de mucuchíes, estado Mérida, Venezuela. Bioagro. Vol 25. Núm 2: 117-128

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

Firma: Firma: Firma:

Nombre: Equipo docentes laboratorio Nombre: Mic. Andrea Cortes Nombre: Ing. Claudia Fernández
de microbiología

Fecha: Enero de 2016 Fecha: Enero de 2016 Fecha: Enero de 2016

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INFORME DE LABORATORIO

ESTUDIANTES: GRUPO:



 NOTA:


CARRERA:
Formule tres objetivos que desee cumplir con la Práctica de Laboratorio





Elabore un Mapa conceptual del tema a tratar en la Práctica de Laboratorio.

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RESULTADOS

Recuento en placa
A partir del número de colonias presentes en el agar nutritivo sembrado con la dilución 10 -1, dilución 10-2,
dilución 10–3 y dilución 10-4, calcule a población en cada una de las diluciones realizadas informando en
UFC/ml. Éste cálculo se realiza multiplicando el número de colonias obtenido en cada caja por el inverso de la
dilución, y ese resultado se divide por el volumen sembrado. Ejemplo: Usted obtuvo 15 colonias en la
dilución 10-3, de la cual sembró 0.1 ml. El número de UFC/ml será igual a:

15 x 1000 = 15000 /0.1ml : 150000 UFC/ml o 1,5 x 105 UFC/ml

A partir de los resultados obtenidos realice los cálculos correspondientes:

Técnica Dilución Número de Colonias en UFC/ml por dilución

sembrada el agar

10-1

10-2

10-3

10-4

Medición Espectrofotométrica

DILUCIÓN VALOR ABSORBANCIA A 540nm

10-1

10-2

10-3

10-4

Realice una gráfica en papel milimetrado con los datos obtenidos Absorbancia (eje Y) vs Número de células
(eje X)
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CUESTIONARIO

1. Describa las diferencias entre una siembra en placa por superficie y una en profundidad
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_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

2. Realice el recuento de UFC/g o mL según sea el caso, e interprete los resultados

El número de colonias de microorganismos degradadores de pesticida encontrado en una muestra de suelo

en la finca “Buenos Aires” fue el siguiente:

 Tipo se siembra: superficie, volumen sembrado 0,1 mL.

Finca la hermosa Replica 1 Replica 2 Replica 3 Recuento
Dil -3 >300 >300 >300
Dil-5 200 en 1/2 220 en 1/2 215 en 1/2
Dil-7 100 125 117
Dil-9 30 33 35
Dil-12 0 0 0

El número de colonias de Lactobacilos, en el agua residual de una empresa productora de quesos es la

siguiente:

 Tipo se siembra: profundidad, volumen sembrado 1 mL.

Finca la hermosa Replica 1 Replica 2 Replica 3 Recuento
Dil -3 255 284 293
Dil-4 140 180 153
Dil-5 80 76 71
Dil-6 31 35 34
Dil-7 0 0 0

3. A partir de la gráfica que encontrara en la parte inferior. Justifique

I. ¿Cuál es la relación entre el crecimiento del microorganismo medido en absorbancia y UFC?
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
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II. ¿Por qué en la cinética de crecimiento representada en la gráfica A, no se observa la fase de muerte
del microorganismo?
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___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________

Adaptado de: Blanco, L; Marquina, M; Castro, Y. Respuestas a la aplicación de carbamatos en dos aislados rizobianos
provenientes de mucuchíes, estado Mérida, Venezuela. Bioagro. 2013; 25 (2): 117-128.
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CAUSAS DE ERROR Y ACCIONES PARA OBTENER MEJORES RESULTADOS:

CONCLUSIONES

APLICACIÓN PROFESIONAL DE LA PRÁCTICA REALIZADA

BIBLIOGRAFIA UTILIZADA