3 Grupo Micro

Avaliação de métodos de difusão e diluição para determinação da atividade antibacteriana

de extratos de plantas

Objetivos do estudo

A avaliação da atividade biológica é essencial para a avaliação da suscetibilidade aos

antibióticos, também é necessário triagem de novos antimicrobianos ( ESCMID, 2000 ).
Produtos naturais, compostos puros ou extratos vegetais padronizados, fornecem oportunidades
ilimitadas para aditivos e medicamentos novos e adequados tratamentos devido à sua gama
incomparável de diversidade química (Cos et al., 2006; O'Bryan et al., 2008). Vários métodos
estão atualmente disponíveis para detectar sua atividade antimicrobiana e uma vez que nem
todos baseiam-se nos mesmos princípios, os resultados obtidos são influenciado não apenas pelo
método selecionado, mas também pelo microorganismos utilizados, e pelo método de extração
ou pelo grau de solubilidade de cada composto de teste (Valgas et al., 2007; Tripoli et al., 2007).
O objetivo deste estudo é avaliar métodos de difusão e diluição para determinação do efeito
antibacteriano atividade de extratos vegetais e suas misturas.

O que levou a ser desenvolvido esse estudo

Esse estudo desenvolvido por causa de atividade antibacteriana de extratos de plantas como
inibidor mínimo concentração (IMC) por métodos de difusão e diluição para grama positivo
(Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes) e bactérias gram-negativas
(Salmonella Infantis, Escherichia coli O157:H7, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli);

Para depois discutir e sugerir algumas recomendações para o uso dos mais métodos e indicadores
apropriados para determinação da CIM pelo método de microdiluição e para examinar a
adequação do método proposto para testar antimicrobianos naturais.

As condições necessárias para o alcançar-se o objectivo

Sete cepas bacterianas, nomeadamente:

  B. cereus WSBC 10530 (clínica isolado).
 S. aureus ATCC 25923 (isolado clínico).
 L. monocytogenes Ž M58 (IHM, Würzburg, Alemanha).
 S. Infantis Ž M9 (carne de aves isolado).
 E. coli O157:H7 Ž MJ 129 (isolado clínico).
 C. jejuni ATCC 33560 (isolado de fezes bovinas).
 C. coli ATCC 33559 (isolado de fezes de porco).
 Método de diluição em ágar.
 Métodos colorimétricos.
 Extracto de plantas ou ácidos fenólicos puros.
 Incubadoras com temperaturas recomendável ( 42ºC/ 45ºC/ 37ºC).
 Quatro discos de papel estéreis

Descreva primordialmente os procedimentos aplicados para alcançar-se o bjectivo

Método de diluição em ágar

Para o método de diluição em ágar, diluições em série duplas de plantas extratos ou ácidos
fenólicos puros foram feitos em MHA ou TSA fundido meio resfriado a 45 °C para obter a
concentração final desejada. foram então inoculado em TSA sólido (L. monocytogenes e E. coli
O157:H7) ou MHA (B. cereus, S. aureus e S. Infantis) ou meio MHA com 5% sangue de cavalo
defi brinado (C. jejuni e C. coli). Placas de ágar foram incubados aerobiamente a 37 °C por 48 h
para todas as culturas bacterianas testadas exceto Campylobacter spp. Que foram cultivados
microaeróbicamente em 42°C por 48 horas. O MIC foi definido como a menor concentração de
extrato vegetal ou composto fenólico puro em meio sólido, onde não foi observado crescimento
visível das bactérias investigadas após 24 ou 48 h (Weckesser et al., 2007). Os controles
negativos incluíram etanol em quantidades correspondentes ao maior quantidade presente no
ensaio de diluição em ágar. Ágar inoculado placas sem adição de extrato vegetal serviram como
controles positivos.

Método de microdiluição em caldo

Para o teste de microdiluição em caldo 50 μL de cada suspensão bacteriana em meio de
crescimento adequado foi adicionado aos poços de um recipiente estéril de 96 poços de
microtitulação já contendo 50 μL de solução duplamente diluída em série extrato de planta ou
ácido fenólico puro em meio de crescimento adequado.

Poços de controle foram preparados com meio de cultura, apenas suspensão bacteriana, apenas
extratos vegetais e etanol em quantidades correspondentes à maior quantidade presente. O
conteúdo de cada poço foi misturado em uma microplaca agitador (Eppendorf, Hamburgo,
Alemanha) a 900 rpm por 1 min antes de incubação por 24 horas nas condições de cultivo
descritas acima. O MIC foi a concentração mais baixa onde não foi observada viabilidade testes
antimicrobianos foram preparados escolhendo colônias de 24 horas de idade placas de
TSA/MHA e foi suspenso em meio apropriado (5ml). As culturas foram cultivadas aerobiamente
por 20 horas e continuamente agitado a 100 rpm a 37 °C, enquanto Campylobacter spp. foram
cultivados microaeróbicamente a 42 °C. Para ensaios de atividade antibacteriana 1 mL de cada
cultura foi diluída com meio TSB ou MHB a 10 5 – 106 UFC/mL.

Método de difusão em disco

Para o ensaio de difusão em disco ( NARMS, 2002 ) 1 mL de cada bactéria suspensão foi
espalhada uniformemente em meio de crescimento sólido em Petri prato. Quatro discos de papel
estéreis (6 mm de diâmetro; Becton, Dickinson & Co.) foram colocados na superfície de cada
placa de ágar e foram impregnados com 10 μL do extrato vegetal diluído. As placas eram
incubadas por 24 horas sob condições apropriadas de cultivo. Antibacatividade material como
MIC foi determinada como a concentração mais baixa de extrato de planta ou ácido fenólico
puro que produziu uma zona de inibição em torno de um disco após a incubação de 24 horas
(Valgas et al., 2007). Discos impregnados com água destilada estéril e etanol serviram como
controles negativos e um disco com antibiótico (oxitetraciclina ou ácido nalidíxico, Sigma-
Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha) serviu como controle positivo.
Protocolo de avaliação da atividade Biológica

Com esta atividades experimental pretende-se avaliar métodos de difusão para determinação do
efeito antibacteriano atividade de extratos vegetais e suas misturas.

Material

Sete cepas bacterianas, nomeadamente:

 B. cereus WSBC 10530 (clínica isolado).

 S. aureus ATCC 25923 (isolado clínico).

 L. monocytogenes Ž M58 (IHM, Würzburg, Alemanha).

 S. Infantis Ž M9 (carne de aves isolado).

 E. coli O157:H7 Ž MJ 129 (isolado clínico).

 C. jejuni ATCC 33560 (isolado de fezes bovinas).

 C. coli ATCC 33559 (isolado de fezes de porco).

 Método de diluição em agar

 Métodos colorimétricos

 Extracto de plantas ou ácidos fenólicos puros.

 Incubadoras com temperaturas recomendável ( 42ºC/ 45ºC/ 37ºC).

  Quatro discos de papel estéreis

Procedimentos

Vários métodos para medição da inibição mínima concentração (MIC) de um extrato vegetal
estão disponíveis, mas não existe um procedimento padrão como existe para antibióticos.

Método de diluição em ágar: Fazer iluições em série duplas de plantas extratos ou ácidos
fenólicos puros fazer em MHA ou TSA fundido meio resfriado a 45 °C para obter a concentração
final desejada.

Incubar aerobiamente a 37ºC por 48 h placas de ágar, para todas culturas bacterianas testadas e
depois observar o crescimento visível após 24/48h, execto Campylobacter spp, que foram
cultivados microaeróbicamente em 42°C por 48 horas.

Método de microdiluição em caldo: Para o teste de microdiluição em caldo, 50 μL de cada

suspensão bacteriana em meio de crescimento adequado e adicionar aos poços de um recipiente
estéril de 96 poços de microtitulação contendo 50 μL de solução duplamente diluída em série
extrato de planta ou ácido fenólico puro em meio de crescimento adequado. Os antimicrobianos
devem ser preparados escolhendo colônias de 24 horas de idade placas de TSA/MHA e é
suspenso em meio apropriado (5ml). O conteúdo de cada poço deve ser misturado em uma
microplaca agitador (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) a 900 rpm por 1 min antes de incubação
por 24 horas nas condições de cultivo descritas acima. As culturas devem ser cultivadas
aerobiamente por 20 horas e continuamente agitado a 100 rpm a 37 °C, enquanto que
Campylobacter spp, devem ser cultivadas microaeróbicamente a 42 °C. Para ensaios de atividade
antibacteriana 1 mL de cada cultura é diluída com meio TSB ou MHB a 10 5 – 106 UFC/mL.
Preparar os Poços de controle com meio de cultura, apenas suspensão bacteriana, apenas extratos
vegetais e etanol em quantidades correspondentes à maior quantidade presente. Espera-se que o
MIC sejá a concentração mais baixa onde não se observara viabilidade testes.

Método de difusão em disco: Espalhar uniformemente 1 mL de cada bactéria em meio de

crescimento sólido em Petri prato. Colocar quatro discos de papel estéreis (6 mm de diâmetro;
Becton, Dickinson & Co.) na superfície de cada placa de ágar e impregnando com 10 μL do
extrato vegetal diluído. Incubar as placas por 24 horas sob condições apropriadas de cultivo.
Espera-se depôs desses procedimentos se verficar antibacatividade material como CIM deve ser
determinada como a concentração mais baixa de extrato de planta ou ácido fenólico puro que
produziu uma zona de inibição em torno de um disco após a incubação de 24 horas (Valgas et al.,
2007).