XII Congreso CYTAL - AATA

Facultad de Ciencias de la Alimentación, UNER,

Entre Ríos, Argentina, 7-9 de octubre 2009

EFECTO DEL TIPO DE ÁCIDO EN LA CINÉTICA DE LA AGREGACIÓN

POR pH DEL CASEINOGLICOMACROPÉPTIDO

M.E. Farías1, 2, M.J. Martínez1 y A.M.R. Pilosof1

(1)
Universidad de Buenos Aires- Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Industrias.
Ciudad Universitaria, Buenos Aires, Argentina.
(2)
Universidad Nacional de Luján- Departamento de Tecnología. Rutas 5 y 7, Luján (6700), Buenos
Aires, Argentina, efarias@mail.unlu.edu.ar

Resumen: El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto del acidulante (clorhídrico,
acético, láctico y cítrico) en la formación de estructuras autoensambladas y geles de
caseinoglicomacropéptido (CMP) a 25 ºC en un rango de pH entre 3,5 y 6. El
autoensamblaje del CMP se determinó por Dispersión de Luz Láser (DLS) y se
analizaron las propiedades de textura de los geles acidulados con HCl y ácido cítrico
obtenidos a pH 3,5 y 25 ºC. El tamaño promedio y la distribución del tamaño de partícula
de las formas asociadas fueron diferentes a cada pH. El tipo de ácido utilizado influyó en
las velocidades de autoensamblaje inicial a pH < 4,5 y de gelificación. El efecto de los
iones en el CMP coincidió con el comportamiento de la serie de Hofmeister. La
concentración de CMP tuvo influencia fundamentalmente en las propiedades texturales.

Palabras clave: caseinoglicomacropéptido, gelificación, CMP, autoensamblaje

INTRODUCCIÓN
El caseinoglicomacropéptido (CMP), péptido
bioactivo de 64 aminoácidos, es liberado en la ruptura
enzimática específica en el enlace peptídico Phe105–
Met106 de la k-caseína durante la elaboración del
queso. Dependiendo del pH, el CMP se autoensambla
y gelifica a pH < 4,5 aún a concentraciones bajas
como 3 % p/p a temperatura ambiente (Farías, et al.
2009). El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto
del acidulante (clorhídrico, acético, láctico y cítrico)
en las formas asociadas y en los geles de CMP a 25 ºC
en un rango de pH entre 3,5 y 6.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
El CMP fue provisto por Davisco Foods International
Inc. (Le Sueur, USA). De acuerdo con la información
del proveedor, su composición fue: proteínas 90,0 %
p/p (N x 7,07), grasa 0,6 % p/p, cenizas 6,3 % p/p y
humedad 6,0 % p/p. El polvo fue disuelto en agua
Milli-Q (5 al 20 % p/p) y las soluciones almacenadas
en la heladera al menos 24 horas antes de su uso. El
pH se ajustó con HCl y ácidos orgánicos (láctico,
acético y cítrico) de alta normalidad para evitar
dilución. Las muestras fueron preservadas con 0,02 %
p/p de NaN3. Las soluciones fueron microfiltradas
(0,45; 0,2 y 0,02μm) para los ensayos de DLS.
Estudio del autoensamblaje del CMP
El autoensamblaje o “self-assembly” del CMP fue
determinado por Dispersión de Luz Láser (DLS) a
temperatura ambiente con un equipo Zetasizer Nano-
Zs, Malvern Instruments (Malvern, England) provisto
de un laser He-Ne (633 nm) con un correlador digital
modelo ZEN3600. Las medidas fueron hechas a un
ángulo de dispersión fijo de 173º.
La técnica de DLS consiste en que la muestra sin
tratamiento previo más que el filtrado, se vierte en una
cubeta de poliestireno descartable, se ilumina por un
rayo láser y se registra la intensidad de la luz
dispersada por las partículas de la muestra. De esta
forma se relaciona la intensidad de luz dispersada por
la partícula, que fluctúa debido al movimiento
browniano de la misma, con el diámetro de la
partícula mediante la ecuación de Stokes-Einstein (1):
kT (1)
d (H ) =
3πηD
donde, d(H): diámetro hidrodinámico (nm); D:
coeficiente de difusión translacional (m2.s-1); k:
constante de Boltzmann (1,28 x 10-23 N.m.K-1); T:
temperatura absoluta (K); η: viscosidad del solvente
(N.s.m-2). Para analizar los resultados se utilizaron dos
aproximaciones: (i) el algoritmo Contin, para analizar
los datos de la distribución por percentilos de los
tamaños de las partículas/agregados. Este análisis se
conoce como distribución de intensidad por tamaño de
partículas. Es posible convertir la distribución de
intensidad en distribución en volumen y número de
partículas a través de la teoría de Mie. (ii) el método
de cumulante, para calcular el diámetro promedio de
la distribución de intensidad o z-average (z-ave). El
valor del z-ave es adecuado para obtener un simple
valor con el propósito de comparación pero no lo es
para dar una completa descripción de los resultados
para sistemas polidispersos. El valor que se informa es
el promedio de tres repeticiones.
Transición Sol-gel
El tiempo de la transición sol-gel se determinó por el
ensayo “tilting test” modificado (Relkin et al. 1998).
Se observaron (en el tiempo a 25 °C) tubos de 4 ml de
capacidad con 2 g de solución de CMP acidulada con
HCl o ácido cítrico cerrados herméticamente y se
determinó el tiempo de gelificación (ttil) como el
tiempo donde no hubo deformación en el menisco al
inclinar el tubo. Los valores reportados fueron la
media de dos a tres repeticiones.
10.0
pH 6,0
Textura de los geles
Los ensayos de perfil de textura (TPA) se realizaron
en un texturómetro TA-XT2i de Stable Micro
Systems. Se vertieron 6 ml de CMP (5-20 % p/p) en
envases plásticos de 2,8 cm de diámetro y 3,5 cm de
altura y se acidularon con ácido cítrico o HCl (pH
3,5), se dejaron gelificar a temperatura ambiente. Los
geles no se desmoldaron para realizar los ensayos y se
dejaron reposar 48 horas a 25 ºC antes de realizar
determinaciones.
Para la compresión de los geles se utilizó una punta de
prueba cilíndrica de ebonita de ½ pulgada de diámetro
(P/05). Las muestras se comprimieron un 20 % de su
altura original, a una velocidad de deformación de 0,5
mm.min-1. Este porcentaje fue determinado de modo
de obtener representabilidad en los ensayos que fueron
por duplicado.
15
pH 5,5

7.5
Intensidad %

Intensidad %

10

5.0

5
2.5

0.0 0
1 10 100 1000 1 10 100 1000
Tamaño (d.nm) Tamaño (d.nm)
15 20
pH 5,0 pH 4,5
Intensidad %

Intensidad %

10

10

0 0
1 10 100 1000 1 10 100 1000
Tamaño (d.nm) Tamaño (d.nm)
15 20
pH 4,0 pH 3,5
Intensidad %

Intensidad %

10

10

0 0
1 10 100 1000 1 10 100 1000
Tamaño (d.nm) Tamaño (d.nm)

Figura 1. Distribución de tamaño de partículas por intensidad de soluciones al 5% p/p de CMP inmediatamente
después de ajustar el pH con diferentes ácidos (■) clorhídrico (□) láctico (○) acético (▲) cítrico.
Temperatura 25 ºC.
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
30 30
pH 6,0 pH 5,5

Volumen %
Volumen%

20 20

10 10

0 0
1 10 100 1000 1 10 100 1000
Tamaño (d.nm) Tamaño (d.nm)
30 30
pH 5,0 pH 4,5
Volumen %

Volumen %
20 20

10 10

0 0
1 10 100 1000 1 10 100 1000
Tamaño (d.nm) Tamaño (d.nm)
30 30
pH 4,0 pH 3,5
Volumen %

Volumen %

20 20

10 10

0 0
1 10 100 1000 1 10 100 1000
Tamaño (d.nm) Tamaño (d.nm)

Figura 2. Distribución de tamaño de partículas por volumen de soluciones al 5% p/p de CMP inmediatamente
después de ajustar el pH con diferentes ácidos (■) clorhídrico (□) láctico (○) acético (▲) cítrico.
Temperatura 25 ºC.

La Figura 1 muestra la distribución de tamaño de
partículas por intensidad con el pH ajustado con
diferentes ácidos (entre pH 3,5 y 6). A pH 6, la
distribución de tamaños por intensidad presentó tres
poblaciones independientemente del tipo de ácido
utilizado. El d(H) del pico predominante se encontró
entre 1,2 y 6,5 nm con un máximo a 2,6 nm. Una
estimación aproximada del peso molecular por el
software del equipo Zetasizer Nano-Zs para
proteínas globulares indicó un peso molecular medio
de 7500 Da, correspondiente a la forma monomérica
del CMP, aunque esta predicción debe ser tratada
con cautela debido a que el CMP no es una proteína
globular. Las otras dos poblaciones corresponden a
moléculas asociadas de tamaños entre 20 y 140 nm,
sin embargo estas formas asociadas son
despreciables como puede verse en la distribución en
volumen correspondiente a pH 6 en la Figura 2. A
pesar que la distribución en volumen indicó que a
pH 6 la forma monomérica fue la predominante, en
el equilibrio se encontraron presentes otras formas
asociadas como dímeros, trímeros, tetrámeros,
pentámeros y hexámeros a quienes correspondería
un d(H) entre 3,8 y 6. Estos resultados obtenidos a
pH 6 son similares a pH 6,6 (pH natural de una
solución de CMP en agua) (Farías et al. 2009).
Cuando el pH decreció desde 6 a 3,5, el diámetro
hidrodinámico correspondiente al máximo valor del
pico predominante se incrementó. Las formas
agregadas de gran tamaño, entre 100 y 150 nm
también fueron despreciables para los pH desde 5,5 a
3,5, como es deducido de la distribución en volumen
de la Figura 2. De esta forma, las soluciones de CMP
a todos los pH, independientemente del tipo de ácido
 10000 utilizado, presentaron formas asociadas de CMP con
A un tamaño menor a 10 nm, que estimadas mediante el
software del equipo Zetasizer Nano-Zs,
corresponderían a dímeros, tetrámeros, hexámeros y
Z-ave (nm)

otros oligómeros a medida que el pH desciende desde

100 5,5 a 3,5.
El z-ave inmediatamente después de ajustar el pH
(t=0) mostró un mínimo a pH 4,5. Sin embargo, a pH
por debajo de 4,5 el valor del z-ave aumentó con el
tiempo (Figura 3). El autoensamblaje del CMP a pH <
1 4,5 conduce a la gelificación, dependiendo de la
3 4 5 6 7 concentración como fue demostrado en Farías et al.
pH (2009). En el tiempo, la distribución de tamaño de
1000 partículas mostró una disminución en la intensidad del
B
pico predominante y un aumento simultáneo de la
intensidad de formas asociadas superiores a 200 nm,
independientemente del tipo de acidulante utilizado
Z-ave (nm)

100
(Farías et al. 2009).
A partir de graficar el log del z-ave en función del
10 tiempo se obtuvo una función lineal cuya pendiente
correspondió a la velocidad de autoensamblaje. A
pesar de que la distribución de tamaño de partículas en
el rango de pH estudiado fue independiente del tipo de
1
3 4 5 6 7 ácido utilizado, se observaron diferencias en la
cinética de autoensamblaje del CMP por pH y por tipo
pH
1000000 de ácido (Figuras 3 y 4).
C
Z-ave (nm)

10000

100

1
3 4 5 6 7
pH
1000
D
Z-ave (nm)

100

Figura 4. Velocidad de agregación inicial (por DLS)

10 en función del pH para CMP 5% p/p. El pH fue
ajustado con diferentes ácidos: clorhídrico, acético,
cítrico, láctico. Temperatura 25 °C.
1
3 4 5 6 7 El CMP es un péptido heterogéneo con diferentes
pH grados de glicosilación y fosforilación (Thöma-
Worringer et al., 2006). El pI del CMP es impreciso y
Figura 3. Z-average en función del pH y el tiempo
disminuye con el grado de glicosilación, variando
(minutos): (■) 0, (Δ) 20, (○) 40, (x) 60 para solución
desde 4,15 hasta 3,15 para CMP no glicosilado
5% p/p de CMP. El pH fue ajustado con diferentes
(aCMP) y glicosilado (gCMP), respectivamente
ácidos A) clorhídrico B) acético
(Kreuß et al., 2009). A pH < 4,5 las fracciones menos
C) cítrico y D) láctico. Temperatura 25 °C.
glicosiladas son las que primero alcanzan el pI y se
neutralizan. En un trabajo previo (Farías et al., 2009)
se detalló un modelo para el proceso de
autoensamblaje del CMP: cuando las fracciones
menos glicosiladas alcanzan el pI, se favorecen
interacciones hidrofóbicas péptido-péptido y se
forman dímeros de CMP que son irreversibles con el
pH. Las fracciones glicosiladas, con carga negativa,
interaccionan con las fracciones diméricas por fuerzas
electrostáticas que conducen finalmente a la
gelificación mediante la formación de una red
polimérica (Farías et al., 2009).
La velocidad obtenida en los primeros estadíos de la
autoasociación fue, para todos los ácidos estudiados,
mayor a pH 3,5 que a 4 (Figura 4). La mayor
diferencia entre las cargas que posibilita la formación
de interacciones electrostáticas entre dímeros de
aCMP, ahora positivos, con gCMP todavía negativo.
El tipo de ácido utilizado en el ajuste de pH tuvo
influencia sobre la velocidad de autoensamblaje, en el
siguiente orden: ácido cítrico > ácido láctico > HCl >
ácido acético. La velocidad de autoensamblaje se
relacionó con la inversa del tiempo necesario para
gelificar obtenido con el ensayo del tilting test (ttil).
El tiempo necesario para gelificar una solución del
12% p/p de CMP acidificada con HCl fue 2,5 ± 0,2
horas, a pH 3,5. En cambio, si la misma solución se
acidifica con ácido cítrico el tiempo se redujo a apenas
5,8 ± 0,1 min. A pH 4 la misma solución acidificada
con HCl tardó 27 ± 2 horas en gelificar, en cambio
con ácido cítrico el tiempo necesario fue 53 ± 5 min.
Todos los geles macroscópicos fueron opacos con
excepción de los geles obtenidos con ácido láctico
cuya coloración fue más blanquecina.
Los aniones tienden estabilizar la estructura de
proteínas y macromoléculas según la serie de
Hofmeister o liotrópica (Resch et al. 2005). Según esta
serie el citrato y el lactato son cosmotropos, son
fácilmente hidratables e interaccionan fuertemente con
el agua. Este tipo de aniones incrementan la tensión
superficial del agua, realzan las uniones hidrofóbicas y
disminuyen la solubilidad de moléculas no polares
(“salting out”).

Figura 5: Parámetros del perfil de textura (TPA): A) cohesividad, B) fracturabilidad, C) dureza, D) Gomosidad y
E) Masticabilidad de geles de CMP (5-20% p/p) a pH 3,5 con ácido cítrico (□) y HCl (▲) como acidulantes
obtenidos a 25 ºC.
En contraste, los aniones caotropos, por ejemplo el
ioduro y el isocianato, exhiben interacciones débiles
con el agua y con sí mismos, decrecen las
interacciones hidrofóbicas entre las proteínas, tienen
menor efecto en la tensión superficial e incrementan la
solubilidad de las moléculas no polares. El punto de
división entre los aniones cosmotropos y los caotropos
es el Cl¯ quien es neutral con respecto a los efectos de
ambos (Curtis et al. 2002). Resch et al. (2005)
encontraron que el ácido cítrico aumentó la velocidad
de gelificación de β-lg, seguido por el ácido láctico y
el ácido clorhídrico a pH 3,35, estos resultados fueron
similares a los obtenidos en este trabajo.
El análisis de perfil de textura (TPA) es un método
objetivo que se correlaciona con el análisis sensorial,
basado en el reconocimiento de la textura como un
atributo de múltiples parámetros (Figura 5). La
cohesividad, que puede ser interpretada como la
velocidad en que el material se desintegra bajo acción
mecánica, se mantuvo prácticamente constante hasta
un 15% p/p de CMP y no se observaron diferencias
significativas entre el uso de ácido cítrico y
clorhídrico. Por otro lado, el incremento de la
concentración de CMP aumentó la dureza, la
fracturabilidad y la masticabilidad, especialmente en
el rango entre 10-20% p/p de CMP, sin embargo los
geles acidulados con ácido cítrico presentaron valores
levemente menores de estos parámetros.
CONCLUSIONES
La selección del acidulante afecta a la velocidad de
autoensamblaje y de gelificación del CMP a
temperatura ambiente. Se concluye que los ácidos
cítrico y láctico favorecen las condiciones de
autoensamblaje del CMP a pH 3,5 y 4 pero es la
concentración de CMP quién afecta principalmente a
las condiciones finales de textura del gel.
AGRADECIMIENTOS
Las autoras agradecen al Departamento de Tecnología
de la Universidad Nacional de Luján, a la Universidad
de Buenos Aires, al Consejo de Investigaciones
Científicas y Técnicas de la República Argentina y a
la Agencia Nacional de Promoción Científica y
Tecnológica de la República Argentina.
REFERENCIAS
Curtis, R. A., J. Ulrich, A. Montaser, J. M. Prausnitz y
H. W. Blanch (2002), Hofmeister-Series Effects
Protein-protein interactions in concentrated
electrolyte solutions. Biotechnology and
Bioengineering 79(4): 367-380.
Farías, M. E., M. J. Martinez y A. M. R. Pilosof
(2009), Casein glycomacropeptide pH dependent
self-assembly and cold gelation. International
Dairy Journal, Submitted.
Kreuß, M., T. Strixner y U. Kulozik (2009), The effect
of glycosylation on the interfacial properties of
bovine caseinomacropeptide. Food Hydrocolloids
23, 1818-1826.
Relkin, P., T. Meylheuc, B. Launay y K. Raynal
(1998), Heat-induced gelation of globular protein
mixtures. A DSC and scanning electron
microscopic study. Journal of Thermal Analysis,
51, 747-755.
Resch, J. J., C. R. Daubert y E. A. Foegeding (2005),
The effects of acidulant type on the rheological
properties of beta-lactoglobulin gels and powders
derived from these gels. Food Hydrocolloids
19(5): 851-860.
Thöma-Worringer, C., J. Sørensen y R. López-
Fandiño (2006), Health effects and technological
features of caseinomacropeptide. International
Dairy Journal 16: 1324–1333.