Lab Cultivo de Tejidos

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
FACULTAD DE INGENIERÍA
Bioingeniería
CULTIVO DE TEJIDOS
Manual de prácticas
laboratorio
Dra. Angélica López Izquierdo.

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ÍNDICE
Práctica No.1 Prueba de viabilidad de embriones .................................................. 4
MARCO TEÓRICO................................................................................................................................................ 4
COMPETENCIAS .................................................................................................................................................. 5
MATERIAL Y EQUIPO ......................................................................................................................................... 5
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL ..................................................................................................................... 5
CUESTIONARIO ................................................................................................................................................... 6
OBSERVACIONES................................................................................................................................................ 6
REFERENCIAS ..................................................................................................................................................... 7
Práctica No.2 Cultivo in vitro de embriones de maíz. ............................................ 8

MARCO TEÓRICO................................................................................................................................................ 8
COMPETENCIAS .................................................................................................................................................. 9
MATERIAL Y EQUIPO ........................................................................................................................................10
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL ....................................................................................................................10
CUESTIONARIO ..................................................................................................................................................14
OBSERVACIONES...............................................................................................................................................14
REFERENCIAS ....................................................................................................................................................17
Práctica No.3 Encapsulado de semillas ................................................................. 18

MARCO TEÓRICO...............................................................................................................................................18
COMPETENCIAS .................................................................................................................................................18
CUESTIONARIO ..................................................................................................................................................19
OBSERVACIONES...............................................................................................................................................20
REFERENCIAS ....................................................................................................................................................20
Práctica No.4 Establecimiento de un cultivo de callo. .......................................... 21

MARCO TEÓRICO...............................................................................................................................................21
COMPETENCIAS .................................................................................................................................................21
CUESTIONARIO ..................................................................................................................................................23
OBSERVACIONES...............................................................................................................................................23
REFERENCIAS ....................................................................................................................................................23
Práctica No.5 Citoquininas: reguladores de la senescencia de las hojas. ............ 24

MARCO TEÓRICO...............................................................................................................................................24
COMPETENCIAS .................................................................................................................................................25
Bioingeniería FIM
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CUESTIONARIO ..................................................................................................................................................26
OBSERVACIONES...............................................................................................................................................26
REFERENCIAS ....................................................................................................................................................27
Práctica No. 6 Conteo celular. ............................................................................... 28

MARCO TEÓRICO...............................................................................................................................................28
COMPETENCIAS .................................................................................................................................................29
CUESTIONARIO ..................................................................................................................................................30
REFERENCIAS ....................................................................................................................................................31
Bioingeniería FIM
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE
BAJA CALIFORNIA
Facultad de Ingeniería
Bioingeniería
Cultivo de Tejidos
Práctica No.1 Prueba de viabilidad de

embriones
MARCO TEÓRICO
Los granos de maíz forman parte de la familia de las cariópsides desnudas, al igual
que distintos cereales, cuyas estructuras están formadas principalmente por:
● Pericarpio: Se refiere la parte externa de grano, esté conforma entre el 5 y
el 6% del peso total de grano y le brinda una resistencia al agua y el vapor a la
semilla; Este se divide a su vez en cuatro capas más delgadas.
● Endospermo: En la mayoría de las variedades del maíz representa
aproximadamente del 80 al 20% del peso total de la semilla, gran fuente de
almidón y proteína.
● Germen: Representa entre el 8 y el 12% del peso del grano, está formado
por:
○ Escutelo: Órgano encargado de la alimentación del embrión en
el momento de su germinación.
○ Eje embrionario: Conformado por una plúmula, que posee
entre 5 y 6 hojas y una radícula.
● Funículo: Órgano filiforme que une el óvulo de una planta a la placenta del
ovario.
La principal característica tomada en cuenta para la clasificación de los cereales es

la coloración externa del grano.
Figura 1. Anatomía de la semilla de maíz.

INTRODUCCIÓN
Actualmente se realizan distintas pruebas con cloruro trifeniltetrazolio para conocer
la viabilidad de tejidos tanto animales como vegetales, distintas bacterias y
levaduras, pero principalmente se realizan pruebas para determinar la capacidad
germinativa de semillas, sobre todo en cereales.
La viabilidad de una semilla determina la posibilidad que esta tiene de germinar,
Bioingeniería FIM
5
esta práctica busca aplicar una prueba que nos permita detectar aquellas semillas de
maíz aptas para cultivar.
La calidad del grano de maíz está asociada a la constitución morfológica de la
semilla, tanto la textura como la dureza de esta, además de depender rigurosamente
de su composición química, ya que ésta definirá su valor nutrimental y sus
aplicaciones tecnológicas.
COMPETENCIAS
● Desarrollar una metodología para la detección de semillas aptas para la

siembra.
● Determinar la eficacia del reactivo cloruro de trifeniltetrazolio para identificar
la calidad de las semillas.
MATERIAL Y EQUIPO
Tabla 1. Material y equipo.
Material Equipo
Vasos de precipitado. Balanza analítica.
Agua destilada. Incubadora.
Cajas Petri.
Pinzas (para disección).
Papel aluminio.
Pipeta.
Papel absorbente.
Semillas de maíz.
Cuchillo.
Agua desionizada estéril.
Tabla de picar.
Vasos de precipitado.
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
1. Cortar por la mitad con un corte longitudinal, 10 granos de maíz con embrión
visible por caja Petri (60 granos).
2. Tomar parte de ellas (10 semillas) y sumergirlas en una solución de hipoclorito al
1% durante 3 minutos, después de ello realizarles un lavado en agua purificada,
siendo este repetido 5 veces.
3. Colocar papel filtro en el fondo de cada una de las cajas Petri.
4. Preparar 10 ml al 1% de cloruro de trifeniltetrazolio.
5. Humedecer con ayuda de una pipeta el papel filtro de dos de las cajas con 2 ml de
la solución anterior.
6. Posteriormente, humedecer la caja restante con 2 ml de agua purificada.
7. Colocar las semillas expuestas al hipoclorito boca abajo sobre el papel filtro de una
de las cajas con la solución de cloruro de trifeniltetrazolio.
8. Colocar el resto de las semillas de igual forma en las 2 cajas sobrantes.
Bioingeniería FIM
6
9. Cubrir las 3 cajas con aluminio para evitar exponer la reacción a la luz,
posteriormente pasarlas a incubar durante 1 hora a 37 grados centígrados.
10. Por último, abrir para realizar las observaciones debidas de la coloración en los
embriones y realizar las anotaciones.
CUESTIONARIO
Tabla 2. Cuestionario.
¿Cuál es la finalidad del test de trifeniltetrazolio y qué indica la presencia o
1.
ausencia de coloración en la semilla?
2. ¿Qué factores afectan la viabilidad de una semilla?
Explica con tus palabras la importancia de realizar pruebas de viabilidad en
3.
semillas.
OBSERVACIONES
Notas:
Figura 2. Resultados de la práctica, caja A) control negativo de semillas más agua. Caja B)
control de semillas tratadas en hipoclorito más la solución activa. Caja C) semillas más
solución activa.
Bioingeniería FIM
7
Figura 3. Estándares de viabilidad.
REFERENCIAS
[1] Servicio Nacional de Inspección y Certificación de Semillas.(2018).¿Cómo saber qué tan

viable es una semilla?.Recuperado el 29 de agosto del 2019,
de:https://www.gob.mx/snics/artículos/como-saber-que-tan-viable-es-una-se
milla?idiom=es
[2] Universidad Nacional Autonoma de Mexico. (2017).Maíz (Zea mays).Recuperado el 30
de agosto del 2019, de
http://olimpia.cuautitlan2.unam.mx/semillas/index.php?option=com_content
&view=article&id=24&Itemid=25
[3] Vieitez Cortizo Ernesto.(1952). El uso del cloruro 2, 3, 5-trifeniltetrazolium para
determinar la vitalidad del polen. Recuperado el 5 de septiembre del 2019, de:
http://digital.csic.es/handle/10261/61542
Bioingeniería FIM
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BAJA CALIFORNIA
Bioingeniería
Cultivo de Tejidos
Práctica No.2 Cultivo in vitro de embriones de

maíz.
MARCO TEÓRICO
El cultivo in vitro de embriones de maíz es una técnica ampliamente utilizada en la
investigación agrícola y en la biotecnología vegetal para el mejoramiento de plantas. Esta
técnica permite el desarrollo y crecimiento de embriones de maíz en un entorno
controlado, fuera de su ambiente natural, lo que proporciona ventajas significativas para
el empleo de técnicas de mejoramiento genético, propagación de plantas y estudio de
procesos de desarrollo.
Los embriones de maíz se obtienen a partir de semillas maduras. Las semillas se

desinfectan para eliminar posibles contaminantes superficiales, y luego se extraen los
embriones de su interior. Los embriones son estructuras tempranas que aún no han
germinado y consisten en una radícula (raíz embrionaria), plúmula (primeras hojas) y el
escutelo (estructura de almacenamiento).
Se debe de utilizar medios de cultivo específicos que proporcionen los nutrientes

necesarios para el crecimiento y desarrollo de los embriones. Estos medios deben
contener: sales minerales, vitaminas, carbohidratos, reguladores de crecimiento y otros
componentes esenciales (como fitohormonas). El tipo de medio puede variar según los
objetivos del cultivo. Para el proceso de inoculación, los embriones aislados se colocan
en el medio de cultivo en placas de Petri o frascos estériles; y se deben de establecer las
condiciones de temperatura, humedad y luz controladas para promover su crecimiento.
Bioingeniería FIM
9
Durante el cultivo, se observarán las distintas etapas del desarrollo embrionario, como
la elongación de la radícula y la emergencia del coleóptilo (vaina protectora que rodea a
la plúmula y la protege mientras emerge a la superficie). Los reguladores de crecimiento
presentes en el medio de cultivo propiciarán estos procesos. La multiplicación es parte
del proceso de la micropropación de plantas, en estos casos, una vez que los embriones
han germinado y desarrollado se pueden separar en plántulas individuales para su
posterior multiplicación. Esto se logra transfiriendo las plántulas a nuevos medios de
cultivo y permitiendo que crezcan y se desarrollen.
El cultivo in vitro de embriones de maíz también se utiliza para la propagación de plantas

con características deseables, como resistencia a enfermedades o mayor rendimiento. Se
pueden aplicar técnicas de ingeniería genética para introducir o modificar genes
específicos en los embriones y luego regenerar plantas completas a partir de estos
embriones modificados.
Otro tipo de cultivo in vitro vegetal, es el rescate de embriones, el cual es un

procedimiento que se utiliza en la biotecnología vegetal para obtener y cultivar
embriones en desarrollo a partir de cruzamiento de plantas de difícil germinación o que
no pueden producir semillas viables. Esta técnica es muy útil en la mejora genética de
plantas, ya que permite obtener nuevas plantas, además de que permite el estudio y la
manipulación controlada de embriones, lo que conduce a un mejor entendimiento de los
procesos de desarrollo y a la producción de plantas con características agronómicas
deseables.
COMPETENCIAS
● Desarrollar una metodología para elaborar medio de cultivo de bajo costo que
promuevan el crecimiento de los tejidos vegetales.
● Desarrollar una metodología para la desinfección y germinación de embriones.
● Identificar los componentes básicos para realizar el cultivo vegetal in vitro.
● Determinar los factores que influyen positiva y negativamente en el proceso de
germinación.
Bioingeniería FIM
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MATERIAL Y EQUIPO

Material Equipo
Vasos de precipitado. Balanza analítica.
Agua destilada. Incubadora.
Cajas Petri.
Papel aluminio.
Pipeta.
Papel absorbente.
Semillas de maíz.
Cuchillo.
Tabla de picar.
1. Lavar todo el material de vidrio y secar evitando residuos.
2. Preparar todo el material para su esterilización en autoclave.
a) Preparación de medio de cultivo (cálculos).

Medio Plátano (Tubos)
Cálculos realizados para 130 ml de medio.
-13 g. de plátano.
-13 g. de agar bacteriológico.
-1.95 g. de sacarosa.
-0.156 g. de fosfato de potasio.
-Aforar con agua destilada.
Medio agua de coco (Tubos)

-65 ml de agua de coco.
-2.6 g. de sacarosa.
Medio agua de coco (Cajas Petri)

-150 ml de agua de coco.
-6 g. de sacarosa.
Medio base Tomate - Plátano (Cajas Petri)

-8 g. de plátano hecho puré.
Bioingeniería FIM
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-4.6 g. de agar bacteriológico.

-20ml de jugo de tomate.
-4 g. de glucosa.
-160ml de agua destilada.
Medio base Tomate (Cajas Petri)

-50 g. de tomate maduro y sano (hacer puré y tamizar).
-3 g. de glucosa.
-180 ml de agua destilada
Medio base Tomate - Zanahoria (Cajas Petri)

-20 ml de jugo de zanahoria.
-20 ml de jugo de tomate.
-3 g. de glucosa.
-160 ml de agua destilada.
Medio base Piña (Cajas Petri)

-40 ml de jugo de piña dulce y madura.
-3 g. de glucosa/sacarosa.
-160 ml de agua destilada.
b) Preparación Medio Base plátano. (Tubos)

1. Macerar los plátanos maduros en una caja Petri con ayuda de una
espátula y pesar 13 g.
2. Colocar en un vaso de precipitado el plátano molido, adicionar agua
destilada y homogeneizar con una espátula.
3. Filtrar la mezcla y reservar el líquido.
4. Al líquido sobrante adicionar sacarosa y fosfato de potasio, calentar
hasta disolver sin alcanzar la ebullición.
5. Adicionar el agar en tibio y mezclar hasta homogeneizar.
6. Medir el pH.
7. Agregar a los tubos de ensayo.
8. Esterilizar en olla de presión por 15 minutos y dejar enfriar.
9. Corroborar la esterilidad del medio, dejar a temperatura ambiente y en
oscuridad durante 1 semana.
c) Preparación Medio Base agua de coco (Tubos).

1. En un vaso de precipitado agregar el de agua y la sacarosa.
2. Calentar en agitación hasta disolver sin llegar a la ebullición.
3. Agregar el volumen de agua de coco deseado y mezclar.
4. Medir el pH.
Bioingeniería FIM
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5. Homogeneizar el medio, distribuir en tubos de ensaye con 10 ml cada

uno.
6. Esterilizar en una olla de presión por 15 minutos.
7. Corroborar la esterilidad del medio, dejar a temperatura ambiente
y en oscuridad durante 1 semana.
d) Preparación Medio Base agua de coco (Cajas Petri).

1. En un vaso de precipitado agregar el de agua y la sacarosa.
2. Calentar en agitación hasta disolver sin llegar a la ebullición.
3. Agregar el volumen de agua de coco deseado y mezclar.
4. Medir el pH.
5. Homogeneizar el medio.
6. Esterilizar en una olla de presión por 15 minutos.
7. Corroborar la esterilidad del medio, dejar a temperatura
ambiente y en oscuridad durante 1 semana.
di) Preparación Medio Base tomate plátano. (Cajas Petri)

1. Macerar 8 g. de plátano en un mortero hasta que quede libre de grumos.
2. Colocar en un vaso de precipitado el plátano molido, adicionar agua
destilada y homogeneizar con una espátula.
3. Filtrar la mezcla y reservar el líquido.
4. Verter 20 ml de jugo de tomate en un vaso de precipitado.
5. Agregar la solución de plátano en el jugo de tomate y mezclar añadiendo
160 ml de agua destilada.
6. Verter la mezcla en un matraz Erlenmeyer (usar agitador magnético),

lograr la homogeneización de la mezcla.
7. Calentar el matraz con la mezcla sin llegar a la ebullición.
8. Añadir 4 g. de glucosa en tibio a la mezcla.
9. Agregar el agar bacteriológico poco a poco conforme se vayan
disolviendo en la mezcla.
10. Esperar a que la mezcla se haya homogeneizado completamente para
evitar la sedimentación del agar durante la esterilización.
11. Retirar el agitador magnético del Matraz y proseguir con su proceso de
esterilización en el autoclave.
dii) Preparación Medio Base Tomate (Cajas Petri).

1. Macerar 50 g. de tomate en un mortero hasta que quede libre de grumos.
2. Filtrar hacia un vaso de precipitados; utilizando un tamiz, para obtener
solo el jugo de tomate.
3. Verter la mezcla en un matraz Erlenmeyer.
4. Agregar un agitador magnético al matraz Erlenmeyer para seguir con su
homogeneización.
Bioingeniería FIM
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g) Preparación Medio Base Tomate Zanahoria (Cajas Petri).

1. Añadir 20 ml de jugo de tomate en un matraz Erlenmeyer.
2. Agregar 20 ml de jugo de zanahoria al mismo matraz.
3. Agregar 160 ml de agua destilada al matraz.
4. Agregar un agitador magnético al matraz para seguir con su
homogeneización.
h) Preparación Medio Base Piña (Cajas Petri).

1. Agregar 40 ml de jugo de piña a un matraz Erlenmeyer.
2. Agregar 160 ml de agua destilada al matraz.
3. Agregar un agitador magnético al matraz para seguir con su
homogeneización.
Cultivo in vitro de embriones de maíz.
Desinfección de los explantes:
1. Separar los granos del maíz de la espiga.

2. Desinfectar el área de trabajo y los utensilios. Los palillos de madera a utilizar
deben estar estériles.
3. Preparar los granos para el proceso de desinfección, para lo cual se deben de
envolver en gasas formando unos sacos.
4. Sumergir los sacos de granos en etanol al 70% durante 20 segundos y retirar
utilizando las pinzas de disección.
Bioingeniería FIM
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5. Cubrir los sacos con la solución esterilizadora (hipoclorito de sodio al 3%) por 15
minutos, agitar cada 2 minutos aproximadamente.
6. Retirar de la solución esterilizadora (hipoclorito de sodio al 3%) utilizando las pinzas de
disección.
7. Realizar 3 lavados con agua destilada estéril en agitación, 5 minutos por lavado.
Extracción del embrión:
1. Con ayuda de bisturí y pinzas romper un saco de granos de maíz.

2. Utilizando las pinzas estériles extraer un grano y presionar suavemente cerca del
mechero para facilitar la salida del embrión.
3. Utilizando un palillo de madera estéril romper el grano de maíz de manera que sea
sencillo obtener el embrión.
Sembrado del embrión:
1. Dentro del área de esterilidad abrir el tubo de ensayo con medio de cultivo estéril,
colocar el embrión en el tubo de ensayo con ayuda del palillo.
2. Cerrar el tubo, rotular adecuadamente.
Proceso de incubación:
1. Incubar durante 14 días a una temperatura aproximada de 26°C.

2. Monitorear el crecimiento de los embriones con frecuencia.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las fases de la germinación?
2. ¿Cuáles son las condiciones básicas para la germinación?
3. ¿Por qué se utiliza el detergente para la desinfección de semillas?
4. ¿Por qué la incubación se puede realizar en total oscuridad?
OBSERVACIONES
Notas:
Bioingeniería FIM
15
Figura 3.- Representación esquemática del proceso de asepsia de los embriones.
Figura 4.- Preparación del material dentro de la cabina de bioseguridad.
Figura 5.- Inoculación del embrión de maíz.
Bioingeniería FIM
16
Figura 6.- Imágenes representativas de la germinación del embrión de maíz.
Figura 7.- Imágenes representativas de la germinación del embrión de maíz.
Bioingeniería FIM
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Figura 8.- Plántula trasplantada en un maceta.
REFERENCIAS
[1] Instituto Nacional de Innovacion y Transferencia en Tecnologia Agropecuaria. (2019).
Obtenido de PRUEBA PRÁCTICA DE LA DUREZA DEL GRANO DE MAÍZ:
http://www.mag.go.cr/acerca_del_mag/programas/PITTA-Frijol/XV-Encuentro-
Nacional/Prueba-practica-dureza-grano-maiz.pdf
[2] Caviedes-Cepeda, M., Carvajal-Larenas, F. ., & Zambrano-Mendoza, J. L. (2022).
Generación de tecnologías para el cultivo de maíz (Zea mays. L) en el Ecuador. ACI
Avances En Ciencias E Ingenierías, 14(1). https://doi.org/10.18272/aci.v14i1.2588
[3] Universidad de Granada. (2016). Obtenido de PREPARACION DE MEDIOS DE
CULTIVO: https://www.ugr.es/~cjl/medios%20de%20cultivo.pdf
Bioingeniería FIM
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BAJA CALIFORNIA
Bioingeniería
Cultivo de Tejidos
Práctica No.3 Encapsulado de semillas
MARCO TEÓRICO
La semilla es el órgano reproductivo más importante en las plantas terrestres. Tiene
funciones como renovar, persistir y dispersar poblaciones de plantas, también regenerar
bosques y formar parte de la sucesión ecológica.
El almacenamiento de semillas artificiales es un factor crítico para mantener la viabilidad
del material encapsulado. Las formas de almacenamiento dependen del tiempo que se
conservará la semilla artificial: corto, mediano o largo plazo. En las de corto y mediano
plazo por lo general se utilizan métodos de baja temperatura sobre cero grados. En los de
largo plazo se usan las inmersiones en nitrógeno líquido (Benelli 2016).
El alginato de sodio, que es un polisacárido obtenido de algas marinas. Tiene

características como rigidez, elasticidad y flexibilidad. Una de las propiedades
interesantes del alginato es su capacidad gelatinizante, al entrar en contacto con una
solución que contenga calcio (Avendaño-Romero et al. 2013).
Figura 1. Semilla artificial de zanahoria: A) forma irregular, B) forma de lágrima y

C) embrión somático de zanahoria encapsulado y posicionado cerca de la pared.
COMPETENCIAS
● Desarrollar una metodología para la desinfección de semillas.
● Reconocer el método de encapsulado en gel de alginato, como un método de
conservación de semillas, embriones somáticos, explantos de interés biotecnológico.
Bioingeniería FIM
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MATERIAL Y EQUIPO
Material Equipo
Puntas para micropipetas (1 ml). Balanza.
Vasos de precipitado. Parrilla y agitador metálico.
Alginato de Sodio.
Cloruro de Calcio.
Bisturí o navaja.
Balanzas.
Papel absorbente.
Semillas.
Pipetas Pasteur.
1. Preparar 100 ml de solución de alginato de sodio al 1%, mezclar con agitación
constante hasta que el alginato se disuelva por completo. La solución de alginato de
sodio puede ser teñida con colorantes vegetales (opcional).
2. Preparar 200 ml de CaCl2 H20 al 15 %.
3. Colocar las semillas, previamente lavadas y correctamente desinfectadas

(condiciones asépticas), en la solución de alginato y mezclar suavemente para lograr
que la solución impregne completamente a las semillas.
4. Colocar la solución de CaCl2 en un vaso de precipitado. Con ayuda de una pipeta

Pasteur o gotero, aspirar la solución de alginato conteniendo las semillas, y suspender
en la solución de CaCl2 (goteándolos de manera individual dentro de la solución de
CaCl2). Procurar que la pipeta no toque la solución de calcio.
5. Colocar el vaso de precipitado con las semillas/alginato en un agitador metálico

(agitación suave) por 30-45 min para ayudar a que se formen las esferas
(gelificación).
6. Recuperar las esferas de alginato conteniendo las semillas, decantar el CaCl2 y realizar
dos lavados con agua desionizada estéril.
7. Almacenar las semillas en cajas Petri (previamente esterilizadas), sellarlas y

mantenerlas en refrigeración a 3 ± 1°C, hasta su uso.
CUESTIONARIO
Tabla 2. Cuestionario
1. ¿Qué son las semillas sintéticas?
2. ¿Cuál es la finalidad de crear una cubierta alrededor de las semillas?
Bioingeniería FIM
20
3. Explica por qué se gelifica el alginato al entrar en contacto con el CaCl2.

Menciona 3 ejemplos de agentes gelificantes que pueden ser usados para
4.
encapsular semillas (sin contar el alginato de sodio).
OBSERVACIONES
Notas:
Figura 2. Embrión somático de Laelia anceps ssp. dawsonii, en estadio de

plúmula, encapsulado en matriz de alginato de sodio en complejo con
cloruro de calcio.
Beads
Figura 3.
REFERENCIAS
[1] Avendaño-Romero GC, López-Malo A, Palou E. 2013. Propiedades del alginato y
aplicaciones en alimentos. Temas selectos de Ingeniería de Alimentos. [accessed
2016 Sep 23] 7 (1):87-96. web.udlap.mx/tsia/files/2013/12/TSIA-71-Avendano-
Romero-et-al-2013.pdf
[2] Benelli C. 2016. Encapsulation of shoot tips and nodal segments for in vitro storage of
“Kober 5BB” grapevine rootstock. Horticulturae. 2(10):1-8/.
doi:10.3390/horticulurae2030010.
Bioingeniería FIM
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BAJA CALIFORNIA
Bioingeniería
Cultivo de Tejidos
Práctica No.4 Establecimiento de un cultivo de

callo.
MARCO TEÓRICO
Los callos de plantas son masas celulares diferenciadas, no organizadas y de rápido

crecimiento que pueden ser producidas en todas las especies de plantas en respuesta a un
suplemento de hormonas endógenas o exógenas. Los cultivos de callos de plantas (callos
que crecen asépticamente en medios semisólidos con agar y hormonas vegetales) y
cultivos de suspensión de callos (callos que crecen asépticamente en medio líquidos en
matraces o biorreactores) han incrementado su uso en Biotecnología como una
herramienta para la manipulación genética de plantas, micropropagación, estudios del
metabolismo y de desarrollo celular de plantas, así como para la producción comercial de
productos naturales (metabolitos primarios y secundarios).
Figura 1. Formación in vitro de callos de batata.
COMPETENCIAS
● Analizar la importancia del conjunto de técnicas que implica el cultivo in vitro de
tejidos vegetales.
Bioingeniería FIM
22
● Familiarizar al estudiante con las técnicas de cultivo de vegetales in vitro y llevar a

cabo la formación de callos.
● Analizar la actividad de los reguladores de crecimiento en la formación de callos.
MATERIAL Y EQUIPO
Material Equipo
Raíces de Zanahoria. Campana de flujo laminar.
Etanol al 70%. Autoclave.
Solución de hipoclorito de sodio al 10 %.
Agua destilada/desionizada estéril.
Medio de cultivo de bajo costo (agua de
coco).
2,4-D (Herbicida auxínico).
Mioinositol.
Sacarosa.
Preparación del medio
1. Preparar medio de cultivo de bajo costo, complementarlo con 2,4-D 1.0 mg/L,
sacarosa 20 g/L, agar-agar 6.0 g/L y mioinositol 0.1 g/L. Ajustar el pH a 5.5 con NaOH
1.0 N, antes de agregar el agar.
2. Preparar otro medio de cultivo, sin mioinositol, ni 2,4-D. Todos los demás
componentes a la misma concentración y ajustar el pH del medio a 5.5.
3. Verter a cajas Petri y después esterilizar en autoclave de presión.
Nota: La preparación de medios se debe de realizar antes de la práctica.
Preparación de material
1. Lavar las zanahorias con agua de la llave y jabón en agitación manual.
2. Pelar las zanahorias con un pelador de vegetales, eliminar 2 milímetros del tejido.
3. Cortar las zanahorias en rebanadas de un centímetro de grosor.
4. Sumergir las rebanadas en una solución de etanol al 70% por 30 segundos.
5. Sumergir las rebanadas en una solución de hipoclorito de sodio al 10%, durante 10
minutos, a partir de este paso se debe trabajar en la campana de flujo laminar.
6. Durante el tiempo de espera, numerar y pesar las cajas Petri en las cuales se van a
colocar los tejidos.
7. Lavar el material vegetal cinco veces con agua destilada y estéril, con agitación; dentro
de un vaso de precipitados, durante 30 segundos.
8. Del vaso de precipitados, tomar una a una las rebanadas y pasar a una caja de Petri
sin medio. Con la ayuda de unas pinzas de disección, cortar cubos de la zona del
cambium de un centímetro por lado.
9. Colocar de tres a cuatro cortes (cubos) de cambium por caja Petri, procurando que la
superficie de uno de los lados del cubo quede en contacto con la superficie del medio
de cultivo.
10. Volver a pesar las cajas Petri y calcular el peso de los explantes por diferencia.
11. Colocar las cajas Petri con los explantes en un cuarto de cultivo con fotoperiodo de 16
Bioingeniería FIM
23
horas de luz por 8 de oscuridad a una temperatura de 24-26 ºC.
Nota: Se llevará a cabo el mismo procedimiento tanto para las cajas de cultivo con medio
adicionado con mioinositol y 2,4-D, y con el medio de cultivo sin los aditivos antes
mencionados.
12. Observar cada tres días el desarrollo de los cultivos, anotar las apariencias y cambios
que van sufriendo los explantes. Separar las cajas Petri con explantes contaminados y
describir si se trata de contaminación bacteriana o fúngica. Es de particular
importancia determinar el tiempo de aparición de los callos.
13. Pesar los frascos cada semana para calcular la tasa de crecimiento del callo.
14. Observar y comparar los dos grupos de estudio (con y sin mioinositol y 2,4-D).
Reportar las diferencias encontradas y analizar los resultados obtenidos y la influencia
de los componentes en la formación del callo.
CUESTIONARIO
Con los datos obtenidos del peso de los frascos, realizar la curva de crecimiento del cultivo de
1. callos, en peso vs tiempo.
2. ¿Cuál es el papel, en general, del mioinositol en la fisiología de las plantas?
3. ¿Cuál es el papel, en general, 2,4-D en la fisiología de las plantas?
OBSERVACIONES
Notas:
REFERENCIAS
Bioingeniería FIM
24
BAJA CALIFORNIA
Bioingeniería
Cultivo de Tejidos
Práctica No.5 Citoquininas: reguladores de la

senescencia de las hojas.
MARCO TEÓRICO
Las Citoquininas forman el grupo de fitohormonas descubiertas más recientemente. Se
llegó a conocer esta clase de hormonas por estudios del crecimiento de células vegetales
como las del tallo del tabaco en condiciones estériles sobre medios nutritivos sintéticos,
donde se induce la división celular añadiendo al medio de cultivo extracto de malta o leche
de coco.
En 1964 se pudo determinar químicamente la primera citoquinina natural denominada
zeatina. Actualmente se conocen varios compuestos vegetales naturales, pertenecientes a
este grupo de hormonas, tales como la isopenteniladenina y la dihizeatina aparte de la
cinotina y la 6-bencilaminopurina sintéticas (Salisbury y Ross, 1994). Los efectos de estas
sustancias en las plantas son variados. Por ejemplo, el retraso de la senescencia de las
hojas.
Senescencia o envejecimiento es la fase de crecimiento vegetal que comprende de la plena
madurez a la muerte y se caracteriza por la acumulación de productos metabólicos y
pérdida de peso sobre todo de hojas y frutos. En las hojas la senescencia se pone de
manifiesto por el amarillamiento, construcción de RNA, proteínas y clorofila.
La 6-Bencilaminopurina es el regulador que más frecuentemente se aplica para retrasar
la senescencia vegetal. Su acción consiste en mantener un alto nivel de síntesis de proteína
retrasando la degradación de la clorofila y las proteínas, reduciendo el ritmo de
respiración y en general manteniendo el vigor de las células.
La clorofila es un pigmento verde existente en las plantas, algunas algas y bacterias que
permite llevar a cabo el proceso de fotosíntesis que es la conversión de energía luminosa
en energía química (Mathews et al., 2013).
Fue descubierta en 1817 por Caventou y Pelletier quienes lograron aislarla de las hojas de
las plantas. Existen diferentes tipos de clorofila, la A que se encuentra presente en la
mayoría de los vegetales y es la encargada de absorber la luz durante la fotosíntesis; la B
que se encuentra presente en los cloroplastos, se encarga de absorber la luz de otra
longitud y transfiere la energía a la clorofila A; la C está presente en los cloroplastos de
las algas pardas, las diatomeas y, por último, la D se halla únicamente en las algas rojas.
Para su extracción y cuantificación existen tres métodos el espectrofotométrico,
Bioingeniería FIM
25
fluorométrico y por cromatografía líquida.
COMPETENCIAS
● Observar el efecto de la 6-Bencilaminopurina (6-BA) sobre el envejecimiento de
hojas de apio.
● Determinar la concentración de clorofila en el tejido vegetal mediante un análisis
cuantitativo por espectrofotometría.
MATERIAL Y EQUIPO
Material Equipo
Vasos de precipitado. Espectrofotómetro.
Solución 6-BA (15 mg/L).
Gasas.
Hojas de cilantro frescas.
Acetona 80%.
Cajas petri.
Tubos de ensaye.
Probeta de 10 mL.
Mortero con pistilo.
Parte I. Aplicación de 6-Bencilaminopurina
1. Seleccionar del mazo de cilantro, 24 hojas de cilantro del mismo tamaño y apariencia
para lavar dentro de un vaso de precipitado con agua purificada.
2. Utilizando 3 cajas Petri para la prueba y 3 para la muestra testigo, colocar una base
de papel secante en el interior de la caja. Distribuir 4 ml de agua desionizada en el
papel.
3. Sumergir 12 hojas de cilantro en la solución de 6-BA (15mg/L) durante 5 minutos.
Sacarlas y sacudir el exceso de solución. Sumergir otras 12 hojas en agua destilada.
Estas servirán como testigos.
4. Colocar las hojas tratadas con 6-BA en las cajas Petri destinadas para la prueba y las
hojas sumergidas en agua destilada en sus cajas correspondientes. Se deben colocar
4 hojas por cada caja Petri.
5. Repetir el tratamiento cada dos días, siendo un total de 3 aplicaciones.
6. Después de 7 días o cuando se note diferencia marcada realizar las mediciones de
clorofila.
Parte II. Cuantificación de clorofila A, B y total mediante espectrofotometría

1. Pesar 0.1 g de las hojas tratadas con 6-BA y 0.1 g de las hojas testigo.
2. Moler en un mortero adicionando 10 mL de acetona al 80%. Procurar extraer todo
el pigmento de forma que los restos del tejido vegetal queden blanquecinos.
3. Filtrar en un embudo con una gasa. Recibiendo el extracto en la probeta.
Bioingeniería FIM
26
4. Completar con el resto de acetona 80% el volumen del extracto a 10 mL.

5. Hacer lecturas de absorbancia en el espectrofotómetro a 645 y 663 nm de longitud
de onda. Usar acetona 80% como blanco.
Nota: Realizar el paso 5 para las hojas tratadas con 6-BA y las hojas testigo.
Para la determinación de clorofila A, B y total se utilizarán las ecuaciones descritas por

Arnon (1949).
Donde:
● A663 = Absorbancia a 663
● A645= Absorbancia a 645
● V = Volumen final del extracto (10 mL)
● W = Peso fresco en gramos del tejido (0.1 g)
CUESTIONARIO
No aplica
OBSERVACIONES
Prueba realizada, Periodo total de exposición a la fitohormona: 1 semana.
Muestra a la cual se le
realizaron lavados con
6-BA por el periodo de
prueba
Muestra a la cual se le
realizaron lavados con
agua purificada por el
periodo de prueba
Figura 1.
Con sus resultados llene el siguiente cuadro:
Tabla 2. Cantidad de clorofila A, B y total en las hojas de apio tratadas con 6-BA.
Tratamiento Clorofila A Clorofila B Clorofilas totales
Testigo
6-BA (15 mg/L)
Bioingeniería FIM
27
Notas:
REFERENCIAS
[1] Salisbury, F.S. y C.W. Ross. (1994). Fisiología Vegetal. Gpo. Edil. Iberoamérica, México,
D.F.
[2] Mathews K.C, Van Holde K.E., Appling D.R.,Spencer J.A. (2013) Bioquímica. Editado
por Pearson Educación Madrid, pp. 678-679.
Bioingeniería FIM
28
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA
DE BAJA CALIFORNIA
Bioingeniería
Cultivo de Tejidos
Práctica No. 6 Conteo celular.
MARCO TEÓRICO
La cámara de Neubauer, es una gruesa placa de cristal con forma de portaobjetos, de unos
30 x 70 mm y unos 4 mm de grosor. En una cámara simple, la porción central, que es donde
se realiza el conteo, está dividida en 3 partes. La retícula completa mide 3 mm x 3 mm de
lado. Subdividida a su vez en 9 cuadrados de 1 mm de lado cada uno (Figura 1).
Figura 1. Detalle de la rejilla de una cámara de Neubauer.
El hemocitómetro inicialmente se utilizó para el recuento sanguíneo. En el caso del recuento

de sangre, los cuadrados de las esquinas son los destinados al recuento de leucocitos. Al
existir estos en menor número que los hematíes, se necesitan menos líneas de referencia
para realizar el conteo. Mientras, que el cuadrado central es el destinado al recuento de
hematíes y plaquetas. Se divide en 25 cuadrados medianos de 0,2 mm de lado, y cada uno
de estos cuadros se subdivide a su vez en 16 cuadrados pequeños (Figura 1).
Recuento celular en cámara de Neubauer

Es común el encontrarse con la necesidad de conocer el número de células presentes en un
volumen dado; por ejemplo, cuando se realizan cultivos celulares se precisa saber cuántas
células se encuentran en un momento con respecto al número de células que inicialmente se
sembraron. En tales casos se requiere de un instrumento que permita contar directamente,
Bioingeniería FIM
29
o bien, calcular la concentración celular en un medio. Una alternativa, es el contar

directamente el número de células presentes en un volumen conocido. Esto puede resultar
un gran trabajo considerando el tamaño de algunas células, sin embargo, la cámara de
Neubauer permite contar células de manera muy práctica.
Para realizar el recuento de las células existe una convención por la cual, si las células tocan
el límite superior o el límite izquierdo del cuadro, deben contabilizarse, pero no se
contabilizan si tocan el límite inferior o el límite derecho. En caso de que la concentración
celular sea muy alta, y sea fácil perderse en el recuento, se suele utilizar un orden de conteo
en forma de zigzag, como el descrito en la Figura 2 y 3.
Figura 2. Ejemplo de conteo de un cuadro Figura 3. Recuento con alta concentración

grande de cámara de Neubauer. celular.
COMPETENCIAS
● Reconocer el uso correcto de la cámara de Neubauer para el conteo celular.
● Familiarizar al estudiante con el uso y manipulación del microscopio.
● Analizar la importancia del conteo celular en los cultivos celulares.
MATERIAL Y EQUIPO
Tabla 1. Material y Equipo.
Material Equipo
Muestra celular a medir. Cámara de Neubauer.
Cubreobjetos. Microscopio óptico.
Pipeta / micropipeta con puntas.
Buffer para diluciones.
Azul de Metileno.
Preparación de la muestra
1. Pipetear 10 μL de las células Re-suspendidas previamente, y colocar en un vial de 2
ml.
Bioingeniería FIM
30
2. Posteriormente, adicionar 10 μL de azul de tripano, homogeneizar la mezcla

suavemente.
Conteo Celular
1. Colocar un cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer, colocar la cámara en posición
horizontal sobre la mesa.
2. Tomar 10 μL de la muestra preparada utilizando la micropipeta.
3. Colocar la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos, en el extremo de la cámara
de Neubauer.
4. Tratar de dejar que el líquido penetre entre la cámara y el cubreobjetos desde el
lateral, por capilaridad.
5. Colocar la cámara de Neubauer en la bandeja del microscopio.
6. Enfocar el microscopio hasta que pueden verse nítidas las células observando por el
binocular.
7. Buscar el primer cuadro donde vaya a realizarse el recuento. Realizar el recuento de
células en el primer cuadro.
8. Anotar la cantidad de células contadas en cada cuadro (4 o 5 cuadros grandes).
ANOTACIONES
Total de células viables:

Total de células no viables:
1) Porcentaje de células viables:
2) Promedio de células por cuadro:
3) Factor de dilución:
4) Concentración (células viables/ml):
FÓRMULAS
CUESTIONARIO
¿Qué tipos de células se pueden contar utilizando la cámara de Neubauer?
1. Con los datos obtenidos del peso de los frascos, realizar la curva de crecimiento del
cultivo de callos, en peso vs tiempo.
2. ¿De qué color se tiñen las células viables?
3. ¿Cuál es el fundamento de utilizar azul de tripano?
Bioingeniería FIM
31
¿Existe algún otro método para realizar el conteo celular? De ser así explica este
4.
o estos métodos.
REFERENCIAS
[1] Segretin M. (s.f). Los cultivos celulares y sus aplicaciones (cultivos de células animales).
Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología. Sitio web.
Recuperado de :
http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20I%20Euge.p
df
[2] Castro M. & Martinez E. (s.f). Desarrollo de las técnicas de cultivos celulares. Escuela
de Gestión Sanitaria. Sitio web. Recuperado de:
https://www.formacionegs.com/archivos/1325673989.pdf
Bioingeniería FIM
32
Anexo 1. La altura entre el portaobjetos y el cubreobjetos puede cambiar en función del

fabricante; por lo tanto, también puede variar el volumen de la muestra contenida en los
compartimientos de la cámara.
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Dra. Angélica López Izquierdo.

Práctica No.2 Cultivo in vitro de embriones de maíz. ............................................ 8

Práctica No.3 Encapsulado de semillas ................................................................. 18

Práctica No.4 Establecimiento de un cultivo de callo. .......................................... 21

Práctica No.5 Citoquininas: reguladores de la senescencia de las hojas. ............ 24

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL ....................................................................................................................25

Práctica No. 6 Conteo celular. ............................................................................... 28

Práctica No.1 Prueba de viabilidad de

La principal característica tomada en cuenta para la clasificación de los cereales es

Figura 1. Anatomía de la semilla de maíz.

La viabilidad de una semilla determina la posibilidad que esta tiene de germinar,

● Desarrollar una metodología para la detección de semillas aptas para la

Figura 3. Estándares de viabilidad.

[1] Servicio Nacional de Inspección y Certificación de Semillas.(2018).¿Cómo saber qué tan

Práctica No.2 Cultivo in vitro de embriones de

Los embriones de maíz se obtienen a partir de semillas maduras. Las semillas se

Se debe de utilizar medios de cultivo específicos que proporcionen los nutrientes

El cultivo in vitro de embriones de maíz también se utiliza para la propagación de plantas

Otro tipo de cultivo in vitro vegetal, es el rescate de embriones, el cual es un

Tabla 1. Material y equipo.

a) Preparación de medio de cultivo (cálculos).

Medio agua de coco (Tubos)

Medio agua de coco (Cajas Petri)

Medio base Tomate - Plátano (Cajas Petri)

-4.6 g. de agar bacteriológico.

Medio base Tomate (Cajas Petri)

Medio base Tomate - Zanahoria (Cajas Petri)

Medio base Piña (Cajas Petri)

b) Preparación Medio Base plátano. (Tubos)

c) Preparación Medio Base agua de coco (Tubos).

5. Homogeneizar el medio, distribuir en tubos de ensaye con 10 ml cada

d) Preparación Medio Base agua de coco (Cajas Petri).

di) Preparación Medio Base tomate plátano. (Cajas Petri)

6. Verter la mezcla en un matraz Erlenmeyer (usar agitador magnético),

dii) Preparación Medio Base Tomate (Cajas Petri).

8. Esperar a que la mezcla se haya homogeneizado completamente para

9. Retirar el agitador magnético del Matraz y proseguir con su proceso de

g) Preparación Medio Base Tomate Zanahoria (Cajas Petri).

h) Preparación Medio Base Piña (Cajas Petri).

Cultivo in vitro de embriones de maíz.

Desinfección de los explantes:

1. Separar los granos del maíz de la espiga.

Extracción del embrión:

1. Con ayuda de bisturí y pinzas romper un saco de granos de maíz.

Sembrado del embrión:

1. Incubar durante 14 días a una temperatura aproximada de 26°C.

Figura 3.- Representación esquemática del proceso de asepsia de los embriones.

Figura 4.- Preparación del material dentro de la cabina de bioseguridad.

Figura 5.- Inoculación del embrión de maíz.

Figura 6.- Imágenes representativas de la germinación del embrión de maíz.

Figura 7.- Imágenes representativas de la germinación del embrión de maíz.

Figura 8.- Plántula trasplantada en un maceta.

Práctica No.3 Encapsulado de semillas

El alginato de sodio, que es un polisacárido obtenido de algas marinas. Tiene

Figura 1. Semilla artificial de zanahoria: A) forma irregular, B) forma de lágrima y

2. Preparar 200 ml de CaCl2 H20 al 15 %.

3. Colocar las semillas, previamente lavadas y correctamente desinfectadas

4. Colocar la solución de CaCl2 en un vaso de precipitado. Con ayuda de una pipeta

5. Colocar el vaso de precipitado con las semillas/alginato en un agitador metálico

7. Almacenar las semillas en cajas Petri (previamente esterilizadas), sellarlas y

3. Explica por qué se gelifica el alginato al entrar en contacto con el CaCl2.

Figura 2. Embrión somático de Laelia anceps ssp. dawsonii, en estadio de