Marcadores moleculares

Los marcadores moleculares son proteínas y secuencias de DNA que se pueden relacionar
con un rasgo genético. Cuando varios marcadores moleculares se asocian inequívocamente
con un rasgo genético, se dice que forman un QTL (loci de rasgos cuantitativos o
cuantificables).
Los primeros marcadores desarrollados a finales de los 70 se basaron en la identificación de
proteínas e isoenzimas por electroforesis. La tecnología del DNA recombinante ha permitido
el desarrollo de los marcadores moleculares de DNA.
El número de técnicas descritas es muy numeroso. Se pueden diferenciar en 3 clases:
RFLP (Polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción).
MAAP (Múltiples perfiles arbitrarios de amplificación)
STS (Sitios etiquetados por la secuencia. Sequence target sites))

RFLP. Análisis de fragmentos de restricción por electroforesis. Para moléculas de DNA de

genomas como el mitocondrial pueden analizarse todos los pequeños fragmentos derivados
de la digestión con enzimas de restricción. Para moléculas de mayor tamaño, como las del
DNA nuclear se utiliza la técnica de Southern Blot, hibridando los fragmentos de restricción
con sondas específicas, generalmente marcadas con isótopos radiactivos, que suelen
corresponder a secuencias conocidas. Esta técnica sólo permite reconocer un tipo de
polimorfismo en cada análisis, pero el resultado es muy preciso. Cuando se emplea la técnica
de PCR para el análisis de los fragmentos en lugar de sondas radiactivas, se denomina PCR-
RFLP.
Los primeros mapas físicos de los genes se basaban en esta técnica.

MAAP. Se incluyen técnicas que emplean oligonucleótidos arbitrarios para generar huellas
dactilares complejas. Entre ellas están:
 RAPD (DNA polimórfico amplificado al azar): Se amplifican secuencias de DNA por
PCR utilizando una colección de oligonucleótidos (de unos 10 residuos) que hibridan a
baja temperatura en múltiples secuencias distribuídas al azar por el genoma. Los
fragmentos resultantes se analizan por electroforesis, obteniéndose un perfil más o
menos específico para cada individuo. Como ventaja, diremos que esta técnica
requiere poca cantidad de DNA y no es preciso que esté muy purificado. Como
inconvenientes está la relativamente baja utilidad para el mapeo de genes ya que
muchas son secuencias repetidas no relacionadas con genes y que no es
cuantificable, no da información sobre el número de copias de la secuencia en el DNA.
 AP-PCR (PCR con oligonucleótidos arbitrarios): Es semejante a la anterior aunque en
este caso los oligonucleótidos han de ser largos ( 20 nucleótidos), y la PCR se hace
en dos ciclos de baja especificidad que permiten la síntesis de una batería de
fragmentos característicos de cada variedad. Esta fase va seguida de ciclos de alta
especificidad en la hibridación para amplificar las bandas anteriores. Los fragmentos
amplificados se pueden analizar por electroforesis. Existe una variación denominada
DAF (Huellas dactilares por amplificación de DNA) que utiliza oligonucleótidos de 5 a
15 bases, pero las huellas proporcionadas suelen ser muy complejas y difíciles de
interpretar.
 AFLP (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados): En esta técnica se
digiere el DNA con dos enzimas de restricción, una de corte muy frecuente y otra de
corte poco frecuente. A estoa fragmentos se les añaden unos oligonucleótidos que
sirven para amplificar el fragmento por PCR. De esta forma se obtienen marcadores
moleculares muy específicos sin necesidad de conocer la secuencia. Una ventaja de
esta técnica es la posibilidad de obtener numerosos marcadores moleculares en una
sola reacción.

STS o SSLP (Polimorfismo de longitud en las secuencias discretas) Consiste en la

amplificación, por PCR, de secuencias únicas y conocidas. El polimorfismo es más
habitual cuando se amplifican intrones en vez de exones. Una ventaja es la rapidez de los
análisis, y otra su especificidad.
De esta técnica derivan otras muchas, descritas a finales de los años 80 y principios de los
90, en las que se introducen pequeñas modificaciones, sobre todo en el tipo de oligos y la
forma de obtenerlos. Algunas de esas técnicas son:
 SSR (Repetición de secuencias discretas). Analiza microsatélites, que se pueden usar
como marcadores moleculares. Se utiliza por ejemplo en el análisis de poblaciones,
para determinar árboles filogenéticos.
 EST (Sitios etiquetados de expresión, expressed target sites). Se usan
oligonucleótidos cuya secuencia se ha deducido a partir de cDNA secuenciado, total o
parcialmente. Los fragmentos amplificados han de digerirse con enzimas de
restricción. Es una técnica laboriosa y costosa.
 CAPS (Secuencia polimórfica amplificada y cortada). Los fragmentos amplificados se
someten a una digestión con enzimas de restricción y se someten a electroforesis. Las
variaciones se detectan por presencia o ausencia de sitios de restricción.
 SCAR (Regiones amplificadas caracterizadas y secuenciadas). Utiliza fragmentos de
RAPD, que se clonan y se secuencian para obtener oligos específicos. Es un método
rápido, pero el grado de polimorfismo observado es pequeño.
 D/TGGE (Geles de electroforesis en gradiente desnaturalizante/térmico). Analiza el
polimorfismo del DNA amplificado en función de su estabilidad bajo distintas
condiciones (desnaturalizantes, diferentes temperaturas,…). Un gran inconveniente es
poder mantener esas condiciones experimentales.
 SSCP (Polimorfismo de conformaciones cadena simple). Las distintas conformaciones
del DNA monocatenario se detectan en el comportamiento en cuanto a la movilidad en
un PAGE no desnaturalizante. Es útil cuando las reacciones de PCR producen
bandas de DNA de gran tamaño o cuando varias bandas tienen un tamaño muy
próximo. Puede llegar a discriminar diferencias mínimas en secuencias de más de 1
kb.