BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC TẾ HỒNG BÀNG

Chuyên đề:

ỨNG DỤNG
KỸ THUẬT PHÂN TỬ
TRONG ĐỊNH LƯỢNG VI
SINH VẬT

GVHD: TS. Nguyễn Tuấn Anh

PGS.TS. Nguyễn Thị Nga
Học viên: Hồ Cao Quốc Thịnh – 2326080032
Nguyễn Đoàn Tường Uyên - 2326080046
Học phần: Thực hành Y sinh học di truyền

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2024

 MỤC LỤC
I. TỔNG QUAN ....................................................................................................3
1. Định nghĩa vi sinh vật: ..................................................................................3
2. Kỹ thuật PCR và Real-time PCR: ...............................................................10
3. Ý nghĩa ứng dụng kỹ thuật phân tử trong định lượng vi sinh vật:..............20
II. BỆNH LÝ COVID–19 ...................................................................................22
1. Mức độ lan truyền của COVID-19: ............................................................22
2. Triệu chứng của COVID-19: ......................................................................23
3. Cơ chế sinh bệnh: ........................................................................................24
4. Phương pháp định lượng virus Sar CoV-2: ................................................25
III. VIÊM GAN SIÊU VI B ................................................................................34
1. Phân loại viêm gan siêu vi B:......................................................................35
2. Triệu chứng của bệnh viêm gan B: .............................................................36
3. Các đường lây nhiễm của bệnh Viêm gan siêu vi B: ..................................37
4. Cấu trúc Virus Viêm gan B: ........................................................................38
5. Cơ chế gây bệnh: .........................................................................................39
6. Một số chỉ số trong xét nghiệm quan trọng trong viêm gan siêu vi B: ......40
7. Phương pháp định lượng Hepatitis B virus (HBV): ...................................40
III. VIÊM GAN SIÊU VI C ................................................................................46
1. Tổng quan: ..................................................................................................46
2. Khả năng gây bệnh:.....................................................................................48
3. Dịch tễ học Viêm Gan C: ............................................................................48
4. Đường lây truyền: .......................................................................................49
5. Một số xét nghiệm quan trọng trong viêm gan siêu vi C: ..........................50
7. Phương pháp định lượng Hepatitis C virus (HCV): ...................................51

2
 TỔNG QUAN
1. Định nghĩa vi sinh vật:
Theo GS.TS. Lê Huy Chính1 định nghĩa vi sinh vật là những vi sinh vật nhỏ bé
chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi - đó là những sinh vật đơn bào (protist), bao
gồm: vi khuẩn, động vật nguyên sinh và vi nấm (bacteria, protozoa, fungi).
Vi khuẩn là những đơn bào không có màng nhân (procaryote) và cùng với virus
hợp thành môn Vi sinh vật học, tiếng Anh gọi là Microbiology. Vi khuẩn có đầy đủ
các đặc điểm của một sinh vật, nhưng virus thì không hoàn toàn.
Virus không có cấu trúc tế bào (dưới tế bào), genome chỉ chứa một trong hai loại
acid nucleic, ký sinh bắt buộc trong tế bào cảm thụ, sinh sản theo cấp số nhân và di
truyền được nòi giống; kích thước rất bé (từ 10 nm đến 300 nm) và chỉ nhìn được
dưới kính hiển vi điện tử, vị trí phân loại của virus chưa rõ ràng, chúng được nghiên
cứu trong môn Vi sinh vật học.
Prion, một loại mầm bệnh mới đơn giản hơn virus (Virus-like agents: Prions).
Vào những năm 90 của thế kỷ XX, một tác nhân gây bệnh mới đã được phát hiện là
prion. Prion là những protein không bình thường, nó để khăng cao với nhiệt độ và
phần lớn các hóa chất sát trùng.
Rickettsia, Chlamydia và Mycoplasma là những vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc
(trước đây xếp loại chúng vào nhóm vi sinh vật trung gian giữa vi khuẩn và virus).
Rickettsia là những vi sinh vật bé hơn vi khuẩn nhưng lớn hơn virus. Chúng cũng ký
sinh nội bào bắt buộc như virus, nhưng chúng có nhiều đặc điểm của vi khuẩn hơn
(có cấu trúc tế bào, có hai loại acid nucleic, nhưng thiếu một số enzym hô hấp năng
lượng), có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học (kích thước trung bình 0, 25 x1
𝜇𝑚). Chlamydia có những đặc điểm như Rickettsia nhưng bé hơn (khoảng 150 nm),
là một tác nhân gây bệnh quan trọng (mắt hột và nhiễm trùng đường sinh dục tiết
niệu). Mycoplasma chỉ khác Rickettsia là không có vách, nên cùng được xếp vào các
vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc.
1.1. Vi khuẩn:
Vi khuẩn là những sinh vật nhân sơ đơn bào có kích thước cực kỳ nhỏ (0,2 – 10
𝜇𝑚) , một số chúng còn thuộc loại ký sinh trùng. Có bộ khung tế bào và các bào
quan như ty thể và lục lạp. Là nhóm hiện diện đông đảo nhất trong sinh giới. Vi

1
Theo Sách Vi sinh vật Y học _ Chủ biên GS.TS. Lê Huy Chính _ Nhà xuất bản Y học
3
khuẩn có mặt ở khắp mọi nơi, trong đất, nước, chất thải phóng xạ và cả bên trong
những sinh vật khác.
Vi khuẩn là những vi sinh vật có chuỗi ADN xoắn kép (ngoại trừ Mycoplasma)
và vách tế bào. Hầu hết vi khuẩn sống ngoại bào, nhưng một số lại ưu tiên cư trú và
nhân lên trong nội bào. Các mầm bệnh nội bào bắt buộc chỉ có thể phát triển, sinh
sản và gây bệnh trong các tế bào của vật chủ. Ví dụ về các mầm bệnh này bao gồm
Chlamydia, các loài Chlamydophila và Rickettsia. Các mầm bệnh nội bào nuôi cấy
có thể sống và sinh sản bên trong hoặc bên ngoài tế bào vật chủ. Ví dụ về các mầm
bệnh này bao gồm Salmonella typhi, loài Brucella, Francisella tularensis, N.
gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Legionella và loài Listeria, Mycobacterium
tuberculosis.
Nhiều vi khuẩn hiện diện ở người dưới dạng hệ vi sinh vật bình thường, thường
có số lượng lớn và ở nhiều khu vực (ví dụ, trong đường tiêu hóa và da). Chỉ có một
vài loài vi khuẩn là mầm bệnh của con người.
a) Cấu tạo của vi khuẩn:

Vách tế bào
Tạo nên hình dạng của vi khuẩn và nằm bên ngoài màng sinh chất, được làm bằng
polymer gọi là peptidoglycan. Sự hiện diện của thành tế bào ở vi khuẩn được phát
hiện bằng hiện tượng ly tương, bằng cách nhuộm và bằng phân lập trực tiếp.
4
 Thành tế bào vi khuẩn gram dương: Thành phần chủ yếu là mucopeptit gọi là
murein, một chất trùng hợp mà những đơn vị hoá học là những đường amin. N-acetyl
glucosamin và axit N-acetyl muramic và những chuỗi peptit ngắn chứa alanin, axít
glutamic và axit diaminopimelic hoặc lysin. Ngoài ra vách tế bào của một số vi
khuẩn gram dương còn chứa axit teichoic. Ở một vài loại vi khuẩn, axit teichoic
chiếm tới 30% trọng lượng khô của vách tế bào.
Thành tế bào vi khuẩn Gram âm: Lớp mucopeptit mỏng hơn và hai lớp lipoprotein
và lipopolysaccharide ở bên ngoài, lớp lipoprotein chứa tất cả những axit amin thông
thường. Không có axit teichoic, thành tế bào vi khuẩn gram âm chứa một lượng lipit
đáng kể, khoảng 20% trọng lượng khô của vách tế bào.
Chức năng của thành tế bào là duy trì hình dáng của vi khuẩn, quyết định tính bắt
màu Gram của vi khuẩn (do tính thẩm thấu khác nhau của vi khuẩn Gram âm và
Gram dương). Tạo nên kháng nguyên thân O của vi khuẩn đường ruột: Để điều chế
kháng nguyên 0 của vi khuẩn đường ruột xử lý vi khuẩn không di động bằng nhiệt
và cồn. Tạo nên nội độc tố của vi khuẩn đường ruột. Nội độc tố chỉ được giải tỏa lúc
vi khuẩn bị ly giải. Ở vi khuẩn đường ruột, nội độc tố là những phức hợp lipopoly-
saccarit dẫn xuất từ vách tế bào.
Vỏ bao
Là một cấu trúc nhầy bọc quanh vách tế bào của một số vi khuẩn, thường là
polysaccharide, chỉ có vỏ của B.anthracis là một polypeptide acid D-glutamic. Vỏ
có thể phát hiện dễ dàng ở huyền dịch mực tàu, ở đó nó hiện ra như một vùng sáng
giữa môi trường mờ đục và tế bào vi khuẩn trông rõ hơn.
Cũng có thể phát hiện bằng phản ứng phình vỏ hoặc bằng kỹ thuật nhuộm đặc
biệt. Sự đột biến tạo thành vỏ rất dễ nhận biết vì tế bào có vỏ tạo nên khuẩn lạc bóng
láng hoặc nhầy M trong khi tế bào không vỏ tạo nên khuẩn lạc xù xì R. Nhiệm vụ
duy nhất được biết của vỏ là bảo vệ vi khuẩn chống thực bào và chống virus muốn
gắn vào vách tế bào.
Màng tế bào chất (màng nguyên tương)
Là màng bán thấm dày khoảng 10 nm nằm sát vách tế bào. Người ta có thể chứng
minh sự hiện diện của nó bằng hiện tượng ly tương hoặc nhuộm với xanh Victoria
4R. Nó chứa 60 – 70% lipit, 20 – 30% protein và một lượng nhỏ hydrat cacbon.

5
 Màng nguyên tương có chức năng rào cản thẩm thấu của tế bào, ngăn cản không
cho nhiều phẩm vật vào bên trong tế bào nhưng lại xúc tác việc chuyên chở hoạt
động của nhiều phẩm vật khác vào bên trong tế bào.
Hơn nữa màng tế bào chứa nhiều hệ thống enzyme và vì vậy có chức năng giống
như ti lạp thể của động vật và thực vật. Màng nguyên tương cho thấy những chỗ lõm
vào gọi là mạc thể. Ở vi khuẩn Gram dương mạc thể khá phát triển cho thấy hình
ảnh nhiều lá đồng tâm. Ở vi khuẩn Gram âm mạc thể chỉ là vết nhăn đơn giản.
Tế bào chất (nguyên tương)
Là cấu trúc được bao bọc bên ngoài bởi màng nguyên tương, ở trạng thái gel, cấu
trúc này gồm 80% nước, các protein có tính chất enzyme, cacbohydrat, lipid và các
ion vô cơ ở nồng độ cao, và các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp. Nguyên tương
chứa dày đặc những hạt hình cầu đường kính 18 nm gọi là ribosome. Ngoài ra còn
có thể tìm thấy những hạt dự trữ glycogen, granulosa hoặc polymetaphotphat.
Ribosome
Là nơi tạo ra hoặc tổng hợp protein, được tạo thành từ các hạt giàu RNA.
Thể nhân
Có thể thấy với kính hiển vi ánh sáng sau khi nhuộm hoặc soi trực tiếp ở kính
hiển vi pha tương phản. Nhân có thể hình cầu, hình que, hình quả tạ hoặc hình chữ
V. Khảo sát ở kính hiển vi điện tử nhân không có màng nhân và bộ máy phân bào.
Nó là một sợi DNA trọng lượng phân tử 3×109 dallon và chứa một nhiễm sắc thể
duy nhất dài khoảng 1mm nếu không xoắn.
Nhân nối liền ở một đầu với thể mạc. Sự nối liền này giữ một vai trò chủ yếu
trong sự tách rời 2 nhiễm sắc thể con sau khi sợi nhiễm sắc thể mẹ tách đôi. Trong
sự phân chia nhân hai mạc thể qua chổ nối liền với màng nguyên tương di chuyển
theo những hướng đối nghịch theo hai nhóm con nối liền với chúng. Như thế màng
nguyên tương tự động như một bộ máy thô sơ của sự gián phân với mạc thể đảm
nhận vai trò thai vô sắc.
Tiêu mao, nhung mao
Chịu trách nhiệm về tính di động của vi khuẩn. Người ta quan sát sự di động của
vi khuẩn dưới kính hiển vi đặt một giọt huyền dịch vi khuẩn ở lam kính và phủ một
lá kính mỏng. Lông dài 3 – 12 mm hình sợi gợn sóng, mảnh 10 – 20 nm) nên phải
nhuộm với axit tannic để tạo thành một lớp kết tủa làm dày lông dễ phát hiện. Lông
phát xuất từ thể đáy ngay bên dưới màng nguyên tương và có chuyển động xoay tròn.

6
 Bản chất protein nó tạo nên do sự tập hợp những đơn vị phụ gọi là flagellin tạo
thành một cấu trúc hình trụ rỗng. Cách thức mọc lông là một đặc tính di truyền. Ở
một số loại nhiều lông mọc quanh thân, ở một số loại một lông mọc ở cực và ở một
số loại khác một chùm lông ở một cực. Nếu lông bị làm mất đi bằng cơ học thì lông
mới được tạo thành nhanh chóng. Lông đóng vai trò kháng nguyên như kháng
nguyên H ở vi khuẩn đường ruột.
Pili
Là những phụ bộ hình sợi, mềm mại hơn lông, mảnh hơn nhiều và có xu hướng
thẳng đường kính 2 – 3nm và dài từ 0,3 – 1nm, tìm thấy từ một đến hàng trăm ở mặt
ngoài vi khuẩn, bản chất protein.
Pili phát xuất ở trong màng nguyên tương và xuyên qua vách tế bào. Pili được
tìm thấy ở vi khuẩn gram âm nhưng cũng có thể tìm thấy ở một số vi khuẩn gram
dương. Pili F có nhiệm vụ trong sự tiếp hợp. Những pili khác giúp cho vi khuẩn bám
vào niêm mạc hoặc bề mặt khác của tế bào.
Nha bào
Những thành viên của Bacillus, Clostridium và Sporosarcina tạo thành nội nha
bào dưới ảnh hưởng của môi trường bên ngoài không thuận lợi, mỗi tế bào làm phát
sinh một nha bào. Nha bào có thể nằm ở giữa, ở đầu nút hoặc gần đầu nút tùy theo
loài, vách nha bào chứa những thành phần mucopeptide và axit dipicolinic. Sự đề
kháng của nha bào với hóa chất độc là do tính không thẩm thấu của vách nha bào,
sự đề kháng với nhiệt liên hệ đến trạng thái mất nước cao.
Vì chịu đựng với điều kiện không thuận lợi bên ngoài nha bào góp phần quan
trọng trong khả năng lây bệnh của trực khuẩn hiếu khí tạo nha bào như trực khuẩn
than hoặc trực khuẩn kỵ khí tạo nha bào như Clostridia, nhất là trực khuẩn uốn ván,
hoại thư, sinh hơi, ngộ độc thịt.2
b) Các loại vi khuẩn ngày nay
Có vô số các loại vi khuẩn khác nhau. Cách phân loại vi khuẩn là theo hình dạng
của chúng như hình cầu, hình que, hình xoắn, hình dấu phẩy (phẩy khuẩn) hay hình
sợi...
Cầu khuẩn là những vi khuẩn có hình cầu nhưng cũng có thể là hình bầu dục hoặc
hình ngọn nến, cầu khuẩn còn có cách gọi khác là cocci, có đường kính trung bình

2
Vi khuẩn là gì? Cấu tạo, môi trường sinh sống thế nào? Lợi hay hại? – BV Đa khoa Tâm Anh
7
khoảng 1 μm. Cầu khuẩn được chia thành: Song cầu, liên cầu khuẩn, tụ cầu, trực
khuẩn và xoắn khuẩn.
Trực khuẩn: Đây là tên chung của những vi khuẩn có hình que. Có kích thước
của từ 0,5 - 1 - 4μm.
Xoắn khuẩn: Tên gọi của những vi khuẩn có từ hai vòng xoắn trở lên, kích thước
thay đổi 0,5 - 3 - 5 - 40μm. Xoắn khuẩn phần lớn thuộc loại hoại sinh, rất ít có khả
năng gây bệnh.
1.2. Virus:
Virus là một đơn vị sinh học nhỏ bé (kích thước từ 20 - 300 nm), có khả năng
biểu hiện những tính chất cơ bản của sự sống: gây nhiễm cho tế bào, duy trì được
nòi giống qua các thế hệ mà vẫn giữ tính ổn định về mọi đặc điểm sinh học của nó
trong tế bào cảm thụ thích hợp.
Đặc điểm cơ bản nhất để phân biệt virus với vi khuẩn là virus chỉ chứa một trong
hai loại acid nucleic (ADN hoặc ARN), virus sinh sản tăng lên theo cấp số nhân, còn
vi khuẩn sinh sản theo kiểu phân đôi.
a) Cấu trúc của virus:
Virus có cấu trúc rất đơn giản,
không có enzym hô hấp và
enzym chuyển hóa, vì vậy virus
bắt buộc phải ký sinh trong tế
bào cảm thụ.
Virus có nhiều hình thể khác
nhau: hình cầu, hình khối, hình
sợi, hình que, hình chùy, hình
khối phức tạp. Hình thể mỗi loại
rất khác nhau nhưng luôn ổn định
đối với từng loại. Tùy theo cách
sắp xếp của acid nucleic và
capsid chia làm hai loại đối
xứng:
Đối xứng hình xoắn ốc: acid
nucleic và các capsomer được
sắp xếp dọc theo hình lò xo đều hay không đều.

8
 Đối xứng hình khối: khi các capsomer được sắp xếp thành các hình khối cầu đa
diện.
Một số loài có thể sắp xếp đối xứng khối và đối xứng xoắn trên từng phần. Cách
đối xứng này là đối xứng phức tạp.
Cấu trúc cơ bản còn được gọi là cấu trúc chung. Cấu trúc cơ bản bao gồm hai
thành phần chính mà mỗi virus đều phải có:
Acid nucleic (AN):
Mỗi loại virus đều phải có một trong hai acid nucleic: ARN (acid ribonucleic)
hoặc ADN (acid deoxyribonucleic). Những loại có cấu trúc ADN phần lớn đều mang
ADN sợi kép. Ngược lại, loại mang ARN thì chủ yếu ở dạng sợi đơn.
Các acid nucleic (AN) chỉ chiếm từ 1% tới 2% trọng lượng của hạt virus nhưng
có chức năng đặc biệt quan trọng:
AN mang mọi mật mã di truyền đặc trưng cho từng loài.
AN quyết định khả năng gây nhiễm trùng trong tế bào cảm thụ.
AN quyết định chu kỳ nhân lên trong tế bào cảm thụ.
AN mang tính bán kháng nguyên đặc hiệu.
Thành phần capsid:
Capsid là cấu trúc bao quanh acid nucleic. Bản chất hóa học của capsid là protein.
Capsid được tạo bởi nhiều đơn vị capsid bao gồm các phân tử protein có sắp xếp đặc
trưng cho từng loài. Các đơn vị capsid đó được gọi là các capsomer.
Cùng với phần “lõi” AN, phần “vỏ” capsid của virus có thể sắp xếp đối xứng
xoắn, đối xứng khối hoặc đối xứng phức hợp. Cấu trúc capsid có chức năng quan
trọng:
Bao quanh AN để bảo vệ không cho enzym nuclease và các yếu tố phá hủy AN
khác.
Protein capsid tham gia vào sự bám vào những vị trí đặc hiệu của tế bào cảm thụ
(với các loại không có bao envelop).
Protein capsid mang tính kháng nguyên đặc hiệu. Capsid giữ cho hình thái và
kích thước luôn được ổn định.
b) Cấu trúc riêng:
Cấu trúc riêng còn được gọi là cấu trúc đặc biệt, chỉ có ở một số loài nhất định để
thực hiện những chức năng đặc trưng cho loại đó.
Cấu trúc bao ngoài (envelop):

9
 Một số loài bên ngoài lớp capsid còn bao phủ một lớp bao ngoài, được gọi là
envelop.
Bản chất hóa học của envelop là một phức hợp: protein, lipid, carbohydrate, nói
chung là lipoprotein hoặc glycoprotein. Nếu chỉ có màng thì đó là lớp dilipid. Nếu
có thêm gai nhú (spike) thì đó là glycoprotein.
Trên bao ngoài của một số loài có những núm lồi lên, mang những chức năng
riêng biệt.
Chức năng riêng của envelop: Tham gia vào sự bám trên các vị trí thích hợp của
tế bào cảm thụ. Ví dụ: gpl20 của HIV hoặc hemagglutinin cúm. Tham gia vào giai
đoạn lắp ráp và giải phóng virus ra khỏi tế bào sau chu kỳ nhân lên.
Envelop tham gia vào hình thành tính ổn định kích thưốc và hình thái. Tạo nên
các kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt virus. Một số kháng nguyên này có khả năng
thay đổi cấu trúc.
Enzyme:
Trong thành phần cấu trúc có một số enzym, đó là những enzym cấu trúc, chúng
gắn với cấu trúc của hạt virus hoàn chỉnh. Các enzym cấu trúc có thể gặp:
Neuraminidase, ADN hoặc ARN polymerase, men sao chép ngược (Reverse
transcriptase). Mỗi enzym cấu trúc có những chức năng riêng trong chu kỳ nhân lên
trong tế bào cảm thụ và chúng cũng mang tính kháng nguyên riêng, đặc hiệu ở mỗi
loài.
2. Kỹ thuật PCR và Real-time PCR:
2.1. Kỹ thuật PCR:
Cụm từ PCR được viết tắt từ Polymerase Chain Reaction nghĩa là chuỗi phản ứng
polymerase hay phản ứng khuếch đại gene. Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn
DNA với tốc độ nhanh, có độ chính xác cao, không cần sự hiện diện của tế bào.
PCR là một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA hoặc sản xuất
và nhân bản nhiều mẫu DNA giống nhau theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến
hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó từ một mẫu nhỏ ban đầu hoặc là
một bản sao duy nhất.
Nó được sử dụng trong giai đoạn đầu của quá trình xử lý DNA để giải trình tự.
PCR giúp phát hiện sự hiện diện hay vắng mặt của một gen để xác định các tác nhân
gây bệnh trong quá trình nhiễm trùng và khi tạo ra các cấu hình DNA pháp y từ các
mẫu DNA nhỏ.

10
 a) Phản ứng PCR gồm 3 bước chủ đạo:

Biến tính (Denature

DNA): DNA mạch đôi
tách thành mạch đơn (94
– 96°C)
Bắt cặp (Anneal
primer): Nhiệt độ hạ
xuống (50 – 65°C) các
primer bám vào phân tử
DNA, bản chất của
primer là những đoạn
DNA mạch đơn có chiều
dài từ 15-30 nucleotide.
Kéo dài (Extend
primer): Nhiệt độ tối ưu để enzyme tổng hợp DNA mạch mới hoạt động (70 – 72°C)
– Giai đoạn tối ưu để tổng hợp DNA mạch mới hoạt động.
b) Nguyên tắc cơ bản
Dựa trên sự hoạt động của emzyme
Sự hiện diện của mồi chuyên biệt
Khả năng nối dài mồi của taq polymerase
Các nu tự do trong môi trường

11
 c) Thành phần cơ bản trong phản ứng PCR:

1. Polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase), enzyme này có nhiệt độ hoạt động
tối ưu ở 72°C.
2. 4 loại nucleotide (dNTP) gồm: dATP/dTTP/dGTP/dCTP là nguyên liệu để
tổng hợp ra các bản sao DNA.
3. DNA chứa trình tự mục tiêu (Template): Thông thường trong xét nghiệm thì
đây là DNA thu nhận từ mẫu cần xét nghiệm.
4. Cặp mồi đặc hiệu (Primer): Đây là các đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 20
nucleotide và bắt cặp bổ sung đặc hiệu cho 2 đầu trình tự mục tiêu cần nhân
bản.
5. Cation 𝑀𝑔2+ (𝑀𝑔𝐶𝑙2 ) đây là co-factor quan trọng để Taq polymerase hoạt
động hiệu quả.
6. Dung dịch đệm Tris-KCI (PCR Buffer): Cung cấp môi trường thuận lợi cho
phản ứng nhân bản diễn ra.
d) Nguyên tắc hoạt động PCR:
Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:

12
 Giai đoạn biến tính: Nhiệt
độ sẽ được đưa lên 94 – 96°C,
từ 2 – 5 phút các liên kết
hydro sẽ bị phá vỡ khiến
DNA bị biến tính trở thành
dạng mạch đơn.
Giai đoạn bắt cặp (hoặc
giai đoạn gắn mồi): Nhiệt độ
được hạ xuống 50 – 65°C, 20
giây – 2 phút, các đoạn mồi sẽ
bắt cặp bổ sung vào 2 đầu
trình tự mục tiêu.
Giai đoạn kéo dài: Nhiệt
độ được đưa lên 68 – 72°C,
20 giây – 5 phút, Taq
polymerase sẽ sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung.

Giai đoạn biến tính:

Trong giai đoạn này, dung dịch chứa DNA mẫu và tất cả các thành phần cốt lõi
khác được đun nóng đến 94 – 95°C.
13
 Đối với những enzyme DNA polymerase bắt buộc phải kích hoạt bằng nhiệt độ.
Nhiệt độ cao gây ra liên kết hydro giữa các bazơ trong hai dải DNA mẫu để phá
vỡ và hai sợi tách rời. Điều này dẫn đến hai chuỗi DNA đơn lẻ, sẽ hoạt động như
các khuôn mẫu để tạo ra các chuỗi DNA mới.
Điều quan trọng là nhiệt độ được duy trì ở giai đoạn này đủ lâu để đảm bảo rằng
các sợi DNA đã tách hoàn toàn.
Điều này thường mất từ 15 – 30 giây.
Giai đoạn bắt cặp:
Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50 – 65°C trong 20 – 40 giây để mồi gắn vào
sợi DNA đơn.
Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mỗi bắt cặp với sợi DNA, nhưng cũng
đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là mồi chỉ nên gắn hoàn toàn với phần
trình tự bổ sung trên mạch khuôn.
Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gần không đặc hiệu.
Nếu quá cao, mồi có thể không gắn được.
Thông thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn 3 – 5°C so với Tm của mồi dùng
trong phản ứng. Polymerase liên kết với các phân tử lai DNA mồi – khuôn và bắt
đầu tổng hợp DNA.
Các đoạn mồi được thiết kế để bổ sung theo thứ tự các đoạn ngắn của DNA trên
mỗi đầu của chuỗi được sao chép.
Đoạn mới được xem là tác nhân đầu tiên trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme
polymerase chi có thể thêm các base DNA vào một chuỗi DNA kép. Chỉ một khi
đoạn mỗi được kể nói thì enzyme polymerase có thể gắn và bắt đầu tạo ra chuỗi
DNA bổ sung mới từ các cơ sở DNA có liên kết rời rạc lúc đầu.
Hai dải DNA tách rời được bổ sung và chạy theo các hướng ngược.
Bước này thường mất khoảng 10 – 30 giây.
Giai đoạn mở rộng:
Trong bước cuối cùng này, nhiệt được tăng lên 72°C để cho phép DNA mới được
tạo ra bởi một enzyme enzyme Taq DNA polymerase đặc biệt bổ sung thêm các base
DNA.
Các chuỗi ADN mới được tạo ra bằng cách sử dụng các sợi gốc làm mẫu. Một
enzyme DNA polymerase kết hợp các nucleotide DNA tự do với nhau. Enzyme này

14
thường là Taq polymerase, một enzyme ban đầu được phân lập từ một vi khuẩn ưa
nhiệt gọi là Thermus aquaticus.
Thứ tự mà trong đó các nucleotide tự do được thêm vào được xác định bởi trình
tự nucleotide trong sợi DNA gốc (mẫu).
Kết quả của một chu kỳ PCR là hai chuỗi chuỗi DNA mục tiêu, mỗi chuỗi chứa
một sợi mới được tạo ra và một sợi ban đầu.
Chu trình nhiệt của 1 quy trình PCR:
Như vậy, cứ qua một
chu kỳ nhiệt, số mạch
DNA sẽ được nhân đôi.
Nếu chu kỳ nhiệt lặp lại
liên tục 30 – 40 lần thì số
bản sao sẽ là 230 ~ 240
bản sao.
Số lượng bản sao DNA
khổng lồ này khi được
gắn các phân tử phát tín
hiệu (ví dụ Ethidium
Bromide) có thể nhìn thấy
bằng mắt thường trên gel
điện di dưới ánh đèn UV.

e) Phát hiện sản phẩm PCR:

Điện di trên gel agarose
Phân loại DNA dựa vào kích thước
1. Trong điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương, đoạn DNA
có kích thước ngắn di chuyển nhanh hơn so với đoạn có kích thước lớn.
2. Trong khi điện di, ethidium bromide sẽ đan xen vào cấu trúc sợi đôi DNA và
làm sợi đôi DNA phát sáng khi quan sát dưới đèn UV.
f) Ứng dụng:
Phát hiện các tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus (viêm gan
B, viêm gan C, Dengue, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1...), các
vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum...).

15
 Phát hiện các vi khuẩn gây bệnh đường tình dục (Neisseria gonorrhoeae,
Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum...).
Phát hiện các tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị
điều trị kháng sinh trước đó (ví dụ: Lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ mất
đầu...)
Phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc như Staphylococcus aureus – MRSA,
các vi khuẩn sinh ESBL hoặc betalactamase, carbapenemase...)
Xác định độc tố của vi sinh vật: Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt
của Escherichia coli.
Trong công nghệ sinh học, xét nghiệm sinh học phân tử được sử dụng trong việc
lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN...
Phát hiện virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết.
Phát hiện mầm mống của bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát
hiện gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRCA1 - BRCA2 trong ung thư vú, gen
TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-
1,2 trong u xơ thần kinh, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin...)
Nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte
antigen)...
g) Ưu điểm:
Xét nghiệm PCR có nhiều ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với xét nghiệm thông
thường khác như:
Cho kết quả xét nghiệm nhanh, không quá 5 giờ kể từ khi bắt đầu làm xét nghiệm.
Độ đặc hiệu rất cao.
Phát hiện được nhiều tác nhân vi sinh vật gây bệnh mà phòng thí nghiệm hóa,
sinh hay miễn dịch truyền thống không phát hiện được.
Cho kết quả định lượng số copies virus, hỗ trợ bác sĩ điều trị đánh giá giai đoạn,
hiệu quả điều trị, và tiên lượng bệnh.
Phát hiện các đột biến gene gây ung thư, và các bệnh di truyền khác...nhằm có
biện pháp phòng ngừa bệnh.
h) Nhược điểm:
Phải có phòng lab hiện đại, chuẩn mực; đòi hỏi kỹ thuật viên, bác sĩ phải có trình
độ chuyên môn cao.
Giá thành xét nghiệm PCR còn khá cao.

16
 Vài trường hợp như đã dùng kháng sinh, lấy hay bảo quản bệnh phẩm sai quy
cách có thể ức chế PCR khiến độ nhạy của xét nghiệm thấp.
PCR vẫn có nhược điểm là độ nhạy (sensitivity. Se) trong một số bệnh phẩm còn
thấp, nghĩa là cho "âm tính giả còn cao. Điển hình là PCR trong bệnh viêm màng
não lao (Tuberculous meningitis), một bệnh đòi hỏi phải chẩn đoán và điều trị sớm
để tiên lượng tốt và ít biển, di chứng. Dù PCR lao cho dịch não tủy có độ đặc hiệu
Sp cao gần tuyệt đối 98%, nhưng độ nhạy Se lạ rất thấp 56%. Vì thế, các bác sĩ lâm
sàng thường phải: Làm PCR lao thêm trên các mẫu khác như máu, nước tiểu, đờm,
dịch màn phối, màng bụng và làm thêm các xét nghiệm khác như IDR, soi đàm, chụp
phối...
2.2. Kỹ thuật Real-time PCR:
Kỹ thuật Real-time Polymerase Chain Reaction (real-time PCR) là một phương
pháp phân tích DNA hoặc RNA một cách chính xác và độ nhạy cao. Nó còn được
gọi là quantitative PCR (qPCR) vì nó cung cấp thông tin về lượng mục tiêu ban đầu
trong mẫu một cách số lượng.
Kỹ thuật này gần tương tự như kỹ thuật PCR, tuy nhiên ở đây có thêm một thiết
bị ghi tín hiệu khi xả ra phản ứng tổng hợp PCR. Dựa trên việc so sánh số vòng mẫu
thử và số vòng của mẫu chuẩn đạt được trong cũng một khoảng thời gian xảy ra phản
ứng, từ đó sẽ tính được số vòng mẫu thử gấp bao nhiêu lần số vòng mẫu chuẩn, rồi
dựa vào đó người ta tính được nồng độ DNA của mẫu thử.
Lưu ý: khi làm PCR thông thường thì ta có thể dùng nắp ống tube PCR màu, còn
khi làm Real-Time PCR thì khuyến cáo dùng loại nắp trong ở ống tube Real-Time
PCR.
Thành phần: tương tự như PCR, nhưng có thêm TaqMan probe hoặc EvaGreen
(mẫu dò).
Realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan, trong kỹ thuật realtime PCR, có nhiều
cách khác nhau để tạo ra tín hiệu huỳnh quang sau mỗi chu kỳ. Cách dựa trên mẫu
dò TaqMan là một loại mẫu dò (probe) được sử dụng khá phổ biến trong kỹ thuật
realtime PCR. Thành phần trong một phản ứng realtime PCR sử dụng mẫu

17
dòTaqMan gần như tương đồng với một phản ứng PCR thông thường, ngoại trừ việc
trong thành phần có chứa thêm mẫu dò TaqMan.

Sơ đồ nguyên lý hoạt động của mẫu dò TaqMan

Mẫu dò TaqMan là một đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 24 - 30bp với đầu 5'
gắn một chất phát huỳnh quang (reporter) và đầu 3' còn lại gắn chất hấp thụ
(quencher). Khi mẫu dò TaqMan còn nguyên vẹn, quencher sẽ hấp thụ tất cả ánh
sáng huỳnh quang do reporter phát ra. Khi phản ứng PCR diễn ra, mẫu dò sẽ bị Taq
polymerase cắt mẫu dò bằng hoạt tính 5' - 3' exonuclease, reporter được giải phóng
tín hiệu huỳnh quang không còn bị quencher hấp thu.

18
 Mồi trong phản ứng realtime PCR thường có nhiệt độ nóng chảy khoảng 55 –
60 C và thấp hơn mẫu dò TaqMan khoảng 5 – 10oC để đảm bảo mẫu dò luôn bắt cặp
o

trước. Trình tự đích lựa chọn cũng không nên dài quá 150bp để phản ứng diễn ra tối
ưu nhất.
Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan cũng chỉ có
2 giai đoạn:
1. Biến tính ở 94 – 95oC trong 15 – 30 giây.
2. Bắt cặp và kéo dài ở 60oC trong 30 – 60 giây.
a) Nguyên lý hoạt động:
Real-time PCR sử dụng một loại enzyme gọi là DNA polymerase để nhân bản
đoạn DNA hoặc RNA cụ thể trong mẫu.
Sự nhân bản được theo dõi theo thời gian thực (real-time) bằng cách sử dụng các
chất làm đầy (dye) fluorescein.
Dye fluorescein phát sáng khi nó tương tác với DNA được sản xuất, và cường độ
sáng được đo lường theo thời gian để xác định lượng mục tiêu.
Mục tiêu ứng dụng:
Real-time PCR thường được sử dụng để định lượng mức độ gen cụ thể
Nó cũng được sử dụng trong việc phát hiện, định lượng vi khuẩn, virus, và giảm
sự thất bại của quy trình so với PCR truyền thống.
b) Ưu Điểm:
Độ nhạy và độ chính xác cao: Real-time PCR có độ nhạy và độ chính xác cao,
giúp định lượng ngay cả những lượng mục tiêu nhỏ trong mẫu.
Nhanh chóng và hiệu quả: Quá trình real-time PCR thường nhanh chóng, mang
lại kết quả trong thời gian ngắn.
Không cần phải phân tích sau PCR: Trong truyền thống, bạn phải chạy gel để
xem kết quả sau khi đã thực hiện PCR, nhưng với real-time PCR, dữ liệu được thu
thập ngay lập tức.
c) Ứng dụng rộng rãi:
Real-time PCR được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như y học, nghiên cứu sinh
học, thực phẩm và môi trường để đánh giá và định lượng DNA hoặc RNA.
Real-time PCR đóng một vai trò quan trọng trong các phòng thí nghiệm sinh học
phân tử hiện đại, mang lại sự tiện lợi và độ chính xác cao trong việc định lượng và
phân tích gen và RNA.
19
 3. Ý nghĩa ứng dụng kỹ thuật phân tử trong định lượng vi sinh vật:
Việc định lượng vi khuẩn và virus có ý nghĩa quan trọng trong nhiều lĩnh vực
khoa học và ứng dụng, bao gồm y học, nông nghiệp, môi trường, và nghiên cứu cơ
bản. Dưới đây là một số lý do chính tại sao cần phải định lượng chúng:
 Y học và Sức khỏe Cộng đồng:
Chẩn đoán bệnh: Vi khuẩn và virus thường liên quan đến nhiều bệnh truyền
nhiễm. Việc định lượng chúng giúp trong quá trình chẩn đoán, điều trị và theo dõi
sự tiến triển của bệnh nhân.
Kiểm soát dịch bệnh: Định lượng vi khuẩn và virus là quan trọng trong việc kiểm
soát dịch bệnh và đưa ra các biện pháp phòng ngừa.
Nghiên cứu Sinh học và Động lực học Tế bào: Hiểu về sự phát triển và chuyển
hóa của tế bào: Vi khuẩn và virus thường được sử dụng trong nghiên cứu cơ bản để
hiểu rõ hơn về quá trình sinh học, động lực học tế bào, và tương tác tế bào.
Phát triển và Kiểm thử Thuốc: Nghiên cứu và phát triển thuốc: Đối với vi khuẩn
và virus gây bệnh, việc định lượng chúng là quan trọng trong quá trình phát triển và
kiểm thử các loại thuốc và vắc xin.
Để định lượng vi sinh vật có nhiều phương pháp tùy thuộc vào mục tiêu cụ thể,
loại vi sinh vật, và môi trường mẫu. Một số phương pháp:
- Phương pháp đếm trực tiếp:
Đếm trực tiếp dưới kính hiển vi: Sử dụng kính hiển vi để đếm số lượng vi sinh
vật trong một khối lượng hoặc thể tích cố định của mẫu.
Máy đếm tự động: Sử dụng các thiết bị tự động có thể đếm và ghi lại số lượng vi
sinh vật một cách tự động.
Phương pháp này có ưu điểm là giá thành thấp, dễ thực hiện nhưng việc định
lượng đúng hay sai phụ thuộc phần nhiều vào kỹ thuật viên, dễ xảy ra sai sót.
- Phương pháp nuôi cấy và đếm (Plate Count):
Nuôi cấy vi sinh vật trên agar: Mẫu được trải lên bề mặt của một môi trường nuôi
cấy, và sau đó được ủ để vi sinh vật phát triển thành các đám.
Đếm số lượng đám vi sinh vật: Sau một khoảng thời gian ủ, số lượng đám được
đếm để ước tính số lượng vi sinh vật ban đầu.
Phương pháp này dễ thực hiện và việc định lượng vi sinh vật được thực hiện thủ
công hoặc có sự hỗ trợ của máy đếm vi sinh vật nhưng có nhược điểm khi gặp cái vi
khuẩn chậm mọc, khó mọc, virus và vi nấm mọc chậm; tạp nhiễm/

20
 - Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction):
PCR (Polymerase Chain Reaction): Được sử dụng để nhân bản và định lượng
DNA hoặc RNA của vi sinh vật.
Real-time PCR (qPCR): Cho phép định lượng theo thời gian thực, cung cấp kết
quả ngay sau khi PCR hoàn thành.
Việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong định lượng vi sinh vật mang lại
nhiều lợi ích, như độ chính xác cao, độ nhạy, và khả năng xử lý mẫu nhanh chóng,
làm tăng khả năng hiểu rõ về sinh học và y học. Kỹ thuật sinh học phân tử, bao gồm
các phương pháp như PCR (Polymerase Chain Reaction), qPCR (quantitative PCR),
và các phương pháp phân tích DNA hoặc RNA khác, được sử dụng rộng rãi trong
định lượng vi sinh vật.
Định lượng vi khuẩn: Đánh giá tình trạng vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm bằng
phương pháp PCR và qPCR. Điều này giúp theo dõi sự thay đổi trong số lượng vi
khuẩn và theo dõi, tiên lượng bệnh.
Đánh giá nhiễm trùng: Kiểm tra nhiễm trùng virus trong mẫu sinh phẩm để xác
định sự hiện diện và định lượng virus trong các loại mẫu như máu, dịch tiết, hoặc
mẫu dịch nhầy.
Đánh giá sự khử khuẩn: Kiểm tra hiệu quả khử khuẩn: Khi áp dụng các biện pháp
tiệt trùng, khử khuẩn như sử dụng chất khử trùng, PCR có thể được sử dụng để đánh
giá hiệu suất của quá trình này bằng cách định lượng vi khuẩn còn lại.
Đánh giá microbiota ruột: Xác định thành phần vi sinh vật trong hệ thống ruột,
PCR và qPCR được sử dụng để đánh giá thành phần của microbiota ruột, giúp hiểu
rõ hơn về vai trò của các vi khuẩn trong sức khỏe và bệnh tật.
Định lượng MicroRNA (miRNA): Kiểm tra biểu hiện gen và điều chỉnh gen, PCR
có thể được sử dụng để định lượng microRNA, loại RNA nhỏ thường liên quan đến
sự điều chỉnh gen. Điều này có ứng dụng trong nghiên cứu về bệnh lý và phát triển.

21
 II. BỆNH LÝ COVID–19
COVID-19 là một bệnh do virus xuất hiện vào năm 2019 liên quan đến virus
SARS-CoV-2 thuộc họ coronavirus (MERS-CoV, SARS-CoV và SARS-CoV-2).
Hầu như tất cả các thể bệnh nặng liên quan đến COVID-19 được đặc trưng bởi viêm
phổi lan tỏa gây suy hô hấp có thể dẫn đến hội chứng hô hấp cấp (ARDS). Xem xét
các nghiên cứu trước đây về Hội chứng nguy ngập hô hấp cấp (SARS) và những gì
chúng ta biết về sinh lý bệnh học của COVID-19, virus mới cũng cùng họ
coronavirus ở thế kỷ 21 này, gây lo ngại vì một tỷ lệ lớn (lên đến 25%) bệnh nhân
mắc COVID-19 có thể có di chứng hô hấp dài hạn như hội chứng hạn chế liên quan
đến rối loạn trao đổi khí.
Phòng ngừa bằng cách tiêm phòng và các biện pháp phòng ngừa kiểm soát lây
nhiễm (ví dụ: đeo khẩu trang, rửa tay, giãn cách xã hội, cách ly y tế những người bị
nhiễm bệnh). Chẩn đoán bằng xét nghiệm kháng nguyên hoặc PCR (phản ứng chuỗi
polymerase) đối với chất tiết đường hô hấp trên hoặc dưới. Điều trị bằng chăm sóc
hỗ trợ, thuốc kháng virus hoặc corticosteroid.
Nhiễm SARS-CoV-2 gây ra nhiều mức độ nặng của bệnh, từ không triệu chứng
đến suy hô hấp cấp tính và tử vong. Các yếu tố nguy cơ bị bệnh nặng bao gồm tuổi
già, suy giảm miễn dịch, bệnh lý đi kèm (ví dụ: tiểu đường, bệnh thận mạn tính) và
mang thai. Vaccine đã cho thấy phần nào hiệu quả trong việc ngăn ngừa lây truyền
và rất hiệu quả trong việc ngăn ngừa bệnh nặng và tử vong.
1. Mức độ lan truyền của COVID-19:
Virus SARS-CoV-2 lây lan khi tiếp xúc gần người với người, chủ yếu qua các
giọt bắn ở đường hô hấp được tạo ra khi người bệnh ho, hắt hơi, hát, tập thể dục hoặc
nói chuyện. Sự lây lan xảy ra thông qua các giọt bắn ở đường hô hấp lớn có thể di
chuyển với khoảng cách ngắn và hạ trực tiếp trên bề mặt niêm mạc hoặc qua các hạt
sol khí hô hấp nhỏ có thể tồn tại trong không khí vài giờ và di chuyển với khoảng
cách xa hơn (> 6 feet) trước khi bị hít vào. Sự lây lan của virus cũng có thể xảy ra
khi tiếp xúc với các bề mặt bị ô nhiễm (bọt khí) do dịch tiết đường hô hấp, nếu một
người chạm vào bề mặt bị ô nhiễm và sau đó chạm vào niêm trên mặt (mắt, mũi,
miệng).
Virus SARS-CoV-2 dễ lây lan giữa người với người. Nguy cơ lây truyền liên
quan trực tiếp đến số lượng virus mà một người phơi nhiễm. Cả những bệnh nhân

22
không có triệu chứng và có triệu chứng đều có thể truyền virus, điều này gây khó
khăn cho việc kiểm soát tình trạng lây lan.
Các biến thể di truyền của virus SARS-CoV-2 xuất hiện khi nó phát triển. Các
biến thể có khả năng tăng khả năng lây truyền, bệnh nặng hơn hoặc giảm đáp ứng
với các phương pháp điều trị và/hoặc vắc xin hiện có được theo dõi là Biến thể cần
quan tâm và thường được gọi theo nhãn bảng chữ cái Hy Lạp do WHO chỉ định hoặc
số dòng dõi Pango của virus này. Một đột biến di truyền mang lại lợi thế về thể chất,
cụ thể là tăng khả năng lây truyền, có thể nhanh chóng thay thế các biến thể đã lưu
hành trước đó. Sự phát triển của các biến thể thống trị ở Hoa Kỳ và phần lớn thế giới
bao gồm Alpha, Beta, Delta và Omicron. Biến thể Omicron đã chiếm ưu thế trên
toàn thế giới kể từ tháng 3 năm 2022, với các biến thể con Omicron mới hơn và dễ
lây truyền hơn (ví dụ: BA.4 và BA.5) thay thế Omicron ban đầu (B.1.1.529).
Các tình huống có nguy cơ lây truyền cao bao gồm các cơ sở sinh hoạt tập trung,
kém thông thoáng, chẳng hạn như các dịch vụ tôn giáo trong nhà, phòng tập thể dục,
quán bar, câu lạc bộ đêm , nhà hàng trong nhà.
Các yếu tố xã hội quyết định đến sức khỏe (điều kiện ở nơi mọi người sinh ra,
sống, học tập, làm việc và vui chơi) tác động đến một loạt các nguy cơ và kết quả về
sức khỏe, chẳng hạn như phơi nhiễm với nhiễm trùng SARS-CoV-2, COVID-19
nặng và tử vong, cũng như tiếp cận với xét nghiệm, tiêm vaccine và điều trị.
2. Triệu chứng của COVID-19:
Mức độ nặng và nhóm các triệu chứng khác nhau ở những người bị COVID-19.
Một số có ít hoặc không có triệu chứng, và một số bị bệnh nặng và tử vong. Các
triệu chứng phổ biến có thể bao gồm:
- Sốt
- Ho
- Đau họng
- Nghẹt mũi hoặc chảy nước mũi
- Thở dốc hoặc khó thở
- Ớn lạnh hoặc run rẩy kèm theo rùng mình nhiều lần
- Không ngửi thấy mùi hoặc không nếm thấy vị mới xuất hiện
- Mệt mỏi
- Đau cơ
- Đau đầu

23
 - Buồn nôn hoặc nôn
- Bệnh tiêu chảy
Thời gian ủ bệnh (tức là thời gian từ khi phơi nhiễm đến khi bắt đầu có triệu
chứng) dao động từ 2 đến 14 ngày, với mức trung vị ước tính chỉ từ 2 đến 4 ngày
đối với biến thể Omicron (1). Nhiều người bị nhiễm không có triệu chứng hoặc bệnh
nhẹ; khả năng xảy ra điều này khác nhau tùy thuộc vào biến thể SARS-CoV-2 và
nguy cơ mắc bệnh nặng của người đó, bao gồm cả tình trạng chủng ngừa COVID.
Các dấu hiệu tiên lượng nặng bao gồm khó thở, giảm oxy máu, và thâm nhiễm
phổi lan tỏa. Điều này có thể tiến triển đến suy hô hấp cần phải thở máy, sốc, suy đa
tạng và tử vong.
3. Cơ chế gây bệnh3:
Mặc dù SARS-CoV-2 có thể ảnh hưởng đến các cơ quan khác ngoài phổi, nhưng
ở hầu hết các thể nặng của COVID-19, tổn thương hô hấp rất hay gặp. Một số lý do
có thể giải thích tổn thương phổi trong COVID-19. Đầu tiên, biểu mô hô hấp đặc
biệt tiếp xúc với virus SARS-CoV-2. Thật vậy, như các trường hợp nhiễm virus khác,
có liên quan đến SARS- CoV-2 bắt đầu bằng việc gắn protein trên vỏ virus với thụ
thể trên màng tế bào người bệnh. Protein S (protein gai) của virus SARS-CoV-2,
giống như SARS-
CoV-1, có khả
năng liên kết với
ACE2
(Angiotensin-
converting
enzyme 2), một
protein màng có
trên bề mặt của
nhiều loại tế bào.
Đặc biệt ACE-2
hiện diện nhiều
trên bề mặt các tế
bào biểu mô

3
Đại Dịch Coronavirus 2020: từ cơ chế sinh học phân tử SARSCoV-2 đến bệnh lý học COVID-19 – GS.BS.TS.
Đinh Xuân Anh Tuấn - Bệnh Viện Cochin, Đại Học Paris
24
đường hô hấp, đặc biệt là các tế bào lót trong thành mũi nơi có protein thứ hai,
Transmembrane Serine Protease 2, TMPRSS2, làm virus dễ xâm nhập hơn.
Các bệnh viêm phổi gây ra bởi các coronavirus (MERS-CoV, SARS-CoV và
SARS-CoV-2) có thể diễn tiến nặng, khi chúng tiến triển thành hội chứng nguy ngập
hô hấp cấp tính (ARDS) thì tỷ lệ tử vong có thể từ 20 đến 50% các trường hợp. Các
nghiên cứu tiếp theo trên bệnh nhân mắc SARS hoặc MERS, khả năng khuếch tán
qua màng phế nang – mao mạch (DLCO) của 27% trường hợp giảm 6 tháng sau khi
nhiễm bệnh (khoảng tin cậy: 15-45%). Các di chứng hô hấp có thể thấy trên phim X
quang trong 27,8% trường hợp và có thể định lượng bằng DLCO thấp trong 23,7%
trường hợp sau một năm mắc bệnh. Trong số những bệnh nhân này, một tỷ lệ nhỏ
có di chứng lâu dài vì 415 bệnh nhân vẫn có X quang phổi bất thường sau khi xuất
hiện bệnh.
4. Phương pháp định lượng virus Sar CoV-2:
4.1. Kỹ thuật Real-time PCR:
Realtime PCR là kỹ thuật nhân bản DNA dựa vào các chu kỳ nhiệt với tín hiệu
khuếch đại được hiển thị sau mỗi chu kỳ nhiệt, nhờ đó người thực hiện có thể theo
dõi được kết quả PCR.
One-step RT-PCR là phản ứng kết hợp phiên mã ngược và PCR trong cùng một
tube xét nghiệm.
Giá trị chu kỳ
ngưỡng Ct (Threshold
cycle value): số chu kỳ
nơi đường biểu diễn tín
hiệu huỳnh quang vượt
quá tín hiệu nền
(baseline).
SARS-CoV-2 là
virus RNA, sợi đơn,
dương, có vỏ. Bộ gen
của SARS-CoV-2 có
độ dài khoảng 25-32
kilobase gồm các vùng: vùng 5’UTR, khung đọc mở, vùng 3’UTR và cuối cùng là
đuôi-poly (A).

25
 Hai phần ba đầu tiên của bộ gen mã hóa cho các protein phi cấu trúc từ 2 khung
mở đọc ORF1a và ORF1b. Một phần ba cuối của bộ gen mã hóa cho các protein cấu
trúc là protein (S), protein màng (M), protein vỏ (E) và nucleocapsid (N) protein.

4.2. Mẫu bệnh phẩm:

a) Mẫu bệnh phẩm thu thập:
Bệnh phẩm đường hô hấp trên:
- Dịch tỵ hầu và dịch ngoáy họng.
- Dịch súc họng.
Bệnh phẩm đường hô hấp dưới:
- Đờm
- Dịch phế nang, dịch nội khí quản, dịch màng phổi...
- Tổ chức phổi, phế quản, phế nang (khi có chỉ định).
Mẫu máu: 3-5 ml máu tĩnh mạch có hoặc không có chất chống đông.
b) Xử lý mẫu:
Xử lý mẫu: Mỗi loại mẫu sẽ có phương pháp xử lý khác nhau.
- Loại bỏ chất ức chế.
- Tăng nồng độ mục tiêu cần phát hiện (nuôi cấy tăng sinh, cô đặc).
- Tăng độ đồng nhất của mẫu.
Ví dụ: Mẫu dịch phết tăm bông (đồng nhất mẫu)
Xử lý mẫu và tách chiếc DNA/RNA
- Trang thiết bị trạng thái SS.

26
 - Chuẩn bị vật tư, hóa chất, dụng cụ đầy đủ.
- Nhận mẫu kiểm tra đối chiếu thông tin BN.

An toàn: sử dụng PPE, thực hiện thao tác trong tủ ATSH cấp II, sử dụng đầu tip
có lọc, khử nhiễm bằng cồn 70 độ hoặc khử amplicons bằng clo 0.5%.

27
 Các bước xử lý mẫu:
Bước 1 Hút 150𝜇𝐿 mẫu với 250 𝜇𝐿 VL(+ 2-ME), 20 𝜇𝐿 Proteinase K.
Vortex đều từ 30 giây – 1 phút.
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bước 2 Hút 350 𝜇𝐿 Ethanol 100% cho vào hỗn hợp.
Vortex đều từ 30 giây – 1 phút.
Hút hỗn hợp Lysate/ Ethanaol (bước 2) vào cột dọc.
Ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút.
Loại bỏ phần lỏng, đặt cột vào lại eppendorf.
Bước 3 Hút 500 𝜇𝐿 VW1.
Ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút.
Loại bỏ phần lỏng, đặt cột vào lại eppendorf.
Bước 4 Hút 500 𝜇𝐿 VW2 (Ethanol 100%)
Ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút.
Loại bỏ phần lỏng, đặt cột vào lại eppendorf.
Bước 5 Ly tâm khô 13.000 rpm trong 1 phút. Loại bỏ phần wash buffer còn sót
lại.
Đặt cột dọc vào tube 1.5ml mới.
Bước 6 Hút 50 𝜇𝐿 Rnase free water.
Ủ nhiệt độ phòng trong 1 phút.
Ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút.
Thu được dung dịch RNA/DNA.
4.3. Thực hiện phản ứng Real time – PCR:
Chuẩn bị Mastermix: Kit PCR SARS-CoV-2 Allplex™ SARS-CoV-2 Assay.
Trộn bằng cách vortex nhanh và ly tâm nhanh.
Chia 15 𝜇𝐿 hỗn hợp Mastermix vào mỗi tube PCR.
Thêm 5 𝜇𝐿 mẫu nuleic acid tương ứng vào mỗi tube PCR.
Đóng nắp và ly tâm nhanh các tube PCR.
Đảm bảo hỗn hợp chất lỏng có chứa tất cả các thành phần PCR nằm ở đáy của
mỗi tube PCR. Nếu không, ly tâm lại ở tốc độ máy cao hơn trong thời gian dài hơn.

28
 Thành phần Thể tích (𝝁𝑳) Vị trí thành phần PCR
Đúng Không đúng
Master mix
15

Mẫu acid
nucleic/ Chứng 5
dương
Tổng thể tích
phản ứng 20

Chạy mẫu trên máy Realtime PCR AbCyclerQ.

Đặt các tube PCR đã chuẩn bị mẫu vào vị trí trên block nhiệt của buồng phản ứng
PCR. Cài đặt vị trí mẫu và chứng đúng với vị trí đã đặt trên máy Realtime PCR
Cài đặt chế độ gia nhiệt (Temperature setting)
Cài đặt thông số huỳnh quang (Flourescence setting)
Bắt đầu chạy.
Bước Số chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian

1 50 20
1
2 95 15

3 95 10

4 45 60 15

5 72 10

Gen mục tiêu Kênh màu huỳnh quang

Gen E FAM

29
 Gen RdRP/S Texas Red
Gen N Cy5
IC HEX

4.4. Đọc kết quả:

a) Kết quả kiểm tra chất lượng được đánh giá “đạt” khi:
Chứng âm: có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang âm tính (chứng nội phải
dương tính).
Chứng dương: có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang dương tính với Ct <=
40 (chứng nội âm tính hoặc dương tính).
Kết quả
Texas Red
FAM (Ct) Cy5 (Ct) HEX (Ct)
(Ct) Giải thích tự
Gen động
Gen E Gen N IC
Mẫu RdRP/S
Chứng dương
<= 40 <= 40 <= 40 +/- Dương tính

Chứng âm - - - <= 40 Âm tính

b) Kết quả kiểm tra chất lượng được đánh giá “không đạt” khi:
Chứng âm có đường biểu diễn dương tính: nhiễm chéo khi thực hiện xét nghiệm,
môi trường khu vực xét nghiệm bị nhiễm virus / amplicons…
Chứng âm và chứng nội đều có đường biểu diễn âm tính: không thu được RNA
do kỹ thuật tách chiết, hóa chất/ sinh phẩm không đạt, phản ứng PCR bị ức chế…
Chứng dương có đường biểu diễn âm tính: hóa chất/ sinh phẩm không đạt, thiết
bị hư hỏng…
Tìm hiểu nguyên nhân, khắc phục khi kết quả kiểm tra chất lượng không đạt và
thực hiện lại xét nghiệm.

30
 c) Phiên giải kết quả:

Kết quả
Giải thích tự
Gen Gen Mô tả
Gen E IC động
RdRP/ S N

+ + Nguyên nhân khi các gene đích

không được phát hiện:
+ - SARS-CoV-2 - Mẫu ở nồng độ gần hoặc
+/- +/- thấp hơn giới hạn phát hiện
Dương tính
- Một đột biến trong đoạn gene
- + đích
- Yếu tố khác
RNA Sarbecovirus được phát
hiện.
Nguyên nhân khi các gene đích
không được phát hiện:
SARS-CoV-2 - Mẫu ở nồng độ gần hoặc
thấp hơn giới hạn phát hiện
+ - - +/- Dương tính - Một đột biến trong đoạn gene
giả định đích
- Yếu tố khác
Khắc phục:
- Lặp lại phản ứng PCR với
lượng RNA nhiều hơn (lên
tới 10𝜇𝐿)

SARS-CoV-2
- - - +/-
Âm tính

31
 Nguyên nhân:
- Thu thập mẫu không đạt
- Không tuân thủ đầy đủ quy
trình xét nghiệm (ví dụ:
không thêm IC…)
- Có sự hiện diện của chất ức
Không hiệu chế phản ứng PCR.
- - - - - Khắc phục:
lực
- Thực hiện lại xét nghiệm từ
khâu tách chiết
- Nếu kết quả vẫn không hợp lệ
trong phản ứng với mẫu
nucleic acid pha loãng (10 –
100 lần), yêu cầu lấy lại mẫu
bệnh nhân

Sơ đồ 1: Âm tính

32
 Sơ đồ 2: Dương tính CT 19

Sơ đồ 3: Dương tính Covid CT 14

33
 III. VIÊM GAN SIÊU VI B
Viêm gan B là loại bệnh lý về gan thường gặp nhất trên thế giới. Bệnh này là do
siêu vi khuẩn viêm gan B (HBV) tấn công và làm tổn thương gan. Siêu vi khuẩn này
lây truyền qua máu, quan hệ tình dục không an toàn, dùng chung hoặc dùng lại kim
tiêm, và từ người mẹ bị nhiễm bệnh sang bé mới sinh trong thai kỳ hoặc trong khi
sinh. Hầu hết người lớn bị nhiễm bệnh đều có thể loại trừ siêu vi khuẩn viêm gan B
dễ dàng. Tuy nhiên, một số người lớn và hầu hết trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ bị nhiễm bệnh
không thể loại trừ siêu vi khuẩn này và sẽ bị nhiễm bệnh mạn tính (suốt đời).
Bệnh viêm gan siêu vi B hiện nay đang là một vấn đề lớn đối với sức khỏe toàn
cầu. Viêm gan B mạn tính là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến suy gan, xơ gan, ung
thư gan. Trên toàn thế giới, 2 tỷ người (1 trong 3 người) đã bị nhiễm viêm gan B và
257 triệu người bị bệnh mạn tính (có nghĩa là họ không thể loại trừ được siêu vi
khuẩn). Mỗi năm có khoảng 700.000 người tử vong do viêm gan B và các biến chứng
của bệnh này. Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế
giới chiếm khoảng 15%-20% dân số, tức khoảng 10 – 14 triệu người với biểu hiện
viêm gan B cấp và mạn tính.

34
 Virus viêm gan B (Hepatitis B Virus – HBV) là một trong những tác nhân chính
gây viêm gan siêu vi ở người. Các chẩn đoán lâm sàng, sinh hóa thường không đặc
hiệu trong khi các xét nghiệm miễn dịch thì không hiệu quả trong nhiều trường hợp
- ở giai đoạn cửa sổ, ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch và trên các type huyết thanh
đột biến của virus. Mặt khác, các chẩn đoán trên không cho kết quả định lượng trong
khi việc xác định hàm lượng virus ở bệnh nhân là cần thiết để theo dõi và đánh giá
hiệu quả điều trị. Kỹ thuật realtime PCR áp dụng vào chẩn đoán cho phép định lượng
chính xác DNA HBV trong máu bệnh nhân.

1. Phân loại viêm gan siêu vi B:

Viêm gan B được phân thành hai loại là viêm gan B cấp tính và viêm gan B mãn
tính.
1.1. Viêm gan B cấp tính:
Viêm gan B cấp tính là tình trạng nhiễm trùng ngắn hạn, kéo dài trong vòng 6
tháng kể từ khi người bệnh tiếp xúc với HBV. Đa phần người bị viêm gan B cấp tính
35
không có triệu chứng hoặc chỉ bị nhẹ, nhưng cũng có trường hợp tình trạng trở nên
nghiêm trọng khiến người bệnh phải nhập viện để điều trị.
Nhiều người mắc viêm gan B cấp, đặc biệt là những người bị nhiễm bệnh ở độ
tuổi trưởng thành, có thể tự đào thải virus ra khỏi cơ thể nhờ hoạt động của hệ miễn
dịch và bình phục hoàn toàn sau vài tháng mà không để lại bất cứ di chứng nào. Trên
thực tế, có đến 90% người trưởng thành bị nhiễm HBV tự khỏi bệnh. Trường hợp
ngược lại, nếu hệ miễn dịch không thể loại bỏ được virus, viêm gan B cấp sẽ tiến
triển sang dạng mãn tính.
1.2. Viêm gan B mãn tính:
Viêm gan B mãn tính là tình trạng nhiễm trùng gan kéo dài từ 6 tháng trở lên.
Virus HBV không bị loại bỏ và tiếp tục tồn tại một cách âm thầm trong máu và gan
của người bệnh. Theo thời gian, viêm gan mãn tính có thể gây ra các vấn đề sức khỏe
nghiêm trọng, bao gồm tổn thương viêm gan, suy gan, xơ gan, ung thư gan và thậm
chí tử vong.
Người nhiễm có độ tuổi càng trẻ thì khả năng viêm gan phát triển thành mãn tính
càng cao. Cụ thể, theo WHO, có đến 80–90% trẻ sơ sinh bị nhiễm bệnh trong năm
đầu đời và 30–50% trẻ em bị nhiễm bệnh trước 6 tuổi phát triển thành nhiễm trùng
gan mãn tính. Trong khi đó, tỷ lệ này ở người trưởng thành mắc bệnh thấp hơn rất
nhiều (dưới 5%).
2. Triệu chứng của bệnh viêm gan B:
2.1. Triệu chứng viêm gan B cấp tính:
Hầu hết trẻ em dưới 5 tuổi hoặc người bị suy giảm hệ thống miễn dịch khi mắc
viêm gan B cấp tính đều không biểu hiện triệu chứng rõ ràng. Những đối tượng còn
lại, bao gồm trẻ lớn hơn, thanh thiếu niên và người trưởng thành thì có khoảng 30 –
50% sẽ có các dấu hiệu và triệu chứng ban đầu, bao gồm:
- Sốt
- Mệt mỏi
- Chán ăn, ăn mất ngon
- Buồn nôn và nôn
- Đau bụng
- Nước tiểu đậm màu
- Phân nhạt màu
- Đau khớp
36
 - Vàng da
Các triệu chứng nhiễm trùng cấp tính xuất hiện khoảng 60 – 150 ngày sau khi
tiếp xúc với virus và kéo dài từ vài tuần đến 6 tháng. Các triệu chứng thường nặng
hơn ở những người bệnh trên 60 tuổi.
2.2. Triệu chứng viêm gan B mãn tính:
Hầu hết những người bị viêm gan B mãn tính không có bất kỳ triệu chứng nào
trong nhiều năm. Nếu có xuất hiện triệu chứng, chúng sẽ tương tự như các triệu
chứng của nhiễm trùng cấp tính.
Trường hợp người bệnh đã mắc viêm gan B trong một khoảng thời gian dài mới
biểu hiện triệu chứng thì khả năng cao đó là triệu chứng của các biến chứng nguy
hiểm của viêm gan B như xơ gan hoặc ung thư gan, chứ không chỉ đơn thuần là viêm
gan nữa.
3. Các đường lây nhiễm của bệnh Viêm gan siêu vi B:
Bệnh viêm gan siêu vi B có 2 đường lây nhiễm là:
- Đường lây nhiễm theo chiều dọc (vertical contamination)
- Đường lây nhiễm theo chiều ngang (horizontal contamination)
3.1. Đường lây nhiễm theo chiều dọc:
Đường lây nhiễm từ mẹ sang con: Đây là kiểu lây nhiễm này là quan trọng nhất,
thường gặp ở những nước vùng châu Á. Ở người phụ nữ mang thai sự lây nhiễm xảy
ra trong thời kỳ chu sinh (từ tuần thứ 28 của thai kỳ đến ngày thứ 7 sau sinh).
Mức độ lây nhiễm tùy thuộc vào nồng độ HBV DNA:
- Tỷ lệ lây nhiễm cho con là 0% nếu: HBV DNA của mẹ < 105 copies/ml
- Tỷ lệ lây nhiễm cho con là 50% nếu: HBV DNA của mẹ từ 109 đến 1010
copies/ml.
- Tỷ lệ lây nhiễm cho con là 28-39% nếu HBV DNA của mẹ từ 109 copies/ml trở
lên (mặc dù trẻ đã chích ngừa HBV ngay sau khi sanh)

Mức độ lây nhiễm còn tùy thuộc vào tình trạng HBeAg của mẹ vào 3 tháng cuối
thai kỳ:
- Mẹ có HBeAg (+), trẻ sơ sinh có 95% nguy cơ bị nhiễm nếu không được điều trị
dự phòng miễn dịch.
- Mẹ có HBeAg (-), tỷ lệ lây nhiễm cho con là 32% (thường gặp trong các trường
hợp mẹ bị viêm gan B mạn có HBeAg (-)).
37
 Sự lây nhiễm viêm gan siêu vi B có thể xảy ra trong quá trình sinh đẻ
3.2. Lây nhiễm theo chiều ngang:
Lây nhiễm khi tiếp xúc với máu, các vật phẩm của máu là đường lây nhiễm quan
trọng nhất, vì luôn có một lượng virus viêm gan B cao. Lây qua đường tình dục, qua
sử dụng chung kim tiêm (chích thuốc, châm cứu, xăm, xỏ lỗ trên cơ thể như xỏ lỗ
tai, lỗ mũi...) với người bị nhiễm virus viêm gan B là kiểu lây nhiễm thường gặp
nhất.
Virus viêm gan B được tìm thấy trong dịch âm đạo, tinh dịch với nồng độ thấp so
với trong huyết tương hơn 100 lần. Các dịch khác như dịch màng bụng, màng phổi,
dịch não tủy... cũng có chứa virus viêm gan B. Sữa, nước bọt, mồ hôi, nước tiểu,
phân, dịch mật cũng có chứa virus viêm gan B nhưng với nồng độ rất thấp, vì vậy
khả năng lây nhiễm qua các dịch này cũng rất thấp. Dùng chung bàn chải đánh răng
và dao cạo râu có dính máu hay dịch của người bị nhiễm cũng có thể bị lây nhiễm
virus viêm gan B. Virus viêm gan B không lây truyền qua thức ăn, nước uống và
tiếp xúc thông thường.
4. Cấu trúc Virus Viêm gan B:
HBV thuộc họ Hepadnaviridae, có cấu trúc DNA. HBV chỉ gây bệnh cho người
và khỉ đột đen Phi Châu.
Ở giai đoạn nhân đôi, HBV tồn tại trong huyết thanh dưới 3 dạng cấu trúc là hạt
tử siêu vi hay virion hoàn chỉnh, cấu trúc hình cầu và cấu trúc hình ống. Cấu trúc
hình cầu và hình ống là phần kháng nguyên bề mặt của HBV được tạo ra dư thừa
trong bào tương của tế bào gan.
Hạt tử virus hay virion bao gồm lớp vỏ bọc bên ngoài lipoprotein chứa 3 dạng
kháng nguyên bề mặt ( HBsAg) là pre-S1, Pre-S2, S và phần lõi bên trong là casid
bao gồm protein lõi (core protein) bao bọc DNA và DNA polymerase

38
 5. Cơ chế gây bệnh:

(1) Phần vỏ của HBV bám vào màng tế bào gan nhờ sự nhận biết của thụ thể trên
màng tế bào gan, sau đó siêu vi hòa nhập với protein màng của tế bào gan và xâm
nhập vào tế bào gan.
(2) Sau khi vào tế bào chất, chỉ có phần lõi chứa DNA và men DNA polymerase
đi vào nhân tế bào gan.
(3) Tại nhân tế bào gan, DNA được sửa chữa để tạo thành DNA vòng khép kín
(covalently-close circular DNA = cccDNA).
(4) cccDNA được xem là khuôn để sao chép RNA của siêu vi.

39
 (5) mRNA được giải mã tạo thành các protein của siêu vi (protein lõi, polymerase,
protein X, protein bề mặt siêu vi) trong tế bào chất.
(6) Protein lõi (core protein) bao bọc RNA tiền genome ( RNA pregenome ) và
men polymerase tạo thành capsid (7).
(8,9) RNA tiền genome sẽ sao chép ngược thành DNA.
(10) Capsid chứa DNA mới được tổng hợp này có thể phóng thích DNA vào
nhân tế bào gan để tạo thành cccDNA hay (11) sẽ được ghép thêm phần vỏ bọc trong
mạng lưới nội bào (endoplasmic reticulum = ER) và thể Golgi sau đó phóng thích ra
khỏi tế bào gan dưới dạng virion hoàn chỉnh.
6. Một số chỉ số trong xét nghiệm quan trọng trong viêm gan siêu vi B:
Đọc hiểu các chỉ số trong xét nghiệm định lượng virus viêm gan B là điều vô
cùng cần thiết. Trong các chỉ số xét nghiệm, người bệnh cần đặc biệt quan tâm tới
những chỉ số sau:
- HBV-DNA: Là phần virus hoàn chỉnh (gồm nhân và vỏ) của virus viêm gan B.
Xét nghiệm HBV-DNA cho biết số lượng virus viêm gan B tồn tại trong máu.
HBV-DNA phản ánh sự sao chép và nhân lên của virus trong cơ thể người bệnh.
- HBsAg: Là kháng nguyên bề mặt virus HBV. Để kết luận có bị nhiễm virus viêm
gan B hay không phụ thuộc vào xét nghiệm HBsAg. Nếu HBsAg (+) nghĩa là đã
nhiễm virus viêm gan B, nếu HBsAg (-) là không bị nhiễm virus viêm gan B.
- HBeAg: là kháng nguyên nội sinh của virus viêm gan B. Sự có mặt của HBeAg
(+) chứng tỏ là bạn đang có nồng độ virus trong máu cao và rất dễ lây truyền cho
người khác. Nếu HBeAg âm tính (HBeAg (-)) thì nồng độ virus trong máu thấp
hoặc virus đang trong giai đoạn nằm yên, không nhân bản sao chép và nguy cơ
lây nhiễm cho người khác thấp. Tuy nhiên có những bệnh nhân mà nhiễm virus
viêm gan B mang đột biến Precor đây là những bệnh nhân viêm gan B mạn có
HBeAg (-)
- Các chỉ số men gan ALT, AST: cho biết mức độ tổn thương gan do virus gây ra.
7. Phương pháp định lượng Hepatitis B virus (HBV):
7.1. Nguyên lý hoạt động:
AccuPid HBV Quantification Kit hoạt động dựa trên hai bước chính: (1) Xử lý
mẫu huyết thanh để thu được DNA của HBV, (2) Nhân bản DNA HBV bằng cặp
mồi đặc hiệu và định lượng sản phẩm nhân bản dựa trên tín hiệu huỳnh quang thu
được. Hỗn hợp phản ứng PCR chứa bộ mồi và mẫu dò TaqMan được thiết kế với bộ
40
gene HBV để nhân bản và phát hiện sản phẩm nhân bản DNA HBV bằng tín hiệu
huỳnh quang. Số lượng DNA HBV ban đầu có trong ống phản ứng được xác định
dựa vào một đường chuẩn. Đường chuẩn này được xây dựng bằng những hàm lượng
khác nhau của các đoạn DNA ngắn mô phỏng vùng gene HBV được nhân bản.
Ngoài ra, hỗn hợp còn chứa một cặp mồi và mẫu dò TaqMan đặc hiệu cho một
đoạn DNA nhân tạo có trình tự khác trình tự gene HBV gọi là chứng nội ngoại sinh
(internal control, IC) - đã được ly trích cùng với DNA trong mẫu nhằm phát hiện các
chất ức chế có trong mẫu và kiểm soát hiệu quả quá trình tách chiết DNA cũng như
phản ứng PCR.
Quy trình có thể hoàn tất trong 4 giờ.
7.2. Mẫu bệnh phẩm:
a) Mẫu bệnh phẩm thu thập:
Mẫu máu toàn phần được ly tâm phân đoạn để thu lấy huyết thanh. AccuPid HBV
Quantification Kit được sử dụng với các mẫu huyết thanh không chứa chất chống
đông như EDTA hay heparin. DNA bộ gene của các phần tử virus HBV có trong
huyết thanh được thu nhận bằng phương pháp phenol-chloroform. Các thành phần
như phenol, guanidine isothiocyanate, β mercaptopethanol có trong KTS1 có vai trò
chính trong việc phá vỡ cấu trúc protein của màng tế bào người và vỏ capsid của
HBV. Ngoài ra, hoạt động biến tính protein của các chất này cũng làm bất hoạt các
enzyme phân hủy DNA có trong hỗn hợp. DNA sau khi được giải phóng sẽ di chuyển
vào pha nước. Chloroform được bổ sung vào hỗn hợp nhằm thu hút hoàn toàn phenol
ra khỏi pha nước và giúp sự phân tách giữa pha nước và pha hữu cơ (phenol-
chloroform) trở nên rõ ràng hơn. DNA trong pha nước sau đó được chuyển sang
trạng thái không tan bằng isopropanol. Các gốc isopropanol được loại bỏ ra khỏi tủa
DNA bằng ethanol 70%. Dung dịch này đảm bảo việc làm sạch DNA và giữ DNA
ở trạng thái không tan. Cuối cùng, tủa DNA được hòa tan trong dung dịch nước đã
qua xử lý để bất hoạt RNAse, DNase (gọi tắt là DEPC) trước khi sử dụng cho phản
ứng PCR.
b) Bảo quản mẫu:
Nếu chưa tách huyết thanh, máu toàn phần phải được lưu ở 2 – 25oC không quá
1 ngày. Chuyển toàn bộ phần huyết thanh thu được sang eppendorf 1,5 ml sạch.
Huyết thanh được vận chuyển trong điều kiện 2 – 8oC hoặc đông lạnh ở -20oC
hoặc lạnh sâu hơn.
41
 Huyết thanh có thể được giữ ở 2-8oC trong 3 ngày hay đông lạnh ở -20oC hoặc
lạnh sâu hơn trong 6 tuần. Lượng huyết thanh lưu trữ nên khoảng 800 – 900µl.
c) Xử lý mẫu:
Tách chiết DNA
Lưu ý: Huyết thanh phải được bảo quản theo quy định trên từ khi thu đến khi thực
hiện phản ứng.
Lưu ý: Nên làm thêm 1 mẫu chứng âm tách chiết bằng cách dùng 100µl nước cất
hoặc dung dịch KTS5.
Bước 1 Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng
mẫu và thêm 1 eppendorf cho Chứng âm tách chiết.
Bật bồn ủ nhiệt khô ở 600C.
Bước 2 Vortex kỹ ống DNA IC.
Cho vào mỗi eppendorf chính xác 10µl dung dịch DNA-IC
Bước 3 Cho tiếp vào mỗi eppendorf 900µl KTS1.
Lưu ý: cần trộn đều dung dịch trước khi sử dụng
Bước 4 Cho 100µl huyết thanh vào mỗi ống, hoặc 100µl nước cất 2 lần hoặc
dung dịch KTS5 đối với Chứng âm tách chiết.
Vortex mạnh eppendorf trong ít nhất 5 giây cho tan hoàn toàn protein
biến tính.
Để yên 10 phút.
Bước 5 Cho 200µl KTS2. Lắc trộn thật kỹ.
Bước 6 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 7 Chuyển 600µl dịch nổi sang các eppendorf 1,5 ml mới.
Lưu ý: chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch hơi đục (protein
biến tính) ở giữa hai pha nước (trên) và chloroform (dưới).
Bước 8 Thêm 600µl KTS3.
Lưu ý: cần trộn đều dung dịch trước khi sử dụng.
Bước 9 Vortex nhẹ để trộn đều. Để yên 10 phút.
Bước 10 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 11 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn.
Lưu ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh.
Bước 12 Thêm 900µl KTS4.
Bước 13 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
42
Bước 14 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn.
Lưu ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh.
Bước 15 Làm khô cặn trong 10 phút ở 60oC trong bồn ủ nhiệt khô.
Bước 16 Hòa cặn trong 50µl KTS5.
Nếu không tiến hành phản ứng PCR ngay trong ngày, bảo quản DNA
tách chiết ở 2-8oC trong vòng 2-3 ngày, hoặc ở -20oC trong vòng 6
tháng.
7.3. Thực hiện phản ứng PCR
1. Rã đông các ống MasterMix, PrimobeMix và 3 ống Chứng dương hoàn toàn
bằng cách đặt ở nhiệt độ phòng trong tối đa 30 phút. Sau đó ly tâm nhẹ (3.000 –
4.000 rpm) và đặt vào rack lạnh.
Lưu ý: Thao tác các ống Chứng dương tách biệt với 2 ống MasterMix và
PrimobeMix để hạn chế nguy cơ nhiễm.
2. Vortex mạnh ống PrimobeMix và hút ra 200µl chuyển vào ống MasterMix.
Lưu ý: Tránh làm văng dung dịch lên nắp ống PrimobeMix trong quá trình vortex,
dẫn đến việc không đủ thể tích hút.
3. Trộn đều hỗn hợp có trong ống MasterMix bằng micropipette. Hút ra lần lượt
40µl hỗn hợp cho vào từng eppendorf 0,2 ml đ được ghi sẵn tên mẫu.
Lưu ý:
- Không được trộn ống MasterMix bằng máy vortex.
- Sử dụng eppendorf 0,2 ml phù hợp với máy Real-time PCR.
- Mỗi hỗn hợp chuẩn bị đủ cho 19 phản ứng.
4. Vortex nhẹ từng dung dịch DNA xét nghiệm, dung dịch Chứng âm tách chiết,
3 dung dịch Chứng dương.
5. Cho 10µl dung dịch DNA xét nghiệm, Chứng âm tách chiết, 3 dung dịch Chứng
dương hoặc nước cất 2 lần lần lượt vào các ống eppendorf 0,2 ml riêng lẻ đã chuẩn
bị ở Bước 3.
Lưu ý:
- Phản ứng Real-time PCR phải được đặt vào má chạ trong vòng 3 giờ sau khi
bổ sung dịch DNA.
- Mỗi lần chạy máy Real-time PCR cần tối thiểu 1 phản ứng cho Chứng âm tách
chiết, 3 phản ứng cho 3 ống Chứng dương và 1 phản ứng cho Chứng âm PCR
với nước cất 2 lần.

43
 - Thứ tự chuẩn b các phản ứng phải là: Chứng âm PCR Chứng âm tách chiết 
Mẫu xét nghiệm  Chứng dương.
6. Đậy nắp các eppendorf 0,2 ml thật kỹ, ly tâm nhẹ (3.000-4.000 rpm) và đặt vào
máy Real-time PCR.
7. Cài đặt chương trình định dạng vị trí các mẫu trong block nhiệt của máy (Plate
set up), chọn màu huỳnh quang FAM (đặc trưng cho DNA của HBV) và HEX (đặc
trưng cho DNA chứng nội ngoại sinh). Khai báo dạng mẫu cho các giếng chứng
dương là Standard, khai báo nồng độ DNA Chứng dương trên máy khi sử dụng các
mẫu chứng dương E3, E5 và E7 lần lượt là 104, 106 và 8 copies.
Lưu ý: Không cần cài đặt màu HEX cho các giếng Standard.
 Cài đặt chương trình Real-time HBV:
1 chu kì 95oC – 15 phút
40 chu kì 95oC – 20 giây
60oC – 1 phút (Đọc tín hiệu)
7.4. Phân tích kết quả:
Kiểm tra đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang và Ct của các mẫu theo trình tự
sau:
 Tín hiệu huỳnh quang của các mẫu Chứng dương: màu FAM
Chứng dương E3: Ct = 27.33 ± 1.65*
Chứng dương E5: Ct = 20.67 ± 1.65*
Chứng dương E7: Ct = 14.00 ± 1.65*
 Tín hiệu huỳnh quang Chứng âm PCR: không thu được tín hiệu FAM và HEX.
 Tín hiệu huỳnh quang Chứng âm tách chiết: màu FAM không xác định (N/A)
và màu HEX có Ct = 27±1.65*
 Tín hiệu huỳnh quang chứng nội (màu HEX) đối tất cả các mẫu xét nghiệm:
Ct = 27±1.65*
Mẫu xét nghiệm có giá trị Ct (màu FAM) xác định được gọi là “Dương tính với
DNA HBV”.
Mẫu xét nghiệm có giá trị Ct (màu FAM) không xác định (N/A) được gọi là
“Dưới ngưỡng phát hiện của quy trình (102 copies/ml)”.
*Các giá trị Ct trên là kết quả được khảo sát trên dòng máy CFX96 (BioRad) và
Stratagene Mx3000P (Agilent).

44
 “Hàm lượng DNA HBV trong mix phản ứng” của các mẫu dương tính với HBV
được xác định dựa trên đường cong chuẩn xây dựng từ các mẫu Chứng dương và
được hiển thị trên phần mềm xử lý của máy real-time PCR.
Lưu ý: Đường chuẩn có thể sử dụng để định lượng tốt nhất cần đạt các tiêu chí
sau:
- Hiệu suất nhân bản (Efficiency) phải đạt trong khoảng từ 90 đến 105%.
- Hệ số R2 phải lớn hơn 0,980.
- Hệ số góc (slope) của đường chuẩn phải đạt trong khoảng từ -3,58 đến -3,10.
Nếu đường chuẩn không đạt, cần thực hiện lại tất cả các xét nghiệm.
Kết quả định lượng DNA HBV (copies/ml) được tính bằng cách nhân giá trị “hàm
lượng DNA HBV trong mix phản ứng” với 50 (**).
** Hệ số nhân 50 được tính như sau: gọi số trình tự mục tiêu ban đầu có trong
ống phản ứng là X. Máy real-time PCR sẽ cung cấp giá trị X này. Lượng X trình tự
mục tiêu này có trong 10 µl dung dịch DNA. Như vậy, trong 50 µl dung dịch
DNA tách chiết được hay trong 100 µl huyết thanh có 5X trình tự mục tiêu. Cuối
cùng, trong 1 ml huyết thanh sẽ có 50X trình tự mục tiêu. Vậy hệ số nhân là 50.
Kết quả Real-time HBV trên các
Chứng dương, Chứng âm PCR và
mẫu dương tính với HBV
A: Chứng dương (màu F ) ứng với
các hàm lượng 104, 106,108
copies/phản ứng.
B: Mẫu xét nghiệm dương tính với
DN HBV (màu F ).
C: Chứng nội ngoại sinh (màu HEX)
của mẫu xét nghiệm.
D: Chứng âm PCR (màu FAM).

Đường chuẩn xây dựng từ các mẫu

Chứng dương

45
 IV. VIÊM GAN SIÊU VI C
Viêm gan C là một căn bệnh nguy hiểm, phát triển thầm lặng và không có
những triệu chứng đặc biệt chỉ khi biến chứng thành xơ gan hoặc ung thư
gan. Khoảng 70 – 85 % các trường hợp sẽ trở thành viêm gan C mạn tính
hoặc trở thành người lành mang vi rút viêm gan C.

Viêm gan C là một bệnh truyền nhiễm, vào năm 1990 người ta mới khám phá ra
sự hiện diện của vi rút viêm gan C.. Viêm gan C chiếm khoảng từ 1 đến 2% tổng
số dân trên toàn thế giới, Tổ chức Y Tế thế giới ước tính có 170 triệu người trên
thế giới đang mắc Viêm gan C (WHO, 2000). Tại nước Mỹ chiếm tỷ lệ 1.9%, có
khoảng 4 triệu bệnh nhân viêm gan C. Trong đó sẽ có từ 8 đến 10 ngàn người tử
vong mỗi năm do viêm gan C.

1. Tổng quan

Bệnh viêm gan virus C là bệnh truyền nhiễm do virus viêm gan C (HCV hepatis
C virus) gây ra HCV có cấu trúc sợi đơn RNA, thuộc họ Flaviviridae Đường kính
55- 65nm, trọng lượng phân tử 4x10⁶ daltons.

46
Genome HCV: kích thước 9,4kb
Genome mã hóa polyprotein để hình thành 10 protein:
 3 protein cấu trúc: 1 protein lõi (C) và 2 glycoprotein màng bọc (E1 và E2);
 7 protein không cấu trúc (NS): NS1, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B
là protein chức năng.

47
 Dựa trên trình tự nucleotide, HCV có:
 6 genotype (ký hiệu: 1 6): khác biệt 30%
 30 thứ týp (subtypes) (ký hiệu: a, b, c, …): 10-25%.
 Nhiều quasispecies (giả loài): khác biệt < 10%
Tính đa dạng di truyền:
 Không gây bệnh cảnh lâm sàng khác nhau
 Đáp ứng điều trị khác nhau.
2. Khả năng gây bệnh
 Thời gian ủ bệnh trung bình: 6-7 tuần. Biểu hiện lâm sàng mức độ nhẹ, chỉ
25% có biểu hiện vàng da hoặc không triệu chứng. Đến 75% tiến triển thành
bệnh viêm gan mạn và có nguy cơ tiến triển viêm gan mạn thể hoạt động
hoặc xơ gan (10-20%).
 Các đáp ứng miễn dịch thường không ngăn chặn được tình trạng nhiễm
HCV mạn.
3. Dịch tễ học Viêm Gan C

Tỉ lệ nhiễm HCV
Thế giới (WHO, 2014):
 Khoảng 3% dân số nhiễm HCV (185 triệu người),trong số đó: 350.000
người tử vong / năm
 Đa số không biết nhiễm HCV,
 Nhiều người được  nhưng không có khả năng 
 Khả năng  thành công: không khác biệt giữa các quốc gia.
VN: 2 – 5% dân số.
 An giang: 4,1% (Châu Hữu Hầu, 1994),
 TP. HCM: 2,55% (Trương Xuân Liên, 1995),
 Thừa Thiên-Huế: 0,5% (Phạm Văn Lình, 2005),
48
  Hà nội: 1,34% (N.T.Vân, T.T.Dương, 2004).
 Tỉ lệ tăng ở miền Nam
Dịch tễ học phân tử:
Trên thế giới: genotype HCV phân bố khác nhau
 Genotype 1: subtype 1a & 1b chiếm 60% số nhiễm HCV, chủ yếu ở châu Âu
và châu Mỹ; subtype 1b: châu Á.
 Genotype 2 và 4: Bắc và Nam Mỹ, châu Âu và châu Á. + Genotype 4: châu
Phi.
 Genotype 6: Việt Nam và HongKong.
Tại Việt Nam:
 Genotype HCV phổ biến ở VN: 1, 2 và 6

4. Đường lây truyền

Chủ yếu: tiêm chích ma túy.

 70,71% (Hà nội).
 68,24% (TP. HCM)
49
Yếu tố nguy cơ cao nhiễm HCV:
 Chạy thận nhân tạo (10%),
 người đồng tính
 Nhân viên y tế (1%).
 Tình dục không an toàn
 Từ mẹ sang con (<5%);
 Thủ thuật xuyên qua da
5. Một số xét nghiệm trong Viêm Gan C

Xét nghiệm Anti-HCV antibodies là xét nghiệm đầu tiên nhằm xác định sự tồn
tại của kháng thể kháng virus trong cơ thể. Kháng thể chống lại virus viêm gan C là
những protein mà cơ thể tạo ra khi tìm thấy virus trong máu và thường xuất hiện
khoảng 12 tuần sau khi bị nhiễm virus. Kết quả xét nghiệm thường được trả về sau
vài ngày đến một tuần. Nếu kết quả xét nghiệm dương tính có nghĩa là cơ thể có
nguy cơ cao bị nhiễm virus và cần làm thêm các xét nghiệm khác để chắc chắn. Hoặc
nếu kết quả trả về âm tính nhưng nghi ngờ bản thân có nguy cơ bị lây nhiễm cao
trong vòng 6 tháng trở lại thì nên làm xét nghiệm này lần 2 để chắc chắn hơn.
HCV – ARN (đo tải lượng HCV): Xét nghiệm dùng để đo số lượng ARN virus (vật
liệu di truyền của virus viêm gan) trong máu hay còn gọi là xác định tải lượng virus.
Chúng thường xuất hiện 1-2 tuần sau khi bị nhiễm bệnh. Nếu kết quả dương tính thì
chứng tỏ đã bị viêm gan C.

Xét nghiệm chức năng gan: Xét nghiệm dùng để đo mức protein và enzyme
trong gan. Chúng thường tăng từ thời điểm 7 - 8 tuần sau khi bị nhiễm bệnh. Khi
gan bị tổn thương, các enzyme bị tích tụ trong máu. Bên cạnh đó, nhiều người có
nồng độ enzyme bình thường nhưng vẫn bị viêm gan C.

50
 6. Phương pháp định lượng Hepatitis C virus (HCV)
6.1. Nguyên lý

Kỹ thuật TaqMan bao gồm một đầu dò oligonucleotide (probe) được gắn ở đầu
5´ một chất phát tín hiệu huỳnh quang (reporter) và ở đầu 3´ là một chất thu nhận tín
hiệu (quencher). Probe được thiết kế gắn với trình tự đích của mầm bệnh ở giữa mồi
xuôi và mồi ngược của phản ứng PCR. Ở giai đoạn gắn mồi, probe gắn đặc hiệu vào
trình tự đích, khi đó tín hiệu huỳnh quang phát ra từ Reporter đều bị Quencher dập
tắt. Trong giai đoạn kéo dài khi mồi xuôi của phản ứng được kéo dài đến vị trí gắn
của Probe thì taq DNA polymerase sẽ phá hủy các liên kết gắn giữa probe với trình
tự đích và đồng thời phá hủy probe, làm cho Reporter và Quencher không còn ở gần
nhau. Kết quả reporter phát ra tín hiệu huỳnh quang và hệ thống máy realtime PCR
sẽ thu nhận tín hiệu huỳnh quang phát này. Tín hiệu huỳnh quang thu được tỷ lệ
thuận với nồng độ các probe bị phá hủy. Tín hiệu này tăng lên gấp đôi sau mỗi chu
kỳ khuếch đại. Dựa vào tín hiệu huỳnh quang thu được của mẫu bệnh phẩm và các
mẫu chuẩn, phần mềm sẽ tính toán ra nồng độ ban đầu của vật chất di truyền trong
mẫu thử.

Định lượng HCV-RNA sử dụng kỹ thuật Realtime PCR Taqman Probe nhằm xác
định số bản copy của virus viêm gan C trong 1ml huyết tương của bệnh nhân nhiễm
HCV. Mồi và probe được thiết kế trong vùng 5’UTR có tính bảo tồn cao của bộ gene
HCV và khuếch đại một trình tự có kích thước 244 bp. Kỹ thuật cho phép định lượng
HCV-RNA của cả 7 kiểu gen khác nhau của virus HCV.

6.2. Chuẩn bị mẫu

RNA là nguyên liệu ban đầu cho TaqMan RT-PCR Virus viêm gan C (HCV).

51
 Chất lượng của mẫu RNA sẽ có tác động lớn đến hiệu suất của xét nghiệm HCV.
Cần phải đảm bảo rằng phương pháp được sử dụng để chiết RNA là tương thích với
TaqMan One-Step RT-PCR.

Nếu sử dụng quy trình chuẩn bị mẫu dựa trên cột khác bao gồm dựa trên ethanol
rửa đệm, bước làm khô cột bao gồm ly tâm trong 3 phút ở tốc độ 14.000 vòng/phút,
nên sử dụng ống thu thập mới, rất được khuyến khích trước khi rửa giải ARN. Điều
này sẽ giúp ngăn chặn việc nhiễm ethanol nào vào RNA, vì ethanol là được biết đến
là chất ức chế mạnh mẽ PCR. Đảm bảo rằng mọi vết ethanol từ mẫu các bước chuẩn
bị được loại bỏ trước khi rửa giải RNA.

6.3. Tiến hành

Rã đông hoàn toàn các tube chứa mix HCV TQPCR ở 2 – 8oC trong 15 - 20 phút
hoặc ở nhiệt độ thường trong 5 -10 phút.

Thực hiện úp ngửa 5 - 7 lần các tube PCR mix để trộn đều các thành phần.

Phân phối mix:

 Rã đông hoàn toàn các tube chứa mix ở 2 – 8oC trong 15- 20 phút hoặc ở
nhiệt độ thường trong 5 - 10 phút.
 Thực hiện úp ngửa 5-7 lần các tube PCR mix để trộn đều các thành phần.
 Spin cho các mix lắng xuống đáy tube.
 Phân phối mix vào các giếng với thể tích theo hướng dẫn sử dụng
 Dịch ly trích được bổ sung theo thứ tự mẫu kiểm rồi đến chứng âm, chứng
dương và cuối cùng là dãy chuẩn.
 Spin nhẹ trong 10 giây để đảm bảo phần bên trong nằm hoàn toàn dưới đáy
tube.

52
 Đặt các thanh này vào máy spin, spin trong 10 giây để đảm bảo phần hóa chất
bên trong nằm hoàn toàn dưới đáy tube.
 Đặt các thanh tube đã spin vào máy Realtime-PCR đã cài đặt chu trình nhiệt
như sau:
o 1 chu kỳ 450C 10 phút
o 1 chu kỳ 950C 10 phút
o 40 chu kỳ 950C 15 giây
o 60oC 60 giây đọc tín hiệu Fam và Hex
6.4. Diễn giải và báo cáo kết quả
 Xác định các mẫu dương tính và số lượng IU HCV ban đầu: sau khi đã có
đường chuẩn, xác định các giếng dương tính và lượng IU HCV ban đầu trong
các giếng mẫu thử bằng cách đọc kênh FAM của từng giếng và giếng chứng
âm. Giếng mẫu thử được đọc là dương tính với HCV khi có tín hiệu khi đường
biểu diễn tín hiệu cắt đường nền. Để tính số IU HCV trong 1mL mẫu ban đầu
ta nhân với hệ số liên quan đến độ thu hồi sau tách chiết của mẫu và thể tích
mẫu được tách chiết.
 Xác định các mẫu âm tính: bằng cách đọc kênh Fam và kênh Hex của từng
mẫu, mẫu được gọi là âm tính khi không có đường biểu diễn tín hiệu khuếch
đại cắt được đường nền ở kênh Fam nhưng có tín hiệu dương tính khi đọc
bằng kênh Hex.
 Nếu mẫu không có tín hiệu khuếch đại dương tính khi đọc bằng kênh Fam và
cũng không có tín hiệu khuếch đại dương tính khi đọc bằng kênh Hex thì
không thể kết luận mẫu dương tính hay âm tính mà phải thực hiện lại xét
nghiệm.

53
Tài liệu tham khảo:
1. Chủ biên: GS.TS. Lê Huy Chính – Sách Vi sinh vật Y học – Nhà xuất bàn Y học.
2. Chủ biên: Nguyễn Thị Hồng Nhung – Sách Sinh học và di truyền – Nhà xuất bản
Y học.
3. Vi khuẩn là gì? Cấu tạo, môi trường sinh sống thế nào? Lợi hay hại? – Đăng trên
web và được viết bởi BV Đa khoa Tâm Anh.
4. Kỹ thuật realtime PCR sử dụng mẫu dò Taqman – Đăng trên web Gene Smart.
5. Phạm Hùng Vân – PCR và Real-time PCR: Các vấn đề cơ bản và các ứng dụng
thường gặp.
6. Tổng hợp kiến thức chi tiết về kỹ thuật Real-time PCR – Đăng trên web Công ty
TNHH Giải pháp Y sinh ABT.
7. Kỹ thuật Realtime PCR – Đăng trên web Gentis.
8. GS.BS.TS. Đinh Xuân Anh Tuấn – Đại Dịch Coronavirus 2020: từ cơ chế sinh
học phân tử SARSCoV-2 đến bệnh lý học COVID-19 – Bệnh Viện Cochin, Đại
Học Paris.
9. Hoàng Trung Vinh , Phạm Thị Hồng Hoa, Trần Quốc Luận – Covid 19 và Đái
tháo đường: từ cơ chế sinh lý bệnh đến điều trị lâm sàng – Tạp chí “Nội tiết và
Đái tháo đường” Số 51 năm 2022.
10.Ths.Nguyễn Ngọc Bảo Huy – Tập huấn Kỹ thuật xét nghiệm Real-time PCR cho
COVID-19 - Công ty TNHH Giải Pháp Y Sinh ABT.
11.Nhóm sinh viên ĐH Quốc tế Hồng Bàng – Ứng dựng sinh học phân tử trong xét
nghiệm SARS-CoV-2.
12.Thông tin chung về Bệnh Viêm gan B – Trang web Hepatitis B Foundation.
13.Ths.Bs. Trần Thị Khánh Tường (BM Nội ĐHYK Phạm Ngọc Thạch) – Viêm
gan virus B – Đăng trên web Hội Y học thành phố Hồ Chí Minh.
14.Bác sĩ Khoa Xét nghiệm (Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec Đà Nẵng) – Bệnh
viêm gan siêu vi B và các đường lan truyền của bệnh – Đăng trên web VinMec
15.R.A Crowther – The Leeuwenhoek lecture 2006. Microscopy goes cold: frozen
viruses reveal their structural secrets – Đăng trên web The Royal Society
Publishing.

54
16.AccuPid HBV Quantification Kit Real-time PCR – Công ty TNHH Công nghệ
sinh học Khoa Thương.
17. Hướng dẫn sử dụng bộ thuốc thử NKHCV TQPCR, Nam Khoa.
18.Phạm Hùng Vân, 2009, PCR và Realtime PCR-các vấn đề cơ bản và các áp dụng
thường gặp. Nhà xuất bản Y học

55