PRÁCTICA 2: Proteínas: extracción, electroforesis SDS-PAGE y

tinción.
Número de la muestra problema: Puesto nº7- Merluza

1) Antes de realizar la electroforesis vertical, es necesaria la obtención de un

extracto de proteína. Para ello se usarán como reactivos un tapón de extracción de
proteína y un tampón de Laemmli, un agente reductor que rompe los puentes disulfuro y
desnaturaliza las proteínas.

El primer paso para llevar a cabo este procedimiento en la homogeneización de la

muestra de merluza. Con una varilla, se machacará la muestra, primero en seco y
después añadiendo el tampón de TEP, hasta la destrucción completa del tejido. Acto
seguido, se centrifuga la muestra para, posteriormente, extraer el sobrenadante, añadir
el tampón de Laemmli y calentar la muestra hasta los ~100ºC. Luego se recentrifuga la
muestra.

2) El método por el que se va a realizar para la separación de las proteínas según su

peso molecular es la electroforesis SDS-PAGE, un proceso sencillo, rápido y reproducible.

El extracto de proteína obtenido previamente se carga en uno de los pocillos de las

cubetas de electroforesis, así como un marcador de peso molecular para el posterior
cálculo del peso molecular. Las proteínas se alinean gracias a la acción de un gel
concentrador, que permitirá que entren a la vez y a la misma velocidad en el gel
separador, donde se realizará la separación propiamente dicha. Este último, está
constituido de poliacramida y actuará a modo de filtro poroso, separando así las
proteínas en función de su tamaño.

Como en este método las proteínas son sometidas a un campo eléctrico, es necesaria la
adición de un tampón de carga que contenga moléculas de SDS que se incorporarán a
ellas y les conferirá una carga negativa. De esta manera, al conectar los electrodos de la
cubeta las proteínas emigrarán hacia el polo positivo y se irán separando por acción del
gel separador.

Por tanto, al realizar el proceso, las moléculas más pequeñas recorrerán más espacio y
las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.

3) Tras haber realizado la electroforesis, no somos capaces de ver las proteínas de

nuestras muestras. Sólo vemos los marcadores de peso molecular que están pre-
teñidos.

Aunque existen diferentes métodos para visualizar las proteínas, el empleado en la

práctica ha sido la tinción de Comassie. Este colorante se une fuertemente a la proteína
a través de interacciones electroestáticas entre los grupos amino y carboxilo de la
proteína, confiriéndoles así un color azul intenso en los sitios del gel donde se encuentra
la proteína.
4)

5)
6) Se escoge un fragmento de la muestra cualquiera y se mide la distancia recorrida
por el mismo. En este caso, el nuestro ha recorrido 7’4 cm.

Sustituyendo en la ecuación de la recta obtenida gráficamente, tenemos:

𝑦 =−1 ’ 2604 ∗ ( 7 ’ 4 ) +2.3669=−2 ’ 9832

Como 𝑦 =log ❑ 𝑀𝑊 sustituyendo: log ❑ 𝑀𝑊 =−2′ 9832 ↔ 𝑀𝑊 =− 2′ 983210 55.832 es

la masa molecular de ese fragmento de proteína.