UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN FORMATIVA

Biorremediación de diesel de cadena de C10 - C28 con una halomona salina sp (PM-57)

Experiencia Curricular

BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL

Docente

MSc. Valderrama Ramos Isidoro

Integrantes

Escudero Yovera Rony Willian Daniel

León Mallqui Jean Cristopher Elías

Machuca Chacón Fátima Alexandra

Pereda Zelada Daniel Arturo

Quesquén Villegas Junior

Rivera Salas Ana Laura

Siccha Contreras Yanira Yessenia

Ciclo de Estudios

VIII – B

TRUJILLO – 2024
 ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................. 3
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA........................................................................................4
III. HIPÓTESIS..................................................................................................................................... 4
IV. OBJETIVOS..................................................................................................................................... 4
V. MATERIAL Y MÉTODOS.............................................................................................................. 5
5.1 MATERIALES............................................................................................................................ 5
5.2 MÉTODOS.................................................................................................................................. 6
VI. RESULTADOS.................................................................................................................................8
VII. DISCUSIONES.............................................................................................................................10
VIII. CONCLUSIONES...................................................................................................................... 11
IX. RECOMENDACIONES............................................................................................................... 11
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................................... 12
I. INTRODUCCIÓN

La presencia de hidrocarburos derivados del petróleo en el medio ambiente representa

una preocupación global debido a su impacto negativo en la calidad del suelo, del
agua y del aire, así como en la salud humana y la biodiversidad (Ordoñez et al, 2018).
Entre estos hidrocarburos, Rodriguez et al (2022), menciona que los compuestos
presentes en el diesel de cadena de C10 - C28 son particularmente problemáticos
debido a su persistencia y toxicidad. Por lo tanto, es imperativo desarrollar y aplicar
estrategias efectivas para mitigar los efectos adversos de la contaminación por diésel
en los ecosistemas.

La biorremediación, un proceso que utiliza microorganismos para degradar

contaminantes orgánicos en formas menos tóxicas, ha surgido como una alternativa
prometedora para abordar la contaminación por hidrocarburos (Morales y Méndez,
2021). Dentro de los microorganismos utilizados en la biorremediación, las bacterias
halófilas han ganado interés debido a su capacidad para prosperar en ambientes
extremadamente salinos, como los encontrados en suelos contaminados por petróleo
cerca de cuerpos de agua salada o en costas marinas (Aristizabal et al 2022).

Entre estas bacterias, Manya et al (2021), indica que la halomona salina sp (PM-57)
ha demostrado ser altamente efectiva en la degradación de hidrocarburos de cadena
larga. Su capacidad para metabolizar compuestos de diesel de cadena de C10 - C28 la
convierte en un candidato prometedor para la biorremediación de sitios contaminados
con este tipo de contaminantes.

El presente trabajo de investigación se propone calcular y analizar la eficacia de la

biorremediación utilizando la cepa de halomona salina sp (PM-57) en la degradación
de diesel de cadena de C10 - C28. Además, se investigarán las condiciones óptimas
para maximizar la actividad de la bacteria y se discutirán posibles aplicaciones
prácticas de la biorremediación en la restauración de ecosistemas contaminados por
diesel. Mediante este estudio, se espera contribuir al desarrollo de estrategias efectivas
y sostenibles para la rehabilitación de sitios contaminados por hidrocarburos,
promoviendo así la conservación y restauración de la salud ambiental
 II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La contaminación de hidrocarburos en la actualidad se ha vuelto un caso que requiere

un trato urgente debido al aumento de su contaminación en espacios ambientales, ya
sea agua o suelo. Los accidentes por este contaminante puede causar un deterioro en
la capacidad metabólica, asi como afectar a los seres vivos que en ellos habitan. Sin
embargo, la posibilidad de recuperar estos espacios contaminados ha conllevado a
estudiar la funcionalidad de los microorganismos para su remediación. Por lo que se
plantea el siguiente problema:
¿ Que tan eficiente es la aplicación de microorganismos (halomona salina) para la
remediación de cuerpos contaminados con diesel?

III. HIPÓTESIS

De acuerdo al secuenciamiento del método de biorremediación, la aplicación de

microorganismos (halomona salina), logró desarrollarse en un medio contaminado
con diesel hasta poder remediar el sustrato, y logró establecer su curva de
comportamiento.
Cómo segunda suposición, podría existir interferencias en la aplicación del
procedimiento de biorremediación, lo que afectaría el desarrollo del microorganismo
y su efecto biorremediador en el sustrato contaminado con diesel.

IV. OBJETIVOS
● Determinar la biorremediación de diesel de cadena de C10 - C28 con una
halomona salina sp (PM-57).
● Analizar y realizar la curva de crecimiento microbiano del comportamiento de
la cepa.
V. MATERIAL Y MÉTODOS

5.1 MATERIALES
Materiales
● 3 frascos de 100 ml
● 2 matraz de 125 ml
● 1 frasco de 250 ml
● 10 tubos de ensayo
● 1 vaso de precipitación de 500 ml
● Micro pipetas
● Papel tisú
● Papel toalla
● Agua destilada
● Alcohol
Equipos
● Estufa
● Shaker
● Autoclave
● Lámpara de esterilización
● Cabina de bioseguridad
● Incubadora
● Refrigeradora
● Espectrofotómetro
● Balanza analítica
Reactivos
● Cloruro de Sodio
● Extracto de levadura
● Fosfato de disódico
● Fosfato monopotásico
● Sulfato de Amonio
● Sulfato de Magnesio
● Glucosa
● Hidróxido de sodio al 5 M (NaOH)
● 2 microlitros de HCl
5.2 MÉTODOS

DÍA 1:
Preparación del medio, sulfatos y fosfatos
El material de vidrio fue previamente lavado con agua corriente y
posteriormente enjuagado con agua destilada, seguidamente se colocó en la
estufa por un tiempo de 15 minutos. En cuanto al proceso de preparación del
inóculo, se procedió a pesar en la balanza analítica 15 mg de NaCl y 1.5 mg de
extracto de levadura en un shaker designado, seguido de la adición de 0.1191
mg de fosfato de disódico (Na2HPO4) y 0.225 mg de fosfato monopotásico
(KH2PO4) en otro recipiente similar. En un tercer shaker, se incluyeron 0.375
mg de sulfato de amonio (NH4)2SO4 y 0.03 mg de sulfato de magnesio
(MgSO4), mientras que en un cuarto recipiente se colocaron 3 mg de glucosa.
Para la preparación del medio, se emplearon las mismas cantidades de
reactivos, exceptuando la glucosa que fue sustituida por ml de diesel.
Posteriormente, los shakers fueron diluidos con agua destilada en proporciones
específicas: 75 ml para el shaker con NaCl y levadura, 15 ml para los que
contenían sulfatos, otros 15 ml para los fosfatos y 45 ml para el shaker con
glucosa. Respecto al medio, se diluyeron 50 ml para los sulfatos, otros 50 ml
para los fosfatos y 200 ml para el shaker que incluía cloruro de sodio y
levadura. Finalmente, se procedió a etiquetar claramente los medios, sulfatos y
fosfatos, tanto para el inóculo como para el medio, antes de ser sometidos al
proceso de autoclave.
Regulación del pH y preparación del inóculo
Después de ser autoclavados, los materiales se trasladan a la cabina de
bioseguridad, donde se procede a mezclar el medio, sulfatos, fosfatos y diésel
en un matraz grande. Para ajustar el pH, se extraen 2 mL del medio para medir
el pH inicial, luego se ajusta a 8,5 utilizando 500 microlitros de una solución
estéril de hidróxido de sodio al 5 M (NaOH) y 2 microlitros de HCl, utilizando
tubos de ensayo limpios y puntas estériles de micropipeta. Después de mezclar
en el matraz grande, la solución se divide en tres matraces pequeños con 150
ml de medio, a los cuales se les añaden 150 microlitros de la traza 1 y 45
microlitros de la traza 2. Finalmente, se incorporan al medio. Para la
inoculación, se esteriliza el asa utilizando una lámpara de esterilización y se
raspa la cepa PM- 57 de los tubos, se coloca dentro del matraz y se deja hasta
que se disuelva la cepa. Luego, se tapa con algodón y se coloca en el shaker,
se rotula y se deja reposar durante 24 horas.

DÍA 2 al 4:
Medición de absorbancias
Las mediciones subsiguientes se llevan a cabo durante tres días consecutivos,
tanto por la mañana como por la tarde, para asegurar la consistencia de los
resultados a lo largo del tiempo. Para iniciar la medición de la absorbancia, se
reúnen los materiales requeridos, incluyendo alcohol, papel toalla, paensayo
previamente etiquetados. Una vez completada esta etapa, se apaga la cabina de
bioseguridad y se avanza hacia el espectrofotómetro, limpiando la superficie
de los tubos de ensayo con papel tisú. Se introduce el tubo blanco para calibrar
el equipo y se procede a tomar los datos de absorbancia para los tubos 1 y 2.
Finalmente, se desinfectan todos los materiales utilizados con pel tisú, 3 tubos
de ensayo, una micropipeta y las dos muestras de PM 57. Una vez que las
manos se desinfectan con alcohol, se procede a entrar en la cabina de
bioseguridad. El proceso comienza con la preparación del tubo blanco, que
contiene el medio y se emplea para calibrar el equipo. Usando la micropipeta,
se extraen 2 ml de cada muestra de PM 57 y se depositan en los tubos de agua
destilada para mantener las condiciones de higiene y evitar la contaminación
cruzada entre las muestras. Se procede a determinar la biorremediación
midiendo la absorbancia (Abs) cada 24 horas para observar el comportamiento
de la cepa expuesta al hidrocarburo, utilizando los fundamentos de la Ley de
Lambert-Beer e identificando las fases de la curva de crecimiento microbiano
con Excel.
VI. RESULTADOS

Luego de haber realizado las pruebas a los dos tubos de ensayo en el capítulo anterior,
se registraron y se calcularon los datos relacionados a la influencia de la variable
tiempo y absorbancia sobre la concentración de diesel por halomona salina sp.

Tabla 1. Absorbancia de los dos tubos de ensayo

N° de Tubo Absorbancia

22/02/24 23/02/2024 24/02/2024

5:17 p.m. 10:37 a.m. 4:45 p.m. 10:39 a.m. 4:52 p.m.

T1 0.228 1.498 1.610 1.698 1.464

T2 0.245 1.451 1.507 1.685 1.438

Nota: Elaboración propia

Para el tubo 1, se realizaron cinco mediciones de absorbancia en las fechas 22,23 y

24 de febrero del año 2024. Las mediciones del primer día fueron realizadas por la
tarde a las 5:17 p.m dando un resultado de 0.228 de absorbancia. Para el segundo día
se realizaron dos mediciones por la mañana a las 10:37 a.m. y a las 4:45 p.m. dando
como resultado 1.498 y 1.610 respectivamente. Por último, en el tercer día se
realizaron mediciones a las 10:39 a.m. y 4:52 p.m. con 1.698 y 1.464 de absorbancia
respectivamente.

Para el tubo 2, se realizaron cinco mediciones de absorbancia en las fechas 22,23 y

24 de febrero del año 2024. Las mediciones del primer día fueron realizadas por la
tarde a las 5:17 p.m dando un resultado de 0.245 de absorbancia. Para el segundo día
se realizaron dos mediciones por la mañana a las 10:37 a.m. y a las 4:45 p.m. dando
como resultado 1.451 y 1.507 respectivamente. Por último, en el tercer día se
realizaron mediciones a las 10:39 a.m. y 4:52 p.m. con 1.685 y 1.438 de absorbancia
respectivamente.
Figura 1. Curva de crecimiento

Nota: Elaboración propia

Interpretación: En la curva podemos notar que el crecimiento de la absorbancia es
un primer instante ascendente, sin embargo, notamos que en el día 3 realizado el 24
de febrero del 2024 hay una descenso de 1.2 aproximadamente. Esto se debe a las
posibles variables que podrían haber afectado a su crecimiento progresivo.

Figura 2. Promedio de los dos tubos de ensayo

Nota: Elaboración propia

Interpretación: El promedio de la curva de crecimiento fue progresivo en un primer
instante luego tuvo una variación descendente de 1.2 aproximadamente.
VII. DISCUSIONES

La investigación aborda la crucial problemática de la contaminación por diésel y la

búsqueda de soluciones efectivas a través de la biorremediación con Halomonas
salinas. Este estudio representa un segundo esfuerzo después de un intento previo
fallido. Los resultados obtenidos muestran una tendencia positiva, con una
disminución gradual en la absorbancia a lo largo del tiempo, lo que sugiere una
reducción en la concentración de diésel en el medio. Este hallazgo respalda la
hipótesis inicial de que los microorganismos podrían desempeñar un papel clave en la
remediación de sustratos contaminados con diesel.

No obstante, es crucial tener en cuenta posibles variables que podrían haber afectado
la efectividad de la biorremediación en este segundo intento. Además de la presencia
de otros contaminantes en el medio o cambios en las condiciones ambientales, es
importante considerar otros factores que podrían haber influido en la capacidad de los
microorganismos para degradar eficientemente el diésel. Por ejemplo, la
disponibilidad de nutrientes esenciales para el crecimiento bacteriano, como nitrógeno
y fósforo, podría haber sido un factor limitante en el proceso de biorremediación
(Guevara, 2021). Asimismo, como menciona Pretell (2021), la actividad enzimática
de las bacterias degradadoras de diésel puede verse afectada por la temperatura y el
pH del medio ambiente, lo que podría haber modulado su eficacia en este estudio.

Estas interferencias y limitaciones potenciales podrían haber sido responsables del

fracaso del primer trabajo, lo que subraya la importancia de abordar y comprender
estos aspectos para optimizar futuros esfuerzos de biorremediación. Rodriguez et al.
(2022) también resalta que al profundizar en la comprensión de los mecanismos
bioquímicos involucrados en la degradación de hidrocarburos por parte de Halomonas
salina, se podría mejorar el diseño de los protocolos de biorremediación y aumentar su
eficacia en la práctica.

En última instancia, aunque los resultados son alentadores y sugieren un progreso en

comparación con el intento anterior, es evidente que aún queda mucho por hacer. La
investigación continua y la refinación de los métodos son esenciales para comprender
completamente los mecanismos subyacentes de la biorremediación con Halomonas
salina y para desarrollar enfoques más efectivos en la lucha contra la contaminación
 por diesel. Este estudio representa un paso significativo en esta dirección, pero
también señala la necesidad de persistencia y un enfoque riguroso en investigaciones
futuras.

VIII. CONCLUSIONES
● Se logró con éxito la preparación del medio adecuado para el crecimiento
bacteriano(halomona salina sp (PM-57), garantizando las condiciones óptimas
para la fermentación.
● Se determinó a través de una gráfica la curva de crecimiento microbiano a lo
largo del tiempo en términos de crecimiento y proliferación en el medio de
cultivo

IX. RECOMENDACIONES
● Realizar controles para validar la efectividad del inóculo y la bioremediación
documentando detalladamente cada paso del proceso para facilitar la
identificación de posibles errores.
● Verificar y calibrar regularmente el espectrofotómetro para asegurar
mediciones precisas de tal manera que permita evitar errores posteriormente.
● Establecer un protocolo de monitoreo riguroso con intervalos frecuentes
durante el experimento para tener a detalle los cambios que se presenten en el
proceso.
● Considerar la repetición de pruebas en caso de resultados inconsistentes para
confirmar la validez de los datos.
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aristizabal, M. A. R., Hernández, G. S. H., & Riaño, P. A. B. (2022). Perspectivas en

Biorremediación para la recuperación de suelos salinos” ectivas en
Biorremediación para la recuperación de suelos salinos. REVISTA
GUARRACUCO SOSTENIBLE, 1(1).
https://publicaciones.unimeta.edu.co/index.php/guarracucosostenible/article/vie
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Manya, W. F., Lizárraga, W. C., Mormontoy, C. G., Taira, M. A., & Ramírez, P. S.
(2021). Complete genome sequence of Halomonas sp. Strain SH5A2, a
dye-degrading halotolerant bacterium isolated from the salinas and aguada
blanca national reserve in Peru. Microbiology Resource Announcements, 10(2),
10-1128. https://journals.asm.org/doi/abs/10.1128/mra.01083-20

Morales, L. T., & Méndez, G. I. (2021). Biorremediación de carbamazepina por

hongos y bacterias en aguas residuales. Revista Bionatura, 6(2), 1851-1857.
https://www.researchgate.net/profile/Gabriela-Mendez-5/publication/351646990
_Biorremediacion_de_carbamazepina_por_hongos_y_bacterias_en_aguas_resid
uales/links/6176fbfaeef53e51e1e7f618/Biorremediacion-de-carbamazepina-por-
hongos-y-bacterias-en-aguas-residuales.pdf

Rodríguez, A., Zárate, S. G., & Bastida, A. (2022). Biodiversidad bacteriana presente
en suelos contaminados con hidrocarburos para realizar biorremediación.
Revista de Ciencias Ambientales, 56(1),
178-208.https://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S2215-38962022000100178&
script=sci_arttext

Ordoñez, D. E., Abella, C. A., Echeverry, A., Paz, L. M., & Benítez, N. (2018).
Biodegradación de hidrocarburos alifáticos saturados por microorganismos
aislados de suelo contaminado con derivados del petróleo. Revista de Ciencias,
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33-44.http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0121-19352018000200033&sc
ript=sci_arttext
Guevara, A. (2021). Aislamiento e identificación de bacterias halófilas para la
biorremediación de suelos salinos. Repositorio UCV.
https://repositorio.ucv.edu.pe/handle/20.500.12692/62668
Pretell, J. (2021). Evaluación de las propiedades para biorremediación de las bacterias
psicrotolerantes aisladas en la base peruana “Machu Picchu”-Antártida.
https://cybertesis.unmsm.edu.pe/handle/20.500.12672/17292
XI. ANEXOS

Anexo 1. Esterilización de materiales.

Nota: Elaboración propia.

Anexo 2. Pesado de reactivos para el inóculo.

Nota: Elaboración propia.

Anexo 3. Medición de absorbancia en el espectrofotómetro.

Nota: Elaboración propia.

Anexo 4. Segunda fecha de medición.

Nota: Elaboración propia.

Anexo 5. Cuarta fecha de medición.

Nota: Elaboración propia.

Anexo 6. Fotografía del equipo de trabajo.

Nota: Elaboración propia.