5 Microscopias SetastiaRoberoTaboga Pati Simone ete Vlamaior RESUMO As células séo pequenas e complexas, sendo dificil a observaséo de sua estrutura e composigdo ma~ cromolecular. E mais dificil ainda clucidar como fancionam seus diversos subcompartimentos. Ha uma grande variedade de procedimentos experimentais para esse estudo, ¢ as possibilidades ¢ limitagdes dessas ‘técnicas tem determinado, em parte, a concepeao atual da célula e dos tecidos. Portanto, para compreender melhor a célula, é necesséria a compreensio geral dos métodos que foram desenvolvidos para o seu estudo. Neste capitulo, pretende-se mostrar como os efeitos da interasao de raios luminosos ou eletromagnéticos com as eélulas, ou compostos supramoleculares, podem fornecer informagdes preciosas para a compreen- sto da biologia celular e molecular. ‘MICROSCOPIA DE LUZ Os efeitos da interasao da luz com 0 meio por cla percorrido decorrem de sua natureza corpuscular ou fotdnica e ondulatéria (radiagao eletromagnética). Dois efeitos, absorpio e refragio, ocorrem como con- sequéncia da interasio da frente de onda, fotdnica ou letromagnética, com os componentes do material a ser analisado. Pode-se dizer que absorgao e refragio sio duas faces do mesmo fendmeno e sio importantes fatores a serem considerados na formasio das ima- gens aos microscépios Os microseépios so equipamentos que tém por objetivo produzir imagens aumentadas de objetos tio pequenos que sio indistintos a vista desarmada ou que, se vistos, nao revelariam aspectos texturais mais detalhados ‘A formagio de imagens pelos microscépios fun lente condensadora > lentes objetvas —> lente ocular Além do sistema éptico, 0 microseépio de luz € constituido de componentes mecénicos, que estabili- zam o sistema de lentes que produzira a imagem. A porsdo mecinica do microscépio é constituida de base ou pé, brago, platina, parafusos macrométrico © mi- crométrico, revélver das objetivas ¢ canhio da ocular s46 ela (Figura 5.1). Todos esses componentes podem variar na forma cisco é 0 que caracteriza o design dos diversos modelos de microscépios. O importante a ser ressal- tado é que a qualidade da imagem depende tanto da qualidade das lentes quanto da porg0 mecanica ‘A teoria da formagio da imagem nos micros- cépios & regida pelas leis da Fisica, que nio serio abordadas neste capitulo, pois fogem dos objetivos do presente livro, Entretanto, como as lentes dos mi- croscépios comportam-se como sistemas biconvexos, ou seja, lentes convergentes, a formagio da imagem depende da posigio do objeto em relagio ao plano focal (f) ou ao centro focal (c) da lente. Assim, tém-se imagens reais invertidas ou virtuais direitas, de acordo com a Figura 5.2. Deve-se ainda levar em conta, no processo de for- magio e na qualidade da imagem formada, 0 pader de resolugée do microscépio. Essa grandeza pode ser ma- tematicamente entendida quando se define o limite de resolugao de urna lente. Essas duas grandezas definem acapacidade de uma lente, ou do proprio microscépio, em formar imagens com detalhes minimos do objet. Em termos matemiticos, eles caracterizam a distan- cia minima entre dois pontos distintos do objeto, os uais poderio ser individualizados na imagem final. 0 poder de resolusio ¢ o limite de resolugéo sio grande~ zas inversamente proporcionais, isto é, quanto menor o limite de resolugao de uma lente, maior sera o poder Figura .1._Represenagnesquestia de um micoscpi de uz Paes tecnica doapatlo (1) base cup; ) paras mace emicométis (4) hasteou of) eter das objets lente condensed ou condensador (8 lentes btn, (1) ete cua Fur ead de Mele Vidal, 1980 Figura5.2- Sepeseigioesquemsic do taen daluz ralenecondensadora()einerge imager rel ineria(m). Es, por sia dale oc, ue acaetarn fra de ura imager i entender nd se eo rad dss luminosesno pro so de fomagio da imager em um sistema opti condo anes do plano foal (,) da et objet ir. objeto para a lente ocular (0). esse caso objet ser langado ene a plano focal F,) ¢ 0c aera (im), Prtanto em lagi 2 0b sso de formagio das mages, pai. 0 6a de uz so conergidos 1s, pls eis epic, pedi uma «al 0, 2lmager rl ser invert, Paralde resolusio do microseépio que a contém. Em outras palavras, quanto melhor for a capacidade de individua lizar dois pontos distintos do objeto (menor limite de resolusdo), maior sera a definigao da imagem a ser for- mada no aparetho (maior poder de resolug20) ‘Outro fator que deve ser levado em conta para a méxima eficiéncia na formagio de boas imagens 6 a centralizacio do feixe de luz para uma iluminasio perfeita. Essa centralizagio do feixe luminoso € co- nhecida por iluminasao de Kébler. O significado pré tico dessa iluminagio é que, uma vez centralizado 0 feixe de luz, hi uma menor ocorréncia de aberragdes € inregularidades no trajeto luminoso. Na microscopia de luz sio conhecidos muitos tipos de apatelhos, os quais apresentam sistemas de lentes e fitros que selecionam um ou outro tipo de Juz, para assim diversificar as imagens formadas. Es- ses tipos de microscépios sio enquadrados no que é conhecido por microscopias expeciais. Aqui serio trata~ das as principais e mais conhecidas dessas microsco: pias: microscopia de contraste de fase, microscopia de contraste interferencial, microscopia de polarizagio, microscopia de campo escuro, microscopia de fluores- ceéncia e microscopia confocal a laser. MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE Esse tipo de microscopia baseia-se nos prin cipios da difrasio da luz, isto é, 0 caminho do fet xe luminoso, na formagéo da imagem por esse tipo de microscépio, sofre um retardo éptico, permitindo assim que seja possivel observar materiais bioldgicos sem a coloragio, Esse tipo de microscopia foi desen- volvido pelo holandés Zerniké, na década de 1950. Isso permitiu grandes avangos nos estudos de células vvivas pois, a partir desse tipo de microscépio, pode-se observar preparados nao corados que, a microscopia de luz. convencional, apresentam-se transparentes ou com pouco contraste, © mictoscépio de contraste de fase apresenta sis temas de anéis metilicos, colocados estrategicamente no caminho da luz, Um deles localiza-se na lente con- densadora e outro nas lentes objetivas. As objetivas de fase apresentam a designacio “Ph”, que vem da palavra phase. Isso serve para diferencié-las das demais objeti- vvas. Esses anéis, depois de devidamente centralizados, promovem o retardo dptico, permitindo assim a visua lizagao do espécime sem colorasao (Figura 5.3). Micoscopis 47 A utilizasio do microscépio de contraste de fase limita-se & analise de material sem colorago, como exames ripidos de culturas de células, esfregagos vagi nais em consultérios médicos, sangue, bactérias, algas € protozodrios de ambientes aquaticos. Na érea am- biental, esse tipo de microscopia é importante para analise do contetido estomacal de animais. Na area das ciéncias dos materiais, a microscopia de contraste de fase tem tido importante papel na anilise de ma- teriais ceramicos, téxteis, emulsoes, minerais e outros produtos sintéticos. MICROSCOPIA DE CONTRASTE INTERFERENCIAL Esse tipo de microscopia funciona a base de pris mas dpticos posicionados no caminho da luz, Esses prismas modificam a fase da onda luminosa, que apare- cera contrastando-se com o meio em que se encontra 0 material a ser analisado, O microscépio de interferén- cia requer uma construgio especifica, diferente do mi croscépio de contraste de fase, que apenas apresentava anéis no caminho da luz, Esse microscépio néo requet objetivas especiais, mas o revélver deve conter ranhu- ras para alojar os prismas de interferéncia, de modo a _gerar as cores de interferéncia, que promovem a visua- lizagao do material. A microscopia interferencial mais difiundida na area biol6gica é a chamada microscopia de Normarski. Esse tipo de contraste interferencial traba- ha com a defasagem dos comprimentos de ondas. Os objetos defasantes sio aqueles que apresentam indices de refrasao distintos daqueles das regides vizinhas. Assim, essa defasagem gera uma “deformaga na imagem, permitindo o contraste interferencial, au- mentando o relevo das superficies do material anali- sado. A aplicagio desse tipo de microscopia permite a observacio de materiais biolégicos sem coloraca tornando-se titil nos monitoramentos de culturas ce~ Iulares. Em parasitologia, presta-se ao estudo da mor fologia ¢ taxonomia de pequenas larvas ¢ mimisculos caros ou outros ectoparasitos (Figura 5.3). MICROSCOPIA DE POLARIZAGAO © microscépio de polarizagéo apresenta dois prismas, ou filtros, chamados polarizador e analisador Esses filtros esto posicionados estrategicamente en- trea fonte de luz e 0 condensador (filtro polarizador) centre a objetiva e a ocular (filto analisador)48 Kelle FiguraS.3 A Micose care dponyhus chiaegoto Es tema portance rataonomia dese grupo animal, pois pode reelarmaiores etales de cerdaseextutuas epidérmicas no observ pela micascopa de campo cla comencona. B.Imagem do mesma animal vista sb miroscopia de contrast inteferencal de Normars, Observe que esrutuas que ares parecam deresses podem ra realidad er detctadas coma saliénclas (seas) Ae Cortese de Reinaldo Fetes Na mictoscopia de luz comum, os feixes de ondas Juminosas apresentam diresao de vibraga0 em todos os planos. Os filtros polarizadores promovem a sele- 40 de apenas um plano de diresao de vibrasio das ondas uminosas, 0 que é conhecido por plano da lz (polarizada (PPL). As anisotropias dpticas so fendmenos de ordem espectral conhecidos por dicroismo e birrefringéncia, dicroismo ocorre quando apenas um filtro po larizador € colocado no sistema, Ele ¢ expresso pela diferenga de absorga0 do objeto em duas diresdes de deslocamento do feixe de luz no objeto (um perpen- dicular 20 outro). A birrefringéncia ocorre quando se ceruzam perpendicularmente os dois filtros, 0 polari- zador ¢ o analisador, dependendo da diferenga entre 0s indices de refragao do objeto. De maneira pritica ¢ objetiva, os componen. tes mactomoleculares birrefringentes (anisotrépicos) apresentam britho, colorido ou nao, sob o efeito do PPL. Isso promove umn realce desses materiais em de~ trimento a outros no birrefringentes (isotr6picos), que ficam indistintos em um fundo escuro, Entre os materiais biolégicos estudados por mi- croscopia de polarizagio, pode-se citar células muscu- lares estriadas, espermatozoides de algumas espécies animais, paredes celulares, amido, coligenos ¢ DNA. Os materiais biolégicos podem apresentar bisrefiin- géncia, dependendo do grau de agregagao ¢ cristalin dade. A observagio ¢ medida das propriedades aniso: tnépicas (dicroismo e birrefringéncia) s2o importantes para 0 diagnéstico de doengas e estabelecimento da ordem molecular, durante os varios momentos da vida celular E importante lembrar que a birrefringéncia pode ser intensificada por alguns corantes. Por exemplo, 0 coligeno é uma molécula que apresenta birreftingén- cia e brilho caracteristico 4 microscopia de polariza sao. Entretanto, quando submetido a testes citoqui micos pelos corantes xylidine ponceau ou. picrossiius (Figura 5.4), a birreftingéncia ¢ intensificada, podendo inclusive exibir cores de interferéncia, que podem auxi- liar na interpretagio dos graus de agregaci molecular e organizagao dessas moléculas no tecido, Outro co- rante, que se presta muito bem a estudos anisotrépicos, €0 amul de toluidina que, por causa de suas proprieda- des citoquimicas (veja Capitulo 6), permite estudos de ordem ¢ agregagéo molecular da cromatina, da matriz extracelular ¢ de outros componentes (Figura 5.4). tour apresenta adem (las catledonares de ej caroquinha cards pope porceau aluplaada aid sta} a preecllar (cabo dest) aparece agentes. (Car ita lage xbide de gala cad a Net carte podem er csevadas cores den componente da cailager suas ages camo car‘MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO Os microscépios de campo escuro apresentam uum sistema especial de condensador. Esse conden- sador permite 4 luz ficar de tal modo inclinada, ndo atravessando o material. A luz atinge o espécime a ser analisado, ¢ somente os feixes desviados pelo objeto petcorrem 0 resto do sistema, isto é, as objetivas e as coculares, formando a imagem, Esse tipo de micros- copia € utilizado somente para pequenos materiais, como plincton, bactérias, cristais de tamano reduzido, grios de pélen e outros objetos transparentes & mi- croscopia de campo claro convencional. ‘MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA A microscopia de fluorescéncia esti baseada na propriedade fisica de algumas substancias absorverem a luz, em um determinado comprimento de onda, € emitirem luz, com comprimentos de onda maiores e niveis energéticos mais baixos. Existem componentes celulares ou moleculares naturalmente fluorescentes ¢ outros, que podem se ligar a substancias fuorescentes (fluorocromos). Uma estrutura fluorescente deverd, em Ultima analise, emiti brilho contra um fundo escuro. O microscépio de fluorescéncia ¢ diferente dos demais aparelhos citados até agora, por precisar de um sistema éptico que interaja pouco com a luz. A luz que alimenta seu sistema éptico é uma luz de mer- ciitio de alta pressio, cujos picos mais caracteristicos variam entre 312 e 579 nm. ‘Outra peculiaridade do microscépio de fluores- céncia sio os sistemas de filtros requeridos para de tectar 0 brilho do material contra o fundo negro. Sa0 os chamados jiltros de excitasao ¢ filtros de barragem. Os filtros de excitagao localizam-se logo apés a saida da fonte de luz e antes do condensador, tendo como finalidade selecionar 0 comprimento de onda deseja~ do. Os filtros de barragem localizam-se entre a objeti- va ea ocular, isto é, apds 0 objeto, tendo como funsio primordial deixar passar somente a luz fuorescente cemitida pelo espécime analisado,barrando assim a luz de excitagao (Figura 5.5). Assim, 0 material fuoresce contra um fundo escuro, ‘A microscopia de fluorescéncia tem uma am- pla aplicasao nas eiéncias biolégicas por promover a identificagao de compostos naturalmente fluorescen- tes, como a clorofila, a lignina das patedes celulares Micoscopis 49 ,zrt Za=-| |e —> > (|= | S=]1 2 |2}/= Ws l{tes| = = ieee Figura.S —Regresentagioesquemtica da paso dos componentes na rmignscopa de forescenca, Os tons arte dfn de ude alta presao ¢ sto dreconads parofito de ect seledona os ftons de comprimentodeerinado (>, eatingeo abet (0). Este emits uz scene (>), que pasar pl ft de barage 2), enuant alu de enc boqueada Aimage sera se formada pela uz que aves ofito de naragem. vegetais, a elastina e o coligeno, entre outros, Embora sejam muitos os compostos fluorescentes, hé ainda uma quantidade maior de compostos (fluorocromos) que, combinados com estruturas celulares, tornam- -nas fluorescentes e permitem a sua identificagio ¢ localizagio. O exemplo classico de fluorocromo é 0 corante chamado alaranjade de acridina, que se liga aos acidos nucleicos ¢ promove uma fuorescéncia amarelo-esverdeada a0 DNA e avermelhada a0 RNA. A cosina também se comporta como fluorocromo, au mentando a fluorescéncia natural da elastina (Figura 5.6). Todos os componentes observados pela micros- copia de fluorescéncia podem ser quantificados pelo processo de fluorometria, que ausilia sobremaneira os estudos na drea da citoquimica normal e patolégica. Outra aplicagéo da microscopia de fluorescéncia, que nio pode ser negligenciada, é a conjugagéo de anti- corpos a fuorocromos ¢ a utilizagio destes na imu nocitoquimica e nos processos de hibridagio in situ fluorescente (FISH). MICROSCOPIA CONFOCAL A LASER Esse microscépio, desenvolvido recentemente ¢ comercialmente disponivel a partir de 1987, tem suas peculiaridades, permitindo, por exemplo, a observa go de materiais espessos, sem coloragio prévia, vivos ou pré-fixados, Esse aparelho pode obter im planos focais especificos ou cortes dpticos. E tes dpticos sio, entio, estocados em um computador e ens de cor50 Acie Figura 5.6 Obseragan da ucescnc densa enum conehisoégia de ua ara msc coado pel hematnina epics. Obsenara imensa uoescnci emit pel cama esta inera se). podem ser utilizados na reconstrusao tridimensional e visualizagdo da estrutura como um todo, Dessa forma, (0s microse6pios tradicionais trabalham com imagens analégicas, enquanto 0 confocal a Jaser, com imagem digital. Esse aparetho trabalha com a éptica de um microscépio de fluorescéncia, mas utiliza laser como fonte de luz alimentadora do sistema. Q microscé- pio confocal permite o detalhamento de estruturas subcelulares que néo apresentam limite de resolugao compativel ao da microscopia de luz fluorescente con- vencional, como microtibulos e outros elementos fi- brilares do citoesqueleto ¢ elementos finos da matriz, extracelular (Figura 5.7). funcionamento de um microseépio confocal a laser 6 complexo, embora a ideia central seja bastante simples. Esse aparelho conta com o mesmo sistema 6ptico da microscopia de Auorescéncia tradicional, com a diferenga de que, no microscépio a laser, a ilu- minasio nio se dé em todo campo, mas sim em pe- quenos pontos de iluminagio pelo laser. Além disso, acima da objetiva ha um orificio chamado pinole ow fris, que permite a eliminag2o da luz proveniente de objetos que estejam fora do plano focal. Dessa forma, as imagens de objetos fora de foco, que contribuem para a imagem final na microscopia de fluorescéncia, sio climinadas da imagem confocal Figura 5.7 Observagi da juncéo nevomusclr pla miscapia conf «al. O mater marca com a-bungartxina vem), que sega aos receptors de acetnae cam amicorp antnerhlamen 200 (verde, que trac os ana. Apis obtengo de uma sri de cartes Gos, les foram sobreposas, obtendo-se uma nia imagem da juno esa relagio cas ‘ibras maculae Cotesia de Mara ia Marques, Dada a sensibilidade dos detectores fotoelétricos © 0 controle eletrdnico da intensidade dos sinais, ima~ gens pouco evidentes & microscopia de fluorescéncia podem ser observadas a0 microscépio confocal ‘Uma das formas de obtengdo de imagens a0 con focal é a detecsio de luz refletida. Nessa condigio, objetos ou substancias refletoras podem ser visualiza- dos com todas as vantagens da microscopia confocal (Figura 5.8) Figura5.8. Paes esereoscpics de imagem ob pela reconstruc ‘oimensional da preside ean d peroxidase, cpad nde ‘buna, que se lia ans expt acti, Oscars pics sbadospor elds vam sbrepntosaumatcamee assim como a eno ds parsers. Cares de at ila NaruesAPLICACOES DA MICROSCOPIA DE LUZ NAS ANALISES QUANTITATIVAS E DE PADROES TEXTURAIS Para a quantificagao de elementos ou de macto- moléculas na célula, existem varios sistemas. O prin- cipal deles € 0 conhecido citofatémetro ow microes- pectrofetimetro, Esse aparclho comporta-se como um microscépio comum, em seu sistema éptico, entretanto ele apresenta uma fotocélula que capta 6s sinais Iuminosos e os transfere para um terminal fotométrico (a semelhanga do espectrofotdmetto utilizado nas dosagens bioquimieas), que transfor- mara os valores absorciométricos em valores quan- titativos. A citofotometria tem tido ampla aplicagao na area de biologia celular, principalmente para a quantificagao de DNA e de proteinas, entre outras macromoléculas. Aos microscépios de luz podem ainda ser aco- plados sistemas analisadores de imagens, consistindo basicamente de microcimeras de video que captam a imagem e a transferem para um terminal de computa~ dores tipo PC. Softwares especificos permitem a andli- se de padrdes texturais dos componentes morfolégicos nos tecidos, como a distribuigao das massas cromatini- cas em niicleos ou, até mesmo, padrées de arranjo das fibras da matriz extracclular. Essas avaliagdes ocorrem, basicamente, a partir da densitometria dptica. E im- portante ressaltar que esses padroes texturais requerem discriptores matematicos complexos, mas a associagl0 de biologistas celulares a cientistas da computagao tem gerado grandes progressos nessa area, MICROSCOPIA ELETRONICA © desenvolvimento da microscopia eletréni- a teve inicio principalmente a partir de estudos do comportamento ondulatério dos elétrons, que, como foi demonstrado, comportam-se como fotons num sistema de vicuo. Um dos primeitos experimentos a respeito da dptica dos feixes eletrOnicos ocorreu na década de 1920, a partir dos achados de Busch. Esse autor provou que seria possivel conduzir elétrons com © uso de lentes cletromagnéticas. Bascados nesses principios, em 1931, tendo na lideranga o pesquisador Ruska, foram iniciados estudos para a construgio do primeiro microscépio eletranico. Os principios que regem a dptica da microsco- pia eletronica sfo os mesmos deseritos para a micros Meaoscopias 51 copia de luz, ¢ o primeiro apresenta-se de maneira invertida, isto 6, a fonte geradora dos feixes de elé- trons esta na porglo superior do aparelho, As princi~ pais diferengas entre os dois tipos de microseopia sto apresentadas na Tabela 5.1 A microscopia eletrdnica, como a microscopia de Juz, também apresenta virios tipos de aparelhos com especificidades quanto a0 funcionamento ¢ 4 wtili- zasio, Basicamente, pode-se dizer que existem duas formas de microscopia eletrdnica: a microscopia ele~ twonica de transmissio ¢ a microscopia cletronica de varredura Microscopia eletrénica de transmissao © fancionamento do microscépio eletrénico de transmissio esta relacionado, principalmente, 4 natu- reza dos feixes de elétrons, utilizados na formasio da imagem. Nesse tipo de microscopia, os elétrons tém de interagir com o objeto para fornecerem a imagem. O objeto deve ser extremamente fino para permitir a passagem dos elétrons. Em linhas gerais, 0 microscépio eletronico de transmissdo € composto por uma fonte geradora de elétrons que caminha por um sistema de lentes ele~ tromagnéticas, dispostas em uma coluna que fan- ciona num sistema de alto vacuo na ordem de 107 “Torr. Os feixes de elétrons sto acelerados ¢ estes se desprendem do filamento por uma diferenga de po- tencial que varia de 20 a 100 KV num microscépio de transmissdo comum, mas que pode chegar até 1.000 KV em alguns modelos especiais. Ao sairem da fonte sgeradora, eles sZo encaminhados para a lente conden- sadora dos feixes, que os direciona para o espécime O padtio de transparéncia aos elétrons sera ampliado Tabela 5.1. Principais diferencas entre as rmicroscopias de luz e eletrénica quanto aos aspectos de funcionamento e formacao da imagem (retirado de Benchimol, 1996). perry Microscopia de | Mi eaters Perec Fonte luzwishe létrons Lentes De video Eletromagnéticas Limite deresoluggo 20am o2nm Formagio da imagem — Absorgio Héron-opacidade52 ella subsequentemente pelas lentes intermedidria e pro- jetora, Entretanto, a imagem ainda nao pode ser re gistrada pela retina. As imagens ampliadas pela lente projetora so projetadas sobre um anteparo fluores- cente, uma chapa fotografica ou um monitor de TV. ‘A formasio final da imagem pode ser interpre~ tada como sendo eletrodensa, ou seja, escura, quando os elétrons encontram elementos como ferro, 6smio, chumbo ou ouro, ¢ eletrohicida ou clara, quando os clétrons encontram elementos como hidrogénio, carbono, nitrogénio ou oxigénio. O material biolé: gico € constituido na grande maioria por elementos que se comportam como elementos eletroliicidos, de modo que € necessério contrastar o material. Pode- ~se contrastar o material biolégico com metais pesa~ dos para se conseguir um bom contraste na imagem final (Figura 5.9). Microscopia eletrénica de alta voltagem Na microscopia eletrdnica de transmissio co mum, como jé foi dito anteriormente, a acelerasio eletronica se dé por volta de 100 KV. Entretanto, existem alguns tipos de microscépios eletronicos que aceleram seus elétrons entre 500 e 1.000 KV. Esses microscépios sio conhecidos como microscépioseletré- nicos de alta voltagem ou de alta acelerasdo. Os princi- pios de fancionamento e a estrutura geral do aparelho Figura5.9 Micoscopaeletnica de vansmisso de cont la demas em ese degranulgdo ma préstata de rato em pe regesso apis acastago experimental. nove! o aspect aa cell ei nando seus grnuls os quis apresentam graus arises de eletredensade se assemelham muito, com a diferenga de que esses aparelhos sio extremamente grandes, chegando a ocupar edificios de até 3 andares. A utilizas20 do microse6pio de alta voltagem veio, de certa maneira, revolucionar a biologia estru- tural, pois gragas a esse aparelho, muitas estruturas subcelulares puderam ser descritas, como a organi- zasio tridimensional dos componentes do citoes~ qucleto, pela possibilidade de se utilizarem espéci- mes com espessura na casa dos micrémetros ¢ até mesmo células inteiras, 0 que nio seria possivel na microscopia eletrénica de transmissao convencional Microscopia eletranica de varredura A microscopia eletronica de transmissio fornece informasées a partir de cortes ultrafinos de eéhulas ou tecidos, pois a obtengao da imagem depende da inte- aso dos elétrons com o material, a0 ser atravessado por eles ou nao, O microseépio eletronico de varredura pode reve- lar feigoes topograficas de uma superficie com grande nitidez de detalhes, Esse aparelho fornece imagens tri- dimensionais, tanto de objetos relativamente grandes, como vermes ¢ insetos, quanto de células livres, como tecidos animais e vegetais ou, até mesmo, embrides ¢ fragmentos geolégicos em anilises de granulometria e textura de solos (Figura 5.10) Essas imagens tridimensionais sao obtidas quan: do nio sio utilizados os elétrons transmitidos, ¢ sim Figura5.10 Micoscopiadevaredur forragdoAdamatia (municipio de iments geoégicas POs miners de aalcna servadosno centro sruturas pols Corsa de Maxrandt Net mp9os elétrons secundarios ou refletidos, que partem da superficie da amostra quando esta é bombardeada pelo feixe eletronico, Um fator que deve ser levado em conta quando se comparam as microscopias ele~ tronicas de transmissio e de varredura é a maneira de preparar as amostras a serem analisadas. As principais diferencas esto apresentadas na Tabela 5.2. © microscépio eletrénico de varredura esta constituido de um sistema de gerasao de clétrons que varre a superficie do espécime; um local em que deposita-se a amostra devidamente preparada, que partiré o sinal que dard a origem da imagem; um sis- tema de captasao dos elétrons secundétios, que cole~ ta 0 sinal eo amplifica e, por tiltimo, um sistema para compor a imagem final, que consiste de um monitor de video. MICROSCOPIA DE TUNELAMENTO QUANTICO EDEFORGA ATOMICA Esse tipo especial de microscépio eleva a potén- cia visual do olho humano em 1 milhao de vezes. De~ senvolvidos na década de 1980, eles multiplicam em 100 vezes a capacidade dos microseé A concepgao original desses aparelhos resultou dos trabalhos de dois cientistas suigos, Benning e Rohrer, que ganharam 0 Prémio Nobel de Fisica, em 1986. O principio da microscopia de tunclamento parte do pressuposto de que todos os corpos tém caracterist- ios eletrdnicos. Tabela 5.2. Comparagdo entre a microscopia eletrénica de transmissio e ade varredura quanto a0 preparo das amostras biol6gicas (reproduzido de Benchimol, 1996). een Coed erect Perc) Foracio pelo alutaraldeldo Ps fixago peo tetrxido de ésmio Desidratacao em série alodlca ou acetona Material dever serinclido em Material deverépassar por uma resinas especais secagem especial —"ponto critica" Evaporagio com ouro na superficie a seranalsada Nao necessta da contrastagéo Urtramicrotomia para obtengdo os cortsultrafinos Comastagio com metas pesados Micoscopias cas ondulatérias ¢ emitem energia. Assim, 0 apare Iho apresenta uma agulha que dista da superficie da amostra em 1 A, ou seja, um milionésimo de mili- metro. Essa agulha percorre a superficie da amostra ¢ forma uma corrente energética, chamada funelamen: fo, Essa corrente atrai os elétrons do material para a agulha, formando uma espécie de tiinel. Quando a agulha passa sobre um atomo, a corrente aumenta ¢ quando percorre os espasos entre os atomos, ela di- minui, Esses sinais de aumento ¢ diminuigao da cor~ rente sto transmitidos para a tela de um computador, na qual se formam as imagens que se assemelham a superficie de vales ¢ montanhas. O microseépio de forga atomica assemelha-se a0 de tunelamento quantico, com a diferenga de que este iiltimo apresenta um microespelho e um feixe de laser sobre a agulha. Esse fato permite uma me- nor agressividade 4 amostra ¢ a deteccio de deta- Ihes de superficie, sem maiores interferéncias com a amostra (Figura 5.11). Esse tipo de instrumento permite também a obtengao de imagens em solugéo ow de sequéncias que representam reagdes quimi- cas ou modificagbes estruturais 20 longo do tempo. Nesse tipo de aparetho também pode ser avaliada a estrutura atémica de biomoléculas, Figura5.11 resquidel de ula, aps remo da por fies que 2 tog das mer cade, Note também aescala da adem de and F.GarvahoeNvaldo A Paizo Observaco das cadeiaspolsacariias de quia, nance nee Notea andl tabiose ao ongo da ts. Cortes de Hermans 854 ella REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Benchimal M. Métodos de estudos em biologia celular. Aportila técnica. Rio de Janeiro; 1996, 2. Binning G, Robrer H, Gerber C, Weibel E, Surface studies by scanning tunneling microscopy. Am Phys Soc 1982; 49:57-60. 3. Lacey AJ.The principles and aims of light microscopy: In: Light microscopy in biology: a practieal approach. Lacey AJ (ed.). Oxford: IRL Press; 1991. p.1-24. 4. Lenzi HL, Pelajo- Machado M, Silva BV, Panasco MS. Microscopia de varredusa laser confocal: I~ Prineipios e aplica~ ses médicas. NewsL.ab, 1996;16:62-71 5. Lichtman JW. Confocal microscopy. Sei Am. 199437: 305) (6, Mello MLS, Vidal BC. 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