» Espectroscopia de fluorescencia 265 Cubeta de la muestra Luz de excitacion Fuente U de luz — Filtro de excitacién (primario) Luz fluorescente (emitida) . Filtro de [7] tuorescencia (secundario) ee Fototubo 0 tubo fotomultiplicador | Fic. 94. Componentes de un fotofluorémetro de filtro. 92 Practica de anédlisis por fluorescencia esc q Medida de la intensidad de fluorescencia. En la figura 9.4 se muestran los componentes esenciales de un fluorémetro (0 fluorimetro) y su disposi- cién en él, instrumento que se emplea para medir la intensidad de fluo- | rescencia, F. La fuente de luz debe ser muy intensa* y muy estable porque F depende directamente de I). Las amparas de arco de mercurio y de xenén son de uso comin. Estas lmparas emiten en las regiones visible y ultravioleta. La emi- | sién de la lémpara de xenén se distribuye uniformemente sobre un amplio intervalo de longitud de onda, mientras que la de una lémpara de mercurio se concentra en varias bandas muy intensas, entre las cuales las de 254 y 365 nm son de gran valor como radiacién de excitacién. g Para alcanzar determinado valor de excitacién, y para reducir la luz ex- » trafia, se selecciona una banda de radiacién més 0 menos estrecha a ‘partir 5 Y. + La radiacién de ta fuente puede dafiar de manera permanente los ojos. Nunca se ha de mirar la fuente de luz de un fluorémetro sin llevar protegides los ojos.as Espectroscopia de fluorescencia de la radiacién emitida por la fuente de luz. Se efectia esta seleccién me. diante el filtro de excitacidn, que en la mayoria de los fluorimetros es ws filtro de vidrio que transmite luz de la Iongitud de onda deseada y absorb todas las demés radiaciones. Tales filtros pueden transmitir una Banda de rs. diacin de 50.100 nm de anchura, Los fltros son cambiables, y se dispone ag tuna seleceién que permite escoger el que transmita una banda de radiacién {gue corresponda al méximo de absorcién del compuesto, pero que suprima Ih lus de longitudes de onda més corta y mas larga. El filtro de excitacién también se conoce como filtro primario. ‘Ahora, la luz de excitacién pasa por la cubeta de la muestra. Las cubetas y los disclventes pueden ser fluorescentes y se han de escoger euidadosa. mente. Las cubetas de vidrio son adecuadas para la mayor parte de los ané isis por fluorescencia; por debajo de 320 nm puede usarse el cuarzo, ‘Obviamente, la muestra emite luz fluorescente en todas direcciones. La ‘medida de la intensidad de fluorescencia en la direccién de propagacién de fa radiacién de excitacién es extremadamente dificil, porque comporta la weaida dela fez emitida respecte a una alta intensidad de fondo de fur rane mitida. Este problema se supera observando la fluorescencia en angulo recto. icon el haz de excitacién (véase la figura 94). Determinada parte de la lz transmitida se puede dispersar en esta direccién y esta luz indeseable se separa mediante el filtro de fluorescencia (filtro secundario), que se selec ciona de modo que tenga maxima transmisién en el maximo de fluorescencia. ‘A continuacién, la fluorescencia alcanza un fototubo o fotomultiplicador, | produciendo asf una sefial eléctrica que se amplifica y mide con un medidor | para indicar la intensidad de fluorescens El instrumento descrito y representado en la figura 9.4 es un Auorime tio de filtro. Puesto que incorpora deteccién fotoeléctrica de la intensidad de fluorescencia, este instrumento puede recibir el nombre de fotofuorime tro. Actualmente se dispone de instrumentos en que se han reemplazado los filtros de excitacién y fluorescencia por monocromadores, que permiten la seleccién de bandas de radiacién muy estrechas, Estos instrumentos, que se aman espectrofotofluorimetros, son capaces de medir los espectros de exc tacion y fluorescencia de la misma manera que se puede utilizar un espect1- fotémetro para determinar espectros de absorc Aplicaciones. La principal ventaja del andlisis por fuorescencia es 5 sensibilidad, Aunque el rendimiento cudntico, @, es casi siempre menor qué Ja unidad, se puede forzar la intensidad de fluorescencia, F, hasta un valot muy alto con s6lo incrementar la intensidad de la radiacién de excitacion Otro factor que contribuye a esa gran sensibilidad es la excelente caps de rendimiento de los modernos tubos fotomultiplicadores, con los au S© pueden medir con precision muy bajas intensidades de luz emitida. Permites famente concentraciones de compuestos fluorescentes © + Espectroscopia de fluorescenci, © margen 10-10 My lay Suele ser lineal. "aunque rara ver las cantide dosifeacin som tan pequetas ct {ne concentraciones de drozas y ¢ tras bioldgicas puede ser extrem: Gia tiene amplia aplicacion en es Siemos de absorcion de In droge fos compuestos de origen biologt «son potenciales interferencias eh ig“ paracién preliminar de estas mex Por fluorescencia del componente Quizs la droga fuoreseene de excitacién esté a 350 nm y el m Asi, este compuesto absorbe uz + aparece azul la solucion fuoresce tico de uorescencia para la qui ta gran absortividad molar dela + muy intensa fluorescencia en ded sw bargo, se extingue marcadamente v7 a. cl espectro de absorcién. Este eje ciones del disolvente pueden ejcre ‘A menudo, las vitaminas se € Ja tiamina (itamina Bes un ejet cia. La tiamina (8) no es fluores tigcromo (4) Io es fuertemente. L: sys oS COE ‘ B tino, Bt tocrome reulante se ext rimétricamente; el maximo de exci W, Muorescencia a unos 440 nm. Si la hay que separarla de las sustanciEspectroscopla de fluorescencia * te de hn, Se efectia esta selecisn me. te de Mevora de los forimetos. es un 2M Jaga de ondn deseadn y absorbe se Jon trai Wis Banda de Te ee son eambiabes,y se dispone de xs Aletta una banda. de Tadicion 3 ae eh eompucto, pero que suprin ow ds larga. Elrod exlacion vier ia cubeta de Ia muestra, Las cubetas speelta'y se han de escoger clidadose, itcans por fa mayor parte de os and: 1SSitfhm puede uerse el cuarz, ie, tuoescene en todas direciones, La wean'en In direceén de propagacion de ‘StSfamente dil, porque comport ls a als Inensidad de fondo de Wr rane Shando ia fluorescencia en Sngulo recto fra 94) Detrminada parte de a liz ‘Gis avecion y est ur indesable se scenia (tro secandario), be se selec “Ske en el manimo de forercencl, ‘lana un folotubo 0 fotomltplcador ue sc amplifieny mide con un medidor sad ‘Sentado en a figura 94 es un fuorime ‘teen fotolctica de In intensidad puede reir el nombre de fofoorime Taments en que se han reemplazado los {por menccromadors, que permiten Ia uy cvechas Enon insrumentos, que s© 2 apace de medi low especrom de ex Imanrn que se puede alzar un expect we de anor tie del anise por Auorescencia es = O euintico, 6, ex cai siempre menor ave Tide's nuorescencia, F, hasta‘un valor Intend de la radigcion de extol, yan tenibidad esi excelente capaidad Stes fotomultipcadores, con Tos au $ sls intnadades de hr emda, PermikeD tines de compusos, Huorescentes © cosa Ta pul to nce ae ae ar ema on tc ene ‘on poten intrfrencias en eos enstyon Tal ver Sea tetra Ine a a ca ores Me os me ee a cmeh® Mt Ge Por cere eer coe eee a aad po peep eo eee Sar ego seman ee oe Oa as po ee eerie iene ee ee Aa eee ees ae Sa a ae ee N ig? cH, Er CH,CH,OH-2c- es ‘CH ‘CHy formas dad de este one, Ss. Sy -cH.cH.OH nx—cn, ‘ cH XN $ tno, et tocromo reutante se extrac en alcool isouiice y # mide Mu fimétricamente; el maximo de excitacion esté a 365 nm y el méximo de ", florescencia a unos 440 nm. Si Ia tiamina se presenta en tabletas 0 cApsulas, hy que separarla de las sustancias interferentes, Incluso realizando esta eed—[S—— Espectroscopia de fluo la de fluorescenci Pla do Mrescene, pia es fh , y spectro a ont als lt eae eee a ar arith comprar perteament a eviabiiad de Rc." pytorimetron Cae savamente el epatador de lstrat, de instrument para ar ig'ma SS actment, Ee sera para I gui de referencia Inco aunae'varic in tem | ele eco, se mide nen garcons pater manner Se Crane" LAN Sa fuorescencia de ie quinina y el tlocromo son casi idénticos, lo cual pon? &,24°e¥S5e9 y 4308) c cae lamers ret © y Sorin 8 9 1200 ea mclet(amapce Soro ieee eee ae See Proton tet he rn! ids PF cae a RST ge ln ogo antes, analgésicos (71, antihistaminicos, y muchos otros medicamentos [{'s, | @S°°tta sglucién de la luz {as aplicaciones cuaiatvas de la fuorescencia son tambien imgertayeh: | con estos ensayos cualitaivos facilitan su identifcacion, La fuoresserce 2 eparan, en el mi na propiedad may etnias para as sus qt somscnsrse | _ Se Beparan, com Er calizazign che ma obraia ds papel o de capa fina. Se realiza ficliman, | 3ét 36 tulle Oe, Stin I ecaleacgn de aoa sobre papel crmatopico, fumes Re |‘, 80 9 0, ee Sl mmatograma con radacén de ectalén adecuadn (resulta inca ou hy | 08 te 18 TL Se cre par meer) Yee forts dos compu |e tem oh frados en zonas de papel. Se sefalan con un lipiz estas zonas para deen ‘Sheiones del profesor de | registro Permanente, Si las moléculas que se estan separande no soni, |S! PEzen! (oe controle ‘sci pueden conven eras recesses Caged, | esata foe eam la separacién. Por ejemplo, los aminoscidos pueden reaccionar con cleries Sulfuric 0.1 Ny se aju de danso{Sttinetaminnattateno uo} 5, pars dr danse | aur ONY salt dos, 6, que son altamente fluorescentes y facilmente detectables despues de a iateosiad Is "teparacioneromatogrie. Otra forma de detec comusiy oe a | eta gafien de nen S0;Cl $O,;NHCHR El profesor de pra a unin Se aluye esta Il + RGHCOOH ew + HCL fluorescencia caiga en! wa potrones. Se mide la 2 NCH. cién a partir de lac (CHs)2 solucién original. y Para obtener rest | cae ee a muestra o ‘9.4. Anélisis por N(CHs)2 5 Fescentes es la de incorporar una sustancia fluorescente en el sistema cro- matogrifico; entonces, en cualquier lugar que tales compuestos aparezcan | la estabilidad del ins sobre Ia placa cromatogréfica pueden destacarse como manchas oscuras sobre} cinco soluciones pat un fondo fluorescente. | Tmisma intensidad qage - Espectroscopia de fluorese, de fluorescencia enclg | spectroscope Pe uorescentes en Ia muestra o, ig 9.4. Anélisis por fluorescencia de quinina seencia de una alfcuota de la ace | experiment? 1 oxidacion, e REACTIVOS Y APARATOS $ anilisis por fluorescencia, e. Ps 5 un, la estabilidad de la fuente de jo rofuorimetro, Cualquier fotofluorimetro de filtro es satistactori. No Nea Sete pe ay elena potron de quinina. Se ajusta arte 4, ggran instruccione Pistrumeno para dar tamer’ } *,@fgstramento. En este experiment, como en Ia mayor parte delta neluso aunque varie la intensig, © jatico, se miden intensidades de fluorescencia relativas. aque los méximos de excitacion'y gy adecuado el Coleman B, (filtro Corning $847). El Coleman PC, (filtros ticos, lo eval permis ¥ Syning 3389 ¥ 4308) es un filtro de fluorescencia satisfactorio. tedidas. ‘Solucién patrén de sulfato de quinina. Se pesan exactamente unos 10 mg Sarmacéuticos fluorimétricamen. | ge sulfato de quinina puro, se vierten a un matraz aforado de 1000 ml, y se steroides, sedativos [6], tranquili. | suelven en el suficiente dcido sulftirico 0,1 N para levar al enrase. Se pro- ence won lamblia tepals oon dcidos y bases fuerte y TROCEDDATENTS igenuscacon. La Aorestencla'&e | gy prepara, en el mls dia en que se vajan a llr ino soci tlas que se someten a una se | yes de sullato de quinine; para ello se introducen, con una pipeta, Lf, 20, fain fina, Se realiza fécilmente | 9,40 y 50 ml de solucién patrén de sulfato de quinina en matraces afo- Seen Demat, memennnde 2] exeg6| rados de 100 ml. Se enrasa con-Aéldo/saltérie 1 N. zencia de los compuestos concen ‘Se Ilena la cubeta de muestra con la mas concentrada de las cinco solu- seca Ios eompuestos cance | onr de quinine. Se pone en marcha el ftoNuerinetro sguendo Is ind Mini esas zonas para dar un | ‘cies del profesor de prictics, Con a cubeta de musts lena en su ile eaat feparando no son flue | ye ajustan los controles del instrumento para obtener una tecture. de. _anregentes antes o después de | intnsidad del méximo de fluorescencia, Se sustituye Ia solucién por acido siygten renccionar con cloruro | sultrico 0,1 W y se ajusta el aparato al cero de intensidad. A continuation Te Paes dar dansitaminoéci | se mide la intensidad de las otras cuatro soluciones de quinine. Se pispurs de detectar tees una gréfica de intensidad de fluorescencia en funcién de la concentracién de rcompucston mofo, Siete de ne }0;NHCHR El profesor de practicas entreg: oon auinina Se diye dota con Acido + HCI fluorescencia caiga entre los extremos patrons, Se mide la intensidad del problema ‘olin original Para obtener resultados mas precisos se mediria la solucion problema al jets en el sistema cro- mismo tiempo que se ea ie ‘patrones. Se comprueba an ee faré una solucién problema de sulfato de Ifurico 0,1 N hasta que su intensidad de ‘de las intensidades de las soluciones diluido y se lee su concentra. entracién de la N(CH,), ‘ te fles compucsion aparezan | In stbided el instrumento,vlvendo mei iy mis ns . nchasexcuras sobre} doco soluciones patrones yseajustando ow cntrotes Hasta ave Indguen hsm Intenaldad que en et ajuste Inia Ba, eR a ee ee)a 270 Espectroscopia de fluorescenei, ' . Bigrati e York, ». p. 23, "i a i oe sence, New Academic Press, New York, 1971, olectes 2s fea Sons, New York, 1973. Yoh Wiley ang 9 Miles, CT. y°G."H, Schenk, Anal. Lett, 4, 61 (1971). Sehenks'G- HL FH. Boyer, €°7, Miles’y D.R. Wire, Anel. Chem, 44, 1593 (smn, xe Problemas 1, Obténgase Ia ecuacién 9.4 2. Se midié la fuorescencia de soluciones etandlicas de griscofulvina con siguientes resultados, oa Concentracién (wg/ml) Fluorescencia (unidades arbitrarias) » Sereee Ane noe Brbitreetes) 0.02 130 0.08 230 j 0.06 36.6 0.08 494 00 615 \ (a) ¢Se cumple Ia ec. 947 (b) Una solucién de una muestra de griseofulvina de pureza desconocida con tenia 0,085 g/ml de muestra. La fluorescencia de la solucidn, cn la misina eseals que Jos datos anteriores, fue de 46 unidas de la muestra 3. Reflexiénese sobre las razones por las que el tiocromo es fluorescente mien tras que la tlamina no lo es. 4 des. Caledlese el porcentaje de pureza yp Capitulo 10 Refractometria 40. Principios de la refrac Indice de refraccién. La. viesa. La relacion de velocida cia se conoce como indice di todos los sélidos y liquidos ex (y casi equivalente), # donde n, es el indice de ref una velocidad vy; el supe! longitud de onda de la luz. + Es posible demostrar qu es el angulo de ir lar a la interfase entre el el medio M, medido tami estas relaciones, La ec. 10.1