1

คุณสมบัติของยีสตและราที่มีบทบาทในการหมักขาวหมากและสาโท

Properties of Yeasts and Moulds Involed in Khaomak and Satho Fermentation

คํานํา

ขาว เปนพืชเศรษฐกิจของไทยและเปนอาหารหลักประจําชาติ สามารถนํามาใชเปนวัตถุดิบ

ในการผลิตเปนเครื่องดื่มหมักพื้นบาน เชน กระแช อุ น้ําขาว น้ําแดง ซึ่งเปนเครื่องดื่มที่แพรหลาย
ในกลุมประชาชนในชนบทและผูมีรายไดนอ ย เครื่องดื่มเหลานี้ไดจากการหมักขาวจาว ขาวเหนียว
ขาวก่ํา โดยใชลูกแปงซึ่งมีหัวเชื้อจุลินทรียที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติเปนแหลงใหจุลินทรียในการหมัก
(ปราโมทย, 2538) ผลิตภัณฑที่ไมเปนเครื่องดื่ม ไดแก ขาวหมาก ซึ่งปจจุบันเปนผลิตภัณฑที่
ไดรับความนิยมในการบริโภค และมีจําหนายตามหางสรรพสินคาทั่วไป

ผลิตภัณฑเหลานี้ผลิตโดยการหมักขาวของจุลินทรีย โดยนําขาวเหนียวมานึ่งใหสุก ลาง

ยางออกดวยน้าํ ผึ่งใหแหง แลวผสมลู์ กแปงบดลงไป หมักไว 2-3 วัน ไดเปนขาวหมาก คือขาว
ที่ถูกยอยสลายดวยเอนไซมของเชืา้อสราที ตร ่เปลี่ยนแปงเปนน้ําตาลทําใหมีรสหวาน หรือหากมีการเติม
น้ําและน้ําตาลลงไป และหมั ษตกรตศอไปอีก 7-10 วัน จะไดเครื่องดื่มแอลกอฮอลที่เรียกวา สาโท
ล ย
ั เก
หรือกระแช หรือน้ํายขาว า กระบวนการหมักนี้เปนการหมักเชื้อผสม โดยเชื้อราในลูกแปงจะเปลี่ยน
แปงใหเปนน้ําตาล
ท
ิ
าว เชื้อราที่พบในลูกแปง ไดแก Amylomyces rouxii และ Rhizopus oryzae ซึ่ง
ห
มีความสามารถผลิ ท
ิ ัล ม ตเอนไซมแอลฟา-อมัยเลส และกลูโคอมัยเลส จากนั้นยีสต Saccharomyces
ม ร ู้ดิจ
cerevisiae
ว า จะหมักน้ําตาลใหเปนแอลกอฮอลและกาซคารบอนไดออกไซด (ชัยวัฒน, 2520; พิไล
ค
คลังพรรณ, 2523; นภา, 2535) และยังมีการพบยีสตชนิดอื่น เชน Endomycopsis fibuliger (ปจจุบนั
เปลี่ยนชื่อเปน Saccharomycopsis fibuligera) มีความสามารถยอยแปงใหเปนน้าํ ตาล และมี
ความสามารถในการหมักทีแ่ ตกตางไป (Sukhumavasi et al., 1975) อาจพบแบคทีเรียกรดแลคติก
ซึ่งสวนใหญไดแก Pediococcus pentosaceus ทําใหสภาพของเครื่องดื่มเปนกรดเหมาะกับการ
เจริญของยีสต และชวยจํากัดการเจริญของจุลินทรียปนเปอนอื่น ๆ สงผลใหเครื่องดื่มมีรสเปรี้ยว
เล็กนอยนอกจากนั้นอาจมีเชือ้ น้ําสมสายชู เชน Acetobacter spp. และ Gluconobacter spp. ปน
อยูดวยซึ่งจะทําใหเกิดกรดน้าํ สม ทําใหคณ ุ ภาพของผลิตภัณฑลดลงได (นภา, 2535)
 2

การใชลูกแปงนั้นมีขอจํากัดคือ การผลิตนั้นตองอาศัยความชํานาญและมีสูตรที่ตกทอดมา
ภายในครอบครัว ผูผลิตสวนมากจึงตองอาศัยซื้อลูกแปงจากผูผลิตลูกแปงโดยเฉพาะเหลานี้ ทําให
ผูผลิตไมสามารถควบคุมคุณภาพของลูกแปงเพื่อใหเหมาะสมกับผลิตภัณฑของตนได ดังนัน้ หาก
สามารถพัฒนากลาเชื้อจุลินทรียบริสุทธิ์เพื่อใชในการผลิต จะทําใหสามารถควบคุมกระบวนการ
ผลิตและคุณภาพของผลิตภัณฑไดโดยไมตองอาศัยลูกแปงของผูผลิตเพียงไมกี่ราย ทั้งนี้ไดมกี าร
พบวา การใชเชื้อรา A. rouxii หรือ Rhizopus spp. รวมกับ S. cerevisiae ในการผลิตกระแชจะ
ไดผลผลิตที่ไมตางจากการหมักดวยลูกแปง (มนตรี, 2521)

การศึกษาคุณสมบัติของจุลินทรียเปนแนวทางหนึ่ง ทีส่ ามารถจะชวยแกปญหาดังกลาวได

เนื่องจากยีสตสกุลตาง ๆ ที่มีสวนในการหมักแตละสกุล มีคุณสมบัติในการเจริญ การสรางเอนไซม
การใชน้ําตาล และสรางสารใหกลิ่นรสตาง ๆ กันไป (Herraiz et al., 1989; Charoenchai , 1995)
เชน Klockera apiculata ใชน้ําตาลในการหมักไดชากวา S. cerevisiae แตผลิตอซิโตอีน
(acetoine) และเอธิลอะซิเตท(ethyl acetate) มากกวา ทําใหมีกลิ่นรสเฉพาะของยีสตนี้ และแมแต
ยีสตสกุลเดียวกันของ S. cerevisiae แตตางสายพันธุกนั ก็มีคุณสมบัติในการหมักตางกัน (Longo
et al., 1992) จึงสมควรมีการศึกษาจุลินทรีย ที่พบในลูกแปงของไทยที่ใชสําหรับหมักขาว เพือ่
เปรียบเทียบขอมูลและเพื่อสามารถควบคุ ร ์ มกระบวนการผลิต สงผลใหเฉพาะสายพันธุที่ตองการ
าส ต
เทานั้นมีโอกาสในการเจริญได ศและสามารถคั ดเลือกสายพันธุจุลินทรียที่มีคุณสมบัติตามตองการมา
ต ร
เกษ เพื่อใชในอุตสาหกรรมตอไป
เตรียมเปนกลาเชื้อสําเร็จของไทย
ัย
าล
ิาวทย
วัตถุมปหระสงค
ัล
ูร้ดจิ ิท
ม 1. ศึกษาบทบาทของเชื้อราที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลาในการหมักขาว
ว า
คลังค 2. ศึกษาปจจัยที่มีผลตอการเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา
3. ทดสอบการผลิตเอกซตราเซลลูลารเอนไซมของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและ
ลูกแปงเหลา
4. ทดสอบสมบัติเพชฆาตของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา
 3

การตรวจเอกสาร

ลูกแปง คือกลาเชื้อจุลินทรียที่เก็บอยูในรูปเชื้อแหง ใชในการผลิตอาหารหมักหลายชนิด

ในแถบเอเชีย การผลิตลูกแปงเขาใจวามีตนกําเนิดจากประเทศจีน กลาเชื้อนี้มีชื่อเรียกตามภาษา
ทองถิ่นในแตละประเทศแตกตางกันไป เชน ชาวตะวันตก เรียกลูกแปงของจีนวา Chinese yeast,
Chinese yeast cake หรือ Chinese koji ในฟอรโมซา เรียกลูกแปงวา “Peka” ในมาลายาและ
อินโดนีเซีย เรียกวา “Raji” หรือ “Raggi” ในประเทศอินเดียเรียก Bukhar (มนตรี, 2521) ลูกแปง
มีหลายชนิดผลิตตามวัตถุประสงคที่จะนําไปใช เชน ลูกแปงเหลา ลูกแปงขาวหมาก ลูกแปง
น้ําสมสายชู ลูกแปงขนมถวยฟู การใชประโยชนจะคลายคลึงกัน คือใชในการหมักที่มีกิจกรรม
การเปลี่ยนแปงในวัตถุดิบประเภทธัญพืชและพืชหัว ใหเปนน้ําตาล เพื่อผลิตเปนอาหารหมัก
ประเภทขาวหมาก สุรา และเมรัย เชน กระแช สาโท หรือ อุ (นภา, 2535)

การผลิตลูกแปงมักทําเปนอุตสาหกรรมในครัวเรือน โดยมีกรรมวิธีที่คลายคลึงกัน การ

ผลิตลูกแปงตองอาศัยความชํานาญสูตรแนนอนจึงไมมี และประกอบกับผูที่มีความรูทางดานนีใ้ น
สมัยกอนมักปดบังวิชาไมคอยถายทอดมากนัก จึงทําใหเชื้อดี ๆ และสูตรลูกแปงดี ๆ สูญหายไป
อยางนาเสียดาย อยางไรก็ตามองคประกอบที
ต ร ์ ่สําคัญในการทําลูกแปงโดยทัว่ ไปคือ แปง เครื่องเทศ
ส
หรือสมุนไพร น้ํา ลูกแปงเดิมรศซึา่งใชเปนแหลงจุลินทรีย และรําหยาบหรือแกลบ (บางสูตรใชหรือ
ต
บางสูตรไมใช) เัย กษ
าล
วา ิทย
1. ความสําคัมญหขององคประกอบตาง ๆ ในลูกแปง
ัล
ูร้ดจิ ิท
ม 1.1 แปง ควรใชแปงขาวจาวลวน ๆ จะมีคุณภาพดีที่สุด ตามตํารับเดิมผูผลิตจะบดแปงใช
ว า
ลังค
ค เปนคราว ๆ ไป ขาวที่ใชจะตองไมเกาหรือขึ้นรา ไมนิยมใชแปงสําเร็จทั้งนี้เพื่อลดการปนเปอนของ
เชื้อจุลินทรีย และหลีกเลีย่ งกรดโพรพิโอนิกที่เปนสารยับยั้งเชื้อรา ซึ่งมักใสลงไปในแปงสําเร็จ
(นภา, 2535)

1.2 เครื่องเทศหรือสมุนไพร เครื่องเทศแบงออกเปน 3 ลักษณะ ไดแก เครื่องเทศแหง

น้ํามันหอมระเหย และ oleoresin ปริมาณองคประกอบในเครื่องเทศแตละชนิด มีความแตกตาง
กันตามรุนของเครื่องเทศที่นํามาใช เริ่มตั้งแตสายพันธุของพืช การเพาะปลูก การบํารุงรักษา
ความออนแกของสวนที่นํามาเตรียมเปนเครื่องเทศ วิธกี ารเตรียม สภาพแวดลอมและระยะเวลาใน
 4

การเตรียม และวิธีการตรวจหาองคประกอบตาง ๆ ในเครื่องเทศ (พุทธรินทร, 2527) เครื่องเทศ

และสมุนไพรมีหนาที่ในการยับยั้งการเจริญของจุลินทรียอื่น ๆ ที่ไมตองการในลูกแปง เนื่องจาก
เครื่องเทศมีน้ํามันหอมระเหยซึ่งมีองคประกอบหลายชนิด ไดแก แอลกอฮอล, เอสเทอร, เทอรปน,
ฟนอล, อัลคาลอยด, เรซิน, กรดอินทรีย, สารประกอบที่มีกํามะถัน และสารอื่น ๆ น้ํามันหอม
ระเหยเหลานี้ มีคุณสมบัติในการยับยั้งการเจริญของจุลินทรียมากกวาการฆา เนื่องจากมีปริมาณไม
เพียงพอทีจ่ ะทําลายจุลินทรียไ ด (ชัยวัฒน, 2520) การใชในปริมาณที่เหมาะสมจะมีผลในการยับยัง้
การเจริญจุลินทรียบางชนิดแตไมมีผลในการยับยั้งการเจริญของยีสตและรา สมุนไพรแตละชนิดมี
ประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญของจุลินทรียไดแตกตางกัน (บัญญัติ, 2518; พิไลพรรณ, 2523)
การใชเครื่องเทศและสมุนไพรตางกันทั้งชนิดและปริมาณ จะทําใหความหลากหลายของจุลินทรีย
ในลูกแปงตางกัน ปจจัยที่มผี ลทําใหประสิทธิภาพของเครื่องเทศในการทําลายจุลินทรียขึ้นกับสวน
ของเครื่องเทศที่ใช, อายุเครื่องเทศ, ความเขมขนของเครื่องเทศ, ชนิดของเชื้อ, และสภาวะที่ใชใน
การทดสอบ เชน อุณหภูมิ, ชนิดของอาหารเลี้ยงเชื้อ และระยะเวลาที่จลุ ินทรียสัมผัสกับเครื่องเทศ
(พุทธรินทร, 2527)

1.3 น้ํา ปริมาณน้ํามีความสําคัญมากในการควบคุมความชื้นของลูกแปง ถามีความชื้นมาก

ไปทําใหลูกแปงเหม็นเปรีย้ วและเสียได
ร ์ หรือแหงเกินไปจะทําใหลูกแปงแตกหรือราเจริญในลูกแปง
ต
ศาส
ไดไมดี ถาความชื้นในลูกแปงเหมาะสมจะทํ
ตร
าใหเก็บรักษาจุลินทรียใ นลูกแปงไดนาน
เก ษ
ัย
1.4 ลูกแปิทงยเดิาลม ใชเปนแหลงจุลินทรีย ตองไมเกาเกินไปจนมอดกินหรือใชลูกแปงทีม่ ีเชื้อ
หาว
ราอื่นปนเปอมนภายนอกจนเห็ นไดชดั (พิไลพรรณ, 2523)
ัล
ูร้ดจิ ิท
ม 1.5 รําหยาบหรือแกลบ ใสเพื่อใหลูกแปงโปรงเบามีอากาศเขาไดมาก ทําใหจุลินทรียที่
ว า
ลังค
ค สําคัญสามารถเจริญไดดี ในบางสูตรไมใช

ลูกแปงที่ดีควรมีลักษณะโปรงเบา สีขาวนวล ไมมีรอยแตกราว กอนแปงเปนรูพรุน

ซึ่งเกิดจากการฟูของแปงขณะบม เมื่อบี้จะยุย เปนผงละเอียด ไมมีกลิ่นเหม็นเปรี้ยว มีรูปรางและ
ขนาดตางกัน ภายในมีเสนใยของราขึ้นอยูอยางสม่ําเสมอ ที่สําคัญคือไดผลดีเมื่อนําไปหมัก (ขุน
กฤษณามรวิสิฐ, 2494; นภา, 2535)
 5

2. จุลินทรียในลูกแปง

ลูกแปงเปน “กลาเชื้อผสม” ที่มีทั้งเชื้อรา ยีสต และแบคทีเรีย เนือ่ งจากเครื่องเทศและ

สมุนไพรมีผลตอชนิดและปริมาณจุลินทรียจึงทําใหจุลินทรียที่พบในลูกแปงมีไมกี่ชนิด โดยจะพบ
จุลินทรียที่มีบทบาทสําคัญในลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลาเปนสวนใหญ จุลินทรียที่พบในลูก
แปง พอจําแนกไดดังนี้

2.1 เชื้อรา ทีพ่ บเสมอ ไดแก Amylomyces rouxii และ Rhizopus spp. ปริมาณมากนอย
ขึ้นกับชนิดของลูกแปง ราทีพ่ บมากในลูกแปงขาวหมากคือ A. rouxii อยูในพวก Mucorales ทุก
สายพันธุสราง chlamydospore รูปรางทรงกระบอกสั้น ๆ จนกระทั่งกลม เจริญไดดที ี่อุณหภูมิ 40
องศาเซลเซียส

ชัยวัฒน (2520) และ พิไลพรรณ (2523) รายงานวาจุลินทรียที่พบในลูกแปงขาวหมาก

มีทั้งรา และยีสต ราสวนใหญอยูใน order Mucorales ไดแก Amylomyces spp., Rhizopus sp.,
Mucor sp., Absidia sp. นอกจากนีย้ ังพบ Imperfect fungi เชน Aspergillus sp., Penicillium sp.
และ Hyalodendion sp.
สร์
ต
รศ า
ต
ษ ทําการตรวจเชื้อจุลินทรียในลูกแปง และในระหวางการหมักไวนขาว
มนตรี (2521)เกได
พบเชื้อรา Rhizopus,ย ลัย Amylomyces, Aspergillus และ Penicillium
าMucor,
ิท
าว
ม ห
ท
ิ ัล
ิ จ
รู้ด สมพร (2544) ไดแยกราจากตัวอยางลูกแปงขาวหมาก 38 ตัวอยาง และลูกแปงเหลา
ว
19 า มตัวอยาง พบวามีราจํานวน 104-105 cfu/g เมื่อทําการแยกราจากลูกแปง ไดราจากลูกแปงขาว
ค
คลังหมาก 91 ไอโซเลท และจากลูกแปงเหลา 35 ไอโซเลท โดยแบงเปนราที่พบในลูกแปงขาวหมาก
ซึ่งสวนใหญเปนราในสกุล Amylomyces และ Rhizopus ที่เหลือเปน Actinomucor, Aspergillus
niger group, Monascus, Mucor และ Pennicillium สวนราที่แยกไดจากลูกแปงเหลาพบวา สวน
ใหญเปน Rhizopus, Amylomyces, Actinomucor, Aspergillus niger group และ Mucor Ragi ลูก
แปงของอินโดนีเซีย ซึ่งใชในการเตรียมขาวหมากทีเ่ รียกวา tape เตรียมจากการหมักขาวเหนียว
ผลิตภัณฑมีรสหวานอมเปรีย้ ว และมีกลิ่นรสของแอลกอฮอลเล็กนอย จากการแยกเชื้อพบวา ราที่
พบมากที่สุดคือ Rhizopus sp. (Suprianto et al., 1989)
 6

Murcha เปนลูกแปงที่ใชในการหมักเครื่องดื่มแอลกอฮอล หรือที่เรียกกันวา jnards ของ

ประเทศอินเดีย จากการตรวจสอบจุลินทรีย พบจุลินทรียทั้ง รา ยีสต และแบคทีเรีย โดยเชื้อราที่
พบสวนใหญ ไดแก Rhizopus chinensis โดยพบนอยกวา 10-1.0×106 cfu/g fresh weight
นอกจากนี้ยังพบรา Mucor circinelloides ประมาณ 1×106-4.1×107 cfu/g fresh weight โดยทีร่ า
R. chinensis มีกิจกรรมในการยอยแปง(amylolytic activity) (Tamang and Sarkar, 1995)

Banh men ซึ่งเปนกลาเชือ้ ของเวียตนาม จากการศึกษาพบวามีเชือ้ ราทั้งหมด 1.3×106

cfu/g เชื้อราที่ตรวจพบไดแก Rhizopus oryzae, Mucor indicus, M. circinilloides และ A. rouxii
นอกจากนี้ยังพบยีสตอีกหลายชนิด (Lee and Fujio, 1999)

2.2 ยีสต ยีสตที่พบในลูกแปงขาวหมากและขาวหมากมีหลายชนิดสวนใหญ ไดแก

Endomycopsis เปนยีสตที่ยอ ยแปงได นอกจากนีย้ ังพบ Hansenula เปนยีสตที่ใหกลิ่นเอสเทอร
ซึ่งเปนกลิ่นทีด่ ีแกขาวหมาก จากการศึกษาของ ชัยวัฒน (2520) ทําขาวหมากจากเชื้อบริสุทธิ์
Amylomyces รวมกับ Hansenula พบวาใหรสชาติดีกวาขาวหมากที่ทําจาก Amylomyces เพียง
อยางเดียว และ Amylomyces รวมกับ Endomycopsis ในลูกแปงขาวหมากอาจพบ Saccharomyces
cerevisiae ปนมาบาง สวนลูกแปงเหล ร ์ าจะพบ S. cerevisiae ในปริมาณมากกวา Endomycopsis
spp. (นภา, 2535) Saccharomyces
ต
าส เปนยีสตที่เปลี่ยนน้าํ ตาลใหเปนแอลกอฮอล ดังนั้นจึงมีบทบาท
ต ร ศ
หลังจากเปนขาวหมากแลเวกษเปนตัวเพิ่มรสชาติใหกับขาวหมาก
าลัย
ิาวทย
ล
ั มห นอกจากนี้ยงั พบยีสตอื่นในลูกแปงเฉพาะแหลง ไดแก E. burtonii (Ko, 1972) ที่
พบมากในลู
ด
้ ู จ
ิ ิท กแปง Ragi ของอินโดนีเซีย Candida spp. Torulopsis spp. (สิรินทรเทพ, 2523; นภา
ามร Suprianto, 1989) Pichia anomala ที่พบมากใน Murcha ลูกแปงของประเทศอินเดีย
,คว2535;
คลังและ Banh men กลาเชื้อของเวียตนาม (Tamang and Sarkar, 1995; Lee and Fujio, 1999)
Hyphopichia burtonii ใน Banh men กลาเชื้อของเวียตนาม (Lee and Fujio, 1999)

สมพร (2544) ไดแยกยีสตจากตัวอยางลูกแปงขาวหมาก 38 ตัวอยาง และลูกแปง

เหลา 19 ตัวอยาง พบวามียีสตจํานวน 105-106 cfu/g เมื่อทําการแยกยีสตจากลูกแปง ไดยีสตจาก
ลูกแปงขาวหมาก 43 ไอโซเลท และจากลูกแปงเหลา 49 ไอโซเลท โดยแบงเปนยีสตที่พบในลูก
แปงขาวหมาก ซึ่งสวนใหญเปนยีสตในสกุล Saccharomycopsis fibuligera และที่เหลือเปน
 7

C. rhagii, Issatchenkia orientalis, P. anomala, P. burtonii, P. fabianii, Rhodotorula philyla,

Tolulaspora delbrueckii และ T. globosa สวนยีสตที่แยกไดจากลูกแปงเหลา พบวาสวนใหญ
เปน S. fibuligera ทีเ่ หลือเปน C. glabrata, C. rhagii, I. orientalis, P. anomala, P. burtonii,
P. fabianii, P. heimii, P. mexicana, S. cerevisiae, T. globosa และ Trichosporon asahii

2.3 แบคทีเรีย ที่พบสวนใหญ ไดแกแบคทีเรียแลคติก Pediococcus pentosaceus ในลูก

แปงขาวหมาก และลูกแปงเหลาของไทยบางทองถิ่นอาจพบ Lactobacillus spp. และอาจพบ
แบคทีเรียกรดน้ําสม เชน Acetobacter spp. และ Gluconobacter ซึ่งมีมากในสาน้ําสม นอกจากนี้
อาจพบ Bacillus spp. ในลูกแปงจากการปนเปอนมากับวัตถุดิบ เชน แปงและสมุนไพร แตถา
สวนผสมของสมุนไพรเหมาะสม สามารถลดปริมาณจุลนิ ทรียนี้ไดมาก (นภา, 2535)

Ragi ลูกแปงของอินโดนีเซีย ซึ่งใชในการเตรียมขาวหมากที่เรียกวา tape จากการแยก

เชื้อพบวา แบคทีเรียที่พบมากที่สุดคือ Streptococcus sp. (Suprianto et al., 1989)

3. บทบาทของจุลินทรียในลูกแปงตอกระบวนการหมัก

ต ร ์
าส
จุลินทรียที่พบในลูกแปรศงมีหลายชนิด แตมเี พียงไมกี่ชนิดเทานั้นที่มีบทบาทในกระบวนการ
ต
หมัก บทบาทสําคัญของจุเกลษินทรียในลูกแปงมี 2 ประเภท คือ
าลัย
ิาวทย
ห ่ยนแปงในเมล็ดขาวใหเปนน้ําตาล โดยจุลินทรียท ี่สรางเอนไซมอมัยเลส
3.1 มเปลี
ัล
ูร้ดจิ ิท
ม 3.2 การหมักน้ําตาลที่เกิดขึน้ ใหเปนเอธานอล กับคารบอนไดออกไซดโดยยีสต
ว า
คลังค
บทบาทของจุลินทรียทั้งสองประเภทนี้ จะเกิดขึ้นตอเนือ่ งกันตลอดระยะเวลาของการหมัก
ขาว โดยราทีพ่ บในลูกแปง เชน Amylomyces rouxii และ Rhizopus spp. ผลิตเอนไซมอมัยเลส
ชนิด แอลฟา-อมัยเลส และกลูโคอมัยเลส ดังนั้นในกระบวนการหมักจึงมีบทบาทในการเปลี่ยน
แปงเปนน้ําตาล ในขาวหมากเอนไซมที่สําคัญคือ อมัยเลส และ กลูโคอมัยเลส ซึ่งไดจาก
Amylomyces และ Endomycopsis ตามลําดับ บางสวนของน้ําตาลที่ไดจากการยอยแปงจะถูกยีสต
Hansenula และ Saccharomyces นําไปใชเพื่อใหเกิดเอสเทอร และแอลกอฮอลตามลําดับ ทําให
 8

กลิ่นรสขาวหมากดีขึ้น อยางไรก็ตามเอสเทอรอาจเกิดจากลิปดในขาวถูกยอยเปนกรดไขมัน โดย

เอนไซมไลเปส และกรดไขมันที่ทําปฏิกิริยากับแอลกอฮอลให สารประกอบของเอสเทอรเกิดขึ้น
(สิรินทรเทพ, 2523) ในลูกแปงเหลานัน้ Rhizopus spp. และ A. rouxii มีบทบาทเชนเดียวกับใน
การหมักขาวหมากคือ เปลี่ยนแปงในขาวใหเปนน้ําตาล แตยีสตเปนตัวการสําคัญในการหมัก
น้ําตาลใหเปนเอธานอล ไดแก S. cerevisiae ซึ่งมีประสิทธิภาพสูงในการเปลีย่ นน้ําตาลใหเปน
เอธานอล (นภา, 2535)

4. ขาวหมาก

ขาวหมาก เปนอาหารหวานที่มีมาแตโบราณ มีรสหวานและมีแอลกอฮอลเล็กนอย ลักษณะ

ทั่วไปของขาวหมาก คือ เปนเมล็ดขาวนุม เกาะกันเปนกอนสีขาวนวล มีน้ําซึมออกมาจากเมล็ด
ขาวเล็กนอย มีกลิ่นหอม อาจมีกลิ่นของแอลกอฮอลปนบางเล็กนอย ขาวหมากทีด่ คี วรมีรสหวาน
จัด ไมมีรสเปรี้ยว เมื่อทิ้งไวหลายวันมีกลิ่นแอลกอฮอลมากขึ้น น้ําที่ซึมออกมาจากเมล็ดขาว
เรียกวา น้ําตอย หรือ น้ําตาลขาว มีรสหวานชวนรับประทาน (สิรินทรเทพ, 2523) มีผูเชื่อวาการ
บริโภคขาวหมาก ชวยบําบัดโรคบางอยางได เชน โรคไอ และเจ็บคอ โรคเม็ดผื่นคันตามผิวหนัง
ผด และสิว นอกจากนี้ยังใชทําปลาเจร์ าและเหลาแดงไดอีกดวย (อั้งจิ้ว) (ขุน กฤษณามรวิสิฐ, 2494)
า ส ต
สวนประกอบตาง ๆ ที่ใชในการทํ รศ าวหมากคือ ขาว ใชขาวเหนียวอยางดี ที่ไมมีเมล็ดหักปนหรือ
าข
ต
ษ น้ํา นิยมใชน้ําฝนหรือน้ําบาดาลที่สะอาด และภาชนะสําหรับใสขาว
ปนนอย ลูกแปงขาวหมาก เ ก
หมาก อาจเปนใบตอง ย าลโถัย ไห หรือกลองพลาสติกก็ได
าวิท
ม ห
ท
ิ ัล
ิ จ
รู้ด วิธีทําขาวหมาก นึ่งขาวเหนียวและลางน้ําใหสะอาด นําไปสะเด็ดน้ํา ผสมลูกแปงที่
4.1
ว า
บดขยีม ้ใหเขากับขาวเหนียวนึง่ ใหทวั่ แบงใสใบตองหรือใบบัวหรือใสภาชนะเปนถวย ชาม หรือ
ค
คลังกลองเล็ก ๆ เปนตน เมื่อหมักไดประมาณ 3-4 วัน จะไดขาวหมากที่มีลักษณะเมล็ดขาวนุม รส
หวานปนแอลกอฮอลเล็กนอย และมีกลิ่นหอมรับประทานได(อัตราสวนที่ใช คือ ลูกแปง 0.5-1.0
ลูกตอขาวเหนียว 1 ลิตร) ถาตองการใหขาวหมากเกิดเร็วขึ้นเพิ่มลูกแปง ถาใสลูกแปงนอยไปหรือ
มากไป จะทําใหไดขาวหมากมีคุณภาพไมดี ในกรณีที่ใสลูกแปงนอยไป ขาวหมากเกิดชา เนื้อขาว
ไมฟูนิ่มทัว่ ตลอด เมล็ดขาวไมขาวใส เนือ่ งจากมีการปนเปอนของเชือ้ ราอื่น ทําใหมีสีดํา แดงหรือ
คล้ําเปนจุด ๆ ถาใสลูกแปงมากไป ทําใหขาวหมากเกิดเร็วไป ทําใหเก็บไวไดไมนานเพราะจะเกิด
รสเปรี้ยว
 9

4.2 กิจกรรมของจุลินทรียและจุลินทรียที่มบี ทบาทสําคัญในการทําขาวหมาก

จากการศึกษาของ ชัยวัฒน (2520) และ สิรินทรเทพ (2523) แสดงใหเห็นวา เชื้อรา

Amylomyces spp. และยีสต Endomycopsis spp. และ Hansenula spp. มีความสําคัญในการหมัก
ขาวหมาก และใหขาวหมากมีคุณภาพดีทสี่ ุด โดยที่ Amylomyces มีบทบาทสําคัญในการสราง
เอนไซมอมัยเลส สวน Endomycopsis จะสรางกลูโคอมัยเลส สวน Hansenula จะเปลี่ยนน้ําตาล
บางสวนไปเปนเอสเทอร ทําใหกลิ่นรสของขาวหมากดีขึ้น

4.3 ผลิตภัณฑที่คลายคลึงกับขาวหมากและลูกแปงขาวหมาก การทําขาวหมากนิยมทําใน

ประเทศแถบอินโดจีน มีชื่อเรียกตางกันขึ้นอยูกับแตละประเทศ การทําจะอาศัยแปงเชื้อที่มีลักษณะ
คลายกับลูกแปงของไทย ในการหมักขาวเชนกัน

4.3.1 Tape ketan เปนขาวหมากของประเทศอินโดนีเซีย เตรียมขึ้นจากการหมัก

ขาวเหนียวนึ่ง มีลักษณะเปนเมล็ดขาวทีอ่ อนนุมและเหนียว มีรสหวานอมเปรี้ยว หอมและมี
แอลกอฮอลประมาณ 5 เปอรเซ็นต มีพีเอช 3.5-4.0 วิธีการผลิตโดยทั่วไปมีดังนี้ นําขาวเหนียวไป
ลางน้ําและแชน้ํานาน 1 ชั่วโมง หรื ร ์ อมากกวา(บางครั้งอาจขามคืน) นําขาวที่ไดไปนึ่งนาน 30
ต
นาที จนขาวออนนุม ทิ้งไวใศหาเสย็น และนําไปคลุกกับผง Ragi ใหทั่ว จากนัน้ แบงขาวเหนียว
ออกเปนสวน ๆ บรรจุในภาชนะ ษตร อาจเปนถุงพลาสติกหรือใบตอง และหมักที่อณุ หภูมิ 25-30
ล ย
ั เก
า
องศาเซลเซียส นาน ิา ทย 24-48 ชั่วโมง Ragi เปนลูกแปงของอินโดนีเซีย เตรียมไดจากการผสมขาว
ว
บด เครื่องเทศ
ล
ั มห และน้ํา จากนั้นนําไปบม 2-5 วัน จนกระทั่งแหงและบรรจุในรูปของเม็ดเล็ก ๆ
ซึ่งประกอบด
ด
้ ู จ
ิ ิท วย รา และยีสตมากมาย Tape ketan เปนผลิตภัณฑที่เกิดจากการหมักโดยเชื้อรา
า มร ชีส ไดแก A. rouxii และยีสตในจีนัส Endomycopsis, Candida และ Hansenula
หลายสป
ว
ค
คลัง สวนมาก ไดแก E. burtonii และ E. fibuligera ถาหมักนานกวา 6 วัน จะไดเมรัยที่มีสีชมพูออน
เมื่อเติมเครื่องเทศพวกลูกจันทร กานพลู พริกไทย จะไดเมรัยที่เรียกวา Arak (Ardhana and Fleet,
1989)

4.3.2 Tape ketalla เตรียมจากการทาผง Ragi บนหัวมันสําปะหลัง ที่ตัดเปนชิ้น

ขนาด 2×4 เซนติเมตร หอดวยใบตองหรือตัดเปนชิ้นขนาด 30×4 เซนติเมตร วางในถาดคลุม
ดวยใบตอง 5-7 วัน จะไดผลิตภัณฑที่ออนนุม และมีรสหวานปนแอลกอฮอล รับประทานได
โดยตรง หรือนําไปทอดกับน้ํามันมะพราวกอนรับประทาน (ชัยวัฒน, 2520)
 10

4.3.3 Brem ไดจากการหมักขาวเหนียวนึ่งเหมือน Tape ketan แตใชเวลานาน

กวา เมื่อหมักไดทแี่ ลว คั้นเอาน้ําไปเคีย่ วจะไดนา้ํ หวานที่ขนเหนียว นําไปบรรจุลงภาชนะคลาย
กรวยขนาดเล็ก ๆ หลังจากนึ่งและทําใหแข็ง จะไดลักษณะเปนกอนแข็งสีขาวมีรสหวานปนเปรี้ยว
(Hesseltine, 1965)

4.3.4 Lao-Chao หรือ Chin-niang เปนขาวหมากของจีน ทําจากลูกแปงที่เรียก

Chin-yueh หรือ Deh-yueh เรียกทั่วไปวา Chinese yeast ball มีลักษณะกลมสีขาว ๆ วิธีทํา
เลาเชาคลายกับการทําขาวหมาก โดยนึ่งขาวแลวทําใหเย็นคลุกเคลากับลูกแปงและบรรจุอยางหลวม
ๆ ในถวยที่มีฝาปด เก็บที่อณ
ุ หภูมิหอง 2-3 วัน ขาวเริ่มออนนุมมีน้ําหวานออกมามีแอลกอฮอล
เล็กนอย นิยมบริโภคเปนของหวานหรือนําไปปรุงรวมกับไขใชเปนอาหาร การผลิตมักผลิตในพิธี
การพิเศษจึงทําใหมีราคาแพง มีคนเชื่อวาเลาเชาเปนอาหารที่เหมาะสมกับผูที่คลอดบุตรใหม ๆ
เพราะมีความเชื่อวา เลาเชาทําใหสุขภาพดีขึ้น (Wang and Hesseltine, 1970)

5. ไวนขาว

ไวนขาว เปนผลิตภัณฑหมักร์ที่ไดจากการหมักขาวโดยใชลูกแปง ในประเทศแถบเอเชีย

า ส ต
ไดแก สาเกของญี่ปุน ทางเอเชี รศ นออกเฉียงใตมกี ารผลิต tapuy ในฟลิปปนส brem ใน
ย ตะวั
ต
ษยตนาม และ tapuy ในมาเลเซีย สวนประเทศไทยมีการผลิตไวนขาว
อินโดนีเซีย ba-si-de ในเวี
ัย เ ก
กันมากในชนบท ิทมียชาื่อลเรียกตาง ๆ กันตามทองถิ่น เชน ภาคกลางเรียกไวนขาววา “น้ําขาว” แตบาง
ว
ทองถิ่นเรียกวมาหากระแช ชาวอีสานเรียกเครื่องดื่มนี้วา “สาโท” หรือ “เหลาโท” อําเภอเรณูใน
จ
ิ ิทัล
จังหวัดู้ดนครพนมผลิ ตไวนขา วอีกชนิดหนึง่ เรียกวา “อุ” หรือ “ชาง” ปญหาที่พบอยูเสมอในการ
า ร
มไวนขาว คือคุณภาพของผลผลิตที่ไดไมแนนอน เชน มีเปอรเซ็นตแอลกอฮอลสูงไปหรือต่ํา
คว
หมั ก
คลังไป หรืออาจมีกลิ่นรสไมชวนดื่ม สาเหตุสําคัญเกิดจากจุลินทรียใ นลูกแปงที่ไมจําเปนตอการหมัก
ทําใหคุณภาพไวนเสื่อมลง การคัดเลือกเชือ้ จุลินทรียที่มปี ระสิทธิภาพสูงและจําเปนตอการหมักจริง
ๆ มาใชในการหมักแทนลูกแปงจะชวยขจัดหรือลดปญหาดังกลาวได เพราะทําใหสามารถควบคุม
สวนประกอบตาง ๆ ในการผลิตไดงายขึ้น

การหมักน้ําขาวหรือสาโท อาศัยกิจกรรมของจุลินทรียในลูกแปง ที่มีบทบาทในการเปลี่ยน

แปงในเมล็ดขาวใหเปนน้ําตาล โดยจุลินทรียที่สรางเอนไซมอมัยเลส และการหมักน้ําตาลที่เกิดขึน้
ใหเปนแอลกอฮอล โดยยีสตพวก Saccharomyces กิจกรรมของจุลินทรียทั้งสองกลุมนี้ เกิดขึน้
 11

อยางตอเนื่องกันตลอดระยะเวลาการหมักประมาณ 1-2 สัปดาห การดื่มมักดื่มในขณะทีย่ ังหมักอยู

โดยการคั้นน้าํ และกรองเอาเฉพาะสวนทีเ่ ปนน้ําขาว ๆ มาดื่ม เนื่องจากไมมกี ารฆาเชื้อจุลินทรียจ ึง
ทําใหเก็บน้ําขาวไดไมนาน การเพิ่มความหวานหรือเรงการหมักและใหการหมักดําเนินไป เรื่อย ๆ
ไมใหแอลกอฮอลเปลี่ยนไปเปนกรดน้าํ สมทําไดโดยเติมน้ําเชื่อมหรือน้าํ ตาลลงไป วิธีการนี้เรียกวา
การถวงดวยน้าํ ตาล สําหรับวิธีการผลิตโดยสรุปแสดงดังภาพที่ 1 (ประดิษฐ, 2545)

การผลิตไวนขา วชนิดอุ หรือ ชาง มีกระบวนการแตกตางจากการผลิตสาโทหรือน้ําขาว

เล็กนอย เพราะมีการผสมแกลบ(เปลือกของขาวเปลือก) กับขาวเหนียวกอนทําการนึ่ง จากนัน้ จะ
บรรจุใสไหปดฝาและยาดวยดินเหนียว ปลอยใหหมัก 2-3 สัปดาห การดื่มจะใชหลอดดูดโดยเจาะ
ดินเหนียวดานบนออก การผลิตจะมีการใชลูกแปงเหลาเพื่อวัตถุประสงคเดียวกับการผลิตสาโท
หรือ น้ําขาว แตอุจะมีนา้ํ สุราที่สีคอนขางเปนสีชาออน อาจเกิดจากสีของแกลบละลายออกมา
นอกจากนี้ยังมีกลิ่นแกลบและรสเฝอนอีกดวย (ประดิษฐ, 2545)

6. ปจจัยที่มีผลตอการเจริญของยีสต

การเจริญของยีสตในระหวางที
ต ร ์ ่มีการหมักแอลกอฮอลจากน้ําตาล สามารถติดตามไดจาก
าส
รูปแบบการเจริญของจุลินทรียรศในการเพาะเลี ้ยงแบบกะ(batch culture) การติดตามสามารถติดตาม
ต
ษ ที่มีชีวิต, น้ําหนักเซลลแหง, การนับเซลลภายใตกลองจุลทรรศน
ก
ไดโดยใชวิธีการวัดจํานวนเซลล
เ
โดยตรง, การผลิิทตยาคารลัยบอนไดออกไซด, การผลิตเอธานอล, และการใชน้ําตาลในการหมัก
าว 1990)
(Zwietering etมหal.,
ัล
ูร้ดจิ ิท
ม ในอุตสาหกรรมไวนมกี ารคัดเลือกพันธุยีสตที่เหมาะสมในการหมัก คือผลิตแอลกอฮอล
ว า
ลังค
ค และสารที่ใหกลิ่นรสที่ดี มีคุณสมบัติในการตกตะกอนและสามารถฆายีสตชนิดอื่นได ในลูกแปง
ยีสตที่พบในปริมาณมากที่สดุ คือ Saccharomycopsis fibuligera ในระหวางการหมักสาโทบทบาท
ที่สําคัญของยีสตนี้คือ สามารถสรางเอนไซมยอยแปงได และผลิตแอลกอฮอลไดความเขมขนต่ํา
ยีสตนี้จะเจริญเพียงชวงระยะเวลาหนึ่งเทานัน้ แลวยีสตนี้จะตายไปแตจะเกิดยีสต Saccharomyces
cerevisiae ทําหนาที่ในการหมักแทน โดย S. cerevisiae จะมีความสามารถในการหมัก
แอลกอฮอลไดดีกวา และทนปริมาณแอลกอฮอลไดสูงกวายีสตจากลูกแปง แหลงที่มาของยีสตที่
ทําใหเกิดการหมักนีย้ ังไมทราบเปนที่แนนอนอาจมาจากลูกแปงเชนกันแตมีอยูใ นลูกแปงในปริมาณ
นอยจนไมสามารถตรวจพบได และสามารถเจริญเติบโตไดอยางรวดเร็ว ในสภาพที่เหมาะสมของ
 12

ขาวเหนียวขาว

ลางน้ํา

แชน้ํา 6–12 ชั่วโมง

สะเด็ดน้ํา

นึ่งใหสุก 30–60 นาที

ทําใหเย็นเทาอุณหภูมิหอง

ขาวเหนียวนึ่ง

คลุกกับลูกรแป
์ งบดปริมาณ 0.1-0.2 เปอรเซ็นต
า ส ต
รศ
เ ก ษต ตั้งไวในหอง 1-3 วัน
า ลัย
ิา ทย
ว
มห เติมขั้น
ิจ ิทัล
า ม รู้ด
หมักไว 4-14 วัน
คัลงคว
กรองดวยผาขาวบาง
กากขาวเหนียว

น้ําขาว (สาโท)

ภาพที่ 1 กระบวนการผลิตสาโท (น้ําขาว)

ที่มา: (ประดิษฐ, 2545)
 13

ของการหมักสาโท (สถาบันวิจยั ไวน และสุราพื้นบาน คณะวิศวกรรมและเทคโนโลยีการเกษตร

สถาบันเทคโนโลยีราชมงคล, 2545) ปจจัยหลายอยางมีผลตอนิเวศนวิทยาและการเจริญของยีสต
ทําใหไดผลิตภัณฑที่มีคุณภาพตางกันไป การพิจารณาผลของปจจัยตาง ๆ ตอการหมัก สามารถ
พิจารณาไดจากขอมูลเกี่ยวกับการเจริญของยีสตรวมกับการวิเคราะหทางชีวเคมี ปจจัยที่สําคัญไดแก
growth factors, โลหะหนัก, เกลือ, อุณหภูมิ, พีเอช, ความเขมขนของน้าํ ตาล, และความเขมขนของ
เอธานอล เปนตน

6.1 growth factors

Madan and Gulati (1980) ศึกษาความตองการสารอินทรีย ตอการเจริญของ

sporogenous yeasts (Brettanomyces bruxellensis, Debraromyces hansenii, Hansenula ciferrii,
H. polymorpha, Pichia polymorpha, Saccharomycopsis guttulata และ Saccharomyces
chevalieri) ที่แยกไดจากผลไม พบวา H. ciferrii ตองการ thiamine 0.1-1.0 ppm biotin 0.01-
0.1 ppm inositol 10.0 ppm riboflavin และ niacin อยางละ 0.1 ppm สําหรับ optimum growth
H. polymorpha ไมตองการ xanthine P. polymorpha ไมตองการ thiamine และ biotin สวน S.
guttulata ไมตอ งการ biotin และ adenine sulphate แตตองการ pyridoxine เพื่อการเจริญสูงสุด
ต ร ์
าส
6.2 โลหะหนัก ษตรศ
เก
ย าลัย
า ว
Grafl ิทand Schwantes (1983) ศึกษาอิทธิพลของโลหะหนัก ตอการเจริญของยีสต
ห
Saccharomyces ัิทล ม cerevisiae, Saccharomycopsis lipolytica และ Candida tropicalis พบวา
ม
แคดเมี ร ู้ดยิจมและปรอทที่ความเขมขนต่ํา ๆ จะลดอัตราการเจริญของยีสต โดยจะยืดระยะเวลาในชวง
คว า
คลังปรับตัว (lag phase) และเวลาทวีคูณ(doubling time) แตไมมีผลตอผลไดของเซลลสวนสังกะสีจะ
เพิ่มอัตราผลผลิต(productivity) ของ S. cerevisiae และ S. lipolytica โดยจะลดระยะเวลาในชวง
lag phase ใหสั้นลง สวนตะกัว่ ไมมีผลใด ๆ ตอการเจริญของยีสต

6.3 ความเขมขนของน้ําตาล

Nishino et al. (1985) รายงานวา การเพิ่มความเขมขนของน้ําตาล ในน้ําองุนทีใ่ ชใน

การหมักไวน จะเปนการเพิม่ ความดันออสโมติก(osmotic pressure) มีผลทําใหเซลลยีสตเกิดการ
 14

หดตัวทําใหจํานวนเซลลที่มีชีวิต(cell viability) ลดลง ระยะเวลาในการแตกหนอและระยะเวลาใน

การหมักนานขึ้น เนื่องจากน้ําตาลที่เหลือจากการเจริญของยีสตมีมากเกินไป สายพันธุที่ปรับตัวได
ดีที่สุดจึงสามารถเจริญตอไปได

6.4 อุณหภูมิและพีเอช

Gao and Fleet (1988) ศึกษาอิทธิพลของอุณหภูมิและพีเอช ตอการเจริญและการ

ทนตอเอธานอลของไวนยีสต (Saccharomyces cerevisiae, Candida stellata และ Kloeckera
apiculata) โดยเพาะเลี้ยงในอาหารสังเคราะห ที่ประกอบดวย กลูโคส 10 เปอรเซ็นต และ yeast
extract 0.5 เปอรเซ็นต และปรับใหมีความเขมขนของเอธานอล 7 ระดับ คือ 3 5 7 9 11 13
และ 15 เปอรเซ็นต นําไปบมที่อุณหภูมิ 10 15 20 และ 30 องศาเซลเซียส พบวาที่อุณหภูมิ 15
และ 20 องศาเซลเซียส จะเปนชวงอุณหภูมิที่ยีสตสามารถเจริญได ในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลสูงสุด โดยที่ S. cerevisiae, C. stellata และ K. apiculata สามารถเจริญไดที่ระดับ
ความเขมขนของเอธานอลเทากับ 15 11 และ 9 เปอรเซ็นต ตามลําดับ ความเขมขนของเอธานอล
สูงสุด ที่ยีสตสามารถเจริญได จะลดลงเมื่ออุณหภูมิที่ไชบมเทากับ 10 และ 30 องศาเซลเซียส
เมื่อศึกษาถึงผลของเอธานอลตอการอยูร์ รอดของยีสตพบวา เมื่อเลี้ยง S. cerevisiae ในอาหารทีม่ ี
ความเขมขนของเอธานอล 15 ศเปอร า สตเซ็นต และนําไปบมที่อุณหภูมิ 10 และ 15 องศาเซลเซียส มี
ตร
ชีวิตไดนาน 12 วัน แตไเกมษสามารถเจริญไดถานําไปบมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส C. stellata
ัย
าีเลอธานอล
มีชีวิตไดในอาหารที ิา ท
ว ย
ม
่ 12.5 เปอรเซ็นต เมื่อนําไปบมที่อุณหภูมิ 10 และ 15 องศา-
เซลเซียส ยกเว
ล
ั มหนที่อณุ หภูมิ 30 องศาเซลเซียส สําหรับ K. apiculata สามารถมีชีวิตอยูไดในอาหาร
ที่มีเอธานอล
ด
้ ู จ
ิ ิท 10-12.5 เปอรเซ็นต เมื่อบมที่อุณหภูมิ 15 องศาเซลเซียส ยกเวนที่อุณหภูมิ 10 และ
า ร
มองศาเซลเซี
30
คว ยส และรายงานวา เมื่อเลี้ยงยีสตดังกลาวในอาหารที่มคี วามเขมขนของเอธานอล 0
ง
ั
คล 5 10 และ 15 เปอรเซ็นต และปรับใหมีพีเอช 3 4 5 และ 6 พบวาการมีชีวิตของยีสตจะไมลดลง
ยกเวนที่พเี อช 3.0 เมื่อความเขมขนของเอธานอลเทากับ 10 และ 15 เปอรเซ็นต การมีชีวิตของ
ยีสตจะลดลง

Heard and Fleet (1988) รายงานวา อุณหภูมิมีอิทธิพลตออัตราการเจริญ และการทนตอ

เอธานอลของยีสตในระหวางการหมักไวนองุน โดย Kloeckera apiculata เจริญไดดที ี่อุณหภูมิ 10
องศาเซลเซียส และจะเจริญเดนแทนที่ Saccharomyces cerevisiae ทําใหองคประกอบทางเคมี
และคุณภาพดานประสาทสัมผัสของไวนเปลี่ยนแปลงไป นอกจากนั้น พีเอช ความเขมขนของ
 15

น้ําตาล และสารอื่น ๆ ที่มีอยูในน้ําองุน อาจมีผลตอการเจริญของยีสตและคุณภาพของไวนดวย

ผลจากปจจัยเหลานี้ตอการเจริญของ non-Saccharomyces wine yeast จะสงผลโดยตรงตอลักษณะ
การเจริญของ S. cerevisiae

Charoenchai et al. (1998) ศึกษาอัตราการเจริญจําเพาะและมวลเซลลสูงสุด(maximum cell

biomass) ของไวนยีสตเมื่อเลี้ยงในอาหารสังเคราะห chemically defined grape juice medium และ
นําไปบมที่อุณหภูมิ 10 15 20 และ 25 องศาเซลเซียส พบวายีสตทุกสายพันธุจะมีอัตราการเจริญ
เพิ่มขึ้นเมื่ออุณหภูมิทใี่ ชหมักสูงขึ้น ยีสตสวนใหญจะมีมวลเซลลสูงสุดเพิ่มขึ้น ตามอุณหภูมิที่
เพิ่มขึ้น จนกระทั่งอุณหภูมิ 15 องศาเซลเซียส จากนั้นมวลเซลลสูงสุดจะคงที่ ทั้งนี้ขึ้นอยูกับสาย
พันธุของยีสต และรายงานวาหลาย ๆ สายพันธุของ Kloeckera apiculata และบางสายพันธุของ
Candida pulcherrima, C. stellata และ C. colliculosa เจริญไดเร็วกวา Saccharomyces
cerevisiae เมื่อเลี้ยงในอาหารที่ผันแปรคาพีเอชในชวง 3-4 พบวาคาพีเอชไมมีผลตออัตราการ
เจริญและมวลเซลลสูงสุด เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของน้ําตาล 200 กรัมตอลิตร และ
300 กรัมตอลิตรพบวา อัตราการเจริญของยีสตบางสายพันธุจะลดลง สวนมวลเซลลของยีสต
ทั้งหมดมีแนวโนมลดต่ําลง

ต ร ์
Homma et al. (2003)ศารายงานว ส าการเจริญของ Saccharomyces cersvisiae S288C ที่
ร
อุณหภูมิ 4, 15, 25 และเกษ35ต องศาเซลเซียส มีลักษณะตางกัน โดยทีอ่ ุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส
doubling time ของยี ย าสลตัยมีคามากที่สุด (ประมาณ 50 ชัว่ โมง) จากการวิเคราะห DNA microarray
า ว ิท
พบวาการหมัมกหที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส มีผลทําใหยีนบางชนิดลดลงและมียนี ชนิดใหมทยี่ งั ไม
ท
ิ ัล่เกิดขึ้น เรียกยีนเหลานี้วา low temperature growth genes อยางไรก็ตามผลจากการ
ทราบหน
รู้ด จ
ิ าที
า ม
วิเคราะหยังคงพบยีน TIP1, TIR1, TIR2 และ NSR1 ซึ่งเปนยีนที่เรียกวา cold shock genes ยีน
ัลงคว
ค เหลานี้มีความจําเปนสําหรับการเจริญที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส และควบคุมกลไกการปรับตัว
ของเซลลในกรณีที่อุณหภูมลิ ดลงอยางรวดเร็ว

Torija et al. (2003) ศึกษาอิทธิพลของอุณหภูมใิ นการหมักเอธานอล (15-30 องศา

เซลเซียส) ของสายพันธุ Saccharomyces cerevisiae (จําแนกความแตกตางโดยวิธี Restriction
Fragment Length Polymorphism ที่บริเวณ mitochondrial DNA) พบวาอุณหภูมิเปนปจจัย
กําหนดการเจริญและประสิทธิภาพการหมักของ Saccharomyces และรายงานวา Saccharomyces
บางสายพันธุเจริญไดดีที่อณ
ุ หภูมิสูง ในขณะที่บางสายพันธุเจริญไดดที ี่อุณหภูมิต่ํา และพบวาขนาด
 16

ประชากรสูงสุด (maximal population size) มีคาใกลเคียงกันในทุกอุณหภูมิทที่ ําการศึกษา ที่

อุณหภูมิสูงจํานวนเซลลที่มีชีวิตมีแนวโนมลดต่ําลง โดยเฉพาะที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส ผล
จากการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิการหมักมีผลตอการเปลี่ยนแปลงองคประกอบของไวน โดยพบวาเมื่อ
อุณหภูมิที่ใชหมักสูงขึ้น สาร secondary metabolites (กลีเซอรอล) ที่จะเปลี่ยนเปนแอลกอฮอลจะมี
ปริมาณสูงขึ้นดวย และพบวาผลไดของแอลกอฮอลที่อุณหภูมิต่ํามีคาสูงกวาที่อณ ุ หภูมิสูง

6.5 เกลือ

Ota and Morishita (1993) ศึกษาถึงผลของเกลือ NaCl ตอการเจริญและลักษณะทาง

สัณฐานวิทยาของ Saccharomycopsis fibuligera พบวายีสตสามารถเจริญไดในอาหารที่มีความ
เขมขนของ NaCl 1 โมลารไดดีกวาความเขมขน 2 โมลาร ลักษณะของเสนใยมีลักษณะยาวเรียว
และโปงพองตางไปจากเดิม โดยที่ความเขมขน 2 โมลาร จะทําใหเกิดการเปลี่ยนแปลงมากกวา
ความเขมขน 1โมลาร และสรุปผลการทดลองวา NaCl ชวยปองกันการรั่วซึมของเซลล และทํา
ใหลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลลเปลี่ยนไป

6.6 เอธานอล ร ์
าส ต
ต รศ
ษ
Kang et al.เก(2000) รายงานวายีสต 125 สายพันธุที่แยกไดมีเพียง 14 สายพันธุ ที่
สามารถเจริญไดในอาหารที ย าลัย ม่ ีความเขมขนของเอธานอล 15 เปอรเซ็นต (ปริมาตรตอปริมาตร), มี
า ว ิท
เพียง 7 สายพั
ล
ั มหนธุที่สามารถเจริญไดในอาหารที่มีความเขมขนของกลูโคส 50 เปอรเซ็นต (น้ําหนัก
จ
ิ ิท 23 สายพันธุที่มีอัตราการเจริญสูง และมีเพียง 13 สายพันธุ ที่สามารถเจริญไดที่
ตอปริมู้ดาตร),
มร มิ 42 องศาเซลเซียส ในการคัดเลือกขั้นที่สองพบวา มี 11 สายพันธุที่มีอัตราการหมักสูง
อุควณาหภู
ัง
คล และสามารถผลิตเอธานอลไดสูง ในการคัดเลือกขั้นที่สามพบวามี 5 สายพันธุที่สามารถผลิต
เอธานอลไดสูง ในการคัดเลือกขั้นตอมาไดนําทั้ง 5 สายพันธุมาทดสอบการหมักเอธานอลใน
อาหารที่มีความเขมขนของกลูโคสเริ่มตน 25 เปอรเซ็นต โดยพิจารณาจากน้ําตาลที่เหลือ และ
จํานวนเซลลที่มีชีวิต พบวา สายพันธุที่สามารถผลิตเอธานอลไดสูงที่สุดคือ 20-1 สามารถผลิต
เอธานอลได 13.4 เปอรเซ็นต(ปริมาตรตอปริมาตร) ในเวลา 4 วัน ในขณะทีส่ ายพันธุ 11-1
สามารถผลิตเอธานอลได 13.1 เปอรเซ็นต(ปริมาตรตอปริมาตร) ในเวลา 4 วัน และสามารถคง
ความมีชีวิตได 30.44 เปอรเซ็นต หลังจากหมักไปแลว 5 วัน จากการจัดจําแนกยีสตทั้ง 2 สาย
พันธุพบวาเปน Saccharomyces cerevisiae
 17

Medawar et al. (2003) รายงานวายีสต Brettanomyces intermidius ซึ่งเปนจุลินทรียที่ทํา

ใหไวนเนาเสียโดยเปนสาเหตุสําคัญในการเกิด off-flavours และทนตอความเขมขนของเอธานอล
สูง ๆ ไดดี เมือ่ นํามาเลี้ยงในอาหารที่มีการปรับความเขมขนของเอธานอลเริ่มตน 0-90 กรัมตอลิตร
พบวา เมื่อความเขมขนของเอธานอลเพิ่มขึ้น จํานวนเซลลที่มีชีวิต คาความขุน และคาน้ําหนักแหงมี
คาลดลง, ยีสตใชระยะเวลาในชวง lag phase นานขึ้น, อัตราการเจริญจําเพาะ และผลไดของเซลลมี
คาลดลง จากผลการทดลองที่ไดเมื่อพิจารณาจากระยะเวลาในชวง lag phase หรือ อัตราการเจริญ
จําเพาะสูงสุด( maximum specific growth rate) กับความเขมขนของเอธานอล พบวาเอธานอลเปน
สาเหตุสําคัญในการยับยั้งการเจริญ และในระดับความเขมขนของเอธานอล 90 กรัมตอลิตร ยีสต
ไมสามารถเจริญได

การเจริญของยีสตสวนใหญขึ้นกับปจจัยทางกายภาพ เชน อุณหภูม,ิ ออกซิเจน และ

คารบอนไดออกไซด เปนตน นอกจากนีป้ จจัยทางเคมี ไดแกสวนประกอบของอาหารก็มีผลตอการ
เจริญเชนกัน ปจจัยทางเคมีที่สําคัญคือ พีเอช, เอธานอล, ความเขมขนของสับเสตรท และ ธาตุ
อาหาร ในการพัฒนาผลิตภัณฑขาวหมากและสาโท นอกจากจะตองทราบปจจัยทีม่ ีผลตอการเจริญ
แลว จําเปนทีจ่ ะตองทราบถึงปจจัยที่มีผลตอคุณภาพของผลิตภัณฑดว ย เชนปจจัยทีส่ งผลตอการเกิด
กลิ่นรส ปจจัยที่สําคัญคือ อุณหภูมิ และวิ ร ์ ธีการหมัก ในการผลิตเครื่องดื่มแอลกอฮอลของตางชาติ
เชน เบียร ไวน และ สาเก มีกศารนํ
ต
าส าเทคโนโลยีการตรึงเซลลมาใชกันอยางกวางกวาง ผลจากการ
ร
ใชเทคโนโลยีดังกลาวรวมกั เ ก ษบตสภาวะที่เหมาะสม สามารถปรับปรุงคุณภาพของผลิตภัณฑได ดัง
ลัย ้
รายงานการวิจยั ดังิทตยอาไปนี
ห าว
ม ัล
ิ จ ท
ิ
Bakoyianis et al. (1992) รายงานวา Saccharomyces cerevisiae Visanto 1 ซึ่งเปนยีสตที่
รู้ด
า ม ญไดดีที่อณุ หภูมติ ่ําและทนตอแอลกอฮอลความเขมขนสูง เมื่อนํามาหมักน้ําองุน และ
สามารถเจริ
คว
คลังนําไปบมที่อุณหภูมิตาง ๆ กัน พบวาการบมที่อุณหภูมติ ่ํามีผลทําใหความเขมขนของเอธานอลมีคา
เพิ่มขึ้น เนื่องจากที่อุณหภูมดิ ังกลาวมีความเหมาะสมตอกิจกรรมของเอนไซม แอลกอฮอล ดีไฮโดร
จีเนส (alcohol dehydrogenase) ในการเปลี่ยน acetaldehyde ไปเปนเอธานอล และพบวาการหมักที่
อุณหภูมิต่ําจะชวยปรับปรุงกลิ่นรสของไวน ซึ่งเปนผลมาจากปริมาณ propanol-1 และ isobutyl
alcohol ต่ําลง และ ethyl acetate มีปริมาณเพิ่มขึ้น

Bardi and Koutinas (1994) ศึกษาผลของการตรึงยีสต Saccharomyces cerevisiae strain

AXAZ-1 ซึ่งเปนยีสตที่สามารถเจริญไดดีที่อุณหภูมิต่ําและทนตอแอลกอฮอลความเขมขนสูง บน
 18

Delignified cellulosic material (D.C. material) สําหรับหมักไวนที่อณ ุ หภูมิหองเปรียบเทียบกับที่

อุณหภูมิต่ํา พบวาการหมักไวนที่อณุ หภูมติ ่ํา ๆ จะใชเวลาในการหมักนานกวา แตปริมาณเซลลนอย
กวาการหมักทีใ่ ชอุณหภุมิสูง ไวนที่ไดจึงมีความใสมากทําใหชว ยลดคาใชจายในการกรองไวน และ
พบวายีสตที่ถกู ตรึงยังสามารถผลิตเอธานอลไดในปริมาณสูงโดยไมเกิดการสูญเสียกิจกรรม จาก
การเปรียบเทียบอัตราการหมักที่อุณหภูมิเดียวกัน ระหวางเซลลตรึงและเซลลที่ไมถูกตรึง พบวาการ
ตรึงเซลลมีผลทําใหอัตราการหมักเพิ่มขึ้นอยางรวดเร็ว และใชระยะเวลาในการหมักสั้นกวาการใช
เซลลที่ไมถูกตรึง

Bardi et al. (1996a) รายงานวาเมื่อเปรียบเทียบการหมักเบียรที่อณุ หภูมิต่ําแบบ repeated

batch fermentation และ continuous fermentation โดยใชเซลลยีสตที่ถูกตรึง บน Delignified
cellulosic material (D.C. material) และเซลลที่ไมถูกตรึง พบวาใหผลเชนเดียวกับการหมักไวน คือ
การตรึงเซลลและการหมักที่อุณหภภูมิต่ํากวา จะใชเวลาในการหมักสัน้ และเบียรที่ไดจะใส จากการ
ทดสอบทางประสาทสัมผัสพบวา เบียรที่ไดจากการหมักที่อุณหภภูมิต่ําจะใหเบียรที่มีรสชาติดีกวา
ผลการทดสอบการเก็บรักษาพบวา สามารถเก็บเบียรไดนานที่อุณหภูมิ 4-5 องศาเซลเซียส โดยไม
เกิดตะกอนขุน เนื่องจาก D.C. material สามารถดูดซับโปรตีน, polyphenol หรือสารตั้งตนตาง ๆ ที่
ทําใหเบียรขุนได ร์
า ส ต
ตรศ
Bardi et al. (1996b)เ ก ษ รายงานวาการหมักไวน โดยการตรึงยีสต Saccharomyces cerevisiae
ัย
าลเตน
strain AXAZ-1 บนกลู ิา ท
ว ย พบวาใหผลการศึกษาคลายกับการตรึงบน D.C. material สําหรับใชใน
การหมักไวนมแหละเบียรที่อณ ุ หภูมิต่ํา โดยการหมักที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส และใชเซลลตรึงจะ
ล
ั
ิท มากกวาการใชเซลลที่ไมตรึง และพบวาเมื่ออุณหภูมิต่ําลง productivity ก็จะมีคา
ด
้ ู จ
ิ
ให productivity
า
ลดต่
ว มํารลงดวย
ค
คลัง
Bardi et al. (1996c) ศึกษาผลของอุณหภูมิตอการเกิดกลิ่นรสในเบียร โดยใชเซลลยีสต
Saccharomyces cerevisiae strain AXAZ-1 ตรึงบน D.C. material และ gluten pellet พบวา
อุณหภูมิ, การตรึงเซลล และวิธีการหมักมีผลตอการเกิด higher alcohol โดยการตรึงรูปจะให
ปริมาณของ higher alcohol ต่ํากวาเซลลที่ไมถูกตรึง และการตรึงเซลลบน D.C. material จะให
higher alcohol ต่ํากวาการตรึงบน gluten pellet เมื่อเปรียบเทียบวิธีการหมักพบวาการหมักแบบ
batch และ continuous จะใหปริมาณ higher alcohol ใกลเคียงกัน เมือ่ พิจารณาอุณหภูมิทใี่ ชหมักการ
 19

หมักเบียร พบวาที่อุณหภูมติ ่ําจะชวยปรับปรุงกลิ่นรสของเบียร โดยปริมาณ higher alcohol มีคา

ลดลง ขณะเดียวกัน ethyl acetate มีคาเพิ่มขึ้น

Bardi et al. (1997) ติดตามการสรางสารใหกลิ่นรสและความเปนพิษของไวนที่หมักที่

อุณหภูมิต่ํา โดยใชยีสตที่ถูกตรึงบน delignified cellulosic material (DCM) และ gluten pellet การ
หมักที่ใชแบงเปนสองแบบคือ batch และ continuous fermentation ผลการศึกษาพบวา การเกิด
acetaldehyde, ethyl acetate, propanol-1, isobutanol, amyl alcohol และ methanol ขึ้นอยูกับชนิด
ของวัสดุที่ใชตรึงยีสต และอุณหภูมิที่ใชในการหมัก โดยการตรึงยีสตบน DCM และหมักที่อณ ุ หภูมิ
ต่ํา จะชวยเพิม่ ปริมาณ ethyl acetate ขณะเดียวกันจะชวยปรับปรุงกลิ่นรสของไวนใหดีขึ้น และลด
ความเปนพิษของไวนได เนื่องจาก ปริมาณของ amyl alcohol ลดลง

Iconomopoulou et al. (2002) ไดทดลองทําไวนโดยใช freeze-dried gluten supported

biocatalyst (FGB) ของสายพันธุ AXAZ-1 เปรียบเทียบกับ free freeze-dried cell (ffdc) โดยการ
หมักแบบ batch ทําการตรวจสอบผลของอุณหภูมิตอ kinetic parameter ผลการศึกษาพบวาการใช
FGB ในการหมักไวนที่อุณหภูมิต่ํากวา 20 องศาเซลเซียส มีผลทําให amyl alcohol ลดลง และ ethyl
acetate เพิ่มขึ้น และพบวาปริมาณของร์ ethyl acetate มีแนวโนมเพิ่มขึ้นเมื่ออุณหภูมทิ ี่ใชหมักต่ําลง
า ส ต
ตรศ
Kourkoutas et al.
เ ก ษ(2002) ทดลองหมักไวนโดยใช สายพันธุ AXAZ-1 ตรึงบน Quince
(ผลไมขนาดเล็กชนิิทดยหนึ าลัย่ง) ขนาด 2 ลูกบาศกเซนติเมตร โดยทําการหมักแบบ continuous
ว
fermentationมหเปานเวลา 46 วัน ที่อุณหภูมิหองและอุณหภูมิต่ํา ผลการศึกษาพบวา ความเขนของ
ท
ิ ัล amyl alcohol และ methanol มีคานอยกวา 100 มิลลิกรัมตอลิตร ในทุกสภาวะการ
จ
ิ
ethyl acetate,
รู้ด
า
ทดลองม
ว และพบวาการหมักที่อุณหภูมิต่ํา มีผลทําให amyl alcohol ลดลง และ ethyl acetate เพิ่มขึ้น
ง
ั ค
คล จากการทดสอบทางประสาทสัมผัสพบวาไวนที่ผลิตไดมกี ลิ่นรสของผลไม, รสชาติดี, และสามารถ
ปรับปรุงคุณภาพของไวนได

Kourkoutas et al. (2003) รายงานวา สายพันธุ AXAZ-1 ที่ตรึงบนผล Quince เมื่อนํามา

หมักกลูโคสและน้ําองุนที่อณ
ุ หภูมิ 0-10 องศาเซลเซียส พบวามีความคงตัวและมีกิจกรรมคงที่
ความเขมขนของ higher alcohols (propan-lnol และ isobutyl alcohol) มีปริมาณต่ํา การผลิต amyl
alcohol ขึ้นกับอุณหภูมิที่ใชในการหมัก และพบวาจะมีปริมาณนอยลงเมื่ออุณหูมิที่ใชหมักต่ําลง
 20

ในขณะที่ที่อณุ หภูมิต่ํา ๆ จะชวยเพิ่ม ethyl acetate โดยมีปริมาณมากถึง 113 มิลลิกรัมตอลิตร และ

พบวาไวนที่ไดมีกลิ่นรสของผลไม รสชาติเปนที่ยอมรับ

7. การผลิตเอกซตราเซลลูลารเอนไซมโดยยีสต

การผลิตเอกซตราเซลลูลารเอนไซมโดยยีสต มีการศึกษากันอยางแพรหลายในยีสตทําไวน
เนื่องจากจะชวยปรับปรุงคุณภาพของไวน เอนไซมทมี่ ีการศึกษาไดแก เอกตราเซลลูลารเซลลูลาร
เพคติเนส, โปรติเอส, เบตา-กลูแคนเนส, ไลเคนเนส, เซลลูเลส, ไซแลนเนส และอมัยเลส ผลจาก
การทํางานของเอนไซมเหลานี้ มีผลตอคุณภาพของผลิตภัณฑ เชน การทํางานของเอกซตรา
เซลลูลารโปรติเอส ทําใหมีกรดอะมิโนเกิดขึ้น ชวยสนับสนุนการเจริญของของยีสตและแบคทีเรีย
ที่เกี่ยวของกับการหมักไวน และชวยลดตะกอนขุนซึ่งมีสาเหตุมาจากโปรตีน นอกจากนีก้ รดไขมัน
ที่เกิดขึ้นจากการทํางานของเอนไซมเอกซตราเซลลูลารไลเปส มีผลตอคุณภาพทางประสาทสัมผัส
ของไวน การทํางานของเอนไซม เอกซตราเซลลูลารเพคติเนส ที่ผลิตจากไวนยีสตจะชวยในการ
สกัดน้ําองุนและกระบวนการ clarification ทําใหขั้นตอนของการกรองไวนทําไดงายขึ้น การศึกษา
สวนมากมักศึกษาเกีย่ วกับการคัดเลือกยีสตที่ผลิตเอกซตราเซลลูลาร เอนไซม เพื่อใชในการทําไวน
แตรายงานการศึกษาการผลิตและการคัร์ ดเลือกเอกซตราเซลลูลารเอนไซมโดยยีสตทแี่ ยกจากลูกแปง
ต
ของไทยยังมีการศึกษาไมมากนัรกศาส
เ ก ษต
าลัย
ิทย กษาการผลิตเอกซตราเซลลูลารเอนไซมจากยีสตโดยนักวิจัยดังตอไปนี้
ตัวอยางการศึ
าว
ม ห
ท
ิ ัล et al. (1977) ไดแยกยีสตจากลูกแปง Ragi ของอินโดนีเซีย ไดยีสตจํานวน 41
รู้ด ิ จSaono
ว า ม พบวามี 19 ไอโซเลท ที่แสดงกิจกรรมของอมัยเลส และ 14 ไอโซเลท สามารยอย
ไอโซเลท
ค
คลังไขมันได แตทุกไอโซเลท ไมสามารถยอยโปรตีนได

Charoenchai et al. (1997) ตรวจสอบความสามารถในการผลิตเอกซตราเซลลูลาร เพคติ

เนส, อมัยเลส, ไลเปส, โปรติเอส และบีตา-กลูโคซิเดส ของไวนยสี ต 26 สายพันธุ (Candida,
Debraromyces, Hanseniaspora, Hansenula, Kloeckera, Metschnikowia, Pichia, Saccharomyces
และ Torulaspora) พบวาบางสายพันธุของ Candida spp .และ Hanseniaspora uvarum สามารถ
ผลิตเอกซตราเซลลูลารโปรติเอส หรือ เอกซตราเซลลูลารไลเปส ได ยีสตสวนใหญสามารถแสดง
 21

กิจกรรมของเอนไซมบีตา-กลูโคซิเดส โดย P. anomala และ K. apiculata แสดงกิจกรรมของ

เอนไซมในปริมาณสูง

Strauss et al. (2001) ตรวจสอบชนิดของเอนไซมที่ผลิตโดย non-Saccharomyces yeasts

ซึ่งแยกไดจากผลองุนในสวนบริเวณแอฟริกาใตจํานวน 245 ไอโซเลท พบวายีสตที่แยกได 21
สปชีส ไดแกจีนัส Kloeckera, Candida, Debraromyces, Rhodotorula, Zygosaccharomyces,
Pichia, Hanseniaspora และ Kluyveromyces สามารถผลิตเอนไซม เอกซตราเซลลูลารเพคติเนส,
โปรติเอส, บีตา-กลูแคนเนส, ไลเคนเนส, เซลลูเลส, ไซแลนเนส, อมัยเลส และมีกิจกรรมของ
เอนไซมซัลไฟท รีดักเทส แตไมแสดงกิจกรรมของเอนไซม เบตา-กลูโคซิเดส

Buzzini and Martini (2002) ตรวจสอบกิจกรรมการสรางเอกซตราเซลลูลาร สําหรับใชใน

การผลิตอาหาร จากตัวอยางยีสต 348 สายพันธุ (193 ascomycetous yeast และ 155
basidiomycetous yeast) และ yeasts-like fungi 46 สายพันธุ ซึ่งแยกไดจากแหลงธรรมชาติตาง ๆ
จากปาดงดิบของประเทศบราซิล พบวาสามารถแสดงกิจกรรมของเอนไซม อมัยเลส, เอสเทอร
เลส, ไลเปส, โปรติเนส, เพคติเนส และ ไคตินเนส ในสภาวะที่เปนกรดและเปนกลางได จากผล
การทดลองที่ไดแสดงใหเห็นวา เอนไซม
ต ร ์ จากยีสตเหลานีม้ ีศักยภาพในการนําไปใชในอุตสาหกรรม
ส
อาหารได รศา
เ ก ษต
าลัย
ิทย ในแตละกลุม สามารถสรุปไดดังนี้
สําหรับเอนไซม
าว
ม ห
ท
ิ ัล
ิ จ
รู้ด ไลเปส ไลเปสเปนเอนไซมที่อยูในกลุมไฮโดรเลส (hydrolase) มีชื่อในระบบวา
7.1
ม
กลีวาเซอรอล เอสเทอร ไฮโดรเลส (glycerol ester hydrolase) หรือไตรเอซิลกลีเซอรอล เอซิลไฮโดร
ค
คลังเลส (triacylglycerol acylhydrolase) (E.C. 3.1.1.3) (Seitzz, 1974) แบงได 2 ประเภทตามลักษณะ
ของปฎิกิริยาดังนี้ (ปราณี, 2543)

7.1.1 เอนไซมเรงปฏิกิริยาไฮโดรไลซิส ยอยสลายโมเลกุลของไตรกลีเซอไรดได

ผลิตภัณฑเปนกลีเซอรอล กรดไขมัน และ partial glyceride สับสเตรทของไลเปสเปนไตรกลีเซอ
ไรดที่เปนกรดไขมันโมเลกุลยาว ที่ไมละลายน้ํา ซึ่งไลเปสจะเรงปฏิกิริยาการยอยสลายพันธะเอส
เทอรที่อยูระหวางสวนทีไ่ มละลายน้ําและสวนที่สามารถละลายน้ําได ไลเปสจะทําปฏิกิริยาดังกลาว
ไดเมื่อไตรกลีเซอไรดอยูในสภาพ oil water interface ดังนั้นไลเปสจึงไมใชเอนไซมที่ไฮโดรไลซ
 22

ฟอสฟอไลปด(phospholipids) และโคเลอริลเอสเทอร(choleryl ester) ถึงแมวาจะมีไลเปสบางตัวที่

สามารถไฮโดรไลซฟอสฟอไลปด และโคเลสเตอรอลได (Jensen, 1983) สวนการยอยสลายคาร
บอกซิลิคแอซิค เอสเทอร (carboxylic acid ester) ที่ละลายน้ําไดโดย true lipase ปฏิกิริยาเปนไปได
ชามาก (Macrae, 1983)

7.1.2 เอนไซมไลเปสที่สังเคราะหสารประกอบเอซิลกลีเซอรอลตาง ๆ โดยเกิด

ปฏิกิริยาที่พันธะเอสเทอรของสารประกอบเอซิลกลีเซอรอล เชน ปฏิกิริยาทรานสเอสเทอรริฟเคชั่น
ของไขมัน ซึ่งเปนปฏิกิริยาสังเคราะหหรือมีการเคลื่อนยายหมูเอซิลหรืออัลคิลของสารประกอบ
เอสเทอร ซึ่งอาจเกิดขึน้ ระหวางเอสเทอรกับกรดไขมันอิสระกับแอลกอฮอล เอสเทอรกับเอสเทอร
หรือเอสเทอรกับกรดอะมิโน แลวแตชนิดของสารตั้งตน เอนไซมไลเปสนี้ทําใหสมบัติของไขมัน
หรือน้ํามันเปลี่ยนแปลงไป โดยเกิดการเปลี่ยนแปลงทีช่ นิดของกรดไขมันในไตรกลีเซอรอล (เชิด
ศักดิ,์ 2535)

จุลินทรียที่ผลิตเอนไซมไลเปส สามารถพบไดทั่วไปในธรรมชาติโดยเฉพาะบริเวณที่มี
ไขมันปนเปอนอยู เชน อาหาร น้ําเสียตามบานเรือน ดิน เปนตน ไลเปสจากจุลินทรียแตละชนิด
จะมีสมบัติในการทํางานแตกตางกันไป ร ์ ขึ้นอยูกับชนิดของจุลินทรีย ยีสตเปนจุลินทรียที่มีผูศึกษา
ถึงคุณสมบัติของเอนไซมไลเปสที
ต
าส่ผลิตขึ้น และไดศึกษาการผลิตเอนไซมจนถึงระดับการคาอยาง
ต ร ศ
แพรหลาย เนื่องจากยีสตเกทษี่ใชศึกษาไมกอ ใหเกิดโรค และสามารถนําไปใชในอุตสาหกรรมอาหาร
ย
ได (Miller et al., 1991) าลัย
าว ิท
ม ห
ท
ิ ัลตสายพันธุท ี่ผลิตไลเปสเปนการคาไดแก Candida rugosa ซึ่ง Ampon et al. (1991)
รู้ด ิ จยี ส
และ
ว า ม Padt et al. (1992) ไดทําการศึกษาการทํางานของเอนไซมไลเปสจากเชื้อดังกลาว โดยศึกษา
ค
คลังการเกิดปฏิกิรยิ าอัลคิลเลชั่น อินเตอรเอสเทอรริฟเคชั่น (Interesterification) ในตัวทําละลายอินทรีย
Miller et al., (1991) ไดศึกษาไลเปสจากเชื้อ C. cylindracea ในการเกิดปฏิกิริยาอินเตอรเอสเทอร
ริฟเคชั่นของไตรกลีเซอไรด

Charoenchai (1995) รายงานวา สารพวกลิปดที่มาจากองุน กิจกรรมของจุลินทรีย และ

การยอยสลายตัวเองของยีสตในไวน สามารถยอยสลายได โดยเอนไซมจากยีสต ทําใหเกิดเปน
กรดไขมันอิสระขึ้นในน้ําองุน หรือในไวน มีผลดีตอคุณภาพของไวน การผลิต เอกซตราเซลลูลาร
ไลเปสโดยยีสต ยังมีการศึกษากันไมมากนักแตมีรายงานหลายฉบับรายงานวา Candida lipolytica,
 23

Rhodotorula spp. สามารถผลิตไลเปสไดในปริมาณสูง แตหลาย ๆ สายพันธุของ Saccharomyces

cerevisiae ไมสามารถผลิต เอกซตราเซลลูลารไลเปส และการเกิดกรดไขมันชนิดโซ (chain fatty
acid) เชน decanoic acids หรือ octanoic acids จะมีผลตออัตราการเจริญของ S. cerevisiae และ
malolactic bacteria

การคัดเลือกจุลินทรียที่แสดงกิจกรรมของ lipolytic enzyme นิยมใช Tributyrin เปน

emulsified substrates เนื่องจากสารดังกลาวสามารถรวมตัวไดดกี บั อาหารที่ใชในการตรวจสอบ
และปฏิกิริยาการยอยสลายจะทําใหเกิดบริเวณใส(clear zone) รอบ ๆ โคโลนีของยีสตที่มีการสราง
เอนไซม (Charoenchai, 1995)

7.2 อมัยเลส อมัยเลสเปนเอกซตราเซลลูลาร เอนไซม สามารถยอยแปงเปนน้ําตาลไดพบ

ในพืช สัตว และจุลินทรียหลายชนิด สามารถแบงเอนไซมเปน 2 ประเภทตามตําแหนงการยอย
แปง (เบญจพร, 2542)

7.2.1 เอนโดอมัยเลส เปนเอนไซมที่ยอยแปงแบบสุมทีต่ ําแหนง α-D-

(1,4) glyco-sodic bonds ถาการยอยไมร ์ สมบูรณจะมีกลูโคส มอลโทส และเด็กสตรินเกิดขึ้น ถายอย
สมบูรณจะไดน้ําตาล มอลโทส ศและ
ต
าส กลูโคสเทานั้น เอนไซมประเภทนี้ไดแก แอลฟา-อมัยเลส (α-
ต ร
amylase) พบไดในพืช สัตเกวษและจุลินทรีย
าลัย
ิาวทย
ล
ั มห 7.2.2 เอกซโซอมัยเลส เปนเอนไซมที่ยอยแปงจากทางดาน non-reducing end
เอนไซม ด
้ ู จ
ิ ิทประเภทนี้ไดแก เบตาอมัยเลส(β-amylase) และกลูโคอมัยเลส(glucoamylase)
ว า มร
ค
คลัง เบตาอมัยเลส (β-amylase) ยอยแปงที่ตําแหนง α-D-(1,4) glycosodic
bonds เขาไปทีละสองหนวยของกลูโคสแตไมสามารถยอยพันธะที่ตอแบบ α-D-(1,6) glycosodic
bonds ผลที่ไดจากการยอยคือ น้ําตาลมอลโทส และเด็กสตรินที่มีน้ําหนักโมเลกุลสูง เอนไซมชนิด
นี้พบไดในพืช เชน ธัญพืช มันเทศ และแบคทีเรียบางชนิด

กลูโคอมัยเลส (glucoamylase) สามารถยอยแปงไดอยางสมบูรณจากทาง

ดาน non-reducing end ที่ตําแหนง α-D-(1,4) และ α-D-(1,6) glycosodic เขาไปทีละหนึ่งหนวย
กลูโคส ดังนั้นการยอยที่สมบูรณจะไดน้ําตาลกลูโคสเพียงอยางเดียว
 24

การตรวจสอบจุลินทรียที่แสดงกิจกรรมของเอนไซมอมัยเลส สามารถตรวจสอบไดบน
อาหาร starch agar โดยสังเกตบริเวณใสรอบ ๆ โคโลนีของยีสต หลังจากที่ราดผิวหนาอาหารดวย
สารละลายไอโอดีน เนื่องจากเกิดการยอยสลายแปงทําใหเกิดบริเวณใสขึ้น มีรายงานวาการขับอ
มัยเลสออกนอกเซลลของยีสต ขึ้นกับองคประกอบของอาหารที่ใชในการตรวจสอบเปนสําคัญ
โดยพบวา soluble starch และ dextrin เปนแหลงคารบอนที่ดีที่สุดในการตรวจสอบ การขับอ
มัยเลสบางชนิดตองการกลูโคสและสับสเตรทที่เปนแปง กิจกรรมของอมัยเลสในยีสตเปนสิ่งที่
นาสนใจในการแปรสภาพวัสดุจําพวกแปงใหเปนชีวมวล หรือเอธานอล แตในการผลิตไวนไมมี
ความจําเปนแตอาจมีความสําคัญในระดับ large-scale production ของไวนยีสตที่ใชเศษวัสดุจําพวก
แปงเปนสับเสตรทในการหมัก (Charoenchai, 1995)

ยีสตที่สามารถผลิตเอนไซม แอลฟา-อมัยเลส และกลูโคอมัยเลสได เชน Candida

antarctica, Filobasidium capsuligenum, Lipomyces kononenkoae, Saccharomycopsis capsularis,
S. fibuligera, Schwaniomyces occidentalis (De Mot, 1990) S. alluvius, และ S. cerevisiae var.
diasticus (Wilson and Ingledew, 1982)

Stepanov et al. (1975) รายงานว

ต ร ์ า กลูโคสและ cyclic 3′,5′ adenosine mono(CAMP) มี
าส
ผลตอการสรางกลูโคอมัยเลสและแอลฟา-อมั
ร ศ ยเลส(α-amylase) ที่ผลิตจากยีสต Endomycopsis
ต
fibuligera 20-9 เกษ
ัย
าล
ิาวทย
ห et al. (1975) ไดเพาะเลี้ยงเชือ้ ยีสต Endomycopsis fibuligera ที่คัดเลือกได
Sukhumavasi
ัิทล ม
ิจ งขาวหมากของไทยเพื่อการผลิตเอนไซมกลูโคอมัยเลส โดยนําไปเพาะเลีย้ งในอาหารที่
จากลูกู้ดแป
ร
ว ม
า วย แหลงคารบอน 1.0 เปอรเซ็นต yeast extract 0.3 เปอรเซ็นต และ malto-extract
ประกอบด
ค
คลัง0.3 เปอรเซ็นต ปรับพีเอชเปน 6.0 ดวยสารละลายกรดไฮโดรคลอริกความเขมขน 0.1 โมลาร ทํา
การเพาะเลีย้ งในฟลาสกขนาด 500 มิลลิลิตร ใหอากาศบนเครื่องเขยาควบคุมอุณหภูมิที่ 32 องศา
เซลเซียส นาน 50 ชั่วโมง ในการทดลองใชกลูโคส มอลโตส และ soluble starch ซึ่ง soluble
starch สามารถเหนี่ยวนําใหมีการสรางเอนไซมไดสูงกวาการใชมอลโตส เมื่อลดสัดสวนของสูตร
อาหารลงครึ่งหนึ่งพบวา การผลิตเอนไซมจะสูงขึ้นเปนสองเทา แตการเจริญลดลงและพีเอชของ
อาหารลดลงเปน 5.5 ภายใน 2-3 ชั่วโมงแรก ของการเพาะเลี้ยงและเพิ่มขึ้นเปน 7.5 เมื่อสิ้นสุด
การทดลอง สามารถผลิตเอนไซมได 1.5-2.0 หนวยตอมิลลิลิตร
 25

Georgieva et al. (1976) ศึกษาอิทธิพลขององคประกอบในอาหาร ตอการเจริญและ

กิจกรรมของเอนไซมกลูโคอมัยเลส และไกลโคซิลทรานซเฟอเรส(glycosyltransferase) จาก
Endomycopsis fibuligera พบวาการผลิตเอนไซมจะขึน้ อยูกับแหลงคารบอนและแหลงไนโตรเจน
เมื่อความเขมขนของ starch มากกวา 0.5 เปอรเซ็นต จะชวยกระตุนการสังเคราะหเอนไซมไกลโค
ซิลทรานซเฟอเรส แตยับยั้งการผลิตเอนไซมกลูโคอมัยเลส อัตราการเจริญของเชื้อจะเพิ่มขึน้ เมื่อ
ความเขมขนของ starch จาก 0.5-6 เปอรเซ็นต การผลิตไกลโคซิลทรานซเฟอเรส ควบคุมโดย
กลูโคส แลคโตส ซูโครส และ มอลโตส สวนการผลิตเอนไซมกลูโคอมัยเลส ถูกควบคุมโดย แลค
โตส ซอรโบส และ กาแลตโตส การผลิตไกลโคซิลทรานซเฟอเรส ถูกกระตุนโดย ไซโลส ซอร
โบส และ กาแลคโตส การผลิตเอนไซมกลูโคอมัยเลส ถูกกระตุน โดย ไซโลส และ อะราบิโนส

Kato et al. (1976) ทําการคัดเลือกยีสต Endomycopsis fibuligera จากลูกแปง Ragi ของ

ประเทศอินโดนีเซียพบวา สามารถผลิตเอนไซมกลูโคอมัยเลสไดเชนเดียวกัน เอนไซมที่ผลิตไดมี
สวนเกีย่ วของกับการเปลี่ยนแปลงแปงไปเปนน้ําตาลในอาหารหมัก ของประเทศแถบเอเซีย
ตะวันออกเฉียงใตและจีน

Afanas′eva and Zatseva (1977) ร ์ ศึกษาอิทธิพลของ nitrosoguanidine และ ultraviolet light

ตอการผลิตกลูโคอมัยเลส จากเชื
ต
าส้อยีสต Endomycopsis fibuligera พบวาเชื้อจะมีลักษณะ
ร ศ
เปลี่ยนแปลงไปจากเชื้อในชุ เ ก ษดตควบคุมอยางสิ้นเชิง โดยพบวากิจกรรมของเอนไซมกลูโคอมัยเลสจะ
ัย
ยาลnitrosoguanidine โดยเฉพาะที่ความเขมขน 500 mcq/ml เปนเวลา 90 นาที
เปลี่ยนแปลงไปเมื่อิทใช
ห าว
ม ัล et al. (1980) ศึกษาการผลิตเอนไซมอมัยเลส จากเชื้อยีสต Schwaniomyces
ิ จ ท
ิ
Clementi
ารู้ด
ม และ Endomycopsis fibuligera ในอาหารที่มีองคประกอบของน้ําตาลที่แตกตางกันคือ
castellii
คว
คลังกลูโคส, เซลโลไบโอส, ซูโครส, มอลโตส, ทรีฮาโลส, เมเลไซโอส, ราฟฟโนส, เอธานอล, กลีเซ
อรอล และ soluble starch พบวายีสตทั้งสองชนิดผลิตเอนไซมอมัยเลสไดดีในอาหารที่มี maltose
และ soluble starch กลูโคสอิสระจะยับยัง้ การผลิตเอนไซม โดยพีเอชที่เหมาะสมในการเจริญและ
ผลิตเอนไซมสูงสุดสําหรับ S. castellil และ E. fibuligera คือ 5.5-7.0 และ 4.5-6.0 ตามลําดับ

Sandhu et al. (1987) ไดตรวจสอบการสรางเอนไซมแอลฟา-อมัยเลสจากยีสต 7 ชนิด

ไดแก Candida tropicalis, Hansenula anomala, Lipomyces sp., Pichia membranaefaciens,
Saccharomycopsis fibuligera, Saccharomyces cerevisiae และ Trichosporon pullalans พบวา
 26

S. fibuligera แสดงกิจกรรมของเอนไซมไดสูงที่สุด คือ 6.56 unit/ml และ S. cerevisiae แสดง

กิจกรรมของเอนไซมไดต่ําสุด คือ 1.93 unit/ml เมื่อนํา S. fibuligera ไปชักนําใหเกิดการกลาย
พันธุโดยใชรังสีอัลตราไวโอเลตเปนเวลา 30 วินาที พบวายีสตสามารถแสดงกิจกรรมของเอนไซม
เพิ่มขึ้นประมาณ 2 เทาตัว โดยมีสภาวะทีเ่ หมาะสมในการสรางเอนไซม คือ ความเขมขนของสับ
เสตรท 1.5 เปอรเซ็นต(น้ําหนักตอปริมาตร), พีเอช 5.0 และอุณหภูมิ 28 องศาเซลเซียส

Gasperik et al. (1991) รายงานวา Saccharomycopsis fibuligera KZ สามารถสราง

complex extracellular amylomytic enzymes เมื่อเลี้ยงใน fine fibre (ของเสียที่ไดจากการผลิตแปง
ขาวโพด) และน้ําแชขาวโพด ซึ่งประกอบดวยสวนของ แอลฟา-อมัยเลส และ กลูโคอมัยเลส
โดยมีน้ําหนักโมเลกุลเทากับ 54,000 และ 62,000 ตามลําดับ เอนไซมทั้งสองชนิดจะมีกิจกรรมสูง
ที่สุดในชวงพีเอช 5.0-6.2 และอุณหภูมิ 40-50 องศาเซลเซียส เมื่อทดสอบความคงสภาพของ
เอนไซมพบวา กลูโคอมัยเลส มีความคงตัวไดดีกวา แอลฟา-อมัยเลส และหลังจากบมที่อุณหภูมิ
100 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10 นาที พบวาเอนไซมทั้งสองชนิดมีกิจกรรมลดลงประมาณ 45
เปอรเซ็นต

Shimada et al. (1993) ทดลองตรึ ร ์ งเซลล Saccharomycopsis fibuligera IFO 0111 โดยใช
agarose gel พบวาการเติม concanavalin
ต
าส A ลงไปจะทําใหการสรางเอนไซม กลูโคอมัยเลส สูงขึ้น
ร ศ
โดยเอนไซมจะอยูในรูปของ เ ก ษตconcanavalin A-glucoamylase complex การเกิดและการสลายตัวของ
complex สามารถควบคุ ย าลัย มไดโดยการเติมและไมเติม methyl-∝-D-mannopyranoside ซึ่งมี affinity
า ว ิท
กับ concanavalin
ล
ั มห A ไดดีกวา การแยกและการทําบริสุทธิ์เอนไซมสามารถทําไดโดยการเติม
methyl-ู้ดิจ∝ิท-D-mannopyranoside ในปริมาณที่เหมาะสม
า มร
ว
คลังค Gautam et al. (1993) ทดลองสรางลูกผสมระหวาง Saccharomyces cerevisiae สายพันธุ
ที่ผลิตเอธานอลไดดี กับ Endomycopsis fibuligera สายพันธุที่ผลิตเอนไซมอมัยเลสไดดี พบวา
ลูกผสมที่ไดสามารถหมักแปงได ความถี่ในการ fusion เทากับ 2×10-7 ลักษณะทางสัณฐานวิทยา
ของลูกผสมที่ได มีลักษณะคลายกับ S. cerevisiae แตมีขนาดเล็กกวา และจํานวน DNA ของ
ลูกผสมที่ได มีปริมาณมากกวาเซลลพอแมเพียงเล็กนอย
 27

Baeva et al. (1996) ไดทําการศึกษาการโคลนนิ่งยีนที่ควบคุมการสราง แอลฟา-อมัยเลส

(α-amylase) จากยีสต Saccharomycopsis fibuligera สู Saccharomyces cerevisiae พบวา
ประสิทธิภาพในการขับเอนไซมเทากับ 98 เปอรเซ็นต โดยพีเอชที่เหมาะสมคือ 4.0

Choi et al. (1996) ทดลองสรางลูกผสมระหวาง Saccharomycopsis fibuligera K-33 ซึ่ง

สามารถสรางเอนไซม กลูโคอมัยเลสและแอลฟา-อมัยเลสไดดี กับยีสต Saccharomyces
cerevisiae D-71 โดยใชเทคนิค protoplast fusion พบวา fusion frequency มีคาเทากับ 1.95×10-4
ลูกผสมรหัส 10-1 สามารถผลิตเอนไซมแอลฟา-อมัยเลสไดสูงขึ้น และเมื่อนําไปเลีย้ งในอาหารที่
มี soluble starch เปนเวลา 3 วัน สามารถผลิตเอธานอลไดเทากับ 3.1 เปอรเซ็นต(ปริมาตรตอ
ปริมาตร) และมีกิจกรรมของเอนไซมอมัยเลสสูงขึ้นประมาณ 3 เทาตัวเมื่อเปรียบเทียบกับ K-33
หลังจากเลี้ยงเปนเวลา 2 วัน

Soni et al. (1996) รายงานวา Saccharomycopsis capsularis สายพันธุที่ยอยแปงไดดี ซึ่ง

แยกไดจากอาหารหมักจากธัญพืชของอินเดีย สามารถผลิตเอนไซม แอลฟา-อมัยเลส และ กลูโคอ
มัยเลสได เอนไซมดังกลาวมีกิจกรรมสูงในชวงการเติบโตคงที่ (stationary phase) ผลไดของอ
มัยเลส (amylase yield) จะมีคาสูงเมื่อรเลี ์ ้ยงในแหลงคารบอน แหลงไนโตรเจน พีเอชเริ่มตน และ
อุณหภูมิ ที่เหมาะสม เมื่อทดลองใช
ต
าส วัสดุทางการเกษตรราคาถูก เชน รําขาวสาลี แปงขาวโพด และ
ร ศ
ถั่วเหลืองปน (ขจัดไขมันเแล ก ษวต) เปนแหลงคารบอน และถั่วลิสงบดเปนแหลงไนโตรเจน อุณหภูมิ
และ พีเอช ที่เหมาะสมคื ย าลัยอ 28-32 องศาเซลเซียส และ 4.5-5.0 ตามลําดับ crude enzyme amylase ที่
า ว ิท
ไดแสดงคุณสมบั
ล
ั มห ติ liquefy และ saccharify starch soluble 1 เปอรเซ็นต ไดสมบูรณในเวลา 24
ชั่วโมงู้ดทีิจิท่อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส
า มร
ว
คลังค Jian (2000) ไดทดลองใช amylosa enzyme ในการผลิตไวนขาว โดยใชกระบวนการหมัก
แบบ semi-solid และ semi-liquid fermentation ผลการศึกษาเมื่อเปรียบเทียบกับวิธกี ารผลิตแบบ
ดั้งเดิม พบวาการใช amylosa enzyme ในการผลิตไวนขา ว ชวยใหกระบวนการผลิตดําเนินการได
งายขึ้น ผลไดของไวนขาว (rice wine yield) สูงขึ้นประมาณ 3-5 เปอรเซ็นต ตนทุนในการผลิต
โดยรวมลดลง และไวนขาวที่ผลิตไดมีคุณภาพดีขึ้น

Lee et al. (2001) รายงานวาสามารถสรางยีสตลูกผสมที่หมักแปงขาวโพดไปเปนเอธานอล

ได เซลลผูรับที่ใชในการสรางคือ Saccharomyces cerevisiae SH7458 โดยไดรับยีนควบคุมการ
 28

สรางกลูโคอมัยเลส(glucan 1,4-alpha-glucosidase) STA1 จาก S. diastaticus และยีนควบคุมการ

สรางแอลฟา-อมัยเลส จาก Bacillus stearothermophilus ยีสตลูกผสมที่ไดคือ S. cerevisiae
GA7458 สามารถแสดงกิจกรรมของเอนไซมอมัยเลสทั้งสองชนิดได เมื่อนํายีสตที่ไดไปหมักแปง
ขาวโพดที่มีความเขมขน 2 เปอรเซ็นต โดยใชการหมักแบบ fed-batch culture พบวาสามารถผลิต
เอธานอลได 13.2 กรัมตอลิตร และมีความคงตัวของพลาสมิดตลอดระยะเวลาการหมัก

Kondo et al. (2002) รายงานวาสามารถสรางยีสตสายพันธุ YF207 ซึ่งเปนยีสตที่มี

คุณสมบัติ flocculation ไดดี (ไดรับยีนมาจาก Saccharomyces cerevisiae ATCC 60712 และ S.
cerevisiae W303-1B) พลาสมิดที่ใชในการสราง คือ pGA11 โดยเปนชนิด multicopy plasmid ที่มี
ยีนควบคุมการผลิตกลูโคอมัยเลส(glucan 1,4-alpha-glucosidase)จาก Rhizopus oryzae ผลจาก
การศึกษาพบวาเซลลลูกผสมที่ได สามารถเจริญไดอยางรวดเร็วในสภาวะที่มีออกซิเจน (DO 2.0
ppm) เมื่อใช soluble starch เปนสับเสตรท และสามารถผลิตเอธานอลจาก soluble starch ใน
สภาพไรออกซิเจนไดเทากับ 0.71 กรัมตอลิตรตอชั่วโมง โดยไมพบชวง lag phase

7.3 โปรติเอส โปรติเอส(peptide hydrolase:EC 3.4) เปนเอนไซมที่ไฮโดรไลซพันธะเปป

ไทดของโปรตีน มีคุณสมบัติเปน กรด ร ์ เบส หรือ กลาง ตามลําดับ มีชื่อสามัญหลายชื่อไดแก เปปติ
เดส โปรติเอส โปรติเนส และศเปปไทด
ต
าส ไฮโดรเลส International Union of Biochemistry and
ต ร
Molecular Biology ไดเแกบษงกลุมของเอนไซมยอยโปรตีนตามกลไกการทํางานของเอนไซมได 2
กลุม (Barrett, 1994) ย าลอัย
คื
ิท าว
ม ห
ัล
ูร้ดจิ ิท
ม
7.3.1 เปปติเดส (exopeotidase:EC 3.4.11-19) เปนโปรติเอสที่ยอยสลาย
พั
คว า
นธะเปบไทด จากปลายสายของโปรตีน สามารถแบงเอนไซมตามการสลายพันธะของสายโปรตีน
ง
ั
คล ไดเปน 6 ประเภท ขอกลาวเพียงสังเขปดังนี้

7.3.1.1 อะมิโนเปปติเดส (EC 3.4.11) เปนเอนไซมที่ยอ ยสลาย

พันธะเปปไทดของโปรตีน โดยตัดทางปลายอะมิโน (N-terminal) ทีละหนวย

7.3.1.2 ไดเปปติเดส (EC 3.4.13) เปนเอนไซมที่มีความจําเพาะตอ

dipeptide substrate บริเวณสายพันธะเปปไทดของโปรตีน
 29

7.3.1.3 ไดเปปติดิล-เปปติเดส, ไตรเปปติดิล-เปปติเดส (EC 3.4.14)

เปนเอนไซมทยี่ อยพันธะเปปไทดของโปรตีน จากทางปลายอะมิโน (N-terminal) ทีละสองหรือ
สามหนวย

7.3.1.4 ไดเปปติดิล-ไดเปปติเดส (EC 3.4.15) เปนเอนไซมที่ยอยสลาย

พันธะเปปไทดของโปรตีน โดยตัดทางปลายคารบอกซิล (C-terminal) ทีละสองหนวย

7.3.1.5 คารบอกซีเปปติเดส (EC 3.4.16 - 18) เปนเอนไซมที่ยอยสลาย

พันธะเปปไทดของโปรตีน โดยตัดทางปลายคารบอกซิล (C-terminal) ทีละหนึ่งหนวย

7.3.1.6 โอเมกา เปปติเดส เปนเอนไซมทยี่ อยสลายพันธะเปปไทดของ

โปรตีนไดทั้งปลายอะมิโน (N-terminal) และ ปลายคารบอกซิล (C-terminal)

7.3.2 เอนโดเปปติเดส : EC 3.4.21 - 24 และ 99) เปนโปรติเอสที่ยอย

สลายพันธะเปปไทดอยางอิสระภายในสายโปรตีน เมื่อแบงตาม cytalytic site แบงเอนไซมไดเปน
5 กลุมคือ ร์
า ส ต
รศ
เ ก ษต ซีรีน โปรติเอส (EC 3.4.21) เปนเอนไซมที่มี ฮีสติดีน และ ซีรีน
7.3.2.1
ลัย
า นพวกอัลคาไลน โปรติเอส พีเอชที่เหมาะสมตอการทํางานของเอนไซมอยู
เปน active centerิทยเป
ในชวงพีเอช มห7.0
ว
า - 11.0 ซึ่งเอนไซมกลุมนี้ถูกยับยั้งโดย diisopropylfluorophosphate (DFP)
ัล
ร ิจิท
ตัวอยาู้ดงของเอนไซม กลุมนี้เชน ไคโมทริปซิน, ทริปซิน และ ซับติลิซิน
ว า ม
คลังค 7.3.2.2 ซีสเตอีน โปรติเอส (EC 3.4.22) เปนเอนไซมทมี่ ี ซีสเตอีน เปน
active center เปน neutral proteases มีพีเอชที่เหมาะสมตอการทํางานของเอนไซม อยูในชวงพีเอช
6.0 - 7.5 แตถูกยับยั้งโดย sulfhydryl reagents หรือ sulfhydryl group(-SH) ทําใหเอนไซมสูญเสีย
กิจกรรมของเอนไซมไป เอนไซมในกลุม นี้สามารถสกัดไดจากพืชชั้นสูง และจุลินทรียเชน ปาเปน
ไดจากยางมะละกอ ฟซิน ไดจากมะเดื่อ โบรมีเลน ไดจากสับปะรด เปนตน

7.3.2.3 แอสปาติก โปรติเอส (EC 3.4.23) เปนอะซิดิก โปรติเอส โดย

 30

มีพีเอชที่เหมาะสมในการทํางานคือ นอยกวา 5 และมี negative charges residue และแอสปาติก

เปน active center ตัวอยางเอนไซมไดแก แกสทริค โปรติเอส (เปปซิน แกสทริคซิน และ ไคโมซิน)
เรนนิน เปปซิน และโปรติเอสที่แยกไดจากเชื้อรา เปนตน

7.3.2.4 เมทัลโลโปรติเอส (EC 3.4.24) เปนนิวทรัล โปรติเอส มีพีเอชที่

เหมาะสมตอการทํางานของเอนไซมอยูในชวงพีเอช 6.5-7.5 เอนไซมชนิดนี้เปนเอนไซมที่ใช
ไอออนโลหะ ในการเกิด catalytic machanism กลาวคือ อยูในลักษณะของโคแฟคเตอร และถูกยั้บ
ยั้งโดย สารจับอิออนโลหะ(metal-chelating agents) เชน 1,10-phenanthroline และ EDTA ตัวอยาง
เอนไซมในกลุมนี้คือ คารบอกซีเปปติเดส เอ, คารบอกซีเปปติเดส บี, ไกลซิล-ไกลซีน-ไดเปปติเดส
คารโนซิเนส โปรลิเดส และ อิมิโนไดเปปติเดส เปนตน

7.3.2.5 โปรติเอส บางชนิดที่ยังไมรูถึง catalytic mechanism(EC 3.4.99)

Saccharomycopsis lypolytica CX161-1B เมื่อเจริญอยูในสภาพที่มีพีเอชเปนกลางสามารถ

ผลิตอัลคาไลนเอกซตราเซลลูลารโปรติเอสในปริมาณสูง ผลิตแอซิดเอกซตราเซลลูลารโปรติเอส
ในระดับต่ํา และไมผลิต นิวทรัลเอกซตราเซลลู ร ์ ลารโปรติเอล โดยที่อัลคาไลนเอกซตราเซลลูลาร
โปรติเอสที่ผลิตไดมีพีเอชที่เหมาะสมอยู
ต
าส ใ นชวง 9-10 และเอนไซมจะถูกยั้บยั้งไดอยางสมบูรณโดย
ร ศ
phenylmethylsulphonyl เfluoride ก ษต (Ogrydziak and Scharf, 1982) เมื่อเพาะเลีย้ งในอาหารที่มี
glycerol difco proteose ย าลัยpeptone และ mineral salts และปรับใหมพี ีเอช 3.4 สามารถผลิตแอซิด
า ว ิท
เอกซตราเซลลูมหลารโปรติเอสอยางนอยสามชนิดในชวงการเจริญแบบเอกซโพเนนเชียล และเมื่อ
จ
ิ ิทกัลเปนแหลงไนโตรเจน ยีสตสามารถผลิตเอนไซมไดเล็กนอย เอนไซมบริสุทธิ์ที่ไดมีสาม
ใชกลูตู้ดามิ
ชนิ
ว าดมรโดยที่โปรติเอส I มีน้ําหนักโมเลกุลประมาณ 28,000 มี isoelectric point ที่พีเอช 4.9 และมี
ค
คลังoptimum pH เทากับ 3.5 สําหรับ โปรติเอส II มีน้ําหนักโมเลกุลประมาณ 32,000 มี optimum pH
เทากับ 4.2 สวน โปรติเอส III มีน้ําหนักโมเลกุลประมาณ 36,000 มี isoelectric point ที่พีเอช
3.8 มี optimum pH เทากับ 3.1 โปรติเอสทั้งสามชนิดเปน ไกลโคโปรตีน โดยที่ โปรติเอส I II
และ III มีคารโบไฮเดรตเทากับ 25 12 และ 1.2 เปอรเซ็นต ตามลําดับ ถูกยับยั้งไดโดย pepstatin
และ 1,2-epoxy-3(4-nitrophenoxy) propane และไมมีปฏิกิริยาตอบสนองตอ diazoacetyl-DL-
norleucine methylester (Yamada and Ogrydziak, 1983)
 31

Lagace and Bisson (1990) รายงานวา Candida olea, C. lipolytica, Cryptococcus flavus,
Kloeckera apiculata, Pichia pinus, Torulopsis magnoliae และ C. pulcherrima สามารถลด
ตะกอนขุน ในไวนได 9-96 เปอรเซ็นต ผลจากกิจกรรมของไวนยีสตเหลานี้ ในระหวางชวงทีม่ ี
การตกตะกอนของน้ําองุน หรือในชวงตนของการหมักไวน จะทําใหเกิดเปปไทดและกรดอะมิโน
อิสระขึ้น ทําใหมีแหลงไนโตรเจนซึ่งสนับสนุบการเจริญของ Saccharomyces cerevisiae ตอไปได

วิธีที่นิยมในการคัดเลือกยีสตที่ผลิตเอกซตราเซลลูลารโปรติเอส คือการใช casein และ

gelatin agar plate โดยตรวจสอบจากบริเวณใสบน casein plate และ/หรือ gelatin liquefaction
โปรติเอสบางชนิดจะไฮโดรไลซ casein แตไมไฮโดรไลซ gelatin หรือ albumin ลักษณะการยอย
โปรตีนขึ้นอยูก ับระดับพีเอชของอาหารเลี้ยงเชื้อ อยางไรก็ตามผลที่ไดอาจเกิดความผิดพลาดได
เนื่องจากการยอยสลายตัวเองอาจมีการปลอย อินตราเซลลูลารเอนไซม (intracellular enzymes) ใน
กรณีนจี้ ะพบไดในเชื้อยีสตทมี่ ีอายุมาก ๆ ผลจากการวิเคราะหบน plate จะมีการตรวจสอบตอไปใน
liquid culture media (Charoenchai, 1995)

Wade et al. (2003) รายงานวาการเนาเสียของมะเขือเทศออนและสุก มีสาเหตุสําคัญมา

จากยีสตที่สรางเอนไซมยอยโปรตีน(proteolytic
ร ์ yeasts) จากการสํารวจตัวอยางมะเขือเทศเนา
ต
มะเขือเทศออน และมะเขือเทศสุศกาสจํานวน 215 ตัวอยาง สามารถแยกยีสตได 62 ไอโซเลท และ
ร
พบวา 12 ไอโซเลท (คิเดกเป ษตน 19.4 เปอรเซ็นตของตัวอยางทั้งหมด) สามารถแสดงกิจกรรมของ
าลัย gelatin agar และ standard methods caseinate(SMC) agar ได จาก
เอนไซมยอยโปรตีิทนยบนอาหาร
การวัดพีเอชของเนื ห าว ้อมะเขือเทศ พบวาอยูในชวง 4.3-7.5(เฉลี่ยเทากับ 5.3) ในขณะที่มะเขือเทศที่
ล
ั ม
ท
ิ
ิจ พเี อชอยูในชวง 4.2-5.1(เฉลี่ยเทากับ 4.8) ผลจากการจัดจําแนกยีสตทั้ง 12 ไอโซเล
ไมเปนู้ดโรคมี
า ร
ม า เปนยีสต Cryptococcus albidus 4 ไอโซเลท, Debraromyces hansenii และ
ทพบว
คว
คลังTrichosporon pullulans อยางละ 2 ไอโซเลท, C. humiculus, C. laurentii, Geotrichum
candidum และ Sporidioborus pararoseus อยางละไอโซเลท เมื่อทดลองถายเชื้อผสมระหวาง
Salmonella 5 ชนิด กับ G. candidum ในมะเขือเทศทีไ่ มเปนโรค และมะเขือเทศที่มีบาดแผลจาก
การแชเย็น และนําไปเก็บที่อณ ุ หภูมิ 15 องศาเซลเซียส นาน 10 วัน เปรียบเทียบกับกลุมที่ถาย
เฉพาะ Salmonella เพียงอยางเดียว ผลการทดลองพบวา มะเขื่อเทศที่ถายเชื้อผสมระหวาง
Salmonella 5 ชนิด กับ G. candidum มีประชากรของ Salmonella เพิ่มสูงขึ้นถึง 7.6 log10
cfu/2 g sample และมีพเี อชเพิ่มสูงขึ้น สวนมะเขือเทศที่ถายเฉพาะ Salmonella เพียงอยางเดียว
ประชากรของ Salmonella นอยมาก และพีเอชเพิ่มขึน้ เพียงเล็กนอย ผลการศึกษาสามารถสรุปได
 32

วา ยีสตเหลานี้มีบทบาทในการสรางสภาวะที่เหมาะสมตอการเจริญของแบคทีเรีย จึงเปนผลทําให

มะเขือเทศเกิดการเนาเสีย

8. คุณสมบัติเพชฆาตของยีสต

การคนพบ killer yeast เกิดขึ้นครั้งแรกในป 1963 โดย Makower และ Bevan ตั้งแตนั้นมา
ทําใหมีผูใหความสนใจถึงคุณสมบัติดังกลาวของยีสต และมีการศึกษาเกีย่ วกับสายพันธุเพชฆาต
(killer strains) กันอยางกวางขวาง เนื่องจากยีสตบางชนิดสามารถแสดงคุณสมบัติเพชฆาตได โดย
จะสรางและปลอยสารพิษออกมาฆายีสตสายพันธุที่ไวตอการถูกทําลาย (sensitive strain) ในขณะที่
ตัวเองมีความทน (resistant) ตอสารพิษนั้นได (Reed and Nagodawithana, 1991) ปจจุบันมีรายงาน
วาพบยีสตสายพันธุที่เปน killerในหลาย ๆ ชนิด ไดแก Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces
lactis, Williopsis mrakii, W. saturnus, Pichia kluyveri, Hanseniaspora uvarum, Sporidiobolus
pararoseus, Cryptococcus humicola, C. laurentii, Bullera sinensis, Metschnikowia spp.,
Rhodotorula rubra, R. glutinis, Tolulopsis, Debraromyces และ Candida spp. (สาวิตรี, 2540;
Walker, 1998)

ต ร ์
าส
สารพิษที่ killer strainsรศผลิตขึ้นมีทั้งชนิดที่เปนโปรตีน และไกลโคโปรตีน killer toxins
สามารถแบงได 10 กลุมเกใหญ ษต ๆ แตเนื่องจากมีการคนพบยีสตชนิดใหมและ killer toxins ที่สราง
ัย
าลางไป
ขึ้นก็มีคุณสมบัติแตกต
ิา ท
ว ย ดังนั้นปจจุบนั อาจแบงชนิดของ killer toxins ไดหลายชนิด อยางไรก็
ตามกลไกในการยั
ล
ั มห บยั้งการเจริญของ killer toxins ยังไมเปนที่ทราบแนชัดนัก แตมบี างรายงานได
เสนอวู้ดาิจิทกลไกดังกลาวเกีย่ วของกับการทําลายเยื่อหุมเซลล สําหรับความเปนพิษของ killer toxins
ว า มร
สามารถตรวจวั ดได โดยสังเกตจากการยับยั้งการเจริญของยีสตสายพันธุอื่น งานวิจยั หลายเรือ่ ง
ง
ั ค
คล แสดงใหเห็นวา killer toxins มีประสิทธิภาพดีในชวง พีเอช 4 และ 5 อยางไรก็ตามพบวา ความ
เปนพิษของ killer yeast toxins ยังคงเหลืออยูในชวง พีเอช ของการหมักไวน

การนํา killer yeast ไปใชประโยชน มีการศึกษากันมากในการทําไวน โดยคัดเลือก S.

cerevisiae ที่เปน killer strain มาใชเปน starter culture เพื่อควบคุมการปนเปอนของยีสตชนิดอื่น
ที่ไมตองการในระหวางการหมักไวน อยางไรก็ตามมีรายงานวา spoilage yeasts บางชนิดแสดง
คุณสมบัติเพชฆาตได และสามารถขัดขวางการหมักแอลกอฮอลได (Charoenchai, 1995) ปจจุบันมี
การศึกษาถึงคุณสมบัติของ killer toxin และมีการนํา killer yeast ไปใชประโยชนในงานดานตาง ๆ
 33

อยางกวางขวาง เชน ในงานดานอนุกรมวิธานใชคุณสมบัติการเปน killer strain เปนหลักเกณฑใน

การจัดจําแนก heterobasidiomycetous yeast ในงานดานพันธุวิศวกรรมใชพลาสมิดของยีสตเปน
cloning vector ในงานดานคลีนิคและเภสัชใชในการควบคุมเชื้อโรคตาง ๆ และใชสาร killer toxin
เปนยาฆาเชื้อรากอโรค ในอุตสาหกรรมเครื่องดื่ม เชน เบียร ไวน สาเก ใชในการควบคุมยีสต
ปนเปอน ในอุตสาหกรรมอาหารใชในการถนอมอาหาร ทางการเกษตรใชในการตอตานราที่
ทําลายเนื้อไม และราโรคพืช (Walker, 1998)

Walker et al. (1995) ไดทําการทดสอบความสามารถของ killer yeasts จํานวน 17 สาย

พันธุ ในการยับยั้งการเจริญของเห็ดและราที่กอโรคทางการเกษตร สิ่งแวดลอม และทางคลีนิก
พบวายีสตหลายชนิด สามารถแสดงกิจกรรมในการตอตานเห็ดและราไดหลาย ๆ สายพันธุของ
Saccharomyces cerevisiae และ Pichia anomala สามารถยับยั้งการเจริญของ basidiomycetes ที่
ทําลายไมและราที่กอโรคในพืช จากผลการทดลองดังกลาวสรุปไดวาการสราง killer toxins อาจทํา
ใหยีสตเหลานีม้ ีศักยภาพเปน antimycotic biocontrol agents

Jacqueline et al. (1997) ไดตรวจสอบยีสตจํานวน 944 ไอโซเลทจากเขตรอนพบวามี 105

ชนิดที่แสดงคุณสมบัติการเปน killerร์ yeast และสามารถยอยโปรตีนได โดยยีสตเหลานี้สามารถ
ต
ผลิต killer toxins ไดถึง 13 ชนิศดาสโดยที่ Pichia และ Kluyveromyces สามารถผลิต killer toxinsได
เพียงไมกี่ชนิด สวน Candida ษตร apis, C. bombicola, C. fractus, C. krusei, C. sorbosa,
ล ย
ั เก
า
Hanseniaspora uvarum,ิา ทย Issatchonkia occidentalis, Kloeckera apis, Kluyveromyces marxianus
ว
ล
ั มห
P. membranefaciens, P. ohmeri-like และ Sporoboromyces roseus แตละชนิดมีความสามารถใน
การแสดงกิ
ด
้ ู จ
ิ ิท จกรรมในการฆาไดแตกตางกัน โดยที่ P. kluyveri จะมีกจิ กรรมในการฆาที่กวาง และ
า มร ต killer toxins ไดหลายชนิด
สามารถผลิ
ว
ค
คลัง
Izgu and Altinbay (1997) ไดศึกษาศักยภาพของ killer toxins บริสุทธิ์ ที่ผลิตไดจาก killer
yeast ในการยับยั้งการเจริญของ Gram positive pathogenic bacteria และ Gram negative
pathogenic bacteria ผลการศึกษาพบวา สารพิษของ Saccharomyces cerevisiae และ Pichia
membranefaciens ไมมีกิจกรรมในการยับยั้งแบคทีเรีย ในทางตรงกันขาม killer toxins ของ
Hansenula anomala, H. mrakii, Candida tropicalis, Kluyveromyces drosphilarum และ K. lactis
มีศักยภาพในการยับยั้งการเจริญของ Gram positive pathogenic bacteria ดังนัน้ อาจกลาวไดวา
killer toxins มีผลตอ Gram positive pathogenic bacteria เทานั้น
 34

Kono and Himeno (1997) รายงานวายีสต Kluyveromyces waltii IFO16667 สามารถ

นําไปใชควบคุมกระบวนการ deacidification ได โดยยีสตดังกลาวสามารถยับยั้งการเจริญของ
Schizosaccharomyces pombe อยางไรก็ตามกิจกรรมการยั้บยั้งจะสูญเสียไป หากมีโปรติเอสรวม
อยูดวย

Llorente et al . (1997) ไดทําการตรวจสอบคุณสมบัติในการฆา ของยีสตที่แยกไดจาก

มะกอกดอง ในสภาวะที่มีเกลือโซเดียมคลอไรด ที่ความเขมขนตางกันมากกวา 6 เปอรเซ็นต
(น้ําหนักตอปริมาตร) พบวาความสามารถในการฆาจะเพิ่มขึ้นเมื่อความเขมขนของเกลือเพิ่มขึ้น

Kitamoto et al. (1999) ไดปรับปรุงกระบวนการหมัก maiz silage โดยทดลองเติม

genetically yeast modified killer yeast เพื่อเปนสารปรุงแตงในการยืดระยะเวลาการหมักแบบ
สภาพมีอากาศใหนานขึ้น โดยสายพันธุยสี ตที่เติมลงไปไดแก Kluyveromyces lactis killer strain
PCK27 ยีสตดังกลาวไมสามารถเจริญไดในสภาพที่มกี รดแลคติก เนื่องจากยีนที่เกี่ยวของกับการ
สรางเอนไซม phosphoenolpyruvate carboxykinase ถูกทําลาย สามารถยับยั้งการเจริญของ
Pichia anomala ซึ่งเปน aerobic spoilage yeast และปองกันการเพิ่มขึ้นของ พีเอช ในการหมัก
silage ได ร์
า ส ต
ตรศ
Buzzini and Martini เ ก ษ (2000) ไดตรวจสอบความหลากหลายของ killer activity ของ yeasts
และ yeasts-like fungi ย าลจําัยนวน 438 ไอโซเลท 96 สปชีส ซึ่งแยกไดจากแหลงธรรมชาติตาง ๆ จาก
า ว ิท
ปาดงดิบของประเทศบราซิ
ล
ั มห ล พบวา Ascomycetous yeast 26 เปอรเซ็นต, Basidiomycetous yeast
56 เปอร ด
้ ู จ
ิ เซ็ิทนต และ yeasts-like fungi 42 เปอรเซ็นต แสดงคุณสมบัติ killer activity และพบวามี
ร
ยีควสาตมชนิดใหมจํานวน 15 ชนิด ที่ไมเคยมีรายงานวา สามารถสราง killer toxins ได โดยที่
คลังPseudozyma antarctica, Trichosporon asteroids และ Geotrichum klebahnii มีความสามารถใน
การแสดงกิจกรรมการยับยั้งไดกวางมาก

Buzzini and Martini (2001) ไดอาศัยความไวตอ killer toxins ที่สรางโดย killer yeastใน
การแบงแยก Candida albicans จาก Candida สปชีสอื่น ผลการศึกษาพบวา C. albicans ใหผลลบ
ในขณะที่ non-Candida ใหผลบวกตอ killer toxins ผลที่ไดแสดงใหเห็นวา ความไวตอ killer toxins
สามารถใชเปนวิธีอยางงายในการแบงแยกระหวางของ C. albicans และ สปชีสอื่น ๆ ของจีนัส
Candida
 35

Ciani and Fatichenti (2001) รายงานวายีสต Kluyveromyces phaffii DBVPG 6076 ซึ่งเปน
ยีสตที่แยกไดจากผลองุน สามารถผลิต killer toxins ยับยั้งการเจริญของ apiculate wine yeast
ไดแก Hansenuraspora โดย killer toxins มีกิจกรรมในชวงพีเอช 3-5 ที่อุณหภูมิต่ํากวา 40 องศา-
เซลเซียส จากคุณสมบัติดงั กลาว สามารถนําสายพันธุดังกลาวมาใชในการควบคุมการปนเปอน
ของยีสตชนิดอื่นที่ไมตองการในระหวางการหมักไวนได

Suzuki et al. (2001) ศึกษาถึงปฏิกิริยาของ SMKT(salt-mediated killer toxin) killer toxin

ที่ผลิตจาก halotolerant yeast (Pichia anomala) สามารถฆายีสตไดหลายจีนัสรวมทั้ง
Saccharomyces cerevisiae จากการศึกษาถึงกลไกในการฆาของ SMKT โดยตรวจสอบปฏิกิริยา
ของ SMKT กับเยื่อหุมเซลลโดยใชไลโปโซม การรั่วซึมของ calcein จาก calcein-entrapped
liposome สังเกตไดเมื่อมี SMKT สวนการถูกทําลายสังเกตไดโดยใช dark-field microscopy เมื่อ
เปรียบเทียบกับเซลลของ S. cerevisiae ที่ไมไดถูกทําลายกับเซลลที่ถูกทําลายดวย SMKT โดยใช
dark-field microscopy แสดงใหเห็นวา spherical cell membrane ถูกทําลายโดย SMKT การใช
โซเดียมคารบอเนต ในการสกัดแสดงใหเห็นวา SMKT เกี่ยวของกับเยื่อหุมเซลลของ sensitive cell
ในชวงเวลาแรก จากผลที่ไดแสดงใหเห็นวา SMKT จะฆา sensitive S. cerevisiae โดยทําปฏิกิริยา
กับเยื่อหุมเซลล ร์
า ส ต
ตรศ
Jinhua et al. (2002)
เ ก ษ รายงานวาสามารถสรางเซลลลูกผสมของยีสตที่ใชหมักไซเดอรได
(cider yeast) โดยใช ย
เ าลัย ค protoplast fusion สําหรับ Donor yeast ที่ใชในการสรางไดแกสาย
ทคนิ
า ว ิท
ห his4, kar1-1 [KIL-K1] rho-+) สภาวะทีใ่ ชในการสราง คือเวลา 20 นาที ที่
พันธุ 5045 ม(alpha,
ล
ั
อุณหภูู้ดมิจิ ิท30 องศาเซลเซียส และสารเคมีที่ใช คือ PEG-6000 ผลการคัดเลือก fusant ที่แสดง
มร ติการเปน killer พบวามี 4 ไอโซเลท ที่มีความคงตัวสูง และมีลักษณะในการหมักไซ
คุควณาสมบั
คลังเดอรที่ดี ไดแก F12, F30, F57 และ F65
 36

อุปกรณและวิธีการ

อุปกรณ

1. วัตถุดิบและจุลินทรีย

1.1 ขาวเหนียว พันธุ กข (ซื้อจากตลาดเคหะ อ. ธัญบุรี จ. ปทุมธานี)

1.2 Saccharomyces cerevisiae RIT I แยกไดจากการหมักสาโท
1.3 S. cerevisiae EC1119 killer strain
1.4 S. cerevisiae AWRI 729 sensitive strain จาก Australian Wine Research Institute,
Australia
1.5 Saccharomycopsis fibuligera, Amylomyces spp. และ Rhizopus spp. (แยกไดจากลูก
แปงขาวหมากและลูกแปงเหลาของไทย ไดรับความอนุเคราะหจาก รศ.ดร. สาวิตรี ลิ่มทองภาควิชา
จุลชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร ) แสดงดังตารางที่ 1 และตารางที่ 2

ตารางที่ 1 เชื้อราที่ใชในการศึกษา ต ร ์
าส
ษตรศ
ชนิดรา
ัย เก จากตัวอยาง ทองที่ซึ่งเก็บตัวอยาง
ิทยาล
Amylomyces spp.หML005 าว ลูกแปงเหลา ตลาดนนทบุรี อ. เมือง จ. นนทบุรี
Amylomyces ท
ิ ัลspp.ม MKM031 ลูกแปงขาวหมาก ตลาดนนทบุรี อ. เมือง จ. นนทบุรี
ม ร ู้ดิจ spp. MKM008
Amylomyces ลูกแปงขาวหมาก ตลาดพระโขนง เขตพระโขนง กทม.
คว า
คลังRhizopus spp. MKM012
Amylomyces spp. MKM029 ลูกแปงขาวหมาก ตลาดบางจาก พระโขนง
ลูกแปงขาวหมาก ตลาดนนทบุรี อ. เมือง จ. นนทบุรี
Rhizopus spp. ML004 ลูกแปงเหลา ตลาดนนทบุรี อ. เมือง จ. นนทบุรี
Rhizopus spp. MKM030 ลูกแปงขาวหมาก ตลาดสามแยกเกษตร เขตจตุจักร กทม.
Rhizopus spp. ML010 ลูกแปงเหลา ตลาดสามแยกเกษตร เขตจตุจักร กทม.
Rhizopus spp. MKM007 ลูกแปงขาวหมาก ตลาดพระโขนง เขตพระโขนง กทม.
Rhizopus spp. ML003 ลูกแปงเหลา ตลาดพระโขนง เขตพระโขนง กทม.
Rhizopus spp. MKM023 ลูกแปงขาวหมาก ตลาดบางจาก พระโขนง
Rhizopus spp. MKM028 ลูกแปงขาวหมาก ตลาดบางจาก พระโขนง
 37

ตารางที่ 2 ยีสตที่ใชในการศึกษา

สายพันธุยีสต จากตัวอยาง ทองที่ซึ่งเก็บตัวอยาง

Saccharomycopsis fibuligera YKM010 ลูกแปงขาวหมาก ตลาดนนทบุรี อ. เมือง จ. นนทบุรี

Saccharomycopsis fibuligera YL008 ลูกแปงเหลา ตลาดนนทบุรี อ. เมือง จ. นนทบุรี
Saccharomycopsis fibuligera YKM017 ลูกแปงขาวหมาก ตลาดสามแยกเกษตร เขตจตุจักร กทม.
Saccharomycopsis fibuligera YL013 ลูกแปงเหลา ตลาดสามแยกเกษตร เขตจตุจักร กทม.
Saccharomycopsis fibuligera YL014 ลูกแปงเหลา ตลาดสามแยกเกษตร เขตจตุจักร กทม.
Saccharomycopsis fibuligera YKM005 ลูกแปงขาวหมาก ตลาดพระโขนง เขตพระโขนง กทม.
Saccharomycopsis fibuligera YL007 ลูกแปงเหลา ตลาดพระโขนง เขตพระโขนง กทม.
Saccharomycopsis fibuligera YKM031 ลูกแปงขาวหมาก ตลาดบางจาก พระโขนง
Saccharomycopsis fibuligera YKM015 ลูกแปงขาวหมาก ตลาดบางจาก พระโขนง
Saccharomycopsis fibuligera YKM022 ลูกแปงขาวหมาก ตลาดบางจาก พระโขนง
Saccharomycopsis fibuligera YL025 ลูกแปงเหลา ตลาดบางจาก พระโขนง
ต ร ์
Saccharomycopsis fibuligera YKM035 ส
า ลูกแปงขาวหมาก หนาเรือนจําคลองเปรม เขตจตุจักร กทม.
ต รศ
Saccharomycopsis fibuligera กYL026
เ ษ ลูกแปงเหลา หนาเรือนจําคลองเปรม เขตจตุจักร กทม.
า ล ย
ั
ิา ทย YL028
Saccharomycopsis fibuligera
ว
ลูกแปงเหลา หนาเรือนจําคลองเปรม เขตจตุจักร กทม.
ห fibuligera YL031
ัิทล ม
Saccharomycopsis ลูกแปงเหลา หนาเรือนจําคลองเปรม เขตจตุจักร กทม.

ม ร ู้ดิจ
Saccharomycopsis fibuligera YL009 ลูกแปงเหลา อ. ลับแล จ. อุตรดิตถ
คว า
Saccharomycopsis fibuligera YKM001 ลูกแปงขาวหมาก เขตบางกอกนอย กทม.
คลัง
Saccharomycopsis fibuligera YKM007 ลูกแปงขาวหมาก ตลาดปทุมธานี จ. ปทุมธานี
Saccharomycopsis fibuligera YKM043 ลูกแปงขาวหมาก ตลาดราชวัตร เขตดุสิต กทม.
Saccharomycopsis fibuligera YL049 ลูกแปงเหลา เขตบางกะป กทม.
 38

2. อุปกรณที่ใชในการวิเคราะห

2.1 กระบอกตวงขนาดตาง ๆ
2.2 กรวยกรอง
2.3 เครื่องชั่งชนิดหยาบ และ ชนิดละเอียด
2.4 ชอนตักสาร
2.5 ปเปต
2.6 บิวเรตพรอมขาตั้ง
2.7 ถุงพลาสติก
2.8 หลอดทดสอบ
2.9 ตะเกียง
2.10 เข็มเขี่ยเชื้อ และ ลวดเขี่ยเชื้อ
2.11 ฟลาสกขนาดตาง ๆ
2.12 กระจาด และ อางพลาสติก
2.13 ไมจิ้มฟน ฆาเชื้อ
2.14 หลอดพลาสติกขนาดเสรน์ ผาศูนยกลาง 0.2 เซนติเมตร ฆาเชื้อ
า ส ต
2.15 บีกเกอร รศ
2.16 จานเพาะเชืเ้อก ษต
ัย
2.17 แทงิทแกยาวลเกลี่ยเชื้อ (spreader)
หาว วพรอมฝาปด
2.18มขวดแก
ิทัล ขวดฝาเกลียว
ิดู้ จ2.19
า มร
ว
ลังค
ค 3. อุปกรณในการวิเคราะห

3.1 กลองจุลทรรศน (รุน MBL 2000, A:KRUSS, German)

3.2 เตาอบไมโครเวฟ (รุน Model R-241, SHARP, Japan)
3.3 ตูบมเชื้อ
3.4 ตูปลอดเชื้อ
3.5 เครื่องปน(mixer) (รุน Model G-560E, Scientific industries, INC. USA)
3.6 เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร (spectrophotometer)
 39

3.7 เครื่องโครมาโตกราฟแบบของเหลว (HPLC) (ภาคผนวก ข ขอ 5)

3.8 เครื่องวัดความเปนกรดเปนดาง (pH meter) (รุน 744 pH meter, Metrohm)
3.9 refractometer สําหรับหาปริมาณน้ําตาล (ATAGO, Japan)
3.10 อางน้ํารอน (water bath)
3.11 ตูอบไฟฟา (hot air oven) (Binder)
3.12 เครื่อง stomacher (Interscience, France)
3.13 เครื่องนับโคโลนีเชื้อ

4. สารเคมี

4.1 เอธานอล 95 เปอรเซ็นต

4.2 Absolute ethanol (AnalaR)
4.3 Soluble starch (Merck)
4.4 สารละลาย Lugals′ iodine
4.5 น้ํากลั่น
4.6 สารละลายมาตรฐาน NaOH
ต ร ์
4.7 สารละลายกรด HCl ศ ส มขน 0.1 โมลาร
าความเข
ต ร
4.8 สารละลายดเากงษNaOH ความเขมขน 0.1 โมลาร
ย าลัย
4.9 Phenolpthalein
า ว ิท
ห extract (Merck)
4.10มYeast
ั4.11
ล
ิท Glucose (Merck)
ด
้ ู จ
ิ
ว า มร 4.12 0.1 เปอรเซ็นต peptone water
ค
คลัง 4.13 Starch agar (Difco)
4.14 Malt extract agar (Merck)
4.15 Tributyrin agar (Difco)
4.16 Skim milk (Difco)
4.17 Gelatin (Difco)
4.18 Rose bengal dichloran chloramphenical agar (RBDC) (Merck)
 40

วิธีการ

1. บทบาทของเชื้อราที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา

1.1 ผลของราตอการหมักขาว โดยนําเชื้อราที่แยกไดจากลูกแปงมาหมักขาว การเตรียม

กลาเชื้อโดยเขีย่ เชื้อราลงบน Starch agar slant(ภาคผนวก ก ขอ 1) และนําไปบมที่อุณหภูมิ 30
องศาเซลเซียส นาน 3 วัน

การเตรียมขาวเหนียว ดัดแปลงจากวิธีของ ชัยวัฒน (2520) โดยนําขาวเหนียวมาแชน้ํา

นาน 3 ชั่วโมง และนําไปนึง่ ดวยไอน้ําประมาณ 20 นาที ลางยางขาวเหนียวออก 1 ครั้ง นําขาว
เหนียวมาสะเด็ดน้ําใหแหง ชั่งขาวเหนียวนึ่ง 300 กรัม ใสใน Erlenmeyer flask ขนาด 1000
มิลลิลิตร ปดจุกสําลีที่ปากขวด นําเขา autoclave ที่ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนดตอ
ตารางนิ้ว นาน 15-20 นาที แลวทิ้งใหเย็นที่อุณหภูมิหอง

เทน้ํากลั่นที่ปราศจากเชือ้ ปริมาตร 10 มิลลิลิตร ลงในหลอดเชื้อที่เตรียมไว ใชเข็ม

ต ร ์
เขี่ยเชื้อ เกลี่ยใหเชื้อหลุดจากผิวอาหารและเทกลั บไปหลอดเดิม นําไปปนใหเชื้อกระจายทัว่ กันดวย
whirl mixer คอย ๆ รินลงในรErlenmeyerศ าส flask ขาวเหนียวที่เตรียมไว เขยาใหเชือ้ กระจายไปทัว่
เมล็ดขาว และนําไปบมทีเก่อษณ
ต
ุ หภูมิ 30 องศาเซลเซียส นาน 4 วัน เก็บตัวอยางทุกวัน และนําไป
ย
ั
วิเคราะหดังนี้ ิทยาล
ห าว
ัล ม
ูร้ดจิ ิท
ม
1.1.1 การเจริญของรา นําตัวอยางที่เก็บไดประมาณ 10 กรัม มาละลายใน
ว า
สารละลาย 0.1 เปอรเซ็นต peptone water (ภาคผนวก ก ขอ 2) ปริมาตร 90 มิลลิลิตร ใน
ัลงค
ค ถุงพลาสติกปราศจากเชื้อ นําไปตีปนดวย stomacher นาน 60 วินาที นําสารละลายที่ไดไปเจือจาง
ดวย 0.1 เปอรเซ็นต peptone water จากนั้นนับจํานวนเชื้อโดยวิธี plate count โดยใชปริมาตร
สารละลาย 0.1 มิลลิลิตร (2 ซ้ํา) บนอาหาร Rose bengal dichloran chloramphenical agar (RBDC)
(ภาคผนวก ก ขอ 3) นําไปบมที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส นาน 4-7 วัน นับโคโลนีของเชื้อ
โดยรายงานผลเปน cfu/g (Ardhana and Fleet, 1989)

1.1.2 ปริมาณกรด ใชปเปตที่ปราศจากเชือ้ ดูดน้ําขาวหมากปริมาตร 5 มิลลิลิตร

 41

ใสใน Erlenmeyer flask ขนาด 150 มิลลิลิตร และเติมน้ํากลั่น 10 มิลลิลิตร เขยาและนําไปอุน

ไฟใหเดือด เพื่อไลกาซคารบอนไดออกไซดออกใหหมด ทําใหเย็นโดยผานดวยน้ําประปา นําไป
ไต-เตรทกับสารละลาย NaOH มาตรฐาน (ภาคผนวก ข ขอ 1) โดยใช phenolphthalein
(ภาคผนวก ข ขอ 2) เปนดัชนี จุดยุตใิ หสารละลายสีชมพูจาง ๆ ปริมาณกรดทั้งหมดเทียบเปนกรด
แลคติกโดยคํานวณตามสูตร (ชัยวัฒน, 2520)

เปอรเซ็นตของกรดแลคติก = มิลลิลิตรของ NaOH × normality ของ NaOH × 90.09 × 100

มิลลิลิตรของตัวอยาง × 1,000

1.1.3 พีเอช ใชปเปตที่ปราศจากเชื้อดูดน้ําขาวหมักปริมาตร 5 มิลลิลิตรใสบีก

เกอรขนาด 50 มิลลิลิตร และนําไปวัดพีเอช โดยใช pH meter

1.1.4 ปริมาณน้ําตาลกลูโคส วิเคราะหหาปริมาณน้ําตาลกลูโคสโดย HPLC

(ภาคผนวก ข ขอ 5)

1.1.5 ปริมาณแปง วิร์ เคราะหหาปริมาณแปงโดยใชสารละลาย Lugals′ iodine

า ส ต
(ภาคผนวก ข ขอ 4) รศ
เ ก ษต
ลัย
1.1.6า ของแข็งที่ละลายได ใชปเปตที่ปราศจากเชื้อดูดน้าํ ขาวหมักปริมาตร 0.2
ิา ทย
ว
ห
มิลลิลิตร นํามมาวัดดวยเครื่อง refractometer ปริมาณของแข็งแสดงเปนคาองศาบริกซ
ัล
ูร้ดจิ ิท
ม 1.2 การผลิตเอนไซมอมัยเลสบนอาหารแข็ง ดัดแปลงจากวิธีของ สมพร (2544) โดยเพาะ
ว า
ลังค
ค ราตรงกลางของจานเพาะเชือ้ ที่มีอาหาร starch agar บรรจุอยู นําไปบมที่อุณหภูมหิ องนาน 3 วัน
จากนั้นใชหลอดพลาสติกขนาดเสนผาศูนยกลาง 0.2 เซนติเมตร ทีฆ่ าเชื้อแลว กดลงไปบนอาหาร
แข็งบริเวณขอบโคโลนีของเชื้อ ซึ่งปนบริเวณที่มแี ตเสนใยไมมกี ารสรางสปอร ใชเข็มเขี่ยเชื้อเกีย่ ว
ชิ้นวุนที่มเี สนใย วางลงบนตรงกลางอาหารเลี้ยงเชื้อ Rose bengal dichloran chloramphenical agar
(RBDC) ที่มี soluble starch อยู 4 เปอรเซ็นต (น้ําหนักตอปริมาตร) (ภาคผนวก ก ขอ 4) ในจาน
เพาะเชื้อที่ตรงกลางจานนําไปบมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส นาน 48 ชั่วโมง แลวราดดวย
สารละลาย Lugals′ iodine ใหทวมผิวหนาอาหาร ทิ้งไวประม าณ 1 นาที เทสารละลายออก
 42

สังเกตบริเวณใส (clear zone) ที่เกิดขึ้น จากนั้นวัดขนาดเสนผานศูนยกลางของบริเวณใส และ

เสนผาศูนยกลางโคโลนี

1.3 การผลิตเอนไซมอมัยเลสและการทํางานของเอนไซม ศึกษาการทํางานของเอนไซม

ของเชื้อรา วามีฤทธิ์อยูหลังจากเชื้อราตายแลวหรือไม โดยการหมักขาวดวยเชื้อราบริสุทธิ์ นาน 3
วัน เชนเดียวกับขอ 1.1 จากนั้นเติม absolute ethanol ใหมีความเขมขน 5 เปอรเซ็นต (ปริมาตรตอ
น้ําหนัก) เพื่อเปนการฆาเชื้อรา หมักตอนาน 5 วัน เก็บตัวอยางทุกวัน เพื่อวัดกิจกรรมของ
เอนไซมอมัยเลส จากปริมาณของแข็งทีล่ ะลายไดโดยใชเครื่อง refractometer และปริมาณแปงที่
เหลือ โดยใชสารละลาย Lugals′ iodine

2. ปจจัยที่มีผลตอการเจริญของยีสต

2.1 ผลของอุณหภูมิตอการเจริญของยีสต

การเตรียมกลาเชื้อบริสุทธิ์ของยีสตสายพันธุตาง ๆ ที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและ
ลูกแปงเหลา(ตารางที่ 2) ดัดแปลงมาจากวิ
ต ร ์ ธีของ Gao and Fleet (1988) โดยเลี้ยงยีสตในอาหารเหลว
yeast extract glucose (ภาคผนวกร ศ าสก ขอ 5) ที่ปรับใหมีคาพีเอชเริ่มตน 3.5 จากนั้นนําไปบมที่
ต
อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียเกสษนาน 24 ชั่วโมง
าลัย
ิาวทย
ล
ั มวิหธีการที่ใชดัดแปลงจากวิธีของ Charoenchai (1995) โดยใชปเปตที่ฆาเชื้อแลวดูดเซลล
แขวนลอยปริ ด
้ ู จ
ิ ิท มาณ 2 เปอรเซ็นต (ปริมาตรตอปริมาตร) ลงในอาหารเหลว yeast extract glucose ที่
ร
มีควคาามพีเอชเริ่มตน 3.5 (บรรจุอยูในขวดฝาเกลียวปริมาตร 240 มิลลิลิตร โดยมีปริมาตรอาหาร 200
คลังมิลลิลิตร) จากนั้นนําไปบมทีอ่ ุณหภูมิตางกัน 3 ระดับ คือ 10 20 และ 30 องศาเซลเซียส นาน
10 วัน โดยเก็บตัวอยางทุก 12 ชั่วโมง ในชวง 2 วันแรก จากนัน้ เก็บตัวอยางทุก ๆ วัน นําตัวอยาง
มาวิเคราะหการเจริญ โดยวัดคาการดูดกลืนแสง ที่ความยาวคลื่น 610 นาโนเมตร คํานวณหา
อัตราการเจริญในชวงการเติบโตแบบเอกซโพเนนเชียล (exponential phase) โดยการหาคาความชัน
(slope) ของกราฟ ระหวาง log x กับเวลา t (Zwietering et al., 1990)
 43

2.2 ผลของพีเอชตอการเจริญของยีสต

เตรียมกลาเชื้อบริสุทธิ์เหมือนขอ 2.1 วิธีการที่ใชดัดแปลงจากวิธีของ Charoenchai

(1995) โดยใชปเปตที่ฆาเชือ้ แลวดูดเซลลแขวนลอยปริมาณ 2 เปอรเซ็นต (ปริมาตรตอปริมาตร)
ลงในอาหารเหลว yeast extract glucose ที่มีคาพีเอชเริ่มตนตางกัน 4 ระดับ คือ 3.0 3.5 4.0 และ
4.5 (บรรจุอยูในขวดฝาเกลียวปริมาตร 240 มิลลิลิตร โดยมีปริมาตรอาหาร 200 มิลลิลิตร) จากนั้น
นําไปบมที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส นาน 10 วัน เก็บตัวอยางและวิเคราะหการเจริญของยีสต
เชนเดียวกับขอ 2.1

2.3 ผลของน้ําตาลกลูโคสตอการเจริญของยีสต

เตรียมกลาเชื้อบริสุทธิ์เหมือนขอ 2.1 วิธีการที่ใชดดั แปลงจากวิธีของ Charoenchai

(1995) โดยใชปเปตที่ฆาเชื้อแลวดูดเซลลแขวนลอยปริมาณ 2 เปอรเซ็นต (ปริมาตรตอปริมาตร)ลง
ในอาหาร yeast extract broth (ภาคผนวก ก ขอ 6) ที่ปรับใหมีความเขมขนของน้ําตาลกลูโคส
ตางกัน 3 ระดับ คือ 100 200 และ 300 กรัมตอลิตร และปรับใหมีคา พีเอชเริ่มตน 3.5 (บรรจุอยู
ในขวดฝาเกลียวปริมาตร 240 มิลลิรล์ ิตร โดยมีปริมาตรอาหาร 200 มิลลิลิตร) จากนั้นนําไปบมที่
ต
อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส นานศาส14 วัน เก็บตัวอยางและวิเคราะหการเจริญของยีสต เชนเดียวกับ
ขอ 2.1 ษตร
เก ัย
าล
ิาวทย
ห
2.4 มผลของเอธานอลต อการเจริญและการอยูรอดของยีสต
ัล
มูร้ดจิ ิท
ว า 2.4.1 ผลของเอธานอลตอการเจริญของยีสต
คลังค
เตรียมกลาเชือ้ เหมือนขอ 2.1 วิธีการที่ใชดัดแปลงจากวิธีของ Gao and
Fleet (1988) โดยใชปเปตที่ฆาเชื้อแลวดูดเซลลแขวนลอยปริมาณ 2 เปอรเซ็นต (ปริมาตรตอ
ปริมาตร) ลงในอาหารเหลว yeast extract glucose ที่ปรับใหมีความเขมขนของเอธานอลตางกัน 4
ระดับ คือ 0 5 10 และ 15 เปอรเซ็นต (ปริมาตรตอปริมาตร) โดยใช absolute ethanol เติมดวยวิธี
ปราศจากเชื้อ และปรับใหมคี าพีเอชเริ่มตน 3.5 (บรรจุอยูในขวดฝาเกลียวปริมาตร 240 มิลลิลิตร
โดยมีปริมาตรอาหาร 200 มิลลิลิตร) จากนัน้ นําไปบมที่อณุ หภูมิตางกัน 3 ระดับ คือ 10 20 และ 30
องศาเซลเซียส นาน 20 วัน วิเคราะหการเจริญของยีสตเชนเดียวกับขอ 2.1
 44

2.4.2 ผลของเอธานอลตอการอยูรอดของยีสต

ดัดแปลงจากวิธี Gao and Fleet (1988) โดยเตรียมกลาเชื้อบริสุทธิ์ของยีสต

สายพันธุตาง ๆ ที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา ในสารละลาย yeast extract 0.1
เปอรเซ็นต (น้าํ หนักตอปริมาตร) (ภาคผนวก ก ขอ 7) โดยปรับใหมคี าพีเอชเริ่มตน 3.5 จากนัน้
นําไปบมที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง

ใชปเปตที่ฆาเชื้อแลวดูดเซลลแขวนลอยปริมาณ 2 เปอรเซ็นต (ปริมาตรตอ

ปริมาตร) ลงในสารละลาย yeast extract 0.1 เปอรเซ็นต (น้ําหนักตอปริมาตร) ที่มีการปรับใหมี
ความเขมขนของเอธานอลตางกัน 4 ระดับ คือ 0 5 10 และ 15 เปอรเซ็นต (ปริมาตรตอ
ปริมาตร) โดยใช absolute ethanol เติมดวยวิธีปราศจากเชื้อ และปรับใหมีคาพีเอชเริ่มตน 3.5
(บรรจุอยูในขวดฝาเกลียวปริมาตร 240 มิลลิลิตร โดยมีปริมาตรอาหาร 200 มิลลิลิตร) จากนัน้
นําไปบมที่อุณหภูมิตางกัน 3 ระดับ คือ 10 20 และ 30 องศาเซลเซียส นาน 14 วัน โดยเก็บ
ตัวอยางทุก 12 ชั่วโมง ในชวงวันแรก จากนั้นเก็บตัวอยางทุก ๆ 48 ชั่วโมง นําตัวอยางมานับ
จํานวนเซลลที่มีชีวิต โดยวิธี spread plate บนอาหาร malt extract agar (ภาคผนวก ก ขอ 8) จากนั้น
นําจานเพาะเชือ้ ไปบมที่อุณหภูมิ 25ร์ องศาเซลเซียส นาน 2 วัน ตรวจนับจํานวนเซลลที่มีชีวิต
รายงานผลในหนวย log cell/ml ศาส
ต
ษตร
ัยเก
ยาล ลารเอนไซม
3. การผลิตเอกซติทราเซลลู
ห าว
ม ัล การผลิตเอกซตราเซลลูลารอมัยเลส
ิ จ ท
ิ
3.1
า มรู้ด
ว
คลังค เขี่ยยีสตสายพันธุตาง ๆ ที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา (ตารางที่ 2)
บนผิวหนาอาหาร starch agar (Difco) ที่บรรจุอยูในจานเพาะเชื้อ จากนั้นนําไปบมที่อุณหภูมิหอ ง
นาน 3 วัน

เพาะยีสตแบบ point inoculate โดยใชไมจิ้มฟนที่ฆาเชือ้ แลว เขี่ยยีสตลงบนผิวหนา

อาหาร starch agar 3 จุด จากนั้นนําจานเพาะเชื้อไปบมที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส นาน 2-3
แลวราดดวยสารละลาย Lugals′ iodine ใหทว มผิวหนาอาหาร ทิ้งไวประมาณ 1 นาที เท
 45

สารละลายออก สังเกตบริเวณใส (clear zone) ที่เกิดขึน้ รอบ ๆ โคโลนีของยีสต ( De Mot, 1990 )

จากนั้นวัดขนาดเสนผานศูนยกลางของบริเวณใส และเสนผาศูนยกลางโคโลนี

3.2 การผลิตเอกซตราเซลลูลารไลเปส

เตรียมกลาเชื้อบริสุทธิ์เหมือนขอ 3.1 เพาะยีสตแบบ point inoculate โดยใชไมจิ้มฟน

ที่ฆาเชื้อแลว เขี่ยยีสตลงบนผิวหนาอาหาร tributyrin agar (ภาคผนวก ก ขอ 9) 4 จุด นําจานเพาะ
เชื้อไปบมที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส นาน 2-4 วัน สังเกตบริเวณใสที่เกิดขึน้ รอบ ๆ โคโลนี
ของยีสต จากนั้นวัดขนาดเสนผานศูนยกลางของบริเวณใส และขนาดเสนผาศูนยกลางของโคโลนี
(Charoenchai et al., 1997)

3.3 การผลิตเอกซตราเซลลูลารโปรติเอส

เตรียมกลาเชื้อบริสุทธิ์เหมือนขอ 3.1 เพาะยีสตแบบ point inoculate โดยใชไมจิ้มฟน

ที่ฆาเชื้อแลว เขี่ยยีสตลงบนผิวหนาอาหาร Skim milk agar (ภาคผนวก ก ขอ 10) และ Gelatin agar
(ภาคผนวก ก ขอ 11) 4 จุด การตรวจผลดั
ส ต ร์ งนี้ (Charoenchai et al., 1997)
รศ า
Skim milk agar
ต ษ สังเกตบริเวณใส รอบ ๆ โคโลนีของยีสต หลังจากนําจานเพาะเชื้อ ไป
ัย เ ก
ยาล ยส นาน 2 วัน
บมที่อุณหภูมิ 25 ิทองศาเซลเซี
ห าว
ม ัล Gelatin agar หลังจากนําจานเพาะเชื้อ ไปบมที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส นาน 3-5
ิ จ ท
ิ
รู้ด
วัควนามราดผิวหนาอาหารดวย acetic acid (50 กรัมตอลิตร) ปริมาตร 10 มิลลิลิตร ทิ้งไวประมาณ 1
คลังนาที เทสารละลายออก สังเกตบริเวณใส (clear zone) ที่เกิดขึ้นรอบ ๆ โคโลนีของยีสต

4. คุณสมบัติเพชฆาตของยีสต ( killer activity )

4.1 การทดสอบการเปน killer strain เพาะยีสต S. cerevisiae AWRI 729 sensitive strain
สายพันธุที่ไมทนตอสาร killer toxin ลงบนผิวหนาอาหาร malt extract agar โดยเทคนิค spread
plate ใชลูปเขี่ยยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา(ตารางที่ 2) ลงบนผิวหนาอาหาร
จากกลางจานอาหารเลี้ยงเชือ้ สูขอบจานอาหารเลี้ยงเชื้อเปนแนว 4 แนว จากนัน้ นําจานเพาะเชื้อไป
 46

บมที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส นาน 2 วัน สังเกตบริเวณใสที่เกิดจากสาร killer ไปยับยั้งยีสตที่

ไมทนสารนี้

4.2 การทดสอบการเปน sensitive strain เพาะยีสตทแี่ ยกไดจากลูกแปงขาวหมากละลูก

แปงเหลา ลงบนผิวหนาอาหาร malt extract agar โดยเทคนิค spread plate ใชลูปเขี่ยยีสต S.
cerevisiae EC1119 killer strain ลงบนผิวหนาอาหาร จากกลางจานอาหารเลีย้ งเชื้อสูขอบจาน
อาหารเลี้ยงเชือ้ เปนแนว 4 แนว จากนั้นเขี่ย S. cerevisiae EC1119 killer strain ลงบนผิวหนาอาหาร
นําจานเพาะเชือ้ ไปบมที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส นาน 2 วัน สังเกตบริเวณใสที่เกิดจากสาร
killer ไปยับยั้งยีสตที่ไมทนสารนี้

5. สถานที่ทําการวิจัย

ภาควิชาวิศวกรรมอาหาร คณะวิศวกรรมและเทคโนโลยีการเกษตร
สถาบันเทคโนโลยีราชมงคล

6. ระยะเวลาทําการวิจัย
ต ร ์
าส รศ
ษต
การทดลองเริ่มตั้งเกแตเดือนมกราคม 2545 ถึง มีนาคม 2546
ย าลัย
า ว ิท
ห
ัิทล ม
า มรู้ดจิ
ว
คลังค
 47

ผลและวิจารณ

การศึกษาคุณสมบัติของยีสตและราที่มีบทบาทในการหมักขาวหมากและสาโท แบงการ
ทดลองเปน 4 หัวขอคือ 1) ศึกษาบทบาทของเชื้อราที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปง
เหลาในการหมักขาว โดยเปรียบเทียบราจากลูกแปงลูกแปงขาวหมากและเหลา จากแหลงลูกแปง 2
แหลง ไดแก ตลาดนนทบุรี อ. เมือง จ. นนทบุรี และตลาดพระโขนง เขตพระโขนง กทม ราที่ใช
ศึกษาจํานวน 6 ไอโซเลท ไดแก Rhizopus spp. MKM007, MKM012, ML003, ML004
Amylomyces spp. MKM008 และ ML005 โดยทดลองหมักขาวเหนียวดวยราบริสุทธิ์ และทําการ
ตรวจวัดการเจริญของรา และวิเคราะหคณ ุ สมบัติทางเคมีของขาวหมักตลอดระยะเวลาการหมัก ทํา
การทดสอบความสามารถในการผลิตเอนไซมอมัยเลสบนอาหารแข็ง และศึกษาการทํางานของ
เอนไซมหลังจากที่ราตายไปแลววายังมีกจิ กรรมหรือไม 2) ปจจัยสําคัญที่มีตอการเจริญของยีสต
Saccharomycopsis fibuligera ยีสตที่ใชศกึ ษาแยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลาจํานวน
20 ไอโซเลท โดยเปรียบเทียบกับยีสต Saccharomyces cerevisiae ซึ่งแยกไดในระหวางการหมัก
สาโท โดยปจจัยที่ศึกษาไดแก อุณหภูมิ, พีเอช, ความเขมขนของน้ําตาลกลูโคส และศึกษาความ
เขมขนของเอธานอลตอการเจริญและการอยูรอดของยีสต 3) ทดสอบการผลิตเอกซตราเซลลูลาร
เอนไซมของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงรข์ าวหมากและลูกแปงเหลาบนอาหารแข็ง ในการศึกษาได
า ส ต
เลือกทดสอบเฉพาะเอนไซมชนิรศดที่มีความสําคัญในการหมักขาวไดแก อมัยเลส, ไลเปส และโปรติ
ต
กษ
เอส 4) ทดสอบสมบัตัยิเพชฆาตของยี สตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลาบนอาหาร
ล
ยา นธุที่เปน killer strain และ sensitive strain เปนตัวทดสอบ ผลการทดลอง
แข็ง โดยใชยสี ตสิทายพั
า ว
มีรายละเอียดดัมหงนี้
ัล
มูร้ดจิ ิท
คว
1. า
บทบาทของเชื ้อราที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา
คลงั
จุลินทรียที่พบในลูกแปงมีหลายชนิด ราและยีสตมีบทบาทสําคัญในการหมักขาว โดยรา
สรางเอนไซมอมัยเลสเปลี่ยนแปงในเมล็ดขาวใหเปนน้ําตาล สวนยีสตจะหมักน้ําตาลที่เกิดขึ้นให
เปนเอธานอลกับคารบอนไดออกไซด บทบาทของจุลินทรียทั้งสองประเภทนี้จะเกิดขึ้นตอเนื่องกัน
ตลอดระยะเวลาของการหมัก ราที่พบในลูกแปงมีมากมายหลายสกุลแตที่มีบทบาทสําคัญคือราใน
สกุล Amylomyces rouxii และ Rhizopus spp. ราทั้ง 2 สกุลจะผลิตเอนไซมอมัยเลสชนิด
แอลฟาอมัยเลสและกลูโคอมัยเลส ดังนั้นในกระบวนการหมักจึงมีบทบาทในการเปลี่ยนแปงเปน
น้ําตาล
 48

การทดลองนี้ใชราจากการศึกษาของ สมพร (2544) 2 สกุล ที่มีบทบาทในการหมักขาว

จากแหลงลูกแปง 2 แหลงมาเปรียบเทียบกัน (โดยพิจารณาเลือกแหลงลูกแปงจากแหลงที่มีทั้งเชือ้
ราที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา) จํานวน 6 ไอโซเลท ไดแก Amylomyces spp.
และ Rhizopus spp. จากแหลงลูกแปง 2 แหลง ดังทีไ่ ดกลาวไวขางตน แบงเปนราที่แยกจากลูก
แปงตลาดนนทบุรี อ. เมือง จ. นนทบุรี 3 ไอโซเลท ซี่งเปนราในสกุล Rhizopus spp. 2 ไอ
โซเลท ไดแก MKM012 และ ML004(แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลาตามลําดับ)
และราในสกุล Amylomyces spp. 1 ไอโซเลท ไดแก ML005(แยกจากลูกแปงเหลา) สวนราที่
แยกจากลูกแปงตลาดพระโขนง เขตพระโขนง กทม. ทีใ่ ชศึกษา 3 ไอโซเลท แบงเปนราในสกุล
Rhizopus spp. 2 ไอโซเลท ไดแก MKM007 และ ML003(แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปง
เหลาตามลําดับ) และราในสกุล Amylomyces spp. 1 ไอโซเลท ไดแก MKM008(แยกจากลูกแปง
ขาวหมาก)

1.1 ผลของราตอการหมักขาว

1.1.1 การเจริญของรา

ต ร ์
าส
จากการหมั
รศ กขาวดวยราโดยนําราที่แยกจากลูกแปงมาหมักขาวเหนียวนึ่งเปน
ต
เวลา 4 วัน เก็บตัวอยาเกงทุษกวัน และนําไปวิเคราะหการเจริญของรา โดยวิธี plate count บน
อาหาร Rose bengal ย ลัย chloramphenical agar(RBDC) พบวาราสกุลเดียวกันมีลักษณะการ
าdichloran
า ว ิท
เจริญคลายกันมห แมจะแยกมาจากลูกแปงตางชนิดกันและตางพื้นที่ และราตางสกุลกันจะมีลักษณะ
ัล
การเจริู้ดญิจิทแตกตางกัน ดังแสดงในภาพที่ 2 Rhizopus spp. ที่ใชในการศึกษาจํานวน 4 ไอโซเลท
ว
ไดาแมกร MKM012, ML004, MKM007 และ ML003 จํานวนราจะคอย ๆ เพิ่มขึ้นในระยะแรก และ
ค
คลังจะมีจํานวนรามากที่สุดหลังจากหมักขาวเปนเวลา 2-3 วัน โดยมีจํานวนราเทากับ 104-105 cfu/g
จากนั้นจํานวนราจะคอย ๆ ลดลง สวนราในสกุล Amylomyces spp. 2 ไอโซเลท ไดแก ML005
และ MKM008 มีลักษณะการเจริญที่แตกตางจาก Rhizopus spp. คือจํานวนราจะเพิ่มขึน้ อยาง
รวดเร็วในชวงวันแรกของการหมักขาว จากจํานวนราเริม่ ตน 102-103 cfu/g หลังจากหมักขาว 1
วัน จํานวนราเพิ่มขึ้นเปน 104-105 cfu/g ชวงนี้จะเปนชวงที่มีจํานวนรามากที่สุด หลังจากหมัก
ขาวนานขึ้นจํานวนราจะลดลงอยางเห็นไดชัด
 49

6.0

5.0
Log cfu/g
4.0
MKM007
3.0 MKM008
MKM012
ML003
ML004
2.0 ML005
0 24 48 72 96

เวลาหมัก (ชัว่ โมง)

ภาพที่ 2 การเจริญของราที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมาก และลูกแปงเหลา Rhizopus spp.

(MKM007, MKM012, ML003, ML004) และ Amylomyces spp. (MKM008, ML005)
ในระหวางการหมักขาวเหนียวโดยใชราบริสุทธิ์

ต ร ์
ผลการทดลองที่ไดสอดคล
ร ศ าสองกับการศึกษาของ Ardhana and Fleet (1989) ที่รายงานวาการ
หมัก Tape ketan โดยใชเกราษตAmylomyces rouxii พบวาราดังกลาวสามารถเจริญไดในขาวเหนียว
นึ่งและมีจํานวนรามากที ย าลัย่สุดในวันที่ 2 ของการหมักขาว โดยมีจํานวนราอยูใ นชวง 105 cfu/g
าวิท น้ จํานวนราจะคอย ๆ ลดลง
และเมื่อหมักมขหาวนานขึ
ท
ิ ัล
จ
ิ
รู้ด จากการทดลอง ราแตละสกุลจะมีแบบแผนการเจริญที่เฉพาะ ราในสกุลเดียวกันจะมี
า ม
คัลงคลัวกษณะการเจริญที่คลายกัน แมวาจะแยกมาจากลูกแปงตางชนิดกันและตางพื้นที่ แตกย็ ังคงไวซงึ่
ลักษณะเฉพาะของแตละสกุล Amylomyces spp. จะมีจํานวนรามากทีส่ ุดในชวง 1-2 วันแรก
ของการหมักขาว ทําใหมองเห็นเสนใยเปนสีขาวครีมจํานวนมากบนเมล็ดขาว จึงไมทําใหขาว
เปลี่ยนสี เนือ่ งจากมองไมเห็นเสนใยชัดเจน (เนื่องราสกุลนี้ไมมีการสราง sporangiospore แตมี
การสราง chlamydospore กระจายทั่วไปบนเสนใยจึงทําใหมองเห็นโคโลนีมีสีน้ําตาลออนจนถึงสี
ขาว) จากลักษณะดังกลาวจึงทําให Amylomyces spp. มีความเหมาะสมในการหมักขาวหมาก
ในชวงแรกของการหมักขาว ราจะเริ่มยอยแปงเปนน้ําตาล เกิดเปนน้าํ ซึมออกมาเปนน้ําเชื่อมขาว
หรือ น้ําตอย แตจะมีปริมาณนอย เมื่อหมักขาวนานขึน้ จํานวนราจะคอย ๆ ลดลง ขณะเดียวกัน
 50

น้ําเชื่อมขาวมีปริมาณมากขึน้ สาเหตุหนึง่ ที่รามีจํานวนลดลง อาจมาจากสภาพแวดลอมภายนอกที่

เปลี่ยนไป เชน ความชื้นจากน้ําเชื่อมขาวอาจสงผลตอการเจริญของรา และความทนทานของเสนใย
ราตอความเขมขนของน้ําตาลที่เพิ่มขึ้น สําหรับรา Rhizopus spp. ทั้ง 4 ไอโซเลท จํานวนราจะ
เพิ่มขึ้นเรื่อย ๆ ในชวงแรกของการหมัก และจะมีจํานวนรามากทีส่ ุดในชวงวันที่ 2-วันที่ 3
จากนั้นจํานวนราจะคอย ๆ ลดลง ลักษณะทางกายภาพของขาวหมัก คลายกับที่หมักจากรา
Amylomyces spp. คือขาวถูกยอยเปนน้าํ ตาลทําใหเมล็ดขาวเปยกชุม มีน้ําเชื่อมขาวซึมออกมา
เล็กนอย และเพิ่มมากขึ้นตามระยะเวลาการหมัก ขาวจะมีกลิ่นหอมแตหอมนอยกวาขาวที่หมักจาก
รา Amylomyces spp. และมีกลิ่นฉุนของกรด สีของขาวเปลี่ยนไปเนื่องจากราไดสรางสปอรขึ้น ทํา
ใหขาวมีสีเขมจึงไมเหมาะสมที่จะใชราดังกลาวในการผลิตเปนขาวหมาก จากการสังเกตลักษณะ
การเจริญของราทั้ง 2 สกุลบนผิวหนาอาหารแข็ง Rose bengal dichloran chloramphenical agar
(RBDC) พบวา มีลักษณะแตกตางกันอยางเห็นไดชัด Rhizopus spp. จะเจริญไดเร็วกวา
โคโลนีจะแผขยายใหญขึ้นในชวง 1-2 วันแรก และมีการเจริญสงเสนใยสูอากาศเหนือผิวหนาของ
อาหาร มีการสราง sporangiospore สีดําใน sporangium ทําใหโคโลนีมีสีดํา แตรา Amylomyces
spp. เจริญไดชากวา ลักษณะการเจริญจะแผขยายออกดานขาง ติดไปกับผิวหนาของอาหารเลี้ยงเชือ้
การที่ Amylomyces spp. เจริญไดชามากเมื่อเปรียบเทียบกับ Rhizopus spp. นาจะเปนสาเหตุสําคัญ
ที่ทําใหแยกราชนิดนี้ไดนอยในลูกแปรง์ ขาวหมากทั้ง ๆ ทีม่ ีอยูเปนจํานวนมาก อีกประการหนึ่งการที่
รานี้สราง abortive sporangiumศาและ สต chlamydospore อยูตามสวนของเสนใย การแยกเชื้อโดยวิธี
streak ไมสามารถทําให ษ
ช
ติ้นรสวนของ chlamydospore แยกออกจากกันไดมากเหมือนกับ
ล ย
ั เก
า
ิา ทย Rhizopus spp. หรือ conidium ของ Aspergillus จึงทําใหปริมาณของ
sporangiospore ของ
ว
Amylomyces มspp.ห ที่เจริญขึน้ มีนอยกวาความเปนจริง เมื่อเทียบกับราชนิดอื่น
ัล
มูร้ดจิ ิท
ว า 1.1.2 ความเปนกรด
คลังค
เมื่อวิเคราะหความเปนกรดของขาวหมัก โดยเทียบเปนเปอรเซ็นตกรด
แลคติก พบวา Rhizopus spp. จะผลิตกรดไดมากกวา Amylomyces spp. หลายเทาตัว และราทั้ง
สองสกุลจะใหปริมาณกรดมากขึ้นเมื่อระยะเวลาหมักขาวนานขึน้ ผลการทดลองแสดงดังตารางที่ 3
และภาพที่ 3 Rhizopus spp. MKM012, ML004, MKM007 และ ML003 จะผลิตกรดไดใน
ปริมาณใกลเคียงกัน และใหปริมาณกรดสูงสุดในวันที่ 4 คือ 4.21 3.97 3.72 และ 4.06
เปอรเซ็นต ตามลําดับ สําหรับรา Amylomyces spp. ML005 และ MKM008 ซึ่งแยกจากลูกแปง
เหลา และลูกแปงขาวหมาก ตามลําดับ ผลิตกรดไดต่ํามาก เมื่อเปรียบเทียบกับราในสกุล Rhizopus
 51

spp. ทั้ง 4 ไอโซเลท โดยใหปริมาณกรดสูงสุดในวันที่ 4 คือ 0.88 และ 1.29 เปอรเซ็นต ตามลําดับ
เมื่อเปรียบเทียบสัดสวนของปริมาณกรดทีผ่ ลิตจาก ML005 กับรา Rhizopus spp. MKM012 และ
ML004 ที่แยกมาราจากลูกแปงตลาดนนทบุรี อ. เมือง จ.นนทบุรี เหมือนกัน พบวา Rhizopus
spp. MKM012 และ ML004 ผลิตกรดไดมากกวา Amylomyces spp. ML005 ประมาณ 10 เทาใน
วันที่ 1, ประมาณ 6 เทาในวันที่ 2 และ วันที่ 3 และประมาณ 5 เทา ในวันที่ 4 เมื่อ
เปรียบเทียบสัดสวนของปริมาณกรด ที่ผลิตจาก Amylomyces spp. MKM008 กับรา Rhizopus
spp. MKM07 และ ML003 ซึ่งแยกมาจากลูกแปงแหลงเดียวกัน พบวา ราในสกุล Rhizopus spp.
สามารถผลิตกรดไดมากกวาราในสกุล Amylomyces spp. ประมาณ 3 เทาในวันที่ 1, ประมาณ 5
เทาในวันที่ 2 และประมาณ 3 เทาในวันที่ 3 และ วันที่ 4

ตารางที่ 3 คุณสมบัติทางเคมีของขาวหมัก ที่หมักโดยเชื้อรา ที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูก

แปงเหลา Rhizopus spp. (MKM007, MKM012, ML003, ML004) และ
Amylomyces spp. (MKM008, ML005) ในชวงเวลาตางๆ

สายพันธุ คุณสมบัติทางเคมี 24 ชั่วโมง 48 ชั่วโมง 72 ชั่วโมง 96 ชั่วโมง

ต ร ์
MKM007 pH าส รศ 4.50 3.63 3.53 3.44
ษต
ปริมาณกรด(%
ย
ั เ ก แลคติก) 1.35 2.21 2.94 3.72
ของแข็ิทยงทัาล้งหมด(องศาบริกซ) 41.00 38.00 40.00 41.30
ห
ปริ าวาณแปง(iodine reaction)
ม ++++ ++++ ++ ++
ม
ัล ปริ
ท
ิ
ู้ดิจ มาณน้ําตาล(มิลลิกรัมตอกรัม) 41.26 40.08 75.72 102.50
า มร
ว
ลังค
ค MKM012 pH 4.50 3.52 3.47 3.54
ปริมาณกรด(% แลคติก) 3.02 3.63 4.01 4.21
ของแข็งทั้งหมด(องศาบริกซ) 45.00 38.00 39.00 40.80
ปริมาณแปง(iodine reaction) ++++ ++++ +++ ++
ปริมาณน้ําตาล(มิลลิกรัมตอกรัม) 33.78 52.35 72.57 106.91
 52

ตารางที่ 3 (ตอ)

สายพันธุ คุณสมบัติทางเคมี 24 ชั่วโมง 48 ชั่วโมง 72 ชั่วโมง 96 ชั่วโมง

ML003 pH 4.50 3.64 3.58 3.57

ปริมาณกรด(% แลคติก) 1.43 2.97 3.58 4.06
ของแข็งทั้งหมด(องศาบริกซ) 39.80 37.10 38.50 39.50
ปริมาณแปง(iodine reaction) ++++ ++++ +++ ++
ปริมาณน้ําตาล(มิลลิกรัมตอกรัม) 31.15 106.78 125.00 129.87

ML004 pH 4.50 3.65 3.63 3.66

ปริมาณกรด(% แลคติก) 2.33 3.27 3.84 3.97
ของแข็งทั้งหมด(องศาบริกซ) 39.80 36.90 39.50 40.50
ปริมาณแปง(iodine reaction) ++++ ++++ +++ ++
ปริมาณน้ําตาล(มิลลิกรัมตอกรัม) 37.05 63.69 85.30 113.50

ต ร ์
MKM008 pH าส รศ 5.25 4.20 4.19 4.25
ษต
ปริมาณกรด(%
ย
ั เ ก แลคติก) 0.44 0.55 1.29 1.29
ของแข็ิทยงทัาล้งหมด(องศาบริกซ) 46.00 42.20 41.50 41.90
ห
ปริ าวาณแปง(iodine reaction)
ม ++++ +++ + +
ม
ัล ปริ
ท
ิ
ู้ดิจ มาณน้ําตาล(มิลลิกรัมตอกรัม) 100.33 190.53 221.80 163.57
า มร
ว
ลังค
ค ML005 pH 5.25 4.95 4.59 4.39
ปริมาณกรด(% แลคติก) 0.30 0.60 0.68 0.88
ของแข็งทั้งหมด(องศาบริกซ) 45.00 40.50 39.50 40.00
ปริมาณแปง(iodine reaction) ++++ ++++ + +
ปริมาณน้ําตาล(มิลลิกรัมตอกรัม) 85.15 120.06 146.41 103.30

หมายเหตุ + สีเหลือง : แปงถูกยอยไปหมด ++ สีน้ําตาลออน : แปงเหลือนอย

+++ สีน้ําตาลเขม : แปงเหลือปานกลาง ++++ สีมว งหรือน้ําเงิน : แปงเหลือมาก
 53

5.0

4.0
ปริมาณกรดแลกติก (เปอรเ ซ็นต)
3.0

2.0
MKM007
MKM008
1.0 MKM012
ML003
ML004
0.0 ML005
24 48 72 96
เวลาหมัก (ชัว่ โมง)

ภาพที่ 3 การเปลี่ยนแปลงปริมาณกรดของขาวหมัก จากราที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมาก และลูก

แปงเหลา Rhizopus spp. (MKM007, MKM012, ML003, ML004) และ Amylomyces spp.
(MKM008, ML005) ในระหว์ างการหมักขาวเหนียวโดยใชราบริสุทธิ์
ส ต ร
รศา
เมื่อพิจารณาการเปลี เ ก ษ่ยตนแปลงคาพีเอชของขาวหมัก จากราทั้ง 6 ไอโซเลท มีแนวโนมการ
เปลี่ยนแปลงสอดคลยอางกั ลัยบปริมาณกรดที่ราสรางขึ้นดังแสดงในตารางที่ 3 ขาวหมักจากรา Rhizopus
า ว ิท
spp. MKM012, ม ห ML004, MKM007 และ ML003 มีคาพีเอชต่ํากวา Amylomyces spp. ML005
และ MKM008 ท
ิ ัล มาก โดยในวันแรกของการหมักขาว รา Rhizopus spp. ทั้ง 4 ไอโซเลท จะให
จ
ิ
มรู้ดกที่มพี ีเอชเทากัน คือ 4.5 จากนัน้ พีเอชจะลดลงอยารวดเร็วในวันที่ 2 โดยมีคาใกลเคียง
ขวาาวหมั
ค
คลังกันมากเทากับ 3.52 3.65 3.693 และ 3.64 ตามลําดับ และคอย ๆ ลดลงจนเกือบมีคาคงที่เมื่อ
หมักขาวนานขึ้น สวนรา Amylomyces spp. ML005 และ MKM008 จะใหขาวหมักที่มีคาพีเอช
สูงกวา Rhizopus spp. ทั้ง 4 ไอโซเลท โดยในวันแรกมีคาพีเอชเทากัน คือ 5.25 จากนั้นจะคอย
ๆ ลดลง โดย ML005 จะใหคาพีเอชสูงกวา MKM008(คาที่ไดสอดคลองกับปริมาณกรดซึ่งพบวา
ML005 จะใหปริมาณกรดต่ําสุดในจํานวนราทั้งหมดทีใ่ ชศึกษา) และเมื่อหมักขาวจนครบ 4 วัน
วัดพีเอชของขาวหมักได 4.39 สวน MKM008 วัดพีเอชของขาวหมักได 4.25 ดังแสดงในภาพที่ 4
 54

5.5

5.0

4.5
pH

4.0
MKM007
MKM008
3.5 MKM012
ML003
ML004
3.0 ML005
24 48 72 96
เวลาหมัก (ชัว่ โมง)

ภาพที่ 4 การเปลี่ยนแปลงคาพีเอชของขาวหมัก จากราที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมาก และลูกแปง

เหลา Rhizopus spp. (MKM007, MKM012, ML003, ML004) และ Amylomyces spp.
(MKM008, ML005) ในระหวร์ างการหมักขาวเหนียวโดยใชราบริสุทธิ์
า ส ต
ตรศ
ผลการทดลองที่ไเกดษสอดคลองกับการศึกษาของ สิรินทรเทพ (2523) ทีร่ ายงานวา
A. rouxii ที่แยกจากลู ย าลกัยแปงขาวหมากและขาวหมากจํานวน 4 ไอโซเลท ไดแก AG5, AH3, AK2
า ว ิท
และ AL3 มเมื ห ่อนํามาหมักขาวหมาก จะใหปริมาณกรดใกลเคียงกัน โดยชวงแรกของการหมัก
ล
ั
ิท อย ๆ เพิ่มขึ้นจากชัว่ โมงที่ 24 จนกระทั่งคงที่ในชัว่ โมงที่ 60 หลังจากหมักขาว
ปริมาณกรดจะค
ร ด
้ ู จ
ิ
เป
ว า
น มเวลา 72 ชั่วโมง ใหปริมาณกรดอยูในชวง 0.7-0.9 เปอรเซ็นต สวนพีเอชจะมีคาลดลงตาม
ง
ั ค
คล ระยะเวลาหมักที่นานขึ้น โดยเริ่มตนมีคาเทากับ 6.5 หลังจากหมักขาวเปนเวลา 36 ชั่วโมง วัด
พีเอชของขาวหมากไดเทากับ 4 จากนั้นจะมีคาลดลงเล็กนอย และคงที่ในชั่วโมงที่ 72

โดยปกติขาวหมากที่ใชรับประทานอยูทวั่ ไป มีคาพีเอชอยูระหวาง 3.8-4.0 (สิรินทรเทพ,

2523) ซึ่งจากการทดลอง Amylomyces spp. ทั้ง 2 ไอโซเลทจะใหพีเอชอยูในชวงดังกลาว
ในขณะที่ Rhizopus spp. จะใหพีเอชต่ํากวา จึงเปนสาเหตุอีกประการหนึ่งที่ทําให Amylomyces
spp. มีความเหมาะสมในการหมักขาวหมากซึ่งตองการขาวหมากที่มีรสชาติหอมหวาน และเปรี้ยว
เล็กนอย ดังนัน้ หากนํารา Rhizopus spp. มาใชเปนกลาเชื้อในการหมักขาวหมาก อาจทําใหขา ว
 55

หมากมีรสเปรี้ยวเกินไปไมเปนที่ยอมรับของผูบริโภค ดังรายงานการศึกษาของ มนตรี (2521) ซึ่ง

ไดทดสอบชิมขาวที่หมักจากราบริสุทธิ์ พบวาขาวทีห่ มักดวย Rhizopus spp. และ Amylomyces
spp. ใหรสตางกันมาก คือ Rhizopus spp. ทุกไอโซเลทใหรสเปรี้ยวนํา จนไมรูสึกวามีน้ําตาลอยู
ดวย แตรา Amylomyces spp. ทุกไอโซเลทใหรสหวานนํา แมบางไอโซเลทจะมีรสเปรี้ยวบางก็มี
เพียงเล็กนอย

จากการทดลอง Rhizopus spp. ทุกไอโซเลทใหปริมาณกรดที่คอนขางสูงประมาณ 3.7-

4.3 เปอรเซ็นต จึงนาเปนอีกสาเหตุหนึ่ง ที่ทําใหสุราพืน้ บาน เชน สาโท, อุ, น้ําขาว และ น้ําแดง
มีรสเปรี้ยวนอกเหนือไปจาก การเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันของแอลกอออลไปเปนกรดน้ําสมสายชู
การปนเปอนของ acetic acid bacteria ในระหวางการหมัก หรือการมีแบคทีเรียแลคติกจํานวนมาก
ในลูกแปง หากมีการนําลูกแปงที่มีรา Rhizopus spp. อยูเปนจํานวนมากไปใชในการหมัก
อยางไรก็ตาม Rhizopus spp. เปนราทีม่ ีประโยชนในการผลิตกรดแลคติกในระดับอุตสาหกรรม
(Ruengruglikit, 2003) การที่สามารถแยกราดังกลาวจากลูกแปงได อาจทําใหลูกแปงเปนแหลง
สําคัญในการคัดแยกรา Rhizopus spp. ที่มีประสิทธิภาพสูงในการผลิตกรดแลคติกในระดับ
อุตสาหกรรมได

ต ร ์
1.1.3 ปริมาณน้
ร ศ าสําตาลกลูโคส
เ ก ษต
ย าลัย จากการวิเคราะหปริมาณกลูโคส พบวาราที่แยกจากลูกแปงทั้ง 2 แหลงมี
แนวโนมการเปลี วิท
หา่ยนแปลงคลายกัน ราสกุล Amylomyces spp. จะใหปริมาณกลูโคสสูงกวาราสกุล
ม
Rhizopusิจิทัล spp. ดังแสดงในตารางที่ 3 และ ภาพที่ 5 โดยในวันแรกของการหมักขาว
า ม รู้ด
Amylomyces spp. ML005 และ MKM008 ผลิตกลูโคสไดใกลเคียงกันมาก หลังจากนัน้ เมือ่
คว
คลังระยะเวลาหมักขาวนานขึ้น ปริมาณกลูโคสจะเพิ่มขึ้นดวย โดยที่ MKM008 จะใหปริมาณกลูโคสสูง
กวา ML005 ราทั้งสองไอโซเลทจะใหปริมาณกลูโคสสูงที่สุดเมื่อหมักขาวเปนเวลา 72 ชั่วโมง
โดยมีคาเทากับ 221.80 และ 146.41 กรัมตอลิตร ตามลําดับ และในชั่วโมงที่ 96 จะลดลงเหลือ
เพียง 163.57 และ 103.30 กรัมตอลิตร ตามลําดับ สวนรา Rhizopus spp. MKM012, ML004,
MKM007 และ ML003 จะใหกลูโคสเพิ่มขึ้นตามระยะการหมักทีน่ านขึ้น และมีปริมาณต่ํากวา
Amylomyces spp. ML005 และ MKM008 หลายเทา โดยที่ ML003 จะใหปริมาณกลูโคสสูง
ที่สุด คือ 129.87 กรัมตอลิตร สวนรา MKM012, ML004 และ MKM007 หลังจากหมักขาวไปแลว
 56

4 วัน จะใหปริมาณกลูโคสใกลเคียงกัน โดยมีคาเทากับ 106.91 113.50 และ 102.50 กรัมตอลิตร

ตามลําดับ

250.0

200.0
กลูโคส (มิลลิกรัมตอกรัม)

150.0

100.0
MKM007
MKM008
50.0 MKM012
ML003
ML004
0.0 ML005
24 48 72 96
เวลาหมัก (ชัว่ โมง)
ภาพที่ 5 การเปลี่ยนแปลงปริมาณกลูโคสของขาวหมัก จากราที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมาก และ
ลูกแปงเหลา Rhizopus spp. (MKM007, MKM012, ML003, ML004) และ Amylomyces
spp. (MKM008, ML005) ในระหว
ร์ างการหมักขาวเหนียวโดยใชราบริสุทธิ์
า ส ต
ตรศ
ผลการทดลองที่ไเกดษสอดคลองกับการทดลองของ มนตรี (2521) ที่รายงานวา Amylomyces
ัย
spp. ยอยแปงไดดิทีกยวาาลRhizopus spp. และ Mucor โดยจะใหปริมาณของแข็งทั้งหมดและน้ําตาล
รีดิวซสูงที่สุดมหหลั าว งจากหมักขาวเหนียวนึ่งเปนเวลา 4 วัน และการทดลองของ สิรินทรเทพ (2523)
ท
ิ ัลา Amylomyces spp. จะใหปริมาณน้ําตาลสูงที่สุดในชั่วโมงที่ 60 แลวคอย ๆ ลดลงเมือ่
ที่รายงานว
รู้ด จ
ิ
า ม
คระยะเวลาหมั
ว กขาวนานขึ้น
คลัง
การที่ราทั้งสองสกุลใหปริมาณกลูโคสแตกตางกันมาก อาจมีสาเหตุมาจากราทั้งสองสกุล
สรางเอนไซมมายอยแปงไดตางกัน มีรายงานวาเอนไซมที่สรางโดย Rhizopus spp. นาจะเปน
แอลฟาอมัยเลส ซึ่งไฮโดรไลซแปงไดผลิตผลสวนใหญ คือ มอลโตส, เดกซตริน และใหกลูโคส
ในปริมาณนอย สวนเอนไซมที่สรางโดย Amylomyces spp. สวนมากเปนกลูโคอมัยเลส ซึ่งไฮโดร
ไลซแปงอยางสมบูรณ ไดผลิตผลสุดทาย คือ กลูโคส จึงทําใหขาวมีความหวานมากกวา (มนตรี,
2521) อยางไรก็ตามแมปริมาณของแข็งที่ละลายไดจากราทั้ง 2 สกุลจะมีคาใกลเคียงกัน แตเมื่อ
นํามาวิเคราะหหาปริมาณกลูโคส โดยใชโครมาโตกราฟแบบของเหลว กลูโคสที่วัดไดจากการ
 57

หมักขาวของ Amylomyces spp. ก็ยังใหคา สูงกวา นั่นเพราะวา Amylomyces sp สรางเอนไซม

กลูโคอมัยเลสมายอยแปงนัน่ เอง จากการที่ Amylomyces spp. สามารถเปลี่ยนแปงเปนน้ําตา
กลูโคสไดดีกวา จึงทําใหราสกุลนี้มีความเหมาะสมในการเปลี่ยนแปงเปนน้ําตาลสําหรับการหมัก
ขาวหมากและสาโท

อยางไรก็ตาม การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงคเพื่อศึกษาบทบาทของราแตละสกุล จึงทําการ

ทดลองหมักขาวโดยใชราบริสุทธิ์ แตเนื่องจากราแตละชนิดมีคุณสมบัติในการสรางเอนไซมได
แตกตางกัน และเอนไซมแตละชนิดก็มกี จิ กรรมในการยอยแปงตางกันดวย โดยแอลฟาอมัยเลสจะ
ยอยแปงแบบสุมที่พันธะ α-D-( 1-4) linked เอนไซมจึงยอยแปงออกเปนสายสั้น ๆ ทําใหมี non-
reducing end เพิ่มมากขึ้น ในขณะเดียวกันเอนไซมกลูโคอมัยเลสจะยอยแปงจาก non-reducing
end ทําใหไดน้ําตาลกลูโคสทีละ 1 โมเลกุล นอกจากจะยอยแปงตรงตําแหนง α-D-( 1-4) แลวยัง
พบวาสามารถยอยตรงตําแหนง α-D-( 1-6) และ α-D-( 1-3) ไดดีเทากับตรงตําแหนง α-D-( 1-4)
อีกดวย เอนไซมทั้งสองชนิดนี้จึงมีความสําคัญมากในการยอยแปงใหเปนน้ําตาล ดังนั้นหากมีการ
เลือกใชราบริสุทธิ์มาทําเปนกลาเชื้อหรือลูกแปง สําหรับการเปลี่ยนแปงเปนน้ําตาล ก็ควรใชรา
Rhizopus spp. รวมกับ Amylomyces spp. ดวย เพราะนาจะใหประสิทธิภาพในการยอยแปงดีกวา
การใชราที่ยอยแปงไดดแี ละมีกลูโคสสูร์ งเพียงสกุลเดียว อยางไรก็ตาม การคัดเลือกราไปใชยังตอง
ต
คํานึงถึงลักษณะบางอยางของผลิศตาสภัณฑทไี่ ด เชน ความสามารถในการสรางกรด การเกิดสปอรสี
ตร
ตาง ๆ รวมทั้งกลิ่นรสที่เกิเกดษขึ้นดวย
าลัย
ิาวทย
ม ห 1.1.4 ปริมาณแปง
ิทัล
ู ด
้ จ
ิ
วมรา เมื่อแปงถูกยอยโดยเอนไซม จะทําใหคุณสมบัติของแปงเปลี่ยนไป ทําให
คลังครูอัตราสวนการยอยแปงดวยเอนไซมจากราไดอยางคราว ๆ จากการวัดปฏิกิริยาของสีไอโอดีนกับ
แปง โดยอาศัยหลักการที่วาแปงสามารถทําปฏิกิริยากับสารละลายไอโอดีนใหสีมว งหรือสีน้ําเงิน
การทดสอบทําไดโดยหยดสารละลายไอโอดีนลงบนตัวอยางขาวหมัก ปริมาณแปงมากหรือนอย
สามารถบอกไดจากสีที่เกิดขึน้ หากมีแปงเหลืออยูมากจะใหสีมวงหรือน้ําเงิน หากมีแปงเหลืออยู
นอยจะใหสีเหลือง หรือสีเหมือนกับสารละลายไอโอดีน

การทดสอบปริมาณแปงที่เหลือจากการยอยแปงของราทัง้ 6 ไอโซเลท ผลการทดสอบที่

ได สอดคลองกับปริมาณกลูโคสที่ราสรางขึ้น โดยราที่แยกจากลูกแปงทั้ง 2 แหลงใหผลการ
ทดสอบคลายกัน(ตารางที่ 3 และตารางที่ 4) คือ ราสกุล Amylomyces spp. ยอยแปงไดดีกวารา
 58

สกุล Rhizopus spp. โดยที่ Amylomyces spp. ML005 และ MKM008 ใหผลการทดสอบปริมาณ
แปงเปนสีเหลือง(+) แสดงวามีแปงเหลืออยูนอย สามารถเปลี่ยนแปงไปเปนน้ําตาลไดดี ในขณะที่
Rhizopus spp. ทั้ง 4 ไอโซเลท ไดแก MKM012, ML004, MKM007 และ ML003 สามารถยอย
แปงไปเปนน้ําตาลไดนอยกวา ใหผลการทดสอบเปนสีมวงแกมน้ําเงิน(++++) ในชวงแรกของการ
หมัก และสีนา้ํ ตาลเขม(+++) จนถึงสีน้ําตาลออน(++)เมื่อระยะเวลาในการหมักขาวนานขึ้น

ผลการทดลองที่ได สอดคลองกับการศึกษาของ สิรินทรเทพ (2523) ที่ทําการคัดเลือกราที่

มีประสิทธิภาพในการยอยแปง พบวา Amylomyces spp. สามารถยอยแปงไดดกี วา Rhizopus
Mucor และ Aspergillus โดยใหผลการทดสอบกับสารละลายไอโอดีนเปนสีน้ําตาลออน หรือสี
เหลือง หลังจากเลี้ยงเชื้อราในอาหารเหลว Czapek ที่มีแปง 1 เปอรเซ็นต เปนเวลา 2 วัน แต
จากการทดลองในครั้งนี้พบวา Amylomyces spp. ใหผลการทดสอบกับสารละลายไอโอดีนเปนสี
น้ําตาลออนและสีเหลือง หลังจากหมักขาวเหนียวนึ่งเปนเวลา 3-4 วัน ผลการทดลองที่ตางกันนี้
อาจเปนเพราะวาอาหารที่ใชในการศึกษาตางกัน

1.1.5 คาของแข็งที่ละลายได

จากการนําสน้ตาํ รข์ าวหมักมาวัดปริมาณของแข็งที่ละลายไดดวยเครื่อง

า
refractometer พบวาราจากลูตกรศแปงทั้ง 2 แหลง ใหคาการเปลี่ยนแปลงของของแข็งที่ละลายได
เ ก ษ
คลายกัน ราในสกุล ลAmylomyces
ย า ัย spp. จะใหขาวหมักที่มีของแข็งละลายไดมากกวาราในสกุล
ิท
Rhizopus spp. าวผลการทดลองแสดงดั งตารางที่ 3 ตารางที่ 4 และภาพที่ 6 เมื่อพิจารณารา
ห
Rhizopusิทspp. ัล ม ทั้ง 4 ไอโซเลท พบวา ในชวง 24 ชั่วโมงแรกของการหมักขาว ML004,
MKM007ม ร ู้ดิจ และ ML003 จะใหคาใกลเคียงกันมากคือ 39.80 41 00 และ 39.80 องศาบริกซ
คว า
คลัง
ตามลํ าดับ ในขณะที่ MKM012 จะใหคาของแข็งที่ละลายไดมากกวา โดยมีคาเทากับ 45 องศาบ
ริกซ สําหรับ Amylomyces spp. ML005 และ MKM008 ใหคาของแข็งที่ละลายไดสูงกวาราสกุล
Rhizopus spp. ทั้ง 4 ไอโซเลท โดยมีคาเทากับ 45 และ 46 องศาบริกซ ตามลําดับ หลังจาก
หมักขาวเปนเวลา 24 ชั่วโมง ทุกไอโซเลทจะใหของแข็งที่ละลายไดลดลงอยางชัดเจน จนถึง
ชั่วโมงที่ 48 MKM012, ML004, MKM007 และ ML003 ใหคาของแข็งทีล่ ะลายไดต่ํากวา
ML005 และ MKM007 โดยมีคาเทากับ 38.00 36.9 38.00 และ 37.10 องศาบริกซ ตามลําดับ
ในขณะ ML005 และ MKM008 ใหคาของแข็งที่ละลายไดเทากับ 40.5 และ 42.20 องศาบริกซ
เมื่อพิจารณาราสกุล Rhizopus spp. หลังจากหมักขาวเปนเวลา 48 ชั่วโมง ของแข็งละลายไดมคี า
เพิ่มขึ้น โดยในชั่วโมงที่ 72 MKM012, ML004, MKM007 และ ML003 ใหคาของแข็งที่ละลาย
 59

ไดเพิ่มขึ้นเล็กนอย คือ 39.00 39.50 40.00 และ 38.50 องศาบริกซ ตามลําดับ และในชัว่ โมงที่
96 มีคาเทากับ 40.8 40.5 41.30 และ 39.50 องศาบริกซ ตามลําดับ ในขณะที่ Amylomyces
spp. ML005 และ MKM008 หลังจากหมักขาวเปนเวลา 48 ชั่วโมง ของแข็งละลายไดมีคาลดลง
เล็กนอย โดยในชั่วโมงที่ 72 วัดคาของแข็งที่ละลายไดเทากับ 39.50 และ 41.50 องศาบริกซ
ตามลําดับ และชั่วโมงที่ 96 วัดคาของแข็งที่ละลายไดเทากับ 40.00 และ 41.90 องศาบริกซ
ตามลําดับ

50.0

45.0
ของแข็งทัง้ หมด (องศาบริกซ)

40.0

MKM007
35.0 MKM008
MKM012
ML003
์ ML004
30.0 ต ร ML005
รศ าส
24 ษต 48 72 96
ก
า ลัยเ
เวลาหมัก (ชัว่ โมง)
ิา ทย
ว
ภาพที่ 6 การเปลี ห ่ยนแปลงปริมาณของแข็งทั้งหมดของขาวหมัก จากราที่แยกไดจากลูกแปงขาว
ม
ัล และลูกแปงเหลา Rhizopus spp. (MKM007, MKM012, ML003, ML004) และ
จ
ิ ท
ิ หมาก
า ม รู้ด Amylomyces spp. (MKM008, ML005) ในระหวางการหมักขาวเหนียวโดยใชราบริสุทธิ์
คลังคว
จากผลการทดลองของแข็งที่ละลายได จากการหมักขาวเหนียวนึ่งของราทั้ง 6 ไอโซเลท
จะมีคาสูงในวันที่ 1 และจะลดต่ําลงมากในวันที่ 2 ซึ่งตางจากการทดลองของ ชัยวัฒน (2521) ที่
รายงานวา การหมักขาวหมากโดยใชรา Chlamydomucor (ชื่อพองของ Amylomyces spp.) เพียง
สกุลเดียว จะใหปริมาณน้ําตาลในรูปของแข็งที่ละลายไดคอนขางต่ําในชวงตนของการหมัก และ
จะเพิ่มสูงขึ้นและมีคามากทีส่ ุดประมาณวัน 3 และ วันที่ 4 โดยมีคาประมาณ 35-36 องศาบริกซ
ในการศึกษาของ สิรินทรเทพ (2523) รายงานวา การหมักขาวหมากโดยใชรา Amylomyces spp.
บริสุทธิ์ในชวงวันแรกของการหมัก ปริมาณของแข็งที่วดั ไดอยูใ นชวง 2-10 องศาบริกซ และจะมี
 60

คาสูงที่สุดหลังจากหมักขาวไปแลว 60 ชั่วโมง โดยอยูในชวง 19-23 องศาบริกซ จากผลการ

ทดลองที่ไมสอดคลองกันนี้ อาจมีสาเหตุมาจาก ในชวงวันแรกของการหมักขาว รามีการยอยแปง
ไดนอยทําใหมีน้ําเชื่อมขาวในปริมาณต่ํา ดังนั้นเมื่อทําการวัดคาโดยใช refractometer จึงตองนํา
ตัวอยางเมล็ดขาวมาบีบคั้น อาจทําใหมีเศษขาวปนบาง ผลการวัดคาจึงผิดจากความเปนจริง

1.2 การผลิตเอนไซมอมัยเลสบนอาหารแข็ง

การทดสอบความสามารถในการสรางเอนไซมยอยแปงของราบนอาหาร starch agar

ประสิทธิภาพของการยอยแปงเปรียบเทียบไดจาก บริเวณทีแ่ ปงถูกยอย เมื่อราดดวยสารละลาย
ไอโอดีนจะเกิดสีน้ําเงินในบริเวณที่มแี ปง แตบริเวณที่แปงถูกยอยเปนน้ําตาลแลวจะเห็นเปนบริเวณ
ใส(clear zone) ในการทดลองนี้ไดใชอาหารสําเร็จรูป starch agar(Difco) ในการทดสอบ ผลจาก
การทดสอบพบวา ราบางไอโซเลทสามารถเจริญไดอยางรวดเร็วบนผิวหนาอาหารเลี้ยงเชื้อ ภายใน
ระยเวลา 24 ชั่วโมง แตบางไอโซเลทเจริญไดชามาก ดังนั้นเพือ่ สะดวกตอการตรวจผลและ
สามารถควบคุมระยะเวลาในการเพาะเชื้อใหเทากัน เพือ่ ไมใหโคโลนีของราใหญเกินไป จึงได
เปลี่ยนมาใชอาหาร Rose bengal dichloran chloramphenical agar (RBDC) และเติม soluble starch
4 เปอรเซ็นต(น้ําหนักตอปริมาตร) ร์
า ส ต
ตรศ
เนื่องจากราแต
เ ก ษละสกุลมีอัตราการเจริญไมเทากัน ทําใหมีความสามารถในการสราง
าลัย กษาครั้งนี้จึงเปรียบเทียบความสามารถในการสรางอมัยเลสของราสกุล
เอนไซมตางกันดวิทยยในการศึ
ห าว กแปงขาวหมากจํานวน 8 ไอโซเลท และลูกแปงเหลา 4 ไอโซเลท(ตารางที่
เดียวกัน ที่แยกจากลู
ล
ั ม
ท
ิ
1) ู้ดิจโดยเปรียบเทียบอัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสและเสนผาศูนยกลางของ
า มร ของราในสกุลเดียวกัน(ภาพที่ 7) ดวยการกําหนดอัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของ
โคโลนี
ว
ค
คลังบริเวณใสและเสนผาศูนยกลางของโคโลนีมากกวา 1 แสดงวา มีเอนไซมยอยแปงสูง และ
อัตราสวนดังกลาวเทากับหรือนอยกวา 1 แตไมเทากับ 0 แสดงวาสามารถสรางเอนไซมยอยแปง
ไดนอย และหากเทากับ 0 แสดงวา ไมมีความสามารถสรางเอนไซมยอยแปงได (สมพร,2544)
ผลการทดลองแสดงในตารางที่ 4 มีรายละเอียดดังนี้
 61

ภาพที่ 7 บริเวณใส (clear zone)ที่เกิดจากการยอยแปงเปนน้ําตาลของเอนไซมอมัยเลสจากรา หลัง

จากราดดวยสารละลายไอโอดีน เมื่อใชอาหาร Rose bengal dichloran chloramphenical
agar ( RBDC ) ที่มี soluble starch 4 เปอรเซ็นต (น้ําหนักตอปริมาตร) ในการทดสอบ

ตารางที่ 4 ความสามารถสรางเอนไซมยอยแปงของรา ที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา

เมื่อเลี้ยงบน อาหาร Rose bengal dichloran chloramphenical agar (RBDC) ที่มี soluble
starch อยู 4 เปอรเซ็นต (น้ร์ ําหนักตอน้ําหนัก) เปนเวลา 48 ชั่วโมง
า ส ต
ต รศ
เสัยนเกผษาศูนยกลาง เสนผาศูนยกลาง อัตราสวนระหวางเสนผาศูนย
ยาล
ว ิท ของบริเวณใส ของโคโลนี กลางของบริเวณใสและ
เชื้อรา ห า
ัล ม
ิู้ดจิท (ซม.) (ซม.) เสนผาศูนยกลางของโคโลนี
ามร
คว
ั ง
คล Rhizopus spp.
MKM007 3.50 5.75 0.61
MKM012 0.00 7.15 0.00
MKM023 0.00 7.20 0.00
MKM028 4.15 6.85 0.61
MKM030 2.60 6.50 0.40
 62

ตารางที่ 4 (ตอ)

เสนผาศูนยกลาง เสนผาศูนยกลาง อัตราสวนระหวางเสนผาศูนย

เชื้อรา ของบริเวณใส ของโคโลนี กลางของบริเวณใสและ

(ซม.) (ซม.) เสนผาศูนยกลางของโคโลนี

Rhizopus spp.
ML003 3.80 6.25 0.61
ML004 2.90 8.15 0.36
ML010 4.50 7.40 0.61
Amylomyces spp.
MKM008 3.75 6.30 0.60
MKM029 4.03 6.15 0.65
MKM031 1.95 4.75 0.41
ML005 1.90
ต ร ์ 3.33 0.57
าส
ษ ตรศ
ราสกุล Rhizopus
ล ย
ั เก spp.
า
ิา ทย
ว
ห
ัิทล ม spp. ทั้งหมด 8 ไอโซเลท แบงเปนแยกจากลูกแปงขาวหมาก 5 ไอโซเลท
Rhizopus
(MKM007,
ม ร ู้ดิจ MKM012, MKM023, MKM028 และ MKM030) และลูกแปงเหลา 3 ไอโซเลท
ว า ML004 และ ML010) พบวา ราทุกไอโซเลทสามารถยอยแปงไดนอย โดยมีอัตราสวน
(ML003,
ค
ลัง
ค ระหวางเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสและเสนผาศูนยกลางของโคโลนีนอยกวา 1 แตไมเทากับ 0
ยกเวน MKM012 และ MKM023 จะใหอัตราสวนดังกลาวเทากับ 0 (ราทั้ง 2 ไอโซเลท แยกจาก
ลูกแปงขาวหมาก ตลาดนนทบุรี อ. เมือง จ. นนทบุรี และตลาดบางจาก เขตพระโขนง กทม.
ตามลําดับ) ไอโซเลทที่สรางเอนไซมยอยแปงไดสูงสุด คือ MKM007 และ MKM028 (แยกจาก
ลูกแปงขาวหมาก ตลาดพระโขนง เขตพระโขนง กทม. และตลาดบางจาก เขตพระโขนง กทม.
ตามลําดับ) ใหอัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสและเสนผาศูนยกลางของโคโลนี
เทากัน คือ 0.61 สําหรับราที่แยกจากลูกแปงเหลาพบวา รารหัส ML003 และ ML010 (แยกจาก
ลูกแปงเหลา ตลาดพระโขนง เขตพระโขนง กทม. และตลาดสามแยกเกษตร เขตจตุจักร กทม.
 63

ตามลําดับ) สามารถสรางเอนไซมยอยแปงไดสูงสุด โดยจะใหอัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลาง

ของบริเวณใสและเสนผาศูนยกลางของโคโลนีเทากันคือ 0.61

ราสกุล Amylomyces spp.

Amylomyces spp.ทั้งหมด 4 ไอโซเลท แบงเปนแยกจากลูกแปงขาวหมาก 3 ไอโซเลท

และลูกแปงเหลา 1 ไอโซเลท พบวา ราทุกไอโซเลทสามารถยอยแปงไดนอยเชนกัน โดยมี
อัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสและเสนผาศูนยกลางของโคโลนีนอยกวา 1 แต
ไมเทากับ 0 ไอโซเลทที่สรางเอนไซมยอยแปงไดสูงสุด คือ MKM029(แยกจากลูกแปงขาวหมาก
ตลาดบางจาก เขตพระโขนง กทม.) ใหอัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสและ
เสนผาศูนยกลางของโคโลนีเทากับ 0.65 สวนรารหัส ML005(แยกจากลูกแปงเหลา ตลาดนนทบุรี
อ. เมือง จ.นนทบุรี) ใหอัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสและเสนผาศูนยกลางของ
โคโลนีนอยกวา คือ 0.57

ผลการทดลองที่ไดสอดคลองกับการศึกษาของ Saono et al. (1977) ที่รายงานวา ราทุก

ไอโซเลทที่แยกไดจากลูกแปง Ragi รของอิ ์ นโดนีเซีย สามารถยอยแปงได และแสดงกิจกรรมของ
ต
เอนไซมไลเปส และรายงานวาศาส89 เปอรเซ็นต ของราที่แยกไดสามารถยอยโปรตีนได และ
ร
ตสมพร
สอดคลองกับการศึกษาของ เ ก ษ (2544) ที่ศึกษาความสามารถในการสรางเอนไซมยอยแปงของ
ย
ั
าล agar พบวาทุกไอโซเลทสามารถสรางเอนไซมยอยแปงได และรายงาน
ราเหลานี้บนอาหาริทยstarch
ว
วาราสวนใหญมหา จะใหอัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสและเสนผาศูนยกลางของ
ัล
โคโลนีู้ดเิจทิทากับหรือนอยกวา 1 แตไมเทากับ 0 ไดแกรารหัส MKM023, MKM030, ML003,
า มร ML010, MKM029, MKM031 และ ML005 ใหอัตราสวนดังกลาวมากกวา 1 มี 3 ไอ
ML004,
ว
ค
คลังโซเลท ไดแก รารหัส MKM007, MKM028 และ MKM008 ใหอัตราสวนดังกลาวเทากับ 0 มี 1
ไอโซเลท คือ MKM012 เมื่อพิจารณาขนาดของโคโลนี ในการทดลองนี้ราทุกไอโซเลทจะให
ขนาดของเสนผาศูนยกลางโคโลนีนอยกวา ซึ่งอาจเปนเพราะวาอาหารที่ใชศึกษาแตกตางกัน และมี
สวนผสมของสารขัดขวางการเจริญอยูดวย อยางไรก็ตาม เปนทีน่ าสังเกตวา รารหัส MKM012
ใหอัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสและเสนผาศูนยกลางของโคโลนีเทากับ 0 ทั้ง
2 การทดลอง
 64

การทดสอบการสรางเอนไซมยอยแปงของรา นอกจากจะเปนแนวทางชวยในการตัดสินใจ
หาเชื้อที่มีประสิทธิภาพในการยอยแปงไดดี มาทดลองทําเปนลูกแปงจากกลาเชื้อบริสุทธิ์แลว อาจ
มีประโยชน ในการนําไปใชผลิตเอนไซมอมัยเลสทางอุตสาหกรรม หรือในกระบวนการ Amylo
process สําหรับการผลิตแอลกอฮอลจากแปง โดยคัดเลือกราที่มีประสิทธิภาพในการยอยแปงไดดี
ไปใชในการหมักแปงรวมกับยีสต เพื่อที่จะเปลี่ยนแปงใหเปนน้ําตาลและแอลกอฮอล

1.3 การผลิตเอนไซมอมัยเลสและการทํางานของเอนไซม

ราแตละชนิดมีความสามารถในการยอยแปงไดตางกัน และมีการสรางเอนไซมได
แตกตางกัน เอนไซมสําคัญที่ A. rouxii และ Rhizopus spp. ผลิตไดแก เอนไซมอมัยเลส ชนิด
แอลฟาอมัยเลสและกลูโคอมัยเลส โดยราแตละสกุลจะสรางในปริมาณที่แตกตางกัน จากการที่
เอนไซมทั้งสองชนิดมีความสามารถในการยอยแปงตางกันดังที่ไดกลาวไวในขางตน ทําใหราแตละ
สกุลมีลักษณะเฉพาะในการเปลี่ยนแปงเปนน้ําตาล และมีรูปแบบการทํางานของเอนไซมที่แตกตาง
กันดวย

การหมักขาวหมากและสาโท หลังจากคลุกขาวเหนียวกับลูกแปงแลวจะนําขาวเหนียว
ต ร ์
ไปบรรจุในภาชนะ สําหรับขาวหมากนิ า ส ยมใชกลองพลาสติกขนาดเล็ก หรือนําไปหอดวยใบตอง
สวนสาโทนิยมใชภาชนะปากกว
ศ
ตร างและกนลึก เพื่อใหขา วและเชื้อไดรบั อากาศอยางเพียงพอ เชน
เก ษ
โอง หรือ ถังพลาสติกาลพีัยวีซ(ี การผลิตสาโทแบบพื้นบานมักจะใสขาวลงไปประมาณ 1 ใน 3 หรือ 1
ใน 4 ของปริมหาตรโอ วา ิทยง) จากนั้นจะปดฝาไวหลวม ๆ โดยใชพลาสติกหรือไม และหมักไวประมาณ
3 วัน ในระหว ท
ิ ัล ม างการหมัก 2-3 วันแรก เชื้อราจะเจริญและสรางเอนไซมมายอยแปงใหเปนน้ําตาล
ิจ
(ชวามงนีรู้ดเ้ อนไซมจะมีกจิ กรรมสูงสุด) เกิดเปนน้ําซึมออกมาจากเมล็ดขาว ขณะเดียวกันราจะสราง
ง
ั คว
คล กรดทํ าใหพีเอชของขาวลดลง สรางสภาพที่เหมาะสมตอการเจริญของยีสต ในกรณีของขาวหมาก
จะหยุดกระบวนการหมักเพียงเทานี้ ขาวหมากที่ไดจะหอมนุม ชุมน้ํา มีรสหวานอมเปรี้ยวเล็กนอย
และมีกลิ่นรสของแอลกอฮอล สําหรับสาโท หลังจากราหมักขาวไดประมาณ 3 วัน จะมีการเติม
น้ํา หรือผาน้ําลงไป ผูผลิตบางรายจะมีการเติมน้ําตาลลงไปดวยเพื่อเปนการเรงการหมัก และสราง
สภาพไรอากาศ จากนั้นจะหมักตอไปประมาณ 1-2 สัปดาห ยีสตในลูกแปงจะหมักน้ําตาลใหเปน
แอลกอฮอล และกลิ่นรสตาง ๆ
 65

ในสภาะที่จํากัดการเจริญ จากความเขมขนของแอลกอฮอลและสภาพไรออกซิเจน ซึ่งเกิด

จากการทีย่ ีสตปลอยกาซคารบอนไดออกไซดออกมา สงผลใหราตายไปในที่สุดและไมมีการสราง
เอนไซมออกมายอยแปงไดอกี อยางไรก็ตามยีสต S. fibuligera ซึ่งพบอยูเปนจํานวนมากในลูก
แปงสามารถสรางเอนไซมอมัยเลสออกมายอยแปงที่เหลือได ในการทดลองขั้นนี้จงึ มีวัตถุประสงค
เพื่อศึกษาการทํางานของเอนไซมยอยแปงจากราทั้ง 2 สกุลวามีฤทธิ์อยูหรือไม หลังจากเชื้อราตาย
ไปแลว โดยการหมักขาวดวยเชื้อราบริสทุ ธิ์เปนเวลา 3 วัน จากนัน้ เติม absolute ethanol ใหมี
ความเขมขน 5 เปอรเซ็นต(ปริมาตรตอน้ําหนัก) เพื่อเปนการฆาเชื้อรา และหมักตอไปเปนเวลา 5
วัน การวัดการทํางานของเอนไซมอมัยเลสกอนและหลังจากที่ราตายไปแลว สามารถตรวจสอบได
จากของแข็งทีล่ ะลายไดโดยใช refractometer และปริมาณแปงที่เหลือโดยใชสารละลายไอโอดีน
ผลการทดลองที่ได ใหผลการทดลองคลายกับการทดลองในขอ 1.5 ราจากลูกแปงทั้ง 2 แหลง
จะใหคาการเปลี่ยนแปลงของปริมาณของแข็งที่ละลายไดมีลักษณะคลายกัน คือ เชื้อราในสกุล
Amylomyces spp. จะใหขา วหมักที่มีของแข็งละลายไดมากกวาราในสกุล Rhizopus spp. คา
ของแข็งที่ละลายไดจากการหมักขาวเหนียวนึ่งของราทั้ง 6 ไอโซเลท จะมีคาสูงในวันที่ 1 และจะ
ลดต่ําลงมากในวันที่ 2 ซึ่งนาจะมีสาเหตุเดียวกัน คือ มีน้ําเชื่อมขาวปริมาณต่ําในชวงวันแรกของ
การหมักขาว เมื่อทําการวัดคาโดยใช refractometer จึงตองนําเมล็ดขาวมาบีบคั้น อาจทําใหมีเศษ
เมล็ดขาวปนบาง ผลการวัดคาจึงผิดรจากความเป
์ นจริง อยางไรก็ตามผลการวัดคาตั้งแตวนั ที่ 2
ต
สอดคลองกับการทดลองของผูวศิจาัยสหลายทาน โดยที่ราสกุล Amylomyces spp. สามารถยอยแปง
ร
ษต
ไดดีกวารา Rhizopus spp.เกผลการทดลองแสดงในตารางที ่ 5 และภาพที่ 8 มีรายละเอียดดังนี้
าลัย
ิาวทย
เมื่อพิมจหารณาผลการทดลองที่ไดในวันที่ 3 MKM012, ML004, ML005, MKM007 และ
ัล
ML003ู้ดิจิทจะใหคาของแข็งทีล่ ะลายไดใกลเคียงกัน มีคาเทากับ 39.00 40.00 39.00 40.00 และ
ว า
38.70มร องศาบริกซ ตามลําดับ ในขณะที่ MKM007 จะใหคาของแข็งที่ละลายไดสูงที่สุด คือ
ค
คลัง41.50 หลังจากที่ทําการวัดคาในวันที่ 3 ไดเติม absolute ethanol ลงไปใหมีความเขมขนเทากับ 5
เปอรเซ็นต(ปริมาตรตอน้ําหนัก)(จากการเพาะเชื้อราจากขาวหมัก ไมพบการเจริญของราทุกไอโซเล
ทบนจานเพาะเชื้อ) หลังจากที่ราตายไปแลวในการวัดคาวันตอมา พบวาทุกไอโซเลท จะให
ปริมาณของแข็งที่ละลายไดเพิ่มขึ้นเพียงเล็กนอย และมีคาใกลเคียงกัน โดยในวันที่ 8 ของการ
หมักขาว วัดปริมาณของแข็งที่ละลายไดจาก MKM012, ML004, ML005, MKM007, MKM008
และML003 ไดเทากับ 40.90 41.10 40.00 41.20 42.00 และ 39.90 องศาบริกซ ตามลําดับ
จากการทดสอบปริมาณแปงพบวา ราทั้ง 6 ไอโซเลท ใหผลการทดสอบที่คลายกับการทดลองใน
ขอ 1.1.5 คือรา Amylomyces spp. สามารถยอยแปงไดดีกวาราในสกุล Rhizopus spp. โดยใน
 66

วันที่ 2 และ วันที่ 3 ML005 และ MKM008 ใหผลการทดสอบปริมาณแปงเปนสีน้ําตาลออน(

++) และหลังจากที่ราตายไปแลวใหผลการทดสอบปริมาณแปงเปนสีเหลือง(+) ตั้งแตวนั ที่ 4 สวน
MKM012, ML004, MKM007 และ ML003 ใหผลการทดสอบเหมือนกัน คือ ใหสีน้ําตาลเขม
(+++) ในวันที่ 3 และหลังจากที่ราตายไปแลวยังคงใหสีน้ําตาลเขมจนถึงวันที่ 8 ของการหมักขาว

จากผลการทดลอง ราที่แยกจากลูกแปงทั้ง 2 แหลงแสดงกิจกรรมการทํางานของเอนไซม

ยอยแปงคลายกัน โดยกอนและหลังที่ราตายปริมาณของแข็งที่ละลายไดไมแตกตางกันมากนัก เมื่อ
พิจารณาจากปริมาณของแข็งที่ละลายไดหลังจากที่ราตายไปแลวมีคาเพิ่มขึ้นเล็กนอย อาจกลาวได
วาเอนไซมสามารถทํางานไดอยู แตคาที่วัดไดเพิ่มขึ้นนอยมากจนเกือบจะคงที่ โดยที่ Rhizopus
spp. มีแนวโนมเพิ่มขึ้นแต Amylomyces spp. มีแนวโนมคงที่ อยางไรก็ตามในการทดลองนี้ได
เลือกใชวิธีการฆาราโดยใชแอลกอฮอล ซึ่งอาจมีผลตอกิจกรรมการทํางานของอมัยเลส ดังนั้นคาที่
วัดไดอาจจะผิดจากความเปนจริง จึงควรเลือกวิธีในการฆาราที่ไมสงผลตอกิจกรรมของเอนไซม
ในการศึกษาของ ชัยวัฒน (2521) รายงานวา การหมักขาวหมากโดยใชรา Amylomyces spp.
เพียงสกุลเดียวใหปริมาณน้ําตาลในรูปของแข็งที่ละลายไดคอนขางต่ําในชวงตนของการหมัก และ
จะเพิ่มสูงมากที่สุดในวัน 3 และวันที่ 4 โดยมีคาประมาณ 35-36 องศาบริกซ จากนัน้ จะมีคา
ลดลงเรื่อย ๆ จนกระทั่งในวันที่ 7 ของการหมั
ร ์ ก วัดคาไดประมาณ 32 องศาบริกซ ซึ่งตางไปจาก
ต
การทดลองในครั้งนี้ ของแข็งทีศา่ลสะลายไดจากการหมักขาวโดย ML005 และ MKM008 มี
ษตร ว
แนวโนมคงทีห่ ลังจากที่รเาตายไปแล
ัย ก
าล
ิาวทย
เมื่อพิมจหารณาผลการทดสอบปริมาณแปงที่เหลือ ในวันที่ 3 ของการหมักขาว Amylomyces
ท
ิ ัล อยแปงไดดี โดยใหผลการทดสอบเปนสีน้ําตาลออน(++) ในขณะที่ Rhizopus spp.
spp. สามารถย
รู้ด จ
ิ
า ม
มีวปริมาณแปงที่เหลือมากกวาใหผลการทดลองเปนสีน้ําตาลเขม(+++) แตหลังจากที่ราตายไปแลว
ง
ั ค
คล ปริมาณแปงที่เหลือจากรา Amylomyces spp. มีแนวโนมลดลง โดยใหผลการทดสอบเปนสีเหลือง
(+) ในขณะที่ Rhizopus spp. กับใหผลเปนสีน้ําตาลเขมคงที่(+++) จนถึงวันที่ 8 ของการหมัก
ขาว จากผลการทดลองดังกลาวเปนทีน่ า สังเกตวา ราแตละไอโซเลทใหคาของแข็งที่ละลายได
ใกลเคียงกันมาก แตผลการทดสอบปริมาณแปงกับตางกันอยางเห็นไดชัด ผลการทดสอบที่ตางกัน
นี้อาจมีสาเหตุมาจากการที่ราทั้ง 2 สกุลสรางเอนไซมออกมายอยแปงตางชนิดกัน โดย Rhizopus
spp. สามารถสรางเอนไซมแอลฟา-อมัยเลส มีคุณสมบัติทําใหเกิดการ liquefy ของแปง ดังนั้น
แปงจะถูก liquefy ไปมากหรือนอยสามารถทดสอบไดจากปฎิกิริยาของสารละลายไอโอดีนกับ
แปง โดยการตรวจความเขมของสีที่เกิดขึ้น Rhizopus sp .เปนแหลงที่สําคัญของเอนไซมชนิดนี้
 67

สําหรับเอนไซมกลูโคอมัยเลส มีคุณสมบัติที่ทําใหเกิดการ saccharify ของแปงเปนน้ําตาล ซึ่งวัด

ในรูปของน้ําตาลรีดิวซ ดังนั้นเอนไซมกลูโคอมัยเลสจึงมีความสําคัญอยางมากในการทําขาวหมาก
เพราะทําใหไดน้ําตาลที่มีความหวานมาก และพบวาสามารถผลิตไดมากในรา Amylomyces spp.
ดวยเหตุนี้เองจึงทําใหพบราดังกลาวในลูกแปงขาวหมากมากวาลูกแปงเหลา และการที่ชาวบาน
นิยมนําลูกแปงขาวหมากไปใชหมักสาโทรวมกับลูกแปงเหลา โดยที่ไมตองเติมน้ําตาลในชวงผาน้ํา
เพราะในลูกแปงขาวหมากมีแหลงของเอนไซมชนิดนี้อยูม ากนั่นเอง

จากผลการทดลองที่ไดนี้จึงไมอาจสรุปไดวา ลักษณะการทํางานของเอนไซมหลังจากที่รา
ตายไปแลวเปนอยางไร หากประสิทธิภาพการยอยแปงวัดจากกลูโคส ผลิตผลสําคัญของขาวหมาก
และเปนสารตัง้ ตนในการเกิดแอลกอฮอลในสาโท การวัดการทํางานของเอนไซมในการยอยแปง
จากปริมาณของแข็งที่ละลายไดและสีของไอโอดีนที่หายไป ไมไดบงบอกถึงจํานวนพันธะไกล
โคซิลในแปงที่ถูกยอยสลาย ดวยเหตุนี้ในการติดตามกิจกรรมของอมัยเลส จึงควรเปรียบเทียบจาก
หนวยของหมูร ีดิวซที่เกิดขึน้

ตารางที่ 5 การทํางานของเอนไซมอมัยเลสของรา ที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา

ตร์ MKM012, ML003, ML004 และ ML005

รหัส MKM007, MKM008,
ส
ต รศา
เชื้อรา เกษ วันที่ 1 วันที่ 3 วันที่ 5
าลัย
ิา ทย
ว
Rhizopus sp.ม ห
ัล
ิู้ดจิท
MKM007 ของแข็งทั้งหมด(องศาบริกซ) 40.80 40.00 40.50
ว า มร ปริมาณแปง(Iodine reaction) ++++ +++ +++
คลังค
MKM012 ของแข็งทั้งหมด(องศาบริกซ) 44.00 39.00 40.60
ปริมาณแปง(Iodine reaction) ++++ +++ +++

ML003 ของแข็งทั้งหมด (องศาริกซ) 39.80 38.70 39.60

ปริมาณแปง(Iodine reaction) ++++ +++ +++
 68

ตารางที่ 5 (ตอ)

เชื้อรา วันที่ 1 วันที่ 3 วันที่ 5

Rhizopus sp.
ML004 ของแข็งทั้งหมด(องศาบริกซ) 38.80 40.00 39.80
ปริมาณแปง(Iodine reaction) ++++ +++ +++

Amylomyce sp.
ML005 ของแข็งทั้งหมด(องศาบริกซ) 45.00 39.50 39.80
ปริมาณแปง(Iodine reaction) ++++ ++ +

MKM008 ของแข็งทั้งหมด(องศาบริกซ) 45.00 41.50 41.80

ปริมาณแปง(Iodine reaction) ++++ ++ +

ต ร ์
หมายเหตุ หลังจากที่ราหมักขศาาวไปแล ส ว 3 วัน จะเติม absolute ethanol ลงไป 5 เปอรเซ็นต
(ปริมาตรตอน้าํ หนัก) กษต
ร
ล ย
ั เ
+ สีเหลืา องแปงถูกยอยไปหมด
ิา ทย
ว
++ ห สีน้ําตาลออนแปงเหลือนอย
ั+++ล ม สีน้ําตาลเขมแปงเหลือปานกลาง
ท
ิ
ม ร ู้ดิจ
คว า ++++ สีมวงหรือน้ําเงินแปงเหลือมาก
คลัง
 69

50.0

ของแข็งทัง้ หมด (องศาบริกซ)

45.0

40.0
MKM007
MKM008
35.0 MKM012
ML003
ML004
30.0 ML005
1 2 3 4 5 6 7 8
เวลาหมัก (วัน)
ภาพที่ 8 การทํางานของเอนไซมอมัยเลส ในระหวางการหมักขาวของราที่แยกไดจากลูกแปงขาว
หมากและลูกแปงเหลา Rhizopus spp. (MKM007, MKM012, ML003, ML004) และ
Amylomyces spp. (MKM008, ML005) หลังจากที่ราหมักขาวไปแลว 3 วัน จะเติม
absolute ethanol ลงไปใหมีความเขมขน 5 เปอรเซ็นต (ปริมาตรตอน้ําหนัก)

ต ร ์
าส
ษตรศ
ัยเก
าล
ิาวทย
ม ห
ิจ ิทัล
า ม รู้ด
คัลงคว
 70

2. ปยจัยที่มีผลตอการเจริญของยีสต

ลูกแปงเปนวัตถุดิบที่สําคัญในการหมักขาว เนื่องจากเปนแหลงของราที่มีบทบาทในการ
เปลี่ยนแปงใหเปนน้ําตาล และยีสตที่มีบทบาทในการหมักน้ําตาลใหเปนแอลกอออล นอกจากนี้ยัง
มีสวนชวยในเรื่องกลิ่นและรสของผลิตภัณฑ ผลิตภัณฑจะมีคุณภาพดีหรือไมจึงขึ้นกับจุลินทรียดว ย
ในการผลิตจึงตองเลือกใชลูกแปงที่มีคุณภาพ เนื่องจากจุลินทรียใ นลูกแปงมีมากมายหลายชนิดทั้ง
ชนิดที่มีประโยชและไมมีประโยชนตอการหมักขาว และมีในปริมาณที่แตกตางกันตามแตละสูตร
ของลูกแปง จึงเปนการยากที่จะควบคุมการหมักในแตละครั้งใหมีคณ ุ ภาพของผลิตภัณฑคงที่ ใน
การพัฒนาผลิตภัณฑขาวหมากและสาโท จึงจําเปนอยางยิ่งที่ตองมีการใชกลาเชื้อบริสุทธ ดังนัน้
นอกจากจะศึกษาบทบาทของราในการหมักขาวแลว จึงสมควรที่ตองศึกษาบทบาทของยีสตดวย
เนื่องจากการอาศัยยีสตจากธรรมชาตินั้นจะทําใหไดการเจริญของยีสตที่ไมแนนอน ในระหวางการ
หมักอาจเกิดยีสตที่มีคุณสมบัติที่ไมตองการและการหมักเกิดขึน้ ชาหรือเกิดรสเปรี้ยวได จึงควรมี
การพัฒนากลาเชื้อยีสตขึ้นเพือ่ ใชในการหมักสุราพื้นบานโดยเฉพาะ

ในการทดลองนี้ไดศึกษาปยจัยตาง ๆ ที่มีผลตอการเจริญของยีสต Saccharomycopsis

fibuligera ทีแ่ ยกจากลูกแปงขาวหมากและลู ร ์ กแปงเหลาจํานวน 20 ไอโซเลท จากแหลงลูกแปง
ต
10 แหลง แบงเปนจากลูกแปรงศขาาสวหมาก 10 ไอโซเลท และลูกแปงเหลา 10 ไอโซเลท โดย
เปรียบเทียบกับ Saccharomyces เ ก ษต cerevisiae RIT I ซึ่งแยกไดในระหวางการหมักสาโท ผลที่ได
าลัย
จากการศึกษาจะเปิทนยแนวทางในการพิ จารณาคัดเลือกยีสตในการผลิตเปนกลาเชื้อบริสุทธิ์
ว
หา นขอมูลสําคัญในการควบคุมการผลิตสาโทและผลิตภัณฑอื่น ๆ ทีไ่ ดจากการหมัก
ขณะเดียวกันมจะเป
ขาวใหู้ดมิจีคิทณ
ัล
ุ ภาพดีขึ้น
า มร
ว
คลังค 2.1 ผลของอุณหภูมิตอการเจริญของยีสต

อุณหภูมิเปนปจจัยที่สําคัญที่มีอิทธิพลตอการเจริญของจุลินทรีย เนื่องจากจุลินทรียไม
มีกระบวนการที่ดีในการควบคุมการถายเทความรอน ดังนั้นอุณหภูมภิ ายนอกจึงมีผลโดยตรงตอการ
ทํางานของเอนไซมในระบบเมแทบอลิซึม ซึ่งหมายถึงการมีผลตอการเจริญ นอกจากนั้นการ
เปลี่ยนแปลงระดับอุณหภูมิอาจมีผลใหมีการเปลี่ยนวิถีในกระบวนการเมแทบอลิซึม ทําใหมกี าร
สรางสารบางอยางมากขึ้นหรือนอยลง ดังนั้นจึงจําเปนอยางยิ่งที่จะตองมีการศึกษาผลของอุณหภูมิ
ตอการเจริญของยีสต
 71

จากการเลี้ยงยีสตในอาหารเหลว yeast extract glucose โดยนําไปบมทีอุณหภูมิตางกัน 3

ระดับ คือ 10 20 และ 30 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10 วัน วิเคราะหการเจริญของยีสตจากความ
ขุนที่เพิ่มขึ้น โดยเปรียบเทียบยีสตที่แยกจากลูกแปงแหลงเดียวกัน ผลการทดลองมีรายละเอียดดังนี้

การเจริญของยีสต Saccharomyces cerevisiae RIT I ที่อุณหภูมิตาง ๆ มีลักษณะคลายกัน

(ภาพที่ 9) คือไมพบระยะ lag phase ใชเวลาในชวง log phase สั้นมากประมาณ 24 ชั่วโมง ยีสตมี
การเจริญถึงระยะ stationary phase ในวันที่ 2 ของการเพาะเลี้ยง จากการคํานวณหาอัตราการเจริญ
จําเพาะพบวา เมื่ออุณหภูมทิ ี่ใชบมสูงขึ้น ยีสตจะมีอัตราการเจริญจําเพาะเพิม่ ขึ้น(ตารางที่ 6 และ
ภาพที่ 10) โดยเมื่อบมที่อุณหภูมิ 10 20 และ 30 องศาเซลเซียส ยีสตจะมีอัตราการเจริญจําเพาะ
เทากับ 0.016 0.021 และ 0.029 ชั่วโมง-1 ตามลําดับ เมื่อพิจารณาเวลาทวีคูณ (ตารางที่ 6) การ
บมที่อุณหภูมสิ ูงจะใชเวลาในการเพิ่มจํานวนเซลลเปนสองเทานอยกวาที่อุณหภูมิต่ํา โดยเมื่อบมที่
อุณหภูมิ 10 20 และ 30 องศาเซลเซียส ยีสตจะใชเวลา 42.25 33.10 และ 23.60 ชั่วโมง
ตามลําดับ

0.5
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

0.0 ์
ต ร
-0.5ศาส
ษ ตร
ัย เก -1.0
าล 10 องศาเซลเซียส
ิาวทย -1.5 20 องศาเซลเซียส
มห 30 องศาเซลเซียส
ิทัล -2.0

า มรู้ดิจ 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ว
คลังค เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 9 การเจริญของ S. cerevisiae RIT I ที่อุณหภูมิตางๆ
 72

ตารางที่ 6 อัตราการเจริญจําเพาะ(specific growth rates)และเวลาทวีคณ

ู (doubling times) ของยีสต
ที่แยกจากลูกแปงเหลาและลูกแปงขาวหมากจากแหลงตาง ๆ เมื่อบมที่อุณหภูมิตางกัน

อัตราการเจริญจําเพาะ(ชั่วโมง-1) เวลาทวีคณ
ู (ชัว่ โมง)
10 20 30 10 20 30
สายพันธุ
องศา องศา องศา องศา องศา องศา
เซลเซียส เซลเซียส เซลเซียส เซลเซียส เซลเซียส เซลเซียส

RIT I 0.016 0.021 0.029 42.45 33.10 23.60

YKM001 0.009 0.009 0.013 74.08 77.04 53.63
YKM005 0.008 0.009 0.022 86.13 80.93 31.18
YKM007 0.009 0.008 0.019 77.43 87.03 36.12
YKM010 0.010 0.012 0.021 67.97 58.81 32.71
YKM015 0.007 0.008 0.024 93.28 91.89 28.90
YKM017 0.011 0.012 0.020 60.37 59.66 34.41
YKM022 0.012 0.011ร์ 0.021 57.69 63.75 32.43
า ส ต
YKM031 0.008 0.009
รศ 0.022 88.80 75.53 31.76
YKM035 ษต
0.008 เก 0.013 0.021 92.25 55.42 33.22
YKM043 ย
0.006 าลัย 0.011 0.025 113.22 60.66 27.96
า ว ิท
YL007 มห 0.008 0.008 0.020 83.49 85.25 35.30
ัิทล
YL008ู้ดิจ 0.013 0.010 0.022 54.82 68.19 31.92
า ม ร
ง
ั คว
YL009 0.008 0.008 0.018 84.90 86.31 38.08
คล YL013 0.012 0.011 0.020 58.67 64.57 34.26
YL014 0.008 0.011 0.020 86.81 61.58 35.40
YL025 0.013 0.009 0.019 53.46 81.05 36.71
YL026 0.012 0.012 0.022 57.29 59.53 31.48
YL028 0.007 0.007 0.027 101.41 95.53 26.12
YL031 0.009 0.007 0.022 77.87 97.78 31.33
YL049 0.007 0.010 0.018 99.12 69.94 38.04
 73

0.03

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.02

0.01

0.00
10 20 30
อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)

ภาพที่ 10 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของ S. cerevisiae RIT I ที่อุณหภูมิตาง ๆ

การเจริญของยีสต Saccharomycopsis fibuligera ทั้ง 20 ไอโซเลท ใหลักษณะการเจริญ

ที่คลายกันเมื่อบมที่อุณหภูมติ าง ๆ (ภาพที่ 11 ถึงภาพที่ 14) แมวายีสตเหลานี้จะแยกมาจากลูกแปง
ตางชนิดกัน และตางพื้นที่ คือ ไมพบระยะ lag phase การเจริญในชวง log phase ใชเวลาประมาณ
36 ชั่วโมง ถึง 4 วัน อัตราการเจริญของยีสตจะมากขึน้ เมื่ออุณหภูมทิ ี่ใชบมสูงขึ้น (ภาพที่ 15 ถึง
ภาพที่ 18) ยีสตจะมีอัตราการเจริญรจํ์ าเพาะสูงที่สุดและใชเวลาในการเพิ่มจํานวนเซลลเปนสองเทา
า ส ต ยส (จึงเปนการดีสําหรับการหมักขาวในประเทศไทยซึง่
สั้นที่สุดเมื่อบมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซี
ต รศ
ษ
เปนประเทศเขตรอน ทํเากใหสามารถนํามาปรับใชไดงาย) โดยไอโซเลทที่มีอัตราการเจริญจําเพาะ
ัย
สูงสุดและต่ําสุด เมืิทย่อานํลาไปบมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส คือ YL028 และ YKM001 โดยมี
ว
อัตราการเจริญมหจําาเพาะเทากับ 0.027 และ 0.013 ชัว่ โมง-1 ตามลําดับ จากการเปรียบเทียบการ
ัล
เจริญกัู้ดบิจิทS. cerevisiae RIT I พบวา S. fibuligera ทั้ง 20 ไอโซเลท สามารถเจริญไดชากวา มี
เพี
ว า
ย มง ร1 ไอโซเลทที่พบวา เมื่อบมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส มีอัตราการเจริญจําเพาะใกลเคียง
ค
คลังกับ S. cerevisiae RIT I ไดแก YL028(แยกจากลูกแปงเหลา หนาเรือนจําคลองเปรม เขตจตุจักร
กทม.) โดยมีอัตราการเจริญจําเพาะเทากับ 0.027 ชั่วโมง-1 สวน S. cerevisiae RIT I มีคาเทากับ
0.029 ชั่วโมง-1 จากการที่ S. fibuligera เจริญไดชากวานาจะเปนสาเหตุหนึ่งทีต่ รวจพบยีสตชนิด
นี้ไดนอยหลังจากหมักขาวไปแลวประมาณ 2-4 วัน ซึง่ นิยมหมักที่อณ ุ หภูมิหอง นอกเหนือไปจาก
ความสามารถในการทนตอแอลกอฮอลที่เพิ่มสูงขึ้น
 74

-0.1

การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

-0.6

ก) -1.1

-1.6

-2.1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
-0.1
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

-0.6

ข) -1.1

-1.6

-2.1

ต ร ์
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ศ าส
ษตร-0.1
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

ัย เก
าล -0.6
ิาวทย
ห
ัิทล ค)ม -1.1

ม ร ู้ดิจ YKM001
YKM007
า -1.6
ัลงคว
YKM017
YL013
ค -2.1 YL014

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่11 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา ตลาดบางกอกนอย,
รหัส YKM001, YKM007, YKM017, YL013 และ YL014 ที่อุณหภูมิตาง ๆ
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 75

0.5

การเจริญของยี สต (log OD610 nm)

0.0
-0.5
ก) -1.0
-1.5
-2.0
-2.5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.5
การเจริญของยี สต (log OD610 nm)

0.0
-0.5
ข) -1.0
-1.5
-2.0
-2.5
0 ร์ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
สต
ร0.5ศา
ษต0.0
การเจริญของยี สต (log OD610 nm)

เ ก
า ลัย
ิา ทย
ว -0.5
มห
ค) -1.0
ัล
ิู้ดจิท -1.5
YKM005
ามร
YKM010
ั ง คว -2.0 YKM043
YL007
คล -2.5 YL008

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 12 การเจริญของ ยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM005,
YKM010, YKM043, YL007 และ YL008 ที่อุณหภูมติ างๆ
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 76

0.5

การเจริญของยี สต (log OD610 nm)

0.0
-0.5
ก) -1.0
-1.5
-2.0
-2.5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.5
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
ข) -1.0
-1.5
-2.0
-2.5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
์
0.5สตร
ศา
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

ต ร0.0
เ ก ษ
ล ย
ั -0.5
ยา
ค)หาวิท -1.0
ัล ม -1.5 YKM015
ร ิู้ดจิท YKM022
YKM031
ม -2.0
ว า YL009
คลังค -2.5 YL025
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 13 การเจริญของ ยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM015,
YKM022, YKM031, YL009 และ YL025 ที่อุณหภูมติ างๆ
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 77

0.0

การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

-0.5
-1.0
ก) -1.5
-2.0
-2.5
-3.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.0
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

-0.5
-1.0
ข) -1.5
-2.0
-2.5
-3.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.0าสต
ร์
ศ
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

ษตร-0.5
ัย เก
าล -1.0
ิาวทย -1.5
ค)ห
ลั ม YKM035
ู้ดิจิท
-2.0 YL026
า มร -2.5 YL028
ว YL031
คลังค -3.0 YL049

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 14 การเจริญของ ยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM035,
YL026, YL028, YL031 และ YL049 ที่อุณหภูมิตางๆ
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 78

0.03

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.02

YKM001
0.01 YKM007
YKM017
YL013
0.00 YL014

10 20 30
อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)

ภาพที่ 15 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงเหลารหัส YKM001, YKM007, YKM017, YL013 และ YL014 เมื่อบมที่
อุณหภูมิตางๆ

0.03 ต ร ์
าส
ตรศ
อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

เก ษ
าล ัย 0.02
ิาวทย
มห YKM005
ิจ ิทัล 0.01 YKM010
า ม รู้ด YKM043
YL007
คัลงคว 0.00
YL008

10 20 30
อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)

ภาพที่ 16 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงรหัส YKM005, YKM010, YKM043, YL007 และ YL008 เมื่อบมที่ อุณหภูมิตางๆ
 79

0.03

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.02

YKM015
0.01 YKM022
YKM031
YL009
YL025
0.00
10 20 30
อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)

ภาพที่ 17 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงเหลารหัส YKM015, YKM022, YKM031, YL009 และ YL025 เมื่อบมที่อุณหภูมิ
ตางๆ

ต ร ์
0.03 าส
ตรศ
อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

เก ษ
าล ัย 0.02
ิาวทย
มห YKM035
ิจ ิทัล 0.01 YL026
า ม รู้ด YL028
ัลงคว
YL031
0.00 YL049
ค
10 20 30
อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)

ภาพที่ 18 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงเหลารหัส YKM035, YL026, YL028, YL031 และ YL049 เมื่อบมที่อุณหภูมิ
ตางๆ
 80

ผลการทดลองที่ไดสอดคลองกับคํากลาวทีว่ าอัตราการเจริญและอัตราการหมักแอลกอฮอล
โดย S. cerevisiae ขึ้นอยูกับอุณหภูมิในการหมัก และจะเพิ่มตามอุณหภูมิที่สูงขึ้น และอัตรา
สูงสุดจะอยูใ นชวงอุณหภูมิระหวาง 20-25 องศาเซลเซียส อยางไรก็ตามมีรายงานหลายฉบับแสดง
ใหเห็นวา S. cerevisiae เจริญไดดีที่อณ
ุ หภูมิ 30 องศาเซลเซียส และมีอัตราการเจริญลดลงเมื่อ
อุณหภูมิที่ใชหมักต่ําลง

ในการศึกษาของ Charoenchai et al. (1998) ไดรายงานวา S. cerevisiae HB350 และ S.

cerevisiae V1118 เมื่อเลี้ยงในอาหารสังเคราะหเลียนแบบน้ําองุนและนําไปบมที่อณ ุ หภูมิ 20-25
องศาเซลเซียส มีอัตราการเจริญอยูในชวง 0.13-0.17 ชั่วโมง-1 และเมือ่ บมที่อุณหภูมิ 15 และ 10
องศาเซลเซียส อัตราการเจริญจะลดลงประมาณ 50 และ 70 เปอรเซ็นต ตามลําดับ จากการ
ทดลองครั้งนี้ S. cerevisiae RIT I จะมีอตั ราการเจริญสูงกวา โดยเมื่อบมที่อุณหภูมิ 20 และ 30
องศาเซลเซียส มีอัตราการเจริญเทากับ 0.5 และ 0.7 ชั่วโมง-1 ตามลําดับ คาที่ไดแตกตางกันมาก
อาจเปนเพราะวา ยีสตที่ใชศึกษาตางสายพันธุกนั และอาหารที่ใชศึกษาตางชนิดกันดวย และ
รายงานวาไวนยีสตอีกหลายสายพันธุที่ใชในการศึกษาเกือบทั้งหมด ใหลักษณะเชนเดียวกัน โดย
จะเจริญไดดีเมือ่ อุณหภูมิสูงขึ้น

ต ร ์
2.2 ผลของพีเอชตอการเจริ
ร ศ าส ญของยีสต
เ ก ษต
นอกเหนื
ัย ทธิพลของสิ่งแวดลอม เชน อุณหภูมิ แลวพีเอชก็เปนภาวะของ
าอลจากอิ
ิท ย
สิ่งแวดลอมทีส่ หําาคัวญยิ่ง ที่มีผลตอการเจริญ และระบบเมแทบอลิซึมของยีสต โดยทัว่ ไปแลวยีสตจะ
ล
ั ม
ท
ิ
เจริญไดิจดีที่สุดที่พีเอชอยูในระดับกรด ดังนั้นในการศึกษาจึงจําเปนทีจ่ ะตองทราบวาพีเอชในระดับ
ู้ด
ใดมีา ม
ค รวามเหมาะสมกั บการเจริญของยีสต จากการเลี้ยงยีสตในอาหารเหลว yeast extract glucose
คว
ลัง
ค ที่ปรับคาพีเอชเริ่มตนตางกัน 4 ระดับ คือ 3.0 3.5 4.0 และ 4.5 และนําไปบมที่อุณหภูมิ 25
องศาเซลเซียส เปนเวลา 10 วัน วิเคราะหการเจริญของยีสตจากความขุน ที่เพิ่มขึ้น โดยเปรียบเทียบ
ยีสตที่แยกจากลูกแปงแหลงเดียวกัน ผลการทดลองมีรายละเอียดดังนี้

การเจริญของยีสต Saccharomyces cerevisiae RIT I ในอาหารที่มีคาพีเอชเริ่มตนตางกัน

มีลักษณะคลายกัน (ภาพที่ 19) คือ ไมพบระยะ lag phase ใชเวลาในชวง log phase นอยมาก เมื่อ
เลี้ยงในอาหารที่มีคาพีเอช 3.0 ใชเวลาประมาณ 24 ชัว่ โมง เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มคี าพีเอช 3.5
4.0 และ 4.5 ใชเวลาประมาณ 36 ชั่วโมง ยีสตจะมีการเจริญถึงระยะ stationary phase ประมาณ
 81

ชั่วโมงที่ 24-ชั่วโมงที่ 36 ของการเพาะเลี้ยง จากการคํานวณหาอัตราการเจริญจําเพาะพบวา ยีสต

จะมีอัตราการเจริญเพิ่มขึ้นเมือ่ เลี้ยงในอาหารที่มีคาพีเอชสูงขึ้น (ตารางที่ 7 และภาพที่ 20) เมื่อเลี้ยง
ในอาหารที่มีคา พีเอชเริ่มตน 3.0 3.5 4.0 และ 4.5 ยีสตจะมีอัตราการเจริญเทากับ 0.030 0.038
0.043 และ 0.047 ชั่วโมง-1 ตามลําดับ เมือ่ พิจารณาเวลาทวีคูณ (ตารางที่ 7) อาหารที่มีคาพีเอชสูง
จะใชเวลาในการเพิ่มจํานวนเซลลเปนสองเทานอยกวาอาหารที่มีคาพีเอชต่ํากวา เมื่อเลี้ยงในอาหาร
ที่มีคาพีเอชเริ่มตน 3.0 3.5 4.0 และ 4.5 ยีสตจะใชเวลา 22.94 18.22 16.00 และ 14.63 ชั่วโมง
ตามลําดับ

0.5
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0 พีเ อช 3.0
-1.5 พีเ อช 3.5
พีเ อช 4.0
-2.0 พีเ อช 4.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

ส ต ร์ เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 19 การเจริญของ S. cerevisiae ร ศ า ่
RITI ในอาหารที
ม ่ ค
ี า
 พี เ อชเริ ม
่ ต น ต า
่
งกั น
่
ษ ต
ล ย
ั เก
า
ิา ทย
ว
ม ห 0.06
ัล
อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

ด
้ ู จ
ิ ท
ิ 0.05
า ม ร 0.04
คว
คลัง 0.03
0.02
0.01
0.00 RIT I

3.0 3.5 4.0 4.5

pH
ภาพที่ 20 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของ S. cerevisiae RIT I เมื่อเลี้ยงในอาหาร
ที่มีคาพีเอชเริ่มตนตางกัน
 82

ตารางที่ 7 อัตราการเจริญจําเพาะ(specific growth rates) และเวลาทวีคณ

ู (doubling times) ของ
ยีสตที่แยกจากลูกแปงเหลาและลูกแปงขาวหมากจากแหลงตาง ๆ เมื่อเลี้ยงในอาหาร
ที่ปรับคาพีเอชเริ่มตนตางกัน

อัตราการเจริญจําเพาะ(ชั่วโมง-1) เวลาทวีคณ
ู (ชัว่ โมง)
สายพันธุ พีเอช พีเอช พีเอช พีเอช พีเอช พีเอช พีเอช พีเอช
3.0 3.5 4.0 4.5 3.0 3.5 4.0 4.5

RIT I 0.030 0.038 0.043 0.047 22.94 18.22 16.00 14.63

YKM001 0.007 0.008 0.015 0.012 105.20 90.39 44.95 58.11
YKM005 0.007 0.007 0.014 0.012 96.42 105.60 48.87 55.81
YKM007 0.005 0.007 0.014 0.012 133.16 98.24 50.20 57.77
YKM010 0.007 0.011 0.016 0.017 97.95 61.03 42.25 40.91
YKM015 0.008 0.009 0.021 0.012 85.91 77.94 32.31 57.14
YKM017 0.005 0.007 0.015 0.013 130.34 101.85 44.84 52.55
YKM022 0.009 0.014 0.025 ์ 0.016 78.08 49.72 27.41 44.30
ต ร
YKM031 0.008 0.008 ศาส 0.021 0.016 83.33 91.13 33.05 42.98
YKM035 0.008 0.010 ษตร 0.023 0.013 81.93 72.22 29.71 54.35
ล ย
ั เก
YKM043 0.008 ยา 0.007 0.021 0.014 88.61 102.04 33.17 50.63
า ว ิท
YL007 ม0.006 ห 0.008 0.017 0.017 115.90 83.96 39.78 40.44
ล
ั
YL008ู้ดิจิท 0.005 0.010 0.014 0.014 127.74 66.98 51.27 48.80
ว า
YL009มร 0.007 0.010 0.028 0.014 103.95 72.06 24.91 50.80
ค
คลังYL013 0.008 0.009 0.016 0.015 87.77 74.52 43.83 45.68
YL014 0.006 0.008 0.015 0.013 110.81 85.60 47.18 52.01
YL025 0.006 0.008 0.024 0.011 117.29 88.28 28.32 61.17
YL026 0.005 0.011 0.018 0.014 143.38 64.84 39.60 49.57
YL028 0.005 0.007 0.026 0.018 132.10 92.50 26.63 38.97
YL031 0.006 0.009 0.023 0.016 108.71 76.61 30.14 42.67
YL049 0.006 0.008 0.021 0.016 110.44 90.74 32.59 43.54
 83

การเจริญของยีสต Saccharomycopsis fibuligera ทั้ง 20 ไอโซเลท ใหลักษณะการเจริญ

ที่คลายกันเมื่อเลี้ยงในอาหารที่ปรับคาพีเอชเริ่มตนตางกัน (ภาพที่ 21 ถึงภาพที่ 24) ยีสตสวนใหญ
ตองการระยะ lag phase เมื่อพีเอชของอาหารเทากับ 3.0 และ 3.5 โดยใชเวลาประมาณ 36-48
ชั่วโมง การเจริญในชวงการเติบโตแบบเอกซโพเนนเชียล ใชเวลาประมาณ 36-96 ชั่วโมง ยีสตจะ
มีอัตราการเจริญ (ภาพที่ 25 ถึงภาพที่ 28) เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีพีเอช 3.0 และ 3.5 ใกลเคียงกัน
ยีสตจะมีอัตราการเจริญจําเพาะสูงที่สุดและใชเวลาในการเพิ่มจํานวนเซลลเปนสองเทาสั้นที่สุดเมื่อ
เลี้ยงในอาหารที่มีพีเอช 4.0 โดยไอโซเลทที่มีอัตราการเจริญจําเพาะสูงสุดและต่ําสุด เมื่อเลี้ยงใน
อาหารที่มีคาพีเอช 4.0 คือ YL009 และ YL008 โดยมีอัตราการเจริญจําเพาะเทากับ 0.028 และ
0.014 ชั่วโมง-1 ตามลําดับ ยกเวนยีสตรหัส YKM010 และ YL008 (แยกจากลูกแปงขาวหมาก
และลูกแปงเหลา จากตลาดนนทบุรี อ. เมือง จ. นนทบุรี) มีอัตราการเจริญจําเพาะสูงที่สุดใน
อาหารที่มีคาพีเอชเริ่มตน 4.5 และพบวาทุกไอโซเลทเมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีพีเอช 3.0 3.5 4.0
และ 4.5 จะเจริญไดชากวา S. cerevisiae RIT I จากการที่ S. fibuligera เ จริญไดชากวาจึงนาจะ
เปนอีกสาเหตุหนึ่ง ที่ตรวจพบยีสตชนิดนีไ้ ดนอยกวายีสต S. cerevisiae หลังจากหมักขาวไปแลว
ประมาณ 2-4 วัน ซึ่งชวงนีร้ าจะมีการสรางกรดออกมาและทําใหขาวมีพีเอชอยูในชวง 3.5-4.5

ต ร ์
าส
ษตรศ
ัย เก
าล
ิาวทย
มห
ิจ ิทัล
า ม รู้ด
คัลงคว
 84
0.0

การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

-0.5
-1.0
ก)
-1.5
-2.0
-2.5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.0
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

-0.5
-1.0
ข)
-1.5
-2.0
-2.5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.0
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

-0.5
-1.0
ค)
ต ร ์ -1.5

ร ศ าส
-2.0
ต -2.5
ัย เกษ
าล 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ิาวทย
ห 0.0
ลั ม
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

ู ด
้ จ
ิ ิท -0.5

ว ามร ง)
-1.0
ลัง ค -1.5 YKM001
ค YKM007
YKM017
-2.0
YL013
-2.5 YL014
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 21 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM001,

YKM007, YKM017, YL013 และ YL014 ในอาหารที่มีคาพีเอชเริ่มตนตางกัน
ก) พีเอช 3.0 ค) พีเอช 4.0
ข) พีเอช 3.5 ง) พีเอช 4.5
 85

0.0

การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

-0.5
-1.0
ก) -1.5
-2.0
-2.5
-3.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.0
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

-0.5
-1.0
ข) -1.5
-2.0
-2.5
-3.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
nm)
610nm)

0.0
OD610

-0.5
(logOD

-1.0
ของยีสสตต(log

ค) -1.5
์
ต ร
าส
ญญของยี

-2.0
ตรศ -2.5
การเจริ

ษ
การเจริ

ัย เก -3.0
าล
ิาวทย 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

มห 0.0
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

ิจ ิทัล -0.5
า ม รู้ด -1.0

คัลงคว ง) -1.5
YKM005
-2.0 YKM010
-2.5 YKM043
YL007
-3.0 YL008
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 22 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM005,
YKM010, YKM043, YL007 และ YL008 ในอาหารที่มคี าพีเอชเริ่มตนตางกัน
ก) พีเอช 3.0 ค) พีเอช 4.0
ข) พีเอช 3.5 ง) พีเอช 4.5
 86

0.0

การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

-0.5
-1.0
ก) -1.5
-2.0
-2.5
-3.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.0
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

-0.5
-1.0
ข) -1.5
-2.0
-2.5
-3.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.0
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

-0.5
-1.0
ค) -1.5
ต
-2.0 ร ์
าส
ตรศ
-2.5
เก ษ -3.0
าลัย
ิาวทย 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ห 0.0
ลั ม
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

ู ด
้ จ
ิ ิท -0.5

ว ามร -1.0
ค ง) -1.5
คลัง -2.0
YKM015
YKM022
-2.5 YKM031
YL009
-3.0 YL025
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 23 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลุกแปงเหลา รหัส YKM015,
YKM022, YKM031, YL009 และ YL025 ในอาหารที่มีคาพีเอชเริ่มตนตางกัน
ก) พีเอช 3.0 ค) พีเอช 4.0
ข) พีเอช 3.5 ง) พีเอช 4.5
 87
0.0

การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

-0.5
-1.0
ก) -1.5
-2.0
-2.5
-3.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.0
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

-0.5
-1.0
ข) -1.5
-2.0
-2.5
-3.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.0
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

-0.5
-1.0
ค) -1.5
ต
-2.0 ร ์
าส
ษตรศ -2.5

ัย เก -3.0
าล
ิาวทย 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ห 0.0
ลั ม
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

ู ด
้ จ
ิ ิท -0.5

ว ามร -1.0

ลัง ค ง) -1.5 YKM035

ค -2.0 YL026
YL028
-2.5 YL031
-3.0 YL049

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 24 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM035,
YL026, YL028, YL031 และ YL049 ในอาหารที่มีคา พีเอชเริ่มตนตางกัน
ก) พีเอช 3.0 ค) พีเอช 4.0
ข) พีเอช 3.5 ง) พีเอช 4.5
 88

0.03

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.02

YKM001
0.01 YKM007
YKM017
YL013
0.00 YL014

3.0 3.5 4.0 4.5

pH
ภาพที่ 25 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงเหลารหัส YKM001, YKM007, YKM017, YL013 และ YL014 เมื่อเลี้ยงใน
อาหารที่มีคาพีเอชเริ่มตนตางกัน

ต ร ์
าส
ษตรศ
ัย เก
าล 0.03
ิาวทย
อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

มห
ิจิทัล 0.02

ว ามร้ดู YKM005
ลัง ค 0.01 YKM010
ค YKM043
YL007
0.00 YL008

3.0 3.5 4.0 4.5

pH
ภาพที่ 26 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงเหลารหัส YKM005, YKM010, YKM043, YL007 และ YL008 เมื่อเลี้ยงใน
อาหารที่มีคาพีเอชเริ่มตนตางกัน
 89

0.03

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.02

YKM015
0.01 YKM022
YKM031
YL009
0.00 YL025
3.0 3.5 4.0 4.5
pH
ภาพที่ 27 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงเหลา รหัส YKM015, YKM022, YKM031, YL009 และ YL025 เมื่อเลี้ยงใน
อาหารที่มีคาพีเอชเริ่มตนตางกัน

ต ร ์
าส
ษตรศ
ัย เก 0.03
าล
ิาวทย
อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

มห
ิจ ิทัล 0.02

า ม รู้ด
ัลงคว
YKM035
0.01 YL026
ค YL028
YL031
0.00 YL049

3.0 3.5 4.0 4.5

pH

ภาพที่ 28 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงเหลา รหัส YKM035, YL026, YL028, YL031 และ YL049 เมื่อเลี้ยงในอาหาร
ที่มีคาพีเอชเริ่มตนตางกัน
 90

ผลการทดลองที่ไดสอดคลองกับการศึกษาของ Heard and Fleet (1988) ที่รายงานวา

อัตราการเจริญ และอัตราการหมักโดย S. cerevisiae จะลดลงเมื่อพีเอชลดลงจาก 4 ไปเปน 3
และการทดลองของ Charoenchai et al. (1998) ซึ่งทดลองเลี้ยงยีสตในอาหารสังเคราะหเลียนแบบ
น้ําองุนโดยปรับพีเอชเริ่มตน 3 ระดับ คือ 3.0 3.5 และ 4.0 พบวา การเปลีย่ นแปลงของพีเอช
จาก 3.5 มาเปน 3.0 มีผลทําใหอัตราการเจริญของยีสตและผลไดของเซลลลดลง และพบวายีสต
ชนิดอื่นก็มแี นวโนมเชนเดียวกัน

2.3 ผลของปริมาณน้ําตาลกลูโคสตอการเจริญของยีสต

ยีสตแตละชนิดสามารถเจริญในอาหารที่มีความเขมขนของน้ําตาลในระดับตาง ๆ ได
ตางกัน ความเขมขนของน้าํ ตาลที่สูงเกินไปอาจทําใหการเจริญของยีสตหยุดชะงักลงได ในชวง
แรกของการหมักสาโทปริมาณน้ําตาลจะเพิม่ สูง เนื่องจากกิจกรรมของเอนไซมอมัยเลสจากราและ
ยีสต Saccharomycopsis fibuligera เปลี่ยนแปงในขาวไปเปนน้ําตาล หลังจากนัน้ ประมาณ 3-4
วัน จะมีการผาน้ําหรือเติมน้าํ ลงไปปริมาณน้ําตาลที่สูงจะถูกเจือจางลง อยางไรก็ตามในชวงดังกลาว
ยีสต Saccharomyces cerevisiae จะมีบทบาทในการหมักแอลกอออลและเมื่อความเขมขนของ
แอลกอฮอลสูงขึ้นในระดับหนึ่ง ยีสตร์ S. fibuligera ก็จะตายไปในที่สุด ดังนั้นในการศึกษาผล
ของปริมาณน้าํ ตาลกลูโคสตอการเจริ า ส ตญของยีสต จึงพิจารณาในชวงทีม่ ีการหมักขาวใหเปนน้ําตาล
ตร ศ
เก ษ
ัย
จากการเลีิท้ยยงยีาลสตในอาหาร yeast extract broth ที่มีความเขมขนของน้าํ ตาลกลูโคสตางกัน
3 ระดับ คือมห100 าว 200 และ 300 กรัมตอลิตร เปนเวลา 14 วัน วิเคราะหการเจริญของยีสตจาก
ัล
ความขุู้ดนิจทีิท่เพิ่มขึ้น โดยเปรียบเทียบยีสตที่แยกจากลูกแปงแหลงเดียวกัน ใหผลการทดลองมี
า มร ยดดังนี้
รายละเอี
ว
ค
คลัง
การเจริญของยีสต S. cerevisiae RIT I เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของกลูโคส
ตางกัน มีลกั ษณะคลายกัน(ภาพที่ 29) คือไมพบระยะ lag phase ใชเวลาในชวง log phase
ประมาณ 24 ชั่วโมง ยีสตจะมีการเจริญถึงระยะ stationary phase ในวันที่ 2-วันที่ 3 ของการ
เพาะเลี้ยง จากการคํานวณหาอัตราการเจริญจําเพาะ เมือ่ เลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของกลูโคส
100 และ 200 กรัมตอลิตร ยีสตมีอัตราการเจริญใกลเคียงกัน คือ 0.028 และ 0.029 ชั่วโมง-1
ตามลําดับ(ตารางที่ 8 และภาพที่ 30) เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีกลูโคส 300 กรัมตอลิตร มีอัตราการ
เจริญลดลง คือ 0.024 ชั่วโมง-1 เมื่อพิจารณาเวลาทวีคูณ(ตารางที่ 8) อาหารที่มีกลูโคส 200 กรัม
 91

ตอลิตร ใชเวลาในการเพิ่มจํานวนเซลลเปนสองเทานอยที่สุด คือ 0.99 ชั่วโมง อาหารที่มีกลูโคส

100 และ 300 กรัมตอลิตรใชเวลามากกวา คือ 1.02 และ 1.19 ชั่วโมง ตามลําดับ

0.3

การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

0.1
-0.1
-0.3
-0.5
-0.7 100 กรัม/ลิตร
-0.9 200 กรัม/ลิตร
300 กรัม/ลิตร
-1.1
0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 29 การเจริญของ S. cerevisiae RITI เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของกลูโคสตางกัน

ต ร ์
0.05รศ าส
ษ ต
อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

ัย เก 0.04
าล
ิาวทย 0.03
ห
ิทลั ม 0.02
ู ด
้ จ
ิ
ว ามร 0.01
ลัง ค RIT I
ค 0.00
100 200 300
กลูโคส (กรัมตอลิตร)

ภาพที่ 30 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของ S. cerevisiae RIT I เมื่อเลี้ยงในอาหาร

ที่มีความเขมขนของกลูโคสตางกัน
 92

ตารางที่ 8 อัตราการเจริญจําเพาะ(specific growth rates) และเวลาทวีคณ

ู (doubling times) ของ
ยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลาจากแหลงตาง ๆ เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มี
ความเขมขนของกลูโคสตางกัน

อัตราการเจริญจําเพาะ(ชั่วโมง-1) เวลาทวีคณ
ู (ชัว่ โมง)
สายพันธุ กลูโคส 100 กลูโคส 200 กลูโคส 300 กลูโคส 100 กลูโคส 200 กลูโคส 300
(กรัม/ลิตร) (กรัม/ลิตร) (กรัม/ลิตร) (กรัม/ลิตร) (กรัม/ลิตร) (กรัม/ลิตร)

RIT I 0.028 0.029 0.024 24.58 23.87 28.59

YKM001 0.005 0.003 0.002 147.32 260.28 394.12
YKM005 0.004 0.004 0.003 159.77 183.78 255.48
YKM007 0.004 0.003 0.003 170.24 216.28 262.75
YKM010 0.004 0.004 0.002 159.92 168.17 315.00
YKM015 0.004 0.003 0.003 179.81 233.60 205.84
YKM017 0.005 0.003 0.003 131.69 243.51 250.48
YKM022 0.007 0.004ร์ 0.002 96.75 190.08 340.82
า ส ต
YKM031 0.004 0.004
รศ 0.004 156.91 175.81 178.84
YKM035 ษต
0.005 เก 0.003 0.003 150.52 200.14 267.40
YKM043 ย
0.005 าลัย 0.002 0.002 140.59 299.14 368.78
า ว ิท
YL007 มห 0.004 0.003 0.003 168.34 234.92 221.17
ัิทล
YL008ู้ดิจ 0.004 0.004 0.003 161.32 180.39 252.00
า ม ร
ง
ั คว
YL009 0.004 0.003 0.003 183.78 227.52 206.61
คล YL013 0.010 0.005 0.004 71.38 126.86 197.30
YL014 0.004 0.003 0.003 164.51 219.42 259.88
YL025 0.004 0.004 0.002 166.82 170.58 280.95
YL026 0.004 0.002 0.002 166.49 294.37 347.22
YL028 0.004 0.003 0.002 158.40 214.61 299.14
YL031 0.004 0.003 0.003 154.29 207.64 199.19
YL049 0.005 0.003 0.003 148.63 250.11 275.82
 93

การเจริญของยีสต S. fibuligera ทั้ง 20 ไอโซเลท ใหลักษณะการเจริญที่คลายกัน (ภาพ

ที่ 31 ถึงภาพที่ 34) เมื่อเลีย้ งในอาหารทีม่ ีความเขมขนของกลูโคสตางกัน แมวายีสตเหลานี้จะแยก
มาจากลูกแปงตางชนิดกันและตางพื้นที่ เมื่อนําไปเลีย้ งในอาหารทีม่ ีความเขมขนของกลูโคสมาก
ขึ้น ยีสตสวนใหญระยะ lag phase ยีสตใชเวลาในชวงการเจริญแบบเอกซโพเนนเชียลนานขึน้
และมีอัตราการเจริญลดลง (ภาพที่ 35 ถึงภาพที่ 38) โดยในอาหารที่มีความเขมขนของกลูโคส
100 กรัมตอลิตร ยีสตจะมีอัตราการเจริญสูงที่สุดและใชเวลาในการเพิ่มจํานวนเซลลเปนสองเทา
สั้นที่สุด โดยไอโซเลทที่มีอัตราการเจริญจําเพาะสูงที่สดุ เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
กลูโคส 100 กรัมตอลิตร คือ YL013 (แยกจากลูกแปงเหลา ตลาดสามแยกเกษตร เขตจตุจักร
กทม.) โดยมีอัตราการเจริญจําเพาะเทากับ 0.010 ชั่วโมง-1 เมื่อเปรียบเทียบการเจริญกับ S.
cerevisiae RIT I พบวา S. fibuligera ทั้ง 20 ไอโซเลท สามารถเจริญไดชากวาในทุกความ
เขมขนของกลูโคส จึงนาเปนสาเหตุหนึ่งที่ตรวจพบยีสตชนิดนี้ไดนอยกวา S. cerevisiae หลังจาก
หมักขาวดวยลูกแปงไปแลว 2-3 วัน ซึ่งความเขมขนของน้ําตาลกลูโคสที่เกิดขึ้นมักจะมีในปริมาณ
สูง นอกเหนือจากความสามารถในการทนตอแอลกอฮอลที่สูงขึ้นและคาพีเอชที่ลดต่ําลง ยีสตที่
ปรับตัวในสภาพดังกลาวไดดีที่สุดจึงสามารถเจริญตอไปได

ต ร ์
าส
ษตรศ
ัย เก
าล
ิาวทย
มห
ิจ ิทัล
า ม รู้ด
คัลงคว
 94

0.0

การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

-0.3
-0.6
ก)
-0.9
-1.2
-1.5
0 2 4 6 8 10 12 14
0.0
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

-0.3
-0.6
ข)
-0.9
-1.2
-1.5
0 2 4 6 8 10 12 14
0.0
์
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

ต ร
-0.3าส
ร ศ
ต -0.6
เก ษ
ค) าลัย
ิาวทย -0.9 YKM001
YKM007
มห -1.2 YKM017
ิจ ิทัล YL013

า ม รู้ด -1.5
YL014

คัลงคว 0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 31 การเจริญของ ยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM001,

YKM007, YKM017, YL013 และ YL014 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
กลูโคสตางกัน
ก) กลูโคส 100 กรัมตอลิตร
ข) กลูโคส 200 กรัมตอลิตร
ค) กลูโคส 300 กรัมตอลิตร
 95

0.0

การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

-0.3
-0.6
ก)
-0.9
-1.2
-1.5
0 2 4 6 8 10 12 14
0.0
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

-0.3
-0.6
ข)
-0.9

-1.2
-1.5
0 2 4 6 8 10 12 14
0.0
์
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

ต ร
-0.3าส
ษต-0.6ศ
ร
ัย เก
ค) าล
ิาวทย -0.9 YKM005
YKM010
มห YKM043
ิทัล
-1.2
YL007
รู้ดิจ YL008
า ม -1.5

คัลงคว 0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 32 การเจริญของ ยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM005,
YKM010, YKM043, YL007 และ YL008 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
กลูโคสตางกัน
ก) กลูโคส 100 กรัมตอลิตร
ข) กลูโคส 200 กรัมตอลิตร
ค) กลูโคส 300 กรัมตอลิตร
 96

0.0

การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

-0.3
-0.6
ก)
-0.9
-1.2
-1.5
0 2 4 6 8 10 12 14

0.0
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

-0.3
-0.6
ข)
-0.9
-1.2
-1.5
0 2 4 6 8 10 12 14

0.0าสต
ร์
ตร-0.3ศ
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

เก ษ
าลัย
ท
ิ ย -0.6
ค)หาว
ลั ม -0.9 YKM015
ู้ดิจิท
YKM022
า มร -1.2 YKM031
YL009
ว
ลังค
YL025
-1.5
ค
0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 33 การเจริญของ ยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM015,
YKM022, YKM031, YL009 และ YL025 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
กลูโคสตางกัน
ก) กลูโคส 100 กรัมตอลิตร
ข) กลูโคส 200 กรัมตอลิตร
ค) กลูโคส 300 กรัมตอลิตร
 97

การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

0.0
-0.3
-0.6
ก)
-0.9
-1.2
-1.5
0 2 4 6 8 10 12 14
0.0
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

-0.3

-0.6
ข)
-0.9

-1.2

-1.5
0 2 4 6 8 10 12 14
0.0
ต ร ์
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

าส
ษตร-0.3ศ
ัย เก -0.6
ค)
ว ิทยาล
ห า -0.9 YKM035
ิทลั ม YL026
ู ด
้ จ
ิ -1.2 YL028

ว ามร YL031
YL049
ลัง ค -1.5
ค 0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 34 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM035,
YL026, YL028, YL031 และ YL049 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
กลูโคสตางกัน
ก) กลูโคส 100 กรัมตอลิตร
ข) กลูโคส 100 กรัมตอลิตร
ค) กลูโคส 300 กรัมตอลิตร
 98

0.015

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.010

YKM001
0.005 YKM007
YKM017
YL013
0.000 YL014

100 200 300

กลูโคส (กรัมตอลิตร)

ภาพที่ 35 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงเหลา รหัส YKM001, YKM007, YKM017, YL013 และ YL014 เมื่อเลี้ยงใน
อาหารที่มีความเขมขนของกลูโคสตางกัน

0.015
์
อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

ต ร
าส
ษ ตรศ
0.010
เ ก
า ลัย YKM005

ห วา ิทย 0.005 YKM010

YKM043
ม YL007
ิจ ิทัล YL008
า ม รู้ด 0.000

คัลงคว 100 200 300

กลูโคส (กรัมตอลิตร)

ภาพที่ 36 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงเหลา รหัส YKM005, YKM010, YKM043, YL007 และ YL008 เมื่อเลี้ยงใน
อาหารที่มีความ เขมขนของ กลูโคสตางกัน
 99
0.015

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.010

YKM015
0.005 YKM022
YKM031
YL009
0.000 YL025

100 200 300

กลูโคส (กรัมตอลิตร)

ภาพที่ 37 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงเหลา รหัส YKM015, YKM022, YKM031, YL009 และ YL025 เมื่อเลี้ยงใน
อาหารที่มีความเขมขนของกลูโคสตางกัน

ต ร ์
ศ
ร าส
เ ษต
0.015
ก
อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

ล ย
ั
ว ิทยา 0.010
ห า
ัล ม
ิู้ดจิท YKM035
ว า มร 0.005 YL026
ลังค
YL028
ค YL031
0.000 YL049
100 200 300
กลูโคส (กรัมตอลิตร)

ภาพที่ 38 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงเหลา รหัส YKM035, YL026, YL028, YL031 และ YL049 เมื่อเลี้ยงในอาหาร
ที่มีความขมขนของกลูโคสตางกัน
 100

ผลการทดลองที่ได สอดคลองกับการศึกษาของ Charoenchai et al. (1998) ที่รายงานวา

อัตราการเจริญจําเพาะ และมวลเซลลสูงสุด (maximum cell biomass) ของไวนยีสตจะลดลง เมื่อ
เพิ่มความเขมขนของน้ําตาลจาก 200 กรัมตอลิตร เปน 300 กรัมตอลิตร ยกเวน S. cerevisiae
HB350 อัตราการเจริญจําเพาะมีแนวโนมคงที่ การที่ยสี ตมีการเจริญในอาหารที่มีความเขมขนของ
น้ําตาลสูง ๆ ลดลง เนื่องจากความเขมขนของน้ําตาลที่สูงขึ้นจะไปยับยั้งการเจริญของยีสต การ
ยับยั้งสวนหนึง่ เกิดจากแรงดันออสโมซิสที่เพิ่มมากขึ้น ทําใหเซลลยีสตเกิดการหดตัว (plasmolysis)
และตายในที่สดุ จํานวนเซลลที่มีชีวิต (cell viability) จึงลดลง

โดยปกติแลวความเขมขนของน้ําตาลต่ําสุด ที่ทําใหเซลลยีสตเกิดการออสโมซิส คือ 14

เปอรเซ็นต (สาวิตรี, 2540) บางรายงานไดรายงานวา ความเขมขนของน้ําตาลที่สูงเกินไป จะทําให
ระยะเวลาในการแตกหนอและระยะเวลาในการหมักนานขึ้น (Nishino et al., 1985) นอกจากนีย้ ัง
ทําใหความสามารถในการทนตอเอธานอลลดลง ขณะเดียวกันยีสตตอ งการระยะ lag phase นาน
ขึ้น อัตราการเจริญและประชากรเซลลลดลง

2.4 ผลของเอธานอลตอการเจริญและการอยูรอดของยีสต

ต ร ์
2.4.1 ผลของเอธานอลต
ร ศ าส อการเจริญของยีสต
เ ก ษต
ย าลเนืัย ่องจากในระหวางการหมักขาวโดยราและยีสต จะมีเอธิลแอลกอฮอลเกิด
วิทา ญของ Saccharomycopsis fibuligera ไดแตกตางกัน ยีสตดงั กลาวสามารถ
ขึ้นซึ่งสงผลตมอหการเจริ
จ
ิ
ทนตอู้ดระดัิทัลบแอลกอฮอลไดไมสูงนัก ดังนัน้ ในการศึกษานี้จึงศึกษาถึงผลของเอธานอลตอการเจริญ
า
โดยใช
ว มร ระดับของเอธานอลตางกัน 4 ระดับ (อาจพบไอโซเลทที่สามารถเจริญไดในระดับเอธานอล
ค
คลังสูง ๆ ได) ที่อุณหภูมิตางกัน เนื่องจากมีการศึกษากอนหนานี้พบวา ความทนทานตอเอธานอลของ
ยีสตหลายชนิดขึ้นกับอุณหภูมิเปนปจจัยสําคัญ จากการเลี้ยงยีสตในอาหารเหลว yeast extract
glucose ที่ปรับใหมีความเขมขนของเอธานอลตางกัน 4 ระดับ คือ 0 5 10 และ 15 เปอรเซ็นต
(ปริมาตรตอปริมาตร) และนําไปบมที่อุณหภูมิตางกัน คือ 10 20 และ 30 องศาเซลเซียส เปน
เวลา 20 วัน วิเคราะหการเจริญของยีสตจากความขุน ทีเ่ พิ่มขึ้น โดยเปรียบเทียบยีสตที่แยกจากลูก
แปงแหลงเดียวกัน ใหผลการทดลองมีรายละเอียดดังนี้
 101

การเจริญของ S.accharomyces cerevisiae RIT I ในอาหารที่มีความเขมขนของเอธานอล

0 5 10 และ 15 เปอรเซ็นต (ปริมาตรตอปริมาตร) และนําไปบมที่อุณหภูมิ 10 20 และ 30
องศาเซลเซียส ใหผลการทดลองแสดงดังภาพที่ 39 โดยยีสตสามารเจริญไดดีในอาหารที่มี
เอธานอล 0 และ 5 เปอรเซ็นต แตในอาหารที่มีเอธานอล 10 และ 15 เปอรเซ็นต ยีสตสามารถ
เจริญไดเล็กนอย (ใหลักษณะเดียวกันทั้ง 3 อุณหภูมิ) จากการคํานวณหาอัตราการเจริญจําเพาะ
(ตารางที่ 9-ตารางที่ 11 และภาพที่ 40) พบวา ถาความเขมขนของเอธานอลสูงขึ้นอัตราการเจริญ
ของยีสตจะลดลง โดยเมื่อเลี้ยงในอาหารทีม่ ีเอธานอล 0 และ 5 เปอรเซ็นต ยีสตจะมีอัตราการ
เจริญใกลเคียงกัน และถาเลี้ยงในอาหารทีม่ ีเอธานอล 10 และ 15 เปอรเซ็นต ยีสตจะมีอัตราการ
เจริญลดลงและมีคาใกลเคียงกันดวย เมื่อพิจารณาผลของอุณหภูมิพบวา การบมที่อุณหภูมิสูงยีสต
จะเจริญไดดีกวาที่อุณหภูมิตา่ํ และมีอัตราการเจริญจําเพาะสูงที่สุดเมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีเอธานอล
0 เปอรเซ็นต และนําไปบมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส โดยมีคา อัตราการเจริญจําเพาะเทากับ
0.029 ชั่วโมง-1 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีเอธานอล 5 เปอรเซ็นต อัตราการเจริญจําเพาะจะลดลง
ประมาณ 1.3 เทา โดยมีคาเทากับ 0.023 ชั่วโมง-1 สวนอาหารที่มีเอธานอล 10 และ 15
เปอรเซ็นต ยีสตจะมีอัตราการเจริญจําเพาะลดลงหลายเทา โดยมีคาเทากับ 0.004 และ 0.001
ชั่วโมง-1 ตามลําดับ(มากกวาที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส ประมาณ 1.39 1.04 6.53 และ 0.69
เทา ตามลําดับ) ร์
า ส ต
รศ
เ ก ษต
า ลัย
ิา ทย
ว
มห
ัล
ร ิู้ดจิท
ว า ม
คลังค
 102

0.5

การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
ก)
-1.0
-1.5
-2.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

0.5
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
ข)
-1.0
-1.5
-2.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
ต ร ์
ศาส
0.5 ษตร
เก
การเจริญของยี สต (log OD 610 nm)

า ล ย
ั
0.0
ิา ทย -0.5
ว
ค) มห เอธานอล 0 %
ท
ิ ัล -1.0
เอธานอล 5 %
รู้ด จ
ิ
ม -1.5 เอธานอล 10 %
ว า เอธานอล 15 %
คลังค -2.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 39 การเจริญของ S. cerevisiae RIT I เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของเอธานอล

ตางกันและบมที่อุณหภูมติ างกัน
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 103

ตารางที่ 9 อัตราการเจริญจําเพาะ(specific growth rates) และเวลาทวีคณ

ู (doubling times) ของ
ยีสตที่แยกจากลูกแปงเหลาและลูกแปงขาวหมากจากแหลงตาง ๆ เมื่อเลี้ยงในอาหารที่
มีความเขมขนของเอธานอลตางกัน และนําไปบมที่อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส

อัตราการเจริญจําเพาะ(ชั่วโมง-1) เวลาทวีคณ
ู (ชัว่ โมง)
สายพันธุ
0% 5% 10 % 15 % 0% 5% 10 % 15 %

RIT I 0.016 0.014 0.003 0.001 42.45 50.25 257.06 660.00

YKM001 0.009 0.004 0.004 0.002 74.08 167.16 179.22 404.67
YKM005 0.008 0.003 0.003 0.001 86.13 208.94 227.52 627.62
YKM007 0.009 0.006 0.003 0.001 77.43 116.72 234.58 504.00
YKM010 0.010 0.005 0.002 0.001 67.97 144.75 441.17 548.91
YKM015 0.007 0.003 0.005 0.001 93.28 229.41 142.15 577.50
YKM017 0.011 0.005 0.002 0.001 60.37 136.10 456.92 695.90
YKM022 0.012 0.005 0.005
ต ร ์ 0.001 57.69 152.17 150.24 1052.66
YKM031 0.008 0.005 รศา0.001 ส 0.002 88.80 148.90 602.61 462.00
YKM035 0.008 0.006 เ ก ษต 0.001 0.001 92.25 114.31 536.52 752.58
ัย
YKM043 0.006ิทยาล0.003 0.002 0.001 113.2 246.77 362.35 799.62
YL007 ม0.008 หาว 0.002 0.002 0.000 83.49 319.23 344.35 10395.00
ัล
YL008ู้ดิจิท 0.013 0.005 0.004 0.001 54.82 142.52 185.63 543.53
ว า
YL009มร 0.008 0.004 0.002 0.002 84.90 186.67 329.35 444.71
ค
คลังYL013 0.012 0.005 0.001 0.001 58.67 130.65 984.14 681.64
YL014 0.008 0.003 0.002 0.001 86.81 217.13 389.51 701.77
YL025 0.013 0.004 0.005 0.001 53.46 155.15 130.34 662.63
YL026 0.012 0.005 0.005 0.001 57.29 128.33 131.58 687.27
YL028 0.007 0.004 0.003 0.001 101.4 173.79 236.25 777.20
YL031 0.009 0.006 0.004 0.002 77.87 113.07 160.39 292.82
YL049 0.007 0.004 0.004 0.001 99.12 187.09 177.69 556.25
 104

ตารางที่ 10 อัตราการเจริญจําเพาะ(specific growth rates) และเวลาทวีคณ

ู (doubling times) ของ
ยีสตที่แยกจากลูกแปงเหลาและลูกแปงขาวหมากจากแหลงตาง ๆ เมื่อเลี้ยงในอาหาร
ที่มีความเขมขนของเอธานอลตางกัน และนําไปบมที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส

อัตราการเจริญจําเพาะ(ชั่วโมง-1) เวลาทวีคณ
ู (ชัว่ โมง)
สายพันธุ
0% 5% 10 % 15 % 0% 5% 10 % 15 %

RIT I 0.021 0.022 0.001 0.002 33.10 32.08 1196.55 455.67

YKM001 0.009 0.006 0.004 0.002 77.04 111.85 197.53 339.43
YKM005 0.009 0.008 0.004 0.001 80.93 89.90 166.99 538.25
YKM007 0.008 0.008 0.004 0.003 87.03 90.69 161.48 208.94
YKM010 0.012 0.008 0.004 0.002 58.81 89.95 159.31 322.95
YKM015 0.008 0.007 0.003 0.003 91.89 97.89 203.57 228.15
YKM017 0.012 0.007 0.002 0.003 59.66 101.72 316.20 248.98
YKM022 0.011 0.005 0.002
ต ร ์ 0.003 63.75 128.33 304.62 250.48
YKM031 0.009 0.007รศาส 0.003 0.003 75.53 93.02 248.61 201.60
YKM035 0.013 0.006 เ ก ษต 0.002 0.001 55.42 120.52 390.42 492.07
ัย
YKM043 0.011ิทยาล 0.008 0.002 0.002 60.66 83.96 341.52 351.63
YL007 ม0.008 หาว 0.004 0.002 0.002 85.25 177.69 306.86 356.15
ัล
YL008ู้ดิจิท 0.010 0.008 0.002 0.002 68.19 84.08 345.78 293.33
ว า
YL009มร 0.008 0.006 0.003 0.002 86.31 123.57 243.16 350.89
ง
ั ค
คล YL013 0.011 0.008 0.002 0.002 64.57 86.44 400.77 348.68
YL014 0.011 0.005 0.003 0.002 61.58 146.67 274.00 405.66
YL025 0.009 0.004 0.002 0.001 81.05 190.08 400.77 529.68
YL026 0.012 0.007 0.001 0.003 59.53 100.31 499.46 232.94
YL028 0.007 0.008 0.003 0.002 95.53 89.37 277.20 373.75
YL031 0.007 0.004 0.002 0.002 97.78 154.29 403.69 360.00
YL049 0.010 0.008 0.002 0.002 69.94 87.49 406.65 329.35
 105

ตารางที่ 11 อัตราการเจริญจําเพาะ(specific growth rates) และเวลาทวีคณ

ู (doubling times) ของ
ยีสตที่แยกจากลูกแปงเหลาและลูกแปงขาวหมากจากแหลงตาง ๆ เมื่อเลี้ยงในอาหาร
ที่มีความเขมขนของเอธานอลตางกัน และนําไปบมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส

อัตราการเจริญจําเพาะ(ชั่วโมง-1) เวลาทวีคณ
ู (ชัว่ โมง)
สายพันธุ
0% 5% 10 % 15 % 0% 5% 10 % 15 %

RIT I 0.029 0.023 0.004 0.001 23.76 30.75 183.37 660.00

YKM001 0.013 0.007 0.001 0.000 53.63 99.41 504.00 5940.00
YKM005 0.022 0.009 0.000 0.002 31.18 73.30 1956.71 433.13
YKM007 0.019 0.008 0.002 0.003 36.12 88.66 330.66 204.32
YKM010 0.021 0.009 0.000 0.001 32.71 76.79 2818.98 587.70
YKM015 0.024 0.007 0.003 0.001 28.90 95.15 228.78 984.14
YKM017 0.020 0.007 0.004 0.002 34.41 100.01 165.99 389.51
YKM022 0.021 0.007 0.005 ์ 0.000 32.43 102.29 130.55 23760.00
ต ร
YKM031 0.022 0.007 ศาส0.005 0.000 31.76 100.50 138.02 2053.33
YKM035 0.021 0.007 ษตร 0.004 0.000 33.26 106.14 182.77 7231.30
ล ย
ั เก
YKM043 0.025 ยา 0.007 0.001 0.001 27.96 97.15 472.50 880.00
า ว ิท
YL007 ม0.020 ห 0.007 0.000 0.001 35.39 103.56 1614.76 594.00
YL008 ิจิทัล 0.022 0.007 0.003 0.003 31.92 98.65 250.11 249.73
า
YL009ม รู้ด 0.018 0.008 0.000 0.000 38.08 86.94 2558.77 5365.16
ง
ั คว
คล YL013 0.020 0.008 0.002 0.000 34.26 88.33 344.35 1540.00
YL014 0.020 0.006 0.003 0.003 35.39 124.12 252.38 264.00
YL025 0.019 0.007 0.004 0.001 36.71 106.48 190.08 756.00
YL026 0.022 0.008 0.003 0.000 31.48 88.37 210.00 3261.18
YL028 0.027 0.011 0.003 0.001 26.12 63.87 200.14 1026.67
YL031 0.022 0.010 0.009 0.000 31.33 68.87 78.86 3394.29
YL049 0.018 0.007 0.002 0.001 38.04 93.65 363.94 924.00
 106

0.035

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.025

0.015
เอธานอล 0 %
0.005 เอธานอล 5 %
เอธานอล 10 %
เอธานอล 15 %
-0.005
10 20 30
อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)

ภาพที่ 40 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของ S. cerevisiae RIT I เมื่อเลี้ยงในอาหาร

ที่มีความเขมขนของเอธานอลตางกันและบมที่อุณหภูมติ างกัน

การเจริญของยีสต S. fibuligera ทั้ง 20 ไอโซเลท ใหลักษณะการเจริญที่คลายกันในทุก

สภาวะการทดลอง (ภาพที่ 41 ถึงภาพที่ 52) แมวายีสตเหลานี้จะแยกมาจากลูกแปงตางชนิดกัน
และตางพื้นที่ ยีสตจะเจริญไดดีในอาหารที ์ ่มีความเขมขนของเอธานอลต่ํา (0 และ 5 เปอรเซ็นต)
ต ร
ในอาหารที่มีความเขมขนของเอธานอล
ร ศ าส 10 และ 15 เปอรเซ็นต ยีสตสามารถเจริญไดประมาณ
12-48 ชัว่ โมง แลวจะตายไปในที
เ ก ษต ่สุด ทําใหไมมกี ารเจริญของเซลลในระยะหลังของการเพาะเลีย้ ง
ัย
คาความขุนที่วดั ไดจยึงามีลแนวโนมคงที่ (เมื่อพิจารณาจากกราฟการเจริญของยีสตพบวา ในอาหารทีม่ ี
า ว ิท
ความเขมขนของเอธานอล ห 10 และ 15 เปอรเซ็นต กราฟมีแนวโนมลดต่ําลงในชวงทาย ๆ ของ
ม
ัลย้ งโดยเฉพาะเมื่ออุณหภูมิที่ใชบมต่ําลง เนื่องจากในอาหารที่มีเอธานอลสูงกวาและนําไป
การเพาะเลี
ู้ด จ
ิ ท
ิ
บวมาทีม่อร ุณหภูมติ ่ํา เมื่อระยะเวลาการเพาะเลี้ยงนานขึ้นเซลลจะมีการเจริญเปนกลุมกอนที่มีขนาดใหญ
ค
คลังกวาเมื่อเลีย้ งในอาหารที่มีเอธานอลต่ํากวาและนําไปบมที่อุณหภูมิสูงกวา ดังนัน้ ในชวงวัดความขุน
ตัวอยางที่มกี ารเจริญของเซลลเปนกลุมกอนที่มีขนาดใหญกวาจึงตกตะกอนไดเร็ว คาความขุนที่วัด
ไดจึงลดลง) เมื่อพิจารณาผลของอุณหภูมิ การบมที่อุณหภูมิสูงจะชวยใหยีสตทนเอธานอลไดดีขนึ้
และมีอัตราการเจริญสูงขึ้น (ภาพที่ 53 ถึงภาพที่ 62) และพบวาเมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขน
ของเอธานอลทุกระดับ และนําไปบมที่อณ ุ หภูมิ 10 และ 20 องศาเซลเซียส ยีสตจะมีอัตราการ
เจริญจําเพาะใกลเคียงกัน จากการเปรียบเทียบอัตราการเจริญจําเพาะกับ S. cerevisiae RIT I พบวา
เมื่อเลี้ยง S. fibuligera ทั้ง 20 ไอโซเลท ในอาหารที่มีความเขมขนของเอธานอล 0 และ 5
เปอรเซ็นต สามารถเจริญไดชากวา(ยกเวน YKM035 ในอาหารที่มีเอธานอล 0 เปอรเซ็นต มี
 107

อัตราการเจริญสูงกวา) แตเมือ่ เลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของเอธานอล 10 และ 15 เปอรเซ็นต

จะมีอัตราการเจริญจําเพาะใกลเคียงกัน ไอโซเลทที่มีอัตราการเจริญจําเพาะสูงที่สุด เมื่อเลี้ยงใน
อาหารที่มีเอธานอล 0 เปอรเซ็นต และนําไปบมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส คือ YL028 โดยมี
อัตราการเจริญจําเพาะเทากับ 0.027 ชั่วโมง-1 ไอโซเลทที่มีอัตราการเจริญจําเพาะต่ําสุด คือ
YKM001 โดยมีอัตราการเจริญจําเพาะเทากับ 0.013 ชั่วโมง-1 และไอโซเลทที่มีอัตราการเจริญ
จําเพาะสูงสุดและต่ําสุด เมือ่ เลี้ยงในอาหารที่มีเอธานอล 5 เปอรเซ็นต และนําไปบมที่อุณหภูมิ 30
องศาเซลเซียส คือ YL028 และ YL014 โดยมีอัตราการเจริญจําเพาะเทากับ 0.011 และ 0.006
ชั่วโมง-1 ตามลําดับ

ต ร ์
าส
ษตรศ
ัย เก
าล
ิาวทย
มห
ิจ ิทัล
า ม รู้ด
คัลงคว
 108

การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ก) -1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)
0.0
-0.5
-1.0
ข) -1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ค) -1.5
-2.0
-2.5
ต ร ์
าส 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
ษตรศ0.0
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

ัย เก
าล -0.5
ิาวทย -1.0
มห ง) -1.5
YKM001

ู้ดิจทิ ัล -2.0
YKM007
YKM017

า ม ร -2.5
YL013
YL014

คัลงคว 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 41 การเจริญของ ยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM001,

YKM007, YKM017, YL013 และ YL014 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกันและบมที่อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ก) เอธานอล 0 เปอรเซ็นต ค) เอธานอล 10 เปอรเซ็นต
ข) เอธานอล 5 เปอรเซ็นต ง) เอธานอล 15 เปอรเซ็นต
 109

การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ก) -1.5
-2.0
-2.5

การเจริญของยีสต (log OD610 nm) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

0.0
-0.5
-1.0
ข)
-1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ค) -1.5
-2.0
-2.5ต ร ์
าส
ษตรศ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
ัย เก
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

าล 0.0
ิาวทย -0.5
ห
ัิทล ม ง)
-1.0
YKM001
รู้ดิจ
-1.5
YKM007
ว า ม -2.0 YKM017
YL013

คลังค -2.5 YL014

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 42 การเจริญของ ยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM001,

YKM007, YKM017, YL013 และ YL014 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกันและบมที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ก) เอธานอล 0 เปอรเซ็นต ค) เอธานอล 10 เปอรเซ็นต
ข) เอธานอล 5 เปอรเซ็นต ง) เอธานอล 15 เปอรเซ็นต
 110

การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.5
0.0
-0.5
-1.0
ก) -1.5
-2.0
-2.5
-3.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm) 0.5
0.0
-0.5
-1.0
ข) -1.5
-2.0
-2.5
-3.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD610 nm)

0.5
0.0
-0.5
-1.0
ค) -1.5
-2.0
-2.5
-3.0
ต ร ์
าส 0
ตรศ
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

เก ษ
การเจริญของยีสต (log OD610 nm)

0.5
าลัย 0.0
ิา ทย
ว -0.5

มห ง) -1.0
-1.5 YKM001
ิจ ิทัล -2.0
YKM007
YKM017
า ม รู้ด -2.5 YL013
YL014
ัลงคว
-3.0
ค 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 43 การเจริญของ ยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM001,

YKM007, YKM017, YL013 และ YL014 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกันและบมทีอ่ ุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
ก) เอธานอล 0 เปอรเซ็นต ค) เอธานอล 10 เปอรเซ็นต
ข) เอธานอล 5 เปอรเซ็นต ง) เอธานอล 15 เปอรเซ็นต
 111

การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ก) -1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)
0.0
-0.5
-1.0
ข) -1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ค) -1.5
-2.0
-2.5
ต ร ์
าส
ษตรศ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

ัย เก
าล
การเจริญของยีสต (log AB 610 nm)

0.0
ิาวทย -0.5
ห
ัิทล ม ง) -1.0
YKM005
ู้ดิจ -1.5 YKM010

ว า มร -2.0
YKM043
YL007
ค
คลัง
-2.5 YL008

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 44 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลารหัส YKM005,

YKM010, YKM043, YL007 และ YL008 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกันและบมทีอ่ ุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ก) เอธานอล 0 เปอรเซ็นต ค) เอธานอล 10 เปอรเซ็นต
ข) เอธานอล 5 เปอรเซ็นต ง) เอธานอล 15 เปอรเซ็นต
 112

การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ก) -1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)
0.0
-0.5
-1.0
ข) -1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ค) -1.5
-2.0
-2.5
ต ร ์
าส
ตรศ
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
ษ
เก 0.0
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

าลัย
ิาวทย -0.5
ห -1.0
ัิทล ม ง) -1.5
YKM005
YKM010
รู้ดิจ -2.0 YKM043
า ม YL007
ัลงคว
-2.5 YL008
ค 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 45 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลารหัส YKM005,

YKM010, YKM043, YL007 และ YL008 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกันและบมทีอ่ ุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ก) เอธานอล 0 เปอรเซ็นต ค) เอธานอล 10 เปอรเซ็นต
ข) เอธานอล 5 เปอรเซ็นต ง) เอธานอล 15 เปอรเซ็นต
 113

การเจริญของยีสต (log OD610 nm)

0.5
0.0
-0.5
ก) -1.0
-1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)
0.5
0.0
-0.5
ข) -1.0
-1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD610 nm)

0.5
0.0
-0.5
ค) -1.0
-1.5
-2.0
-2.5
ต ร ์
าส
ษตรศ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

ัย เก
าล
การเจริญของยีสต (log OD610 nm)

0.5
ิาวทย 0.0
ห
ัิทล ม ง)
-0.5
-1.0 YKM005
ู้ดิจ YKM010
มร
-1.5
YKM043
คว า -2.0 YL007

คลัง
-2.5 YL008

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 46 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลารหัส YKM005,

YKM010, YKM043, YL007 และ YL008 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกันและบมทีอ่ ุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
ก) เอธานอล 0 เปอรเซ็นต ค) เอธานอล 10 เปอรเซ็นต
ข) เอธานอล 5 เปอรเซ็นต ง) เอธานอล 15 เปอรเซ็นต
 114

การเจริญของยีสต (log OD610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ก) -1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)
0.0
-0.5
-1.0
ข) -1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ค) -1.5
-2.0
-2.5
ต ร ์
าส
ตรศ
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

เก ษ
าลัย
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
ิาวทย -0.5
ห
ัิทล ม ง) -1.0
YKM015
ู้ดิจ -1.5 YKM022
ว า มร -2.0 YKM031
YL009
ค
คลัง
-2.5 YL025

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 47 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM015,

YKM022, YKM031, YL009 และ YL025 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกันและบมที่อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ก) เอธานอล 0 เปอรเซ็นต ค) เอธานอล 10 เปอรเซ็นต
ข) เอธานอล 5 เปอรเซ็นต ง) เอธานอล 15 เปอรเซ็นต
 115

การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ก) -1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ข) -1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ค) -1.5
-2.0 ต ร ์
าส
ตรศ
-2.5

เก ษ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
าลัย
ิา ทย
ว
ห
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

ม 0.0

ิจ ิทัล -0.5

า ม รู้ด ง)
-1.0

ัลงคว
YKM015
-1.5 YKM022
ค -2.0 YKM031
YL009
-2.5 YL025
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 48 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM015,

YKM022, YKM031, YL009 และ YL025 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกันและบมทีอ่ ุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ก) เอธานอล 0 เปอรเซ็นต ค) เอธานอล 10 เปอรเซ็นต
ข) เอธานอล 5 เปอรเซ็นต ง) เอธานอล 15 เปอรเซ็นต
 116

การเจริญของยีสต (log OD610 nm)

0.5
0.0
-0.5
ก) -1.0
-1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD610 nm)
0.5
0.0
-0.5
ข) -1.0
-1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD610 nm)

0.5
0.0
-0.5
ค) -1.0
-1.5
-2.0
-2.5 ต ร ์
าส
ษตรศ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

ัย เก
าล
การเจริญของยีสต (log OD610 nm)

ิาวทย
0.5
0.0
ห
ัิทล ม ง) -0.5
YKM015
ู้ดิจ
-1.0
า มร -1.5 YKM022
YKM031
ว
ลังค
-2.0 YL009
YL025
ค -2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 49 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM015,

YKM022, YKM031, YL009 และ YL025 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกันและบมทีอ่ ุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
ก) เอธานอล 0 เปอรเซ็นต ค) เอธานอล 10 เปอรเซ็นต
ข) เอธานอล 5 เปอรเซ็นต ง) เอธานอล 15 เปอรเซ็นต
 117

การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ก) -1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ข) -1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ค) -1.5
-2.0 ต ร ์
าส
ตรศ
-2.5

เก ษ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
าลัย
ิา ทย
ว
การเจริญของยีสต (log OD610 nm)

0.0
ห
ิทลั ม -0.5
ู ด
้ จ
ิ
มร
-1.0
า ง) YKM035
คว -1.5 YL026
คลัง -2.0 YL028
YL031
-2.5 YL049

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 50 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM035,

YL026, YL028, YL031 และ YL049 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของเอธานอล
ตางกันและบมที่อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ก) เอธานอล 0 เปอรเซ็นต ค) เอธานอล 10 เปอรเซ็นต
ข) เอธานอล 5 เปอรเซ็นต ง) เอธานอล 15 เปอรเซ็นต
 118

การเจริญของยีสต (log OD610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ก) -1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ข) -1.5
-2.0
-2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0
-0.5
-1.0
ค) -1.5
-2.0
ต ร ์
าส
ตรศ
-2.5

เก ษ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
าลัย
ิาวทย
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

0.0

มห -0.5

ิจ ิทัล ง)
-1.0

า ม รู้ด -1.5 YKM035

YL026
ัลงคว -2.0 YL028
YL031
ค -2.5 YL049

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 51 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM035,

YL026, YL028, YL031 และ YL049 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของเอธานอล
ตางกันและบมที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ก) เอธานอล 0 เปอรเซ็นต ค) เอธานอล 10 เปอรเซ็นต
ข) เอธานอล 5 เปอรเซ็นต ง) เอธานอล 15 เปอรเซ็นต
 119

การเจริญของยีสต (log OD610 nm)

0.5
0.0
-0.5
-1.0
ก) -1.5
-2.0
-2.5
-3.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD610 nm)
0.5
0.0
-0.5
-1.0
ข) -1.5
-2.0
-2.5
-3.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
การเจริญของยีสต (log OD610 nm)

0.5
0.0
-0.5
ค) -1.0
-1.5
-2.0
-2.5
-3.0
ต ร ์
าส
ตรศ
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
ษ
เก 0.5
การเจริญของยีสต (log OD 610 nm)

าลัย 0.0
ิาวทย -0.5
ห -1.0
ัิทล ม ง) -1.5 YKM035
YL026
รู้ดิจ -2.0 YL028
YL031
า ม -2.5

ัลงคว
-3.0 YL049

ค 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 52 การเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา รหัส YKM035,

YL026, YL028, YL031 และ YL049 เมือ่ เลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของเอธานอล
ตางกันและบมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
ก) เอธานอล 0 เปอรเซ็นต ค) เอธานอล 10 เปอรเซ็นต
ข) เอธานอล 5 เปอรเซ็นต ง) เอธานอล 15 เปอรเซ็นต
 120

0.035

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.025

0.015
เอธานอล 0 %
0.005 เอธานอล 5 %
เอธานอล 10 %
เอธานอล 15 %
-0.005
10 20 30
อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)

ภาพที่ 53 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมาก เขตบาง

กอกนอย กทม. (S. fibuligera YKM001) เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกันและบมทีอ่ ุณหภูมิตางกัน

ต ร ์
าส
ษตรศ
ัยเก
าล
ิาวทย
มห
ิจ ิทัล
า ม รู้ด
คัลงคว
 121

0.035

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.025

ก) 0.015

0.005

-0.005
10 20 30

0.035
อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.025

ข) 0.015
เอธานอล 0 %
0.005 เอธานอล 5 %
เอธานอล 10 %
-0.005 เอธานอล 15 %

10 20 30
ส ตร์ อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)
ต รศา
ภาพที่ 54 การเปลี่ยนแปลงค เ ก ษาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
าลัย
แปงเหลิทายตลาดพระโขนง เขตพระโขนง กทม. เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
ว
หา างกันและบมทีอ่ ุณหภูมิตางกัน
เอธานอลต
ม
ัล S. fibuligera YKM005
จ
ิ ท
ิ ก)
า ม รู้ด
คว ข) S. fibuligera YL007
คลัง
 122

0.035

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.025

0.015
เอธานอล 0 %
0.005 เอธานอล 5 %
เอธานอล 10 %
เอธานอล 15 %
-0.005
10 20 30
อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)

ภาพที่ 55 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมาก
ตลาดปทุมธานี จ.ปทุมธานี (S. fibuligera YKM007) เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขน
ของเอธานอลตางกันและบมที่อุณหภูมิตางกัน

ต ร ์
าส
ษตรศ
ัยเก 0.035
าล
ิาวทย
อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

มห 0.025
ิจ ิทัล
า ม รู้ด 0.015

คัลงคว เอธานอล 0 %
0.005 เอธานอล 5 %
เอธานอล 10 %
-0.005 เอธานอล 15 %

10 20 30
อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)

ภาพที่ 56 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงเหลา ตลาดบางกะป

กทม. (S. fibuligera YL049)เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของเอธานอลตางกัน
และบมที่อณ
ุ หภูมิตางกัน
 123

0.035

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.025

ก) 0.015

0.005

-0.005
10 20 30
0.035
อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.025

ข) 0.015
เอธานอล 0 %
0.005 เอธานอล 5 %
เอธานอล 10 %
-0.005 เอธานอล 15 %

10 20 30
ส ตร์ อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)
ต รศา
ภาพที่ 57 การเปลี่ยนแปลงค เ ก ษาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
าลัย
แปงเหลิทายตลาดนนทบุ รี อ.เมือง จ.นนทบุรี เมื่อ เลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
ว
หา างกันและบมทีอ่ ุณหภูมิตางกัน
เอธานอลต
ม
ัลก) S. fibuligera YKM010
จ
ิ ท
ิ
า ม รู้ด
คว ข) S. fibuligera YL008
คลัง
 124

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัวโมง-1) อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัวโมง ) อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัวโมง ) อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัวโมง )

-1
0.035

0.025

ก) 0.015

0.005

-0.005
10 20 30
-1

0.035

0.025

ข) 0.015

0.005

-0.005
10 20 30
0.035
-1

0.025

ค) 0.015

0.005
ต ร ์
-0.005ศาส
ษตร 10
เก 20 30
าลัย 0.035
ิา ทย
ว
ห 0.025
ลั ม
ิท ง)
ู ด
้ จ
ิ 0.015

ว ามร 0.005
เอธานอล 0 %

ลัง ค เอธานอล 5 %
เอธานอล 10 %
ค -0.005 เอธานอล 15 %

10 20 30
อุณหภูมิ (องศาเซลเซีย ส)

ภาพที่ 58 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงเหลาตลาดบางจาก เขตพระโขนง กทม.เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกันและบมทีอ่ ุณหภูมิตางกัน
ก) S. fibuligera YKM015 ค) S. fibuligera YKM031
ข) S. fibuligera YKM022 ง) S. fibuligera YL025
 125

0.035

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.025

ก) 0.015

0.005

-0.005
10 20 30
0.035
อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.025

ข) 0.015

0.005

-0.005
10 20 30
0.035
ต ร ์
าส
อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

รศ
เก ษต
0.025
ล ย
ั
ค) วิท ยา 0.015
หา
ลั ม 0.005
เอธานอล 0 %
ู้ดิจิท
เอธานอล 5 %
ร เอธานอล 10 %
ว า ม -0.005 เอธานอล 15 %
คลังค
10 20 30
อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)
ภาพที่ 59 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงเหลา ตลาดสามแยกเกษตร เขตจตุจกั ร กทม. เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขน
ของเอธานอลตางกันและบมที่อุณหภูมิตางกัน
ก) S. fibuligera YKM017
ข) S. fibuligera YL013
ค) S. fibuligera YL014
 126

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัวโมง-1) อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัวโมง-1) อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัวโมง-1) อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัวโมง-1)

0.035

0.025

ก) 0.015

0.005

-0.005
10 20 30
0.035

0.025

ข) 0.015

0.005

-0.005
10 20 30
0.035

0.025

ค) 0.015

0.005
ต ร ์
าส
ตรศ 10
-0.005
ษ
ัย เก 20 30

ยาล
0.035

า ว ิท
ห 0.025
ลั ม
ิท ง)
ู ด
้ จ
ิ 0.015

ว ามร เอธานอล 0 %
ลัง ค 0.005 เอธานอล 5 %
ค -0.005
เอธานอล 10 %
เอธานอล 15 %
10 20 30
อุณหภูมิ (องศาเซลเซีย ส)

ภาพที่ 60 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมากและลูก
แปงเหลา ตลาดหนาเรือนจําคลองเปรมเขตจตุจักร กทม. เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มี
ความเขมขนของเอธานอลตางกันและบมที่อุณหภูมิตางกัน
ก) S. fibuligera YKM035 ค) S. fibuligera YL028
ข) S. fibuligera YL026 ง) S. fibuligera YL031
 127

0.035

อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

0.025

0.015
เอธานอล 0 %
0.005 เอธานอล 5 %
เอธานอล 10 %
-0.005 เอธานอล 15 %

10 20 30
อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)

ภาพที่ 61 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมาก
ตลาดราชวัตร เขตดุสิต กทม.(S. fibuligera YKM043) เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขน
ของเอธานอลตางกันและบมที่อุณหภูมิตางกัน

0.035 ต ร ์
รศ าส
อัตราการเจริญจําเพาะ (ชัว่ โมง-1)

เ ษต
ก0.025
ล ย
ั
ว ิท ยา 0.015
ห า
ัล ม เอธานอล 0 %
ร ิู้ดจิท 0.005 เอธานอล 5 %
ว า ม เอธานอล 10 %
เอธานอล 15 %
คลังค -0.005
10 20 30
อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)

ภาพที่ 62 การเปลี่ยนแปลงคาอัตราการเจริญจําเพาะของยีสตที่แยกจากลูกแปงเหลา อ. ลับแล

จ. อุตรดิตถ (S. fibuligera YL009) เมื่อเลีย้ งในอาหารทีม่ ีความเขมขนของเอธานอล
ตางกันและบมที่อุณหภูมติ างกัน
 128

ผลการทดลองที่ได สอดคลองกับการศึกษาของ Heard and Fleet (1988) ซึ่งรายงานวา

อุณหภูมิมีอิทธิพลตออัตราการเจริญ และการทนตอเอธานอลของยีสต ในระหวางการหมักไวน
องุน และการศึกษาของ Gao and Fleet (1988) ที่รายงานวา เมื่อเลีย้ งไวนยีสต S. cerevisiae,
Candida stellata และ Koeckera apiculata ในอาหารทีป่ ระกอบดวยกลูโคส 10 เปอรเซ็นต และ
yeast extract 0.5 เปอรเซ็นต และปรับใหมีความเขมขนของเอธานอลตางกัน 7 ระดับ คือ 3 5 7
9 11 13 หรือ 15 เปอรเซ็นต และนําไปบมที่อุณหภูมิ 10 15 20 และ 30 องศาเซลเซียส พบวา
ที่อุณหภูมิ 15 และ 20 องศาเซลเซียส จะเปนชวงอุณหภูมิที่ยีสตสามารถเจริญอยูได ในอาหารที่มี
ความเขมขนของเอธานอลสูงสุด โดยที่ S. cerevisiae, C. stellata และ K. apiculata สามารถ
เจริญไดที่ระดับความเขมขนของเอธานอล เทากับ 15 11 และ 9 เปอรเซ็นต ตามลําดับ และ
การศึกษาของ Medawar et al. (2003) ที่รายงานวายีสต Brettanomyces intermidius เมื่อนํามาเลี้ยง
ในอาหารที่มีความเขมขนของเอธานอล 0-90 กรัมตอลิตร พบวา เมือ่ ความเขมขนของเอธานอล
เพิ่มขึ้น ยีสตใชระยะเวลาในชวง lag phase นานขึ้น, อัตราการเจริญจําเพาะ และผลไดของเซลลมีคา
ลดลง

ปกติเอธานอลความเขมขน 4.7-7.8 เปอรเซ็นต โดยน้ําหนัก จะทําใหยีสตโดยทัว่ ไปหยุด

การเจริญ และการเติมเอธานอลลงไปในระหว ร ์ างทีเ่ ชื้ออยูในชวง เอกซโพเนนเชียล จะทําใหอตั รา
การเจริญของยีสตลดลงอยางรวดเร็
ต
าสว เชนเดียวกับอัตราการสังเคราะหเอธานอล นอกจากนั้นยังมี
ร ศ
ษต มขนของเอธานอลสูง ๆ จะยับยั้งการเจริญของยีสต เนื่องจาก
ผูรายงานวา อาหารที่มเีคกวามเข
าลัย งเคราะห RNA และโปรตีน ทําใหไมมีการแบงเซลลเพิ่มจํานวน อัตรา
เอธานอลจะไปยับยัิท้งยการสั
ว
การเจริญของยีมหสาตจึงลดลง และพบวาการยั้บยั้งจะสัมพันธกับสภาวะแวดลอมอื่น โดยเฉพาะเมื่อมี
ัล
ิู้ดจิท มขนสูงและอุณหภูมิสูงทําใหการยับยั้งรุนแรงขึ้น (สาวิตรี, 2540)
น้ําตาลความเข
ร
ว า ม
คลังค 2.4.2 ผลของเอธานอลตอการอยูรอดของยีสต

จากการเลี้ยงยีสตในสารละลาย yeast extract 0.1 เปอรเซ็นต (น้าํ หนักตอ

ปริมาตร) ที่ปรับใหมีความเขมขนของเอธานอลตางกัน 4 ระดับ คือ 0 5 10 และ 15 เปอรเซ็นต
และนําไปบมที่อุณหภูมิ 10 20 และ 30 องศาเซลเซียส เปนเวลา 14 วัน รายงานผลโดย ตรวจ
นับจํานวนเซลลที่มีชีวิตของยีสต ผลการทดลองแสดงดังภาพที่ 63-72 โดยในการทดลองนี้ไดใช
ยีสตในการทดสอบ 9 ไอโซเลท จากแหลงลูกแปง 4 แหลง แบงเปนยีสตที่แยกจากลูกแปงขาว
หมาก 3 ไอโซเลท ไดแก YKM005, YKM010 และ YKM035 จากลูกแปงเหลา 6 ไอโซเลท
 129

ไดแก YL007, YL008, YL026, YL028, YL031 และ YL009 โดยเปรียบเทียบกับ S. cerevisiae
RIT I ผลการทดลองที่ไดมรี ายละเอียดดังนี้

เมื่อเลี้ยง Saccharomyces cerevisiae RIT I ในอาหารที่มเี อธานอลตางกัน และนําไปบมที่

อุณหภูมิตาง ๆ พบวาเอธานอลและอุณหภูมิมีผลตอการรอดชีวิตของเซลล เมื่อเลี้ยงในอาหารทีม่ ี
ความเขมขนของเอธานอลสูงขึ้นจํานวนเซลลที่มีชีวิตจะลดลง และการบมที่อุณหภูมิต่ําจะชวยให
ยีสตทนเอธานอลไดดีกวาอุณหภูมิสูง (ภาพที่ 63) เมื่อพิจารณาที่อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส ยีสต
จะทนเอธานอลไดดีที่สุด อาหารที่มีเอธานอลทุกระดับจะมีจํานวนเซลลที่มีชีวิตใกลเคียงกัน เมื่อ
พิจารณาที่อณ ุ หภูมิ 20 องศาเซลเซียส อาหารที่มีเอธานอล 0 5 และ 10 เปอรเซ็นต จะให
จํานวนเซลลที่มีชีวิตใกลเคียงกัน ยกเวนอาหารที่มีเอธานอล 15 เปอรเซ็นต จํานวนเซลลที่มีชีวิต
จะลดลงจากเริ่มตนประมาณ 106 เซลลตอมิลลิลิตร มาเปน 105 เซลลตอมิลลิลิตร ในวันที่ 3
และ ประมาณ 104 เซลลตอมิลลิลิตร ในวันที่ 14 เมื่อพิจารณาที่อณ ุ หภูมิ 30 องศาเซลเซียส ยีสต
จะทนเอธานอลไดต่ําสุด อาหารที่มีเอธานอล 0 5 และ 10 เปอรเซ็นต จํานวนเซลลที่มีชีวิตมีคา
ใกลเคียงกัน ยกเวนอาหารที่มีเอธานอล 15 เปอรเซ็นต จํานวนเซลลที่มีชีวิตจะลดลงจากเริ่มตน
ประมาณ 106 เซลลตอมิลลิลิตร มาเปน 104 เซลลตอมิลลิลิตร ในวันที่ 6 และไมพบเซลลที่มี
ชีวิตในวันที่ 14 ร์
า ส ต
รศ
จากการทดลองยีสกตษตSaccharomycopsis fibuligera ทั้ง 9 ไอโซเลท พบวาใหลกั ษณะ
ล ย
ั เ
คลายกับ S. cerevisiae า RIT I สามารถมีชีวิตในอาหารที่มเี อธานอลต่ํา ไดดีกวาอาหารที่มีเอธานอล
ิา ทย
ว
สูง(ภาพที่ 64 หถึงภาพที่ 72) และการบมที่อุณหภูมิต่ําจะชวยใหยีสตทนเอธานอลไดดีกวาอุณหภูมิ
สูง อาหารที ท
ิ ัล ม่มีเอธานอลความเขมขนสูงจะทําใหเซลลยีสตตายไดมากกวาความเขมขนต่ํา ซึ่งเกิด
ม ร ู้ดิจ
คว า กิริยาทีเ่ อธานอลทําใหโปรตีนในเซลลเสื่อมสภาพ(denature) นอกจากนีก้ ารบมที่อุณหภูมิต่ํา
จากปฏิ
คลังจะชวยใหยีสตทนเอธานอลไดดีกวาการบมที่อุณหภูมิสูงและพบวา Sc. cerevisiae RIT I สามารทน
เอธานอลไดดกี วา

ผลการทดลองที่ได สอดคลองกับการศึกษาของ Gao and Fleet (1988) ที่รายงานวา

อุณหภูมิและพีเอชมีผลตอการเจริญ และการทนเอธานอลของไวนยีสต S. cerevisiae, Candida
stellata และ Koeckera apiculata โดยทดลองเลี้ยงยีสตเหลานี้ในอาหาร yeast extract broth 0.5
เปอรเซ็นต และปรับใหมีเอธานอลเทากับ 2.5 5 7.5 10 12.5 และ 15 เปอรเซ็นต และนําไปบม
ที่อุณหภูมิ 10 15 และ 30 องศาเซลเซียส พบวาเมื่อเลี้ยง S. cerevisiae ในอาหารที่มีเอธานอล
 130

15 เปอรเซ็นต และนําไปบมที่อุณหภูมิ 10 และ 15 องศาเซลเซียส สามารถมีชีวิตได12 วัน แตที่

30 องศาเซลเซียส จํานวนเซลลที่มีชีวิติจะลดลง สวนยีสต C. stellata เมื่อเลี้ยง S. cerevisiae ใน
อาหารที่มีเอธานอล 12.5 เปอรเซ็นต และนําไปบมที่อุณหภูมิ 10 และ 15 องศาเซลเซียส
สามารถมีชีวิตไดตลอดระยะการทดลอง ยกเวนที่ 30 องศาเซลเซียส เซลลจะมีชีวติ ไดประมาณ
6-8 วัน สําหรับยีสต K. apiculata เมื่อบมที่อุณหภูมิ 15 องศาเซลเซียส ความเขมของเอธานอล
สูงสุดที่ยีสตสามารถมีชีวิตอยูไดคือ 10-12.5 เปอรเซ็นต แตที่อณ
ุ หภูมิ 10 และ 30 องศา
เซลเซียส เซลลจะมีชีวิตไดประมาณ 1 วัน และรายงานวา S. cerevisiae และ C. stellata
สามารถมีชีวิตอยูไดในอาหารทีมีคาพีเอช 3-6 ในทุกความเขมขนของเอธานอลที่ใชศึกษา ยกเวน
K. apiculata เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีเอธานอล 15 เปอรเซ็นต และมีคา พีเอช 3-6 จํานวนเซลลที่มี
ชีวิตจะลดลง อยางไรก็ตามการที่ C. stellata และ K. apiculata สามารถเจริญไดในอาหารทีม่ ี
ความเขมขนของเอธานอลสูง ๆ ที่อุณหภูมิต่ําจะเปนผลดีตอการหมักไวนในระยะแรก เพราะจะ
ชวยพัฒนากลิน่ รสของไวน เนื่องจากไวนยีสตเหลานี้ สามารถสรางสารเมตาบอไลซที่ใหกลิ่นรส
ุ หภูมิสูง (Charoenchai, 1995; Torija et al. 2003)
ไดดีกวาที่อณ

ในรายงานของ Torija et al. (2003) ไดรายงานวาอุณหภูมิเปนปจจัยกําหนดการเจริญและ

ประสิทธิภาพการหมักของ Saccharomyces ร ์ และรายงานวาเมื่ออุณหภูมิสูงขึ้นจํานวนเซลลที่มีชีวิตมี
ต
แนวโนมลดต่าํ ลง โดยเฉพาะที่อศุณาสหภูมิ 35 องศาเซลเซียส
ษตร
ัยเก
ในการหมัิทกยขาาลวจากลูกแปง ยีสต S. fibuligera มีบทบาทในการยอยแปงในขาวและสราง
ว
แอลกอฮอลไมดหเล็ากนอย แตยีสตชนิดนีจ้ ะตายไปเมื่อแอลกอฮอลเพิ่มมากขึ้น จากการที่ยีสตชนิดนี้
ท
ิ ัล
ร ด
้ ู จ
ิ
สามารถทนเอธานอลได ดีทอี่ ุณหภูมิต่ํา ดังนั้นหากมีการทดลองหมักขาวที่อุณหภูมิต่ําเปรียบเทียบ
ม กขาวที่อุณหภูมิสูง โดยปรับใหมีความเขมขนของเอธานอลตามสภาพการหมักจริง และ
กัควบาการหมั
คลังตรวจวัดสารเมตาบอไลซตาง ๆ ที่ใหกลิ่นรส ผลการทดลองที่ได นาจะเปนแนวทางหนึ่งในการ
พัฒนาผลิตภัณฑจากการหมักขาว
 131

8.0

จํานวนเซลล(Log cells/mL)
6.0

ก) 4.0

2.0

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14

8.0
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

6.0

ข) 4.0

2.0

0.0
0์ 2 4 6 8 10 12 14
ต ร
าส
ษตรศ8.0
ัย เก
าล
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

ิาวทย 6.0
ห
ัิทล ค)ม 4.0

า มรู้ดิจ เอธานอล 0 %
ว 2.0 เอธานอล 5 %
คลังค เอธานอล 10 %
เอธานอล 15 %
0.0
0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 63 การมีชีวิตของเซลล S. cerevisiae RITI เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มคี วามเขมขนของเอธานอล
ตางกัน และบมที่อุณหภูมติ างกัน
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 132

8.0

จํานวนเซลล(Log cells/mL)
6.0

ก) 4.0

2.0

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14

8.0
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

6.0

ข) 4.0

2.0

0.0
0์
ร 2 4 6 8 10 12 14
าส ต
ษตรศ8.0
ัย เก
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

าล
ิาวทย 6.0
ห
ัิทล ค)ม 4.0
รู้ดิจ เอธานอล 0 %
า ม 2.0
ัลงคว
เอธานอล 5 %
เอธานอล 10 %
ค 0.0 เอธานอล 15 %

0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 64 การมีชีวิตของเซลล S. fibuligera YKM005 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกัน และบมทีอ่ ุณหภูมิตางกัน
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 133

8.0

จํานวนเซลล(Log cells/mL)
6.0

ก) 4.0

2.0

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14
8.0
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

6.0

ข) 4.0

2.0

0.0
0์ 2 4 6 8 10 12 14
ต ร
าส
ษตรศ8.0
ัย เก
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

าล 6.0
ิาวทย
ห
ัิทล ค)ม 4.0
รู้ดิจ เอธานอล 0 %
า ม 2.0 เอธานอล 5 %
คัลงคว เอธานอล 10 %
0.0 เอธานอล 15 %

0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 65 การมีชีวิตของเซลล S. fibuligera YL007 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกัน และบมทีอ่ ุณหภูมิตางกัน
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 134
8.0

จํานวนเซลล(Log cells/mL)
6.0

ก) 4.0

2.0

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14

8.0
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

6.0

ข) 4.0

2.0

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14
ต ร ์
าส
ตรศ
8.0
เก ษ
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

าลัย 6.0
ิาวทย
ค)ห
ม 4.0
ิจ ิทัล เอธานอล 0 %
า ม รู้ด 2.0 เอธานอล 5 %

คัลงคว 0.0
เอธานอล 10 %
เอธานอล 15 %

0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)

ภาพที่ 66 การมีชีวิตของเซลล S. fibuligera YKM010 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ

เอธานอลตางกัน และบมทีอ่ ุณหภูมิตางกัน
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 135

8.0

จํานวนเซลล(Log cells/mL)
6.0

ก) 4.0

2.0

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14

8.0
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

6.0

ข) 4.0

2.0

0.0
0์
ร 2 4 6 8 10 12 14
าส ต
ษตรศ8.0
ัย เก
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

าล 6.0
ิาวทย
ห
ัิทล ค)ม 4.0
รู้ดิจ เอธานอล 0 %
า ม 2.0
ัลงคว
เอธานอล 5 %
เอธานอล 10 %
ค 0.0 เอธานอล 15 %

0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 67 การมีชีวิตของเซลล S. fibuligera YL008 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกัน และบมทีอ่ ุณหภูมิตางกัน
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 136
8.0

จํานวนเซลล(Log cells/mL)
6.0

ก) 4.0

2.0

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14
8.0
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

6.0

ข) 4.0

2.0

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14
8.0สตร์
ต รศา
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

ัย เกษ 6.0
ย าล
ค) าว ท
ิ 4.0
ห
ลั ม เอธานอล 0 %
มร ู้ดิจิท 2.0 เอธานอล 5 %
เอธานอล 10 %
ว า เอธานอล 15 %
คลังค 0.0
0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 68 การมีชีวิตของเซลล S. fibuligera YKM035 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกัน และบมทีอ่ ุณหภูมิตางกัน
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 137
8.0

จํานวนเซลล(Log cells/mL)
6.0

ก) 4.0

2.0

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14
8.0
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

6.0

ข) 4.0

2.0

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14
ร์
าสต
8.0
ษตรศ
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

ัย เก 6.0
ย าล
ค)หาว ท
ิ 4.0
ิทลั ม เอธานอล 0 %
ู ด
้ จ
ิ 2.0
ว ามร เอธานอล 5 %
เอธานอล 10 %
ลัง ค 0.0 เอธานอล 15 %
ค
0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 69 การมีชีวิตของเซลล S. fibuligera YL026 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกัน และบมทีอ่ ุณหภูมิตางกัน
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 138

8.0

จํานวนเซลล(Log cells/mL)
6.0

ก) 4.0

2.0

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14
8.0
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

6.0

ข) 4.0

2.0

0.0
0์
ร 2 4 6 8 10 12 14
าส ต
ษตรศ8.0
ัย เก
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

าล 6.0
ิาวทย
ห
ัิทล ค)ม 4.0
รู้ดิจ
า ม เอธานอล 0 %
ัลงคว
2.0 เอธานอล 5 %
ค เอธานอล 10 %
0.0 เอธานอล 15 %

0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 70 การมีชีวิตของเซลล S. fibuligera YL028 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกัน และบมทีอ่ ุณหภูมิตางกัน
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 139

8.0

จํานวนเซลล(Log cells/mL)
6.0

ก) 4.0

2.0

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14
8.0
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

6.0

ข) 4.0

2.0

0.0

ต ร0์ 2 4 6 8 10 12 14
าส
ตรศ
8.0
เก ษ
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

าลัย 6.0
ิาวทย
ห
ัิทล ค)ม 4.0
รู้ดิจ เอธานอล 0 %
า ม 2.0 เอธานอล 5 %
คัลงคว เอธานอล 10 %
0.0 เอธานอล 15 %

0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 71 การมีชีวิตของเซลล S. fibuligera YL031 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกัน และบมทีอ่ ุณหภูมิตางกัน
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 140

8.0

จํานวนเซลล(Log cells/mL)
6.0

ก) 4.0

2.0

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14
8.0
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

6.0

ข) 4.0

2.0

0.0

ต0ร์ 2 4 6 8 10 12 14
าส
ษตรศ8.0
ัย เก
จํานวนเซลล(Log cells/mL)

าล 6.0
ิาวทย
ห
ัิทล ค)ม 4.0
รู้ดิจ เอธานอล 0 %
า ม 2.0
ัลงคว
เอธานอล 5 %
เอธานอล 10%
ค 0.0 เอธานอล 15%

0 2 4 6 8 10 12 14
เวลาในการหมัก (วัน)
ภาพที่ 72 การมีชีวิตของเซลล S. fibuligera YL009 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีความเขมขนของ
เอธานอลตางกัน และบมทีอ่ ุณหภูมิตางกัน
ก) อุณหภูมิ 10 องศาเซลเซียส
ข) อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส
ค) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
 141

3. การผลิตเอกซตราเซลลูลารเอนไซม

3.1 การผลิตเอกซตราเซลลูลารอมัยเลส จากการทดสอบความสามารถในการยอยแปงของ

ยีสต Saccharomycopsis fibuligera จํานวน 20 ไอโซเลท แบงเปนยีสตที่แยกจากลูกแปงขาว
หมาก 10 ไอโซเลท และลูกแปงเหลา 10 ไอโซเลท การตรวจสอบกิจกรรมของเอนไซมอมัยเลส
บนอาหาร starch agar โดยสังเกตจากบริเวณใสรอบ ๆ โคโลนีของยีสต หลังจากที่ราดผิวหนา
อาหารดวยสารละลายไอโอดีน เนื่องจากเกิดการยอยสลายแปงทําใหเกิดบริเวณใสขึ้น(ภาพที่ 73)
การรายงานผลจะแบงยีสตออกเปน 3 กลุม คือยีสตที่ยอยแปงไดดีสรางบริเวณใส(clear zone)
กวางกวาขนาดของโคโลนี ยีสตที่ยอยแปงไดนอย คือยีสตที่สรางบริเวณใสเทากับขนาดของ
โคโลนี และยีสตที่ไมยอยแปง คือยีสตที่ไมสรางบริเวณใสเลย (สมพร, 2544) มีรายละเอียดดังนี้

ต ร ์
าส
ษตรศ
ลัยเก
า
ภาพที่ 73 บริเวณใสที ิา ทย ่เกิดจากการยอยแปงของเอนไซมอมัยเลสจากยีสต S. fibuligera
ว
ห
ัิทลเมืม่อเพาะบนอาหาร Starch agar เปนเวลา 3 วัน หลังจากราดผิวหนาอาหาร
รู้ดิจ ดวยสารละลายไอโอดีน
า ม
ว
คลังค ยีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมาก

ผลการทดลองพบวายีสตทั้ง 10 ไอโซเลท ใหลักษณะการยอยแปงที่ดี โดยมีขนาด

เสนผาศูนยกลางของโคโลนี 0.70-0.88 เซนติเมตร และมีขนาดเสนผาศูนยกลางของบริเวณใส
2.83-3.33 เซนติเมตร(ตารางที่ 12) ไอโซเลทที่ยอยแปงไดสูงที่สุดคือ YKM007 ซึ่งแยกไดจากลูก
แปงขาวหมาก ตลาดปทุมธานี จ. ปทุมธานี โดยมีอัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของบริเวณ
ใสและเสนผาศูนยกลางของโคโลนีเทากับ 4.76 เซนติเมตร ไอโซเลท ที่ยอยแปงไดต่ําที่สุดคือ
 142

YKM043 ซึ่งแยกไดจากลูกแปงขาวหมาก ตลาดราชวัตร เขตดุสิต กทม. มีอัตราสวนระหวาง

เสนผาศูนยกลางของบริเวณใสและเสนผาศูนยกลางของโคโลนีเทากับ 3.31 เซนติเมตร

ยีสตที่แยกจากลูกแปงเหลา

ยีสต S. fibuligera ทั้ง 10 ไอโซเลท ใหลักษณะการยอยแปงทีด่ ีเชนกัน โดยมีขนาด

เสนผาศูนยกลางของโคโลนี 0.75-1.00 เซนติเมตร และมีขนาดเสนผาศูนยกลางของบริเวณใส
2.83-3.6 เซนติเมตร (ตารางที่ 12) ไอโซเลทที่ยอยแปงไดสูงที่สุด คือ YL008 ซึง่ แยกไดจากลูก
แปงเหลา ตลาดนนทบุรี อ. เมือง จ. นนทบุรี โดยมีอตั ราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของบริเวณ
ใสและเสนผาศูนยกลางของโคโลนีเทากับ 4.63 เซนติเมตร ไอโซเลทที่ยอยแปงไดต่ําที่สุดคือ
YL025 ซึ่งแยกไดจากลูกแปงขาวหมาก ตลาดบางจาก เขตพระโขนง กทม. มีอัตราสวนระหวาง
เสนผาศูนยกลางของบริเวณใสและเสนผาศูนยกลางของโคโลนีเทากับ 3.00 เซนติเมตร

ตารางที่ 12 ความสามารถสรางเอกซตราเซลลูลารอมัยเลส ของยีสต S. fibuligera ที่แยกจากลูก

แปงขาวหมากและลูกแปงเหลา เมื่อเลี้ยงบน starch agar นาน 72 ชั่วโมง

ต ร ์
เสนผาศูนยกลาง
ร ศ าส เสนผาศูนยกลาง อัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลาง
สายพันธุ ต
ของบริเกเษวณใส ของโคโลนี ของบริเวณใสและ
ย าลัย(ซม.) (ซม.) เสนผาศูนยกลางของโคโลนี
หา วิท
YKM001 ลั ม
ิท 3.03 0.82 3.71
ด
้ ู จ
ิ
ว า มร
YKM005 2.83 0.83 3.40
ค
คลัง YKM007 3.33 0.70 4.76
YKM010 3.00 0.88 3.40
YKM015 2.87 0.82 3.51
YKM017 3.07 0.78 3.92
YKM022 3.03 0.83 3.64
YKM031 2.97 0.77 3.87
YKM035 2.93 0.78 3.75
 143

ตารางที่ 12 (ตอ)

เสนผาศูนยกลาง เสนผาศูนยกลาง อัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลาง

สายพันธุ ของบริเวณใส ของโคโลนี ของบริเวณใสและ
(ซม.) (ซม.) เสนผาศูนยกลางของโคโลนี

YKM043 2.83 0.85 3.31

YL007 3.60 0.83 4.32
YL008 3.53 0.76 4.63
YL009 2.83 0.90 3.15
YL013 3.10 0.90 3.44
YL014 2.87 0.82 3.51
YL025 3.00 1.00 3.00
YL026 2.85 0.85 3.35
YL028 3.60 0.82 4.41
YL031 3.03
ต ร ์ 0.75 4.04
YL049 3.38 าส 0.75 4.51
ษตรศ
ัยเก
าล
ิาวทย
ห
ผลการทดลองที ่ไดสอดคลองกับการรายงานของ ชัยวัฒน (2520), มนตรี (2521), สิรินทร
ัิทล ม
ม ร ู้ดิจ เบญจพร (2542) และ Sukhumavasi และคณะ(1975) ไดรายงานวา S. fibuligera ที่
เทพ (2523),
ว า กแปง มีความสามารถในการผลิตอมัยเลสปลอยออกนอกเซลลมายอยแปงได และ
แยกจากลู
ค
คลังสอดคลองกับการทดลองของ สมพร (2544) ที่ไดใชยสี ตเหลานี้ในการทดสอบการสรางเอนไซม
ยอยแปง และพบวาใหลักษณะการยอยแปงที่ดี อยางไรก็ตามอัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลาง
ของบริเวณใสและเสนผาศูนยกลางของโคโลนีอาจแตกตางกันบาง เนื่องจากอาหารที่ใชในการ
ทดสอบแตกตางกัน(ในการทดลองนี้ใหคา มากกวาในทุกไอโซเลท) และรายงานวา ยีสตที่แยกจาก
ลูกแปงขาวหมาก ไอโซเลทที่ยอยแปงไดสูงที่สุดคือ YKM043 (แยกจากลูกแปงขาวหมาก ตลาด
ราชวัตร เขตดุสิต กทม). มีอัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของบริเวณใสและเสนผาศูนยกลาง
ของโคโลนี 3.25 เซนติเมตร ไอโซเลทที่ยอยแปงไดต่ําที่สุดคือ YKM035 (แยกจากลูกแปงขาว
หมาก หนาเรือนจําคลองเปรม เขตจตุจักร กทม). มีอัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของบริเวณ
 144

ใสและเสนผาศูนยกลางของโคโลนี 2.25 เซนติเมตร สวนยีสตทแี่ ยกลูกแปงเหลา ไอโซเลทที่ยอย

แปงไดสูงที่สดุ คือ YL049 (แยกจากลูกแปงเหลา เขตบางกะป กทม). โดยมีอัตราสวนระหวาง
เสนผาศูนยกลางของบริเวณใสและเสนผาศูนยกลางของโคโลนี 3.07 เซนติเมตร ไอโซเลทที่ยอย
แปงไดต่ําที่สดุ คือ YL007 (แยกจากลูกแปงขาวหมาก ตลาดพระโขนง เขตพระโขนง กทม). มี
อัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของบริเวณใส และเสนผาศูนยกลางของโคโลนีเทากับ 2.08
เซนติเมตร ผลที่ไดจากการทดลองนี้เปนที่สังเกตวา ขนาดเสนผาศูนยกลางของโคโลนี มีคา
ใกลเคียงกับการทดลองของ สมพร (2544) (บางไอโซเลทจะมีขนาดใหญกวา) แตมีขนาด
เสนผาศูนยกลางของบริเวณใสมากกวาทุกไอโซเลท อาจกลาวไดวาอาหารที่ใชทดสอบในการ
ทดลองนี้ สงเสริมใหยีสตสรางเอนไซมยอยแปงไดดกี วาอาหารสูตร YM-starch agar ซึ่ง
สอดคลองกับคํากลาวที่วา การขับอมัยเลสออกนอกเซลลของยีสตขึ้นกับองคประกอบของอาหารที่
ใชในการตรวจสอบเปนสําคัญ โดยที่ soluble starch และ dextrin เปนแหลงคารบอนที่ดีที่สุดใน
การตรวจสอบ นอกจากนี้การขับอมัยเลสบางชนิดตองการกลูโคสและสับสเตรทที่เปนแปง

จากการศึกษาของ ชัยวัฒน (2520) ไดทดลองทําขาวหมากจากเชื้อบริสุทธิ์ Amylomyces

รวมกับ Hansenula พบวาใหรสชาติดีกวาขาวหมากที่ทาํ จาก Amylomyces เพียงอยางเดียว และ
Amylomyces รวมกับ Saccharomycopsis ร ์ ดังนั้นแมยีสต S. fibuligerara จะสามารถยอยแปงไดดี
ต
แตเมื่อนําไปใชเปนกลาเชื้อสําหรัศาบสหมักขาวหมากก็ไมไดหมายความวาจะใหขาวหมากที่มีคุณภาพ
ดีตองพิจารณาถึงลักษณะของผลิ ษตร ตภัณฑดว ย
ัย เก
าล
ิาวทย
การมีมกหิจกรรมของอมัยเลสในยีสต S. fibuligera นอกจากจะมีประโยชนในการคัดเลือก
ิทัล งเอนไซมยออยแปงไดดีแลวยังมีประโยชนอยางมากในการแปรสภาพวัสดุจําพวก
ยีสตที่สู้ดิจามารถสร
แป
ว างมดิรบจากมันสําปะหลังซึ่งมีราคาถูกใหเปนแอลกอฮอล สําหรับใชเปนแหลงพลังงานทดแทน
ค
คลังปริมาณเชื้อเพลิงที่กําลังจะหมดไป และชวยแกไขปญหามันสําปะหลังลนตลาด ดังการทดลองของ
เบญจพร (2542) ที่รายงานวา S. fibuligera ที่แยกจากลูกแปงขาวหมาก สามารถสรางเอนไซมอ
มัยเลสยอยแปงดิบได เพื่อผลิตแอลกอฮอลเมื่อหมักรวมกับยีสต Saccharomyces cerevisiae

3.2 การผลิตเอกซตราเซลลูลารไลเปส ในการหมักขาวจากลูกแปง เอนไซมที่สําคัญคือ

อมัยเลส และ กลูโคอมัยเลส ซึ่งไดจาก Amylomyces และ Endomycopsis ตามลําดับ บางสวนของ
น้ําตาลที่ไดจากการยอยแปง จะถูกยีสตนาํ ไปใชเพื่อใหเกิดเอสเทอร และ แอลกอฮอล โดยยีสต
Hansenula และ Saccharomyces cerevisiae ตามลําดับ ทําใหกลิ่นรสของผลิตภัณฑดีขึ้น อยางไร
 145

ก็ตามเอสเทอรอาจเกิดจากลิปดในขาวถูกยอยเปนกรดไขมัน โดยเอนไซมไลเปสที่สรางจากจุลิน-
ทรียในลูกแปง และกรดไขมันที่ไดจะทําปฏิกิริยากับแอลกอฮอล ใหสารประกอบของเอสเทอร
เกิดขึ้น (สิรินทรเทพ, 2523) ดังนั้นหากมีการตรวจสอบและคัดเลือกยีสตที่สามารถหมักขาวไดดี
และมีความสามารถในการยอยลิปดจากขาวไดอยางมีประสิทธภาพ มาเปนกลาเชื้อบริสุทธิ์สําหรับ
หมักขาว ก็จะชวยพัฒนากลิ่นรสของผลิตภัณฑใหดีขนึ้ ในการศึกษานี้ไดตรวจสอบความสามารถ
ในการสรางเอนไซมยอยไขมัน โดยใชอาหาร tributyrin agar ( Difco ) รายงานผลโดยสังเกต
บริเวณใส (clear zone) ที่เกิดขึ้นรอบ ๆ โคโลนีของยีสต หลังจากเพาะเชื้อ 2-4 วัน จากการ
ตรวจสอบพบวา ยีสตทุกไอโซเลทไมสามารถเจริญได และไมพบบริเวณใสจากกิจกรรมของ
เอนไซมไลเปส เนื่องจากเชือ้ ไมสามารถใช tributyrin เปนสับเสตรทในการเจริญ

จากการทดลอง แมวายีสตที่ใชในการศึกษาไมสามารถแสดงกิจกรรมของเอนไซมไลเปส
ไดก็ไมไดหมายความวา ยีสตในลูกแปงทัง้ หมดไมสามารถสรางเอยไซมยอยลิปดไดเลย เนื่องจาก
การทดลองนี้ใชยีสตเพียงสกุลเดียวในการตรวจสอบคือ Saccharomycopsis fibuligera หากมีการ
ตรวจสอบยีสตหลาย ๆ สกุลที่มีอยูในลูกแปงจะมีประโยชนมาก หากยีสตเหลานัน้ มีกิจกรรมของ
เอนไซมไลเปส เมื่อนํามาใชเปนสวนผสมของลูกแปงจากกลาเชื้อบริสุทธิ์ แตตองพิจารณาถึง
คุณสมบัติอยางอื่น เมื่อนํามาใชหมักรรว์ มกับราหรือยีสตสกุลอื่นประกอบดวย Charoenchai (1995)
า ส ต
รายงานวา Candida stellata, C. รศ pulcherrima, C. krusei, Torulaspora delbrueckii ซึ่งปนยีสตที่
ต
ษ างการหมักไวน สามารถสรางเอนไซมยอยลิปดได การที่ไวนยีสต
แยกไดจากผลองุนและในระหว เ ก
แสดงกิจกรรมของเอนไซม ย าลัย ดงั กลาวจะมีผลดีตอคุณภาพของไวน โดยเอนไซมจะไปยอยสลายลิปด
า ว ิท
ตาง ๆ ใน น้ํามองุ ห น และที่เกิดจากการยอยสลายตัวเองของยีสต ทําใหเกิดเปนกรดไขมันอิสระ และ
ล
ั
ิทา S. cerevisiae ซึ่งเปนยีสตชนิดเดียวกันกับยีสตที่มีบทบาทสําคัญในการหมักแอลกอฮอล
รายงานว
ด
้ ู จ
ิ
ว า มร ไมสามารถแสดงกิจกรรมของไลเปสไดเชนกัน
ในสาโท
ค
คลัง
3.3 การผลิตเอกซตราเซลลูลารโปรติเอส ขาวเปนวัตถุดิบที่สําคัญในการหมักสาโท ขาว
แตละชนิดจะใหคุณภาพของผลิตภัณฑตางกัน เนื่องจากองคประกอบของขาวที่ตางกัน การผลิต
สาโท ซึ่งเปนไวนขาวของไทย นิยมใชขาวเหนียวขาวหรือขาวเหนียวดําเปนวัตถุดิบ ไมนิยมใช
ขาวจาวเนื่องจากขาวเหนียวขาวใหกลิ่นรสที่ดีกวา และจุลินทรียใ นลูกแปงสามารถยอยแปงขาว
เหนียวไดดกี วาแปงขาวจาว (มนตรี, 2521) มีรายงานวาขาวจาวจะใหปริมาณแอลกอฮอลต่ําแตมี
กรดมากกวา บางรายงานกลาววา สามารถใชขาวทุกชนิดทําสาโทได ผูผลิตที่มีประสบการณราย
 146

งานวา หากใชขาวจาวจะทําใหสาโทขุนตกตะกอนยาก และอาจเปรี้ยวได แตยังไมมีผลการวิจัยที่

ชัดเจน (สถาบันวิจยั ไวนและสุราพื้นบาน คณะเทคโลยีและวิศวกรรมการเกษตร สถาบันเทคโนโลยี
ราชมงคล, 2545)

ในการผลิตสาเกของญี่ปุน มีการคัดเลือกพันธุขาวเฉพาะสําหรับผลิตสาเก และมักใชขาวที่

มีอัตราสวนการขัดสีขาว (polishing ratio) ประมาณ 50 เปอรเซ็นต การเลือกใชขาวที่มีอัตราสวน
การขัดสีขาว ในอัตราสวนนี้เนื่องจากมีเปอรเซ็นต ของแปงสูง แตมีโปรตีน ไขมัน และเถาต่ํา การ
สีขาวออกไปมากจะขจัดสวน outer layer ที่อุดมดวย โปรตีน ไขมัน เถา และไวตามินออกไป
สวนประกอบดังกลาว จะทําใหเกิดสี กลิ่นรส และตะกอนขุนทีไ่ มตองการในผลิตภัณฑ (มนตรี,
2521) สาเกของญี่ปุน ใชขาวที่มีอัตราสวนการขัดสีขาว 50 เปอรเซ็นต มีโปรตีนประมาณ 5.5
เปอรเซ็นต สวนไวนขาวของไทยนิยมใชขาวสารที่ผานการสี เพื่อใชบริโภคโดยเฉพาะ จึงมีสาร
บางอยาง เชน โปรตีน ไขมัน ไวตามิน ในปริมาณที่สูงกวาปริมาณที่เหมาะสมในการนํามาผลิตไวน
ขาว โดยในขาวเหนียวจะมีโปรตีนประมาณ 6.9 กรัม สวนขาวจาวมีโปรตีนประมาณ 7.3 กรัม
เมื่อเทียบจากสวนที่กินได 100 กรัม ดังนั้น หากมีการคัดเลือกยีสตที่มีบทบาทในการหมักขาวและ
ยอยโปรตีนในขาวไดดี จะเปนแนวทางหนึ่งที่ชวยพัฒนาอุตสาหกรรมไวนขาวของไทย

ต ร ์
ในการตรวจสอบการผลิศตาสโปรติเอสไดใชสับเสตรท 2 ชนิด คือ Skimmilk และ Gelatin
ความสามารถสรางเอนไซม ษ
พ
ติจรารณาจากบริเวณใสรอบ ๆ โคโลนีของยีสต (ภาพที่ 74) การรายงาน
ล ย
ั เก
า
ผลแบงความสามารถในการสร ิา ทย
ว
างเอนไซมไว 3 กลุม คือยีสตที่ยอยโปรตีนไดดมี าก คือยีสตที่
สรางบริเวณใส
ล
ั มห (clear zone) จากขอบโคโลนีมากกวา 5 มิลลิเมตร ยีสตที่ยอยโปรตีนไดดี คือ
ยีสตที่สู้ดิจริทางบริเวณใสจากขอบโคโลนีมากกวา 3 มิลลิเมตร และยีสตที่ยอยโปรตีนไดนอย คือยีสต
ร
ทีคว่สารมางบริเวณใสจากขอบโคโลนีมากกวา 1 มิลลิเมตร โดยแยกพิจารณาแบงตามชนิดของสับ
ลัง
ค เสตรทมีรายละเอียดดังนี้
 147

ก)

ข)

ต ร ์
าส
ษตรศ
เก
ภาพที่ 74 บริเวณใสทีา่เลกิัยดจากการยอยโปรตีนของเอนไซมโปรติเอสจากยีสต Saccharomycopsis
ิา ทยเมื่อทดสอบบนอาหารตางชนิดกัน
ว
fibuligera
ห
ัิทก)ล มskimmilk agar
ม ร ู้ดิจ ข) gelatin agar agar
า
คว
คล ั ง
Skimmilk

ผลการทดลองเมื่อเพาะยีสตบนอาหาร Skim milk agar พบวายีสตที่แยกจากลูกแปงขาว

หมากทั้ง 10 ไอโซเลท ใหลักษณะการยอยโปรตีนแบงเปน 2 กลุม(ตารางที่ 13) คือ ยอยโปรตีน
ไดดีมาก(+++) 1 ไอโซเลท ไดแก YKM015 และยอยโปรตีนไดดี(++) 9 ไอโซเลท ไดแก
YKM001 YKM005 YKM007 YKM010 YKM017 YKM022 YKM031 YKM035 และ YKM043
สวนยีสตที่แยกจากลูกแปงเหลาทั้ง 10 ไอโซเลทใหลักษณะการยอยโปรตีนแบงเปน 3 กลุม
 148

(ตารางที่ 13) คือ ยอยโปรตีนไดดีมาก(+++) 1 ไอโซเลท ไดแก YL049 ยอยโปรตีนไดดี (++) 7

ไอโซเลทไดแก YL007 YL008 YL009 YL014 YL026 YL028 และ YL031 และกลุม ที่ยอยโปรตีน
ไดนอย 2 ไอโซเลท คือ YL013 และ YL025

Gelatin

ผลการทดลองเมื่อเพาะยีสตบนอาหาร Gelatin agar พบวายีสตที่แยกจากลูกแปงขาวหมาก

ทั้ง 10 ไอโซเลทใหลักษณะการยอยโปรตีนแบงเปน 2 กลุม(ตารางที่ 13) คือ ยอยโปรตีนไดดี
(++) 5 ไอโซเลท ไดแก YKM005 YKM007 YKM010 YKM015 และ YKM031 และยอยโปรตีน
ไดนอย(+) 5 ไอโซเลท ไดแก YKM001 YKM017 YKM022 YKM035 และ YKM043 สวนยีสต
ที่แยกลูกแปงเหลาทั้ง 10 ไอโซเลท ใหลักษณะการยอยโปรตีนแบงเปน 3 กลุม(ตารางที่ 13) คือ
ยอยโปรตีนไดดีมาก(+++) 3 ไอโซเลท ไดแก YL009 YL026 และ YL031 ยอยโปรตีนไดด(ี ++)
1 ไอโซเลท ไดแก YL007 และกลุมที่ยอยโปรตีนไดนอ ย 6 ไอโซเลทคือ YL008 YL013 YL014
YL025 YL02 และ YL049

ตารางที่ 13 การผลิตเอกซตราเซลลูลาร
ต ร ์ โปรติเอส โดยยีสต S. fibuligera ที่แยกจากลูกแปงขาว
ศาาส บน skimmilk agar และ gelatin agar
หมากและลูกแปงเหล
ตร
เก ษ
าลัย
สายพันธุ ิาวทย การผลิตเอกซตราเซลลูลารโปรติเอสบนจานอาหารเพาะเชื้อ
มห skimmilk agar gelatin agar
ิทัล
ู้ดิจ
า ม ร
คว
YKM001 ++ +
ลัง
ค YKM005 ++ ++
YKM007 ++ ++
YKM010 ++ ++
YKM015 +++ ++
YKM017 ++ +
YKM022 ++ +
 149

ตารางที่ 13 (ตอ)

สายพันธุ การผลิตเอกซตราเซลลูลารโปรติเอสบนจานอาหารเพาะเชื้อ
skimmilk agar gelatin agar

YKM031 ++ ++
YKM035 ++ +
YKM043 ++ +
YL007 ++ ++
YL008 ++ +
YL009 ++ +++
YL013 + +
YL014 ++ +
YL025 + +
YL026 ++ +++
YL028
ต ร ์++ +
YL031 ร ศ าส ++ +++
ต
YL049
ัย เกษ +++ +
าล
ิาวทย
ล
ั มห
หมายเหตุ
ด
้ ู จ
ิ ิท
ว า มร +, บริเวณใสมากกวา 1 มม. จากขอบโคโลนี
ค
คลัง ++, บริเวณใสมากกวา 3 มม. จากขอบโคโลนี
+++, บริเวณใสมากกวา 5 มม. จากขอบโคโลนี

จากการทดลองเปนที่สังเกตวายีสตสวนใหญสามารถยอย skimmilk ไดดกี วา gelatin

สอดคลองกับการทดลองของ Charoenchai (1995) ที่รายงานวายีสตที่แยกจากผลองุนและใน
ระหวางการหมักไวนไมมีสายพันธุใดสามารถผลิตเอนไซมยอย gelatin ได โดยยีสต Candida
pulcherima 1000 C .pulcherima 2000 Kloeckera apiculata 401 K. apiculata 610 K. .apiculata
FRR 2164 Pichia .anomala 703300 และ P .anomala 209 ใหผลบวกในการแสดงกิจกรรมของ
 150

เอนไซมโปรติเอส เมื่อใชอาหาร skim milk agar ทดสอบ ถาอาหารไมมีกรดอะมิโน กิจกรรม

ของเอนไซมจะเดนชัดขึ้น ในการตรวจวิเคราะห proteolytic activity C. pulcherima 2000 และ
P. anomala 209 แสดงกิจกรรมของเอนไซมโปรติเอสไดสูง ในขณะที่ K. apiculata 401แสดง
กิจกรรมของเอนไซมโปรติเอสไดต่ํา สวน Saccharomyces cerevisiae HB 350 ไมแสดงกิจกรรม
ของเอนไซมโปรติเอส มีรายงานวาโปรติเอสบางชนิดจะไฮโดรไลซเคซีน แตไมไฮโดรไลซ เจ
ลาติน หรือ อัลบูมิน และลักษณะการยอยโปรตีนขึ้นอยูก ับระดับพีเอชของอาหารเลี้ยงเชื้อ ผลที่ได
จากการทดสอบอาจเกิดความผิดพลาดไดเนื่องจาก การยอยสลายตัวเองอาจมีการปลดปลอยอินตรา
เซลลูลาร เอนไซม (intracellular enzymes) ในกรณีนี้พบไดในเชื้อยีสตที่มีอายุมาก ๆ

ในการพัฒนาสาโท หากตองการสาโทที่มีลักษณะใส เพื่อใหเปนผลิตภัณฑระดับเดียวกับ

เครื่องดื่มของตางชาติ เชน ไวน เบียร สาเก ตองนําสาโทมากรองใหใส ทั้งนี้เนื่องจากแมจะมีการ
ตกตกะกอนของสาโทแลว แตอาจมีตะกอนของแปง โปรตีน เซลลยีสต และละอองสาร
แขวนลอยหลงเหลืออยู ในการผลิตระดับชุมชนตะกอนโปรตีนที่เหลือสามารถกําจัดได โดยใช
สารชวยตกตะกอนชนิดเดียวกับที่ใชในไวน เชน เบนโทไนท (bentonite) แตผลจากการใชสาร
ดังกลาว จะมีผลตอการเปลี่ยนแปลงลักษณะทางประสาทสัมผัสของผลิตภัณฑ และทําใหสูญเสีย
ปริมาตรของผลิตภัณฑ หากกําจัดโดยการใช ์ เครื่องกรองหยาบหรือเครื่องกรองละเอียด จะชวยให
ต ร
ผลิตภัณฑใสเปนประกาย แตกลิศ่นาสรสของผลิตภัณฑจะเปลี่ยนแปลง เพราะอาจถูกกรองออกไปดวย
และเปนการเพิ่มตนทุนในการติษตรดตั้งเครื่อง ทําใหตนทุนการผลิตสูงขึ้น
ย
ักเ
ยา ล
วิธีหนึห่งาทีว่นิทยิ มใชในการกําจัดโปรตีนในอุตสาหกรรมเครื่องดื่มแอลกอฮอลในปจจุบนั คือ
การใชเอนไซม ท
ิ ัล ม ยอยโปรตีนจากจุลินทรีย เปนวิธีที่ประสบผลสําเร็จอยางมากในอุตสาหกรรมเบียร
ม ร ู้ดิจ างยิ่ง ในขั้นตอนการปองกันการตกตะกอนของเบียร หลังหมักและกรองหรือการทํา
โดยเฉพาะอย
คว า
คลังใหเบียรใส(chill-proofing beer) การขุน หรือการตกตะกอนของเบียรจะเกิดขึ้นได ถาเก็บเบียรที่
ผานการบมและกรองสารขนาดใหญออกไปแลว ที่อุณหภูมิต่ําประมาณ 10 องศาเซลเซียส ความ
ขุนจะเพิ่มขึ้นตามระยะเวลาในการเก็บ แมวาจะผานการกรองมาแลวก็ตาม ทั้งนี้เพราะเกิดการ
รวมตัวกันของโปรตีนกับสารฟนอลในขาวมอลทและบารเลย เกิดเปนสารเชิงซอนขนาดใหญ
ละลายไมไดทอี่ ุณหภูมิต่ํา ทําใหเบียรมตี ะกอนแขวนลอย (ปราณี, 2543) ในสาโทนิยมดื่มที่
อุณหภูมิต่ําเชนกัน หากผลิตภัณฑมีตะกอนโปรตีนเหลืออยู ก็อาจเกิดตะกอนขุน ได จากผลการ
ทดสอบนี้ หากมีการคัดเลือกสาพันธุยีสตที่ใหลักษณะการหมักขาวทีด่ ี และสามารถยอยโปรตีนใน
ขาวไดอยางมีประสิทธิภาพมาใชเปนกลาเชื้อบริสุทธิ์ รวมกับราและยีสตชนิดอืน่ สําหรับผลิต
 151

เครื่องดื่มจากขาวจะเปนแนวทางหนึ่งที่ชว ยแกปญหาความขุนจากโปรตีนที่เหลือ นอกจากนี้ผลจาก

การยอยโปรตีนในขาว จะทําใหเกิดเปปไทดและกรดอะมิโนอิสระขึ้น ทําใหมแี หลงไนโตรเจน
สะสมชวยสนับสนุนการเจริญของ S. cerevisiae ตอไปได

4. คุณสมบัติเพชฆาตของยีสต (killer activity)

ยีสตบางสายพันธุสามารถแสดงคุณสมบัติเพชฆาตได โดยผลิตสาร killer toxins ไปยับยั้ง

การเจริญของยีสตสปชีสเดียวกัน หรือตางสปชีสได ยีสตธรรมชาติบางชนิดสามารถผลิตสารพิษ
ได และอาจทําใหการหมักหยุดชะงัก ยีสต S. cerevisiae ที่ผลิตเพื่อการหมักไวนหลายสายพันธุ
เปนยีสตที่มีคณ
ุ สมบัตินี้ เพื่อควบคุมยีสตที่ไมพึงประสงคและเพื่อไมใหถูกทําลายดวยสารพิษจาก
ยีสตในธรรมชาติ มีรายงานวาการเสื่อมเสียของไวนมสี าเหตุมาจากยีสตหลายชนิด เชน การเจริญ
ของ filmyeast บนผิวหนาของไวน ทําใหองคประกอบทางเคมีของไวนเปลีย่ นไป ทั้งนี้ขึ้นอยูกบั
ชนิดของยีสต ไดแก Candida, Metschnikowia, Pichia และ Hansenula การเกิดกลิ่นเพี้ยนจากเอส
เทอรที่ผลิตขึ้น โดยยีสต Kloeckera apicula, Hansenula anomala และ Brettanomyces การเกิด
ตะกอนขุน จากยีสตทนกรด ชนิด Zygosacharomyces bailii และการขุนของไวนบรรจุขวดที่มแี อ
ลกอออล 12-13 เปอรเซ็นต จากยีสตร์ S. cerevisiae และ S. mellis
า ส ต
ต รศ
ในการผลิตสาโทเกษหากมีการคัดเลือกยีสตที่มีบทบาทในการหมักขาวทีด่ ี มีคุณสมบัติเปน
ยีสตเพชฆาตและไม ย
เ าลนัย sensitive strain มาใชเปนกลาเชื้อสําหรับการหมัก จะทําใหสามารถ
ป
า ว ิท
ควบคุมกระบวนการผลิ
ล
ั มห ตและคุณภาพของผลิตภัณฑได การทดสอบ killer strain โดยสังเกตจาก
บริเวณใสด
้ ู จ
ิ ิท ที่เกิดจากสาร killer toxin ไปยับยั้งยีสตที่ไมทนตอ killer toxin สวนการทดสอบ killer
ว า มร โดยพิจารณาจากบริเวณใสที่เกิดจาก killer toxin ของ killer strain ไปยับยัง้ การเจริญของ
strain
ค
คลังยีสตที่เปน sensitive strain ผลการทดลองที่ไดมีรายละเอียดดังนี้

ในการทดสอบการเปน killer strain พบวา ยีสตทั้ง 20 ไอโซเลท ไมแสดงสมบัติการเปน

killer strainโดยเมื่อเลี้ยงบนอาหารที่มียสี ต S. cerevisiae AWRI 729(sensitive strain) พบวา
sensitive strain สามารถเจริญไดโดยไมพบบริเวณใสรอบ ๆ การเจริญของยีสตที่ทดสอบ ในการ
ทดสอบการเปน sensitive strain พบวายีสตทั้ง 20 ไอโซเลทไมแสดงสมบัติการเปน sensitive
strainหลังจากเพาะยีสต S. cerevisiae EC1116 (killer strain) ลงบนผิวหนาอาหารทีม่ ียีสตที่ตองการ
ทดสอบ พบวายีสตทั้งหมดสามารถเจริญไดโดยไมพบบริเวณใสรอบ ๆ การเจริญของ killer strain
 152

เมื่อทดสอบการเจริญของ Saccharomyces cerevisiae AWRI 729(sensitive strain) และ S.

cerevisiae EC1116(killer strain) บนอาหาร malt extract agar ก็พบวายีสตท้งั 2 ชนิดสามารถ
เจริญไดอยางอิสระบนผิวหนาอาหารเลี้ยงเชื้อ

ต ร ์
าส
ษตรศ
ัย เก
าล
ิาวทย
มห
ิจ ิทัล
า ม รู้ด
คัลงคว
 153

สรุป

จากการศึกษาคุณสมบัติของยีสตและราที่มบี ทบาทในการหมักขาวหมากและสาโท โดย

ศึกษาถึงบทบาทของเชื้อราที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลาในการหมักขาว ศึกษา
ปจจัยที่มีผลตอการเจริญของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา ทดสอบการผลิต
เอกซตราเซลลูลารเอนไซมของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา และทดสอบ
สมบัติเพชฆาตของยีสตที่แยกไดจากลูกแปงขาวหมากและลูกแปงเหลา สามารถสรุปผลการ
ทดลองไดดังนี้

1. เชื้อราและยีสตชนิดเดียวกันซึ่งแยกมาจากลูกแปงตางชนิดกัน และตางพื้นที่ แสดง

คุณสมบัติตาง ๆ ในทิศทางเดียวกัน

2. เชื้อรา Amylomyces sp. และ Rhizopus sp. มีบทบาทในการหมักขาวตางกัน โดยที่

Amylomyces sp. ผลิตกรดไดในปริมาณต่าํ ประมาณ 0.88-1.29 เปอรเซ็นต สวน Rhizopus sp.
ผลิตกรดไดสูงกวา ประมาณ 3.7-4.3 เปอรเซ็นต และพบวา Amylomyces sp. สามารถยอยแปงเปน
น้ําตาลไดดกี วา Rhizopus sp. ร์
า ส ต
ต รศ
ก ษ
3. เชื้อราทุกไอโซเลทสามารถย
เ อยแปงไดนอย เมื่อทดสอบบนอาหาร RBDC ที่มี
ย
ั
soluble starch 4 %ิทย(น้าลําหนักตอน้ําหนัก) โดยมีอัตราสวนระหวางเสนผาศูนยกลางของบริเวณใส
ว
และเสนผาศูนมยหกาลางของโคโลนีนอยกวา 1 แตไมเทากับ 0
ัล
ูร้ดจิ ิท
ม 4. Saccharomycopsis fibuligera ทุกไอโซเลท สามารถเจริญไดชากวา Saccharomyces
ว า
ลังค
ค cerevisiae RIT I ในทุกปจจัยการทดลอง

5. S. fibuligera สามารถเจริญไดดีที่ อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส, อาหารที่มีคาพีเอช

เริ่มตน 4.0 และในอาหารทีม่ ีความเขมขนของกลูโคส 100 กรัมตอลิตร

6. อุณหภูมิสูงจะชวยใหยีสตมีอัตราการเจริญสูงขึ้น สวนอุณหภูมิต่ําจะชวยใหยีสตทน
เอธานอลไดดขี ึ้น
 154

7. S. fibuligera สามารถแสดงกิจกรรมของอมัยเลสและโปรติเอสได แตไมแสดง

กิจกรรมของไลเปส

8. S. fibuligera ไมแสดงสมบัติการเปน killer strain และ sensitive strain

ต ร ์
าส
ษตรศ
ัย เก
าล
ิาวทย
มห
ิจ ิทัล
า ม รู้ด
คัลงคว
 155

ขอเสนอแนะ

1. การฆาเชื้อราโดยการเติม absolute ethanol ใหมีความเขมขน 5 เปอรเซ็นต (ปริมาตร

ตอน้ําหนัก) อาจทําใหเอนไซมเสียสภาพไดจึงควรเลือกใชวิธีอื่นที่ไมสง ผลตอกิจกรรมของเอนไซม

2. การวัดกิจกรรมของเอนไซมอมัยเลส ในการยอยแปงจากปริมาณของแข็งที่ละลายได
และสีของไอโอดีนที่หายไป ไมไดบงบอกถึงจํานวนพันธะไกลโคซิลในแปงที่ถูกยอยสลาย ดวย
เหตุนใี้ นการติดตามกิจกรรมของอมัยเลส จึงควรเปรียบเทียบจากหนวยของหมูรีดวิ ซที่เกิดขึ้น

3. ในการศึกษาขั้นตอไปควรมีการศึกษาการหมักขาวดวยเชื้อราแตละชนิด รวมกับยีสต
Saccharomycopsi sfibuligera และหรือ Saccharomyces cerevisiae และมีการวิเคราะหการเจริญ
ของจุลินทรียแตละชนิด ตลอดจนปริมาณสารใหกลิ่นรสตาง ๆ ในผลิตภัณฑ

ต ร ์
าส
ษตรศ
ัย เก
าล
ิาวทย
มห
ิจ ิทัล
า ม รู้ด
คัลงคว
 156

เอกสารอางอิง

ขุน กฤษณามรวิสิฐ . 2494. ขาวหมาก. สามิตรสาร 7(2): 75–79.

ชัยวัฒน จาติเสถียร. 2520. การคัดเลือกสายพันธุเชื้อราและยีสตในลูกแปงสําหรับการหมัก

ขาวหมาก. วิทยานิพนธปริญญาโท, มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร.

เชิดศักดิ์ เมธาธไนศวรรย. 2535. การใชเอนไซมไลปสเปนตัวเรงปฏิกิรยิ าทางชีวภาพของ

ปฏิกิริยาทรานสเอสเทอรฟเคชั่นของน้ํามันรําขาว. วิทยานิพนธปริญญาโท,
มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร.

นภา โลหทอง. 2535. กลาเชื้ออาหารหมักและเทคโนโลยีการผลิต. ฟนนี พับลิชชิง่ , กรุงเทพฯ.

บัญญัติ สุขศรีงาม. 2518. ประสิทธิภาพเครื่องเทศบางชนิดในการยับยัง้ การเจริญของจุลินทรีย

วิทยานิพนธปริญญาโท, มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร.
ต ร ์
าส
ตรศ ตและสมบัติของเอนไซมอะมัยเลสยอยแปงดิบจากเชื้อยีสต
เบญจพร บัวบาน. 2542. การผลิ
ษ
ก
ลัยเ sp.. วิทยานิพนธปริญญาโท, มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร.
Saccharomycopsis
า
ิา ทย
ว
ห
ัล มวณั ณา. 2545. ไวน: ศาสตรและศิลป. มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ.
ประดิษฐ ครุ
ิท
ู ด
้ จ
ิ
วมร
า
ลัง ค
ปราณี อานเปรื่อง. 2543. เอนไซมทางอาหาร. จุฬาลงกรณมหาวิทยาลัย, กรุงเทพฯ.
ค
ปราโมทย ธรรมรัตน. 2538. การควบคุมขบวนการหมักสาขาวและสาแดง. การสัมมนาและ
ควบคุม การหมักและการวิเคราะหเครื่องดื่มที่มีแอลกอฮอลกรมสรรพมิต กระทรวง
การคลัง, กรุงเทพฯ. 88 น.

พิไลพรรณ พงษบูล. 2523. การศึกษาชีววิทยาของลูกแปงขาวหมาก. รายงานการวิจยั . สํานัก

งานคณะกรรมการวิจยั แหงชาติ, กรุงเทพฯ. 49 น.
 157

พุทธรินทร ภักดีศุภผล. 2527. ผลของเครื่องเทศตอชนิดของจุลินทรียในลูกแปงขาวหมาก.

วิทยานิพนธปริญญาโท, มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร.

มนตรี เชาวสงั เกต. 2521. การคัดเลือกสายพันธุยีสตและราเพื่อใชผลิตไวนขา ว. วิทยานิพนธ

ปริญญาโท, มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร.

สถาบับวิจัยไวนและสุราพื้นบาน คณะวิศวกรรมและเทคโนโลยีการเกษตร สถาบันเทคโนโลยีราช

มงคล. 2545. เอกสารประกอบการอบรม หลักสูตรการผลิตไวนผลไมและสุราพื้นบาน
สําหรับผูประกอบการ. 62 น.

สมพร สินธารา. 2544. การแยก การจัดจําแนก และการเก็บรักษายีสตและราที่แยกไดจากลูก

แปงขาวหมากและลูกแปงเหลาของไทย. วิทยานิพนธปริญญาโท. มหาวิทยาลัย
เกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ.

สาวิตรี ลิ่มทอง. 2540. ยีสตและยีสตเทคโนโลยี. มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ.

ต ร ์
าส
สิรินทรเทพ ภักดีศภุ ผล. 2523.รศการหมักขาวหมากดวยเชื้อบริสุทธิ์. วิทยานิพนธปริญญาโท,
ต
เัย กษ .
มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร
าล
วา ิทย
ห
ัิทล ม P. and G. V. Zatseva. 1977. Effect of nitrosoguanidine and ultraviolet light on
Afanas′eva, V.

ารู้ดิจEndomycopsis fibuligera--producer of glucoamylase. Mikrobiologiia 46(4): 707-710.

ม
ว
ลังค
ค Ampon, A., A. B. Salleh, W. M. Z. W. Yunus., C. N. A. Razak and M. Basri. 1991.
Reductive alkylation of lipase. Enzyme Microb. Technol 13: 597-601.

Ardhana, M. and G. H. Fleet. 1989. The microbial ecology of Tape ketan fermentation. Int.
J. Food Microbiol 9(3): 157-165.

Baeva, L. F., D . G. Kozlov., E. E. Brevnova and S. V. Benevolenski. 1996. Cloning the

Saccharomycopsis fibuligera alpha-amylase gene and its expression in Saccharomyces
 158

cercvisiae. Prikladnaia Biokhimiia I Mikrobiologiia 32(3): 311-314.

Bakoyianis, V., Kana, K., Kaliatas, A. and A. A. Koutinas. 1992. Low temperature wine
making by Kissiris-support biocatalyst. volatile byproducts. J. Agric Food Chem
41(3): 465-468

Bardi, E. P., A. A. Koutinas., M. J. Supioni and M. B. Wanellaki. 1996a. Imbobilize of

yeast on Delignified cellulosic material for low temperature brewing. J. Agric Food
Chem 44(2): 463-467

Bardi, E. P., V. Bakoyianis., A. A. Koutinas and M. B. Wanellaki. 1996b. Room temperature

and loe temperature wine making using yeast immobilize on gluten pellets. Proc.
Biochem 31(5): 425-430

, , and . 1996c. Effect of temperature on the formation of

volatile by-product in brewing
ต ร ์ by immobilized cell. Food Biotechnokogy
10(30): 203-217 รศา
ส
เ ก ษต
ลัย
and A. ิทA.ยาKoutinas. 1994. Immobilize of yeast on Delignified cellulosic material for
ห า ว
roomม temperature and low temperature wine making. . J. Agric Food Chem 42(1): 46
ท
ิ ัล
รู้ด จ
ิ 221-226
ว า ม
ลังค
ค Barrett, A. J. 1994. Method in Enzymology. V. 244 Proteolytic Enzymes: Serine and
Cysteine Peptidases. Academic Press, London.

Buzzini, P. and A. Martini. 2000. Biodiversity of killer activity in yeasts isolated from the
Brazilian rain forest. Canadian J. Micribiol 46(7): 607-611.

and . 2001. Discrimination between Candida albicans and other

pathogenic species of the genus Candida by their differential sensitivities to toxin of a
 159

panel of killer yeasts. J. Clinical Microbiol 39(9): 3362-3364.

Charoenchai, C. 1995. Growth and metabolic activities of wine yeasts during batch and high
cell density fermentations. Ph. D. thesis, University of New South Wales.

, G. H. Fleet and P. A. Henschke. 1998. Effect of temperature, pH and

sugar concentration on the growth rates and cell biomass of wine yeasts. Am. J. Enol.
Vitic 49: 283–288.

, , and B. E. N. Todd. 1997. Screening of non-

Saccharomyces wine yeasts for the presence of extracellular hydrolytic enzymes.
Austra J. Grape. Wine research 3: 2-8.

Choi, S. H., C. Sung., M. J. Ho and C. J. Kim. 1997. Intergeneric protoplast

fusion in Saccharomycopsis fibuligera and Saccharomyces cerevisiae. J. Ferment
Bioeng 84(2): 158-161. ตร์
ร ศ าส
Ciani, M. and F. Fatichenti. เ ก ษต2001. Killer toxin of Kluyveromyces phaffii DBVPG 6076 as a
ย า ลัย
biopreservative
ว ิท agent to control apiculate wine yeasts. Appl. Environ. Micribiol
ห า
ัิทล ม 3058-3063.
67(7):

ม ร ู้ดิจ
ว า
Clementi.
ค F., J. Ross., L. Costamagna. and J. Rosi. 1980. Production of amylase(s) by
คลัง
Schawanniomyces castellii and Endomycopsis fibuligera. Antonie Van
Leeuwenhoek 46(4): 399-405.

De Mot, R. 1990. Conversion of starch by yeast. Pp. 163-222. Cited H. Verachtert and
R.De Mot (eds.). Yeast : Biotechnology and Biocatalyst. Marcel Dekker. Inc., New
York and Basel.

Gao, C. and G. H. Fleet. 1988. The effect of temperature and pH on the ethanol tolerance of
 160

the wine yeast, Saccharomyces cerevisiae, Candida stellata and Kloeckera apiculata.
J. Appl. Bacteriol 65: 405-409.

Gasperix, J., L. Kovac. and O. Minarikova. 1991. Purification and characterization of the
amylomytic enzymes of Saccharomycopsis fibuligera. Int. J. Biochem 23(1): 21-25.

Gautam, R. D., A. K. Gupta. and S. Pandey. 1993. Hybrid construction by fusion of

protoplasts of Endomycopsis fibuligera and Saccharomycopsis cerevisiae. Cytobios
73(294-295) : 183-188.

Georgieva, S. I., I. M. Gracheva., A. I. Sodova. and N. G. Kolobovnikova. 1976. Effect of

growth medium composition of glucoamylase and glycosyltransferase activity of
Endomycopsis fibuligera. Mikrobiologiia 45: 429-432.

Grafl, H. J. and H. O. Schwantes. 1983. Effect of cadmium, zinc, lead and mercury on the
growth and accumulating ability
ต ร ์ of Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis
ศ าส and Candida utilis. Zentralblatt Fur Bakteriologie,
lipolytica, Candida tropicalis,
ร
ต
เกษ Hygiene. 1. Abt. Originale B, Hygiene 177(1-2): 57-74.
MikrobiologieัยUnd
าล
วา ิทย
Heard, G. M.มหand G. H. Fleet. 1988. The effect of temperature and pH on the growth of yeast
ท
ิ ัล
รู้ด จ
ิ species during the fermentation of grape juice. J. Appl. Bacteriol 65: 23–28.
ว า ม
ลังค
ค Herraiz, T., P.J. Martin-Alvarez., G. Reglero., M. Herraiz. and M. D. Cabezudo. 1989.
Difference between wines fermented with and without sulphur dioxide using various
selected yeast. J. Sci. Food Agric 49: 249-258.

Hesseltine, C. W. 1965. A millennium of fungi, food and fermentation. Mycologia

57: 149-197.

Izgu, F. and D, Altinbay. 1997. Killer toxins of certain yeast strains have potential growth
 161

inhibitory activity on gram-positive pathogenic bacteria. Microbios 89: 15-22.

Jacqueline, A., P. B. Morais., C. A. Rosa., L. C. Mendonca-Hagler. and A. N. Hagler. 1997.

The incidence of killer activity and extracellular protease in tropical yeast communities.
Can. J. Microbiol 43: 328-336.

Jensen, R. G. 1983. Detection and determination of lipase (acyl glycerolhydrolase) activity from
various sources. Libs 18(9): 650-657.

Kato, K., K. Kuswanto., I. Banno. and T. Harada. 1976. Identification of Endomycopsis

fibuligera isolate from Ragi in Indonesia and properties and its crystalline
glucoamylase. J. Ferment. Technol 54(2): 831-837.

Kitamoto, H. K., A. Hasebe., S. Ohmomo., E. G. Suto., M. Muraki. and Y. Limura. 1999.

Prevention of aerobic spoilage of maize silage by a genetically modified killer yeast,
Kluyveromyces lactis, defective
ต ร ์ in the ability to grow on lactic acid. App. Environ.
ส
รศา
Microbiol 65(10): 4697-4700.
เ ก ษต
า ลัย
ิา ทย
ว
ห
ม Tape fermentation. Appl. Microbiol (23)976-978
Ko, S. D. ัล1972.
ู ด
้ จ
ิ ิท
ว ามร
ลัง ค
ค Kono, I. and K, Himeno. 1997. A novel killer yeast effective on Schizosaccharomyces pombe.
Biosci. Biotechnol. Biochem 61: 563-564.

Lagace, L. S. and L. F. Bisson. 1990. Survey of yeast acid proteases for effectiveness of wine
haze reduction. Am. J. Enol. Vitic 41: 147-155.

Lee, A. C. and Y. Fujio. 1999. Microflora of Banh men, a fermentation starter from Vietnam.
World. J. Microbio. Biotechnol 15(1): 57-62.
 162

Llorente, P., D. Marquina., A. Santos., J. M. Peinado. and I. Spencer-Martins. 1997. Effect

of salt on the killer phenotype of yeasts from olive brines. App. Environ. Microbiol
63(3): 1165-1167.

Longo, E., J. B. Velazquez., C. Sieiro., J. Cansado, P Calo. and, T. G. Villa. 1992.

Production of higher alcohol, ethyl acetate, acetaldehyde and other compound by 14
Saccharomyces cerevisiae wine strains isolate from the same region (Salnes,NW Spain).
World J. Microbiol. Biotechnol. 8: 539-541.

Macrae, A. R. 1983. Lipase catalyzed interesterification of oil and fat. J. Amer. Oil. Chem.
Soc 60(2): 243A-246A.

Madan, M. and N. Gulati. 1980. Organic growth factor requirements of some yeasts.
Microbios 28(113-114): 167-172.

Miller, D. A., J. M. Prausintz. andรH.์ W. Blanch. 1991. Kinetic of lipase catalyzed

า ส ต
ต รศ
interesterification of triglyceride in cyclohexane. Enzyme Microb. Technol
13: 98-103. ัยเกษ
าล
วา ิทย
Nishino, H., มS.ห Miyazaki. and K. Tohjo. 1985. Effect of osmotic pressure on the growth rate
ท
ิ ัล
จ
ิ
รู้ด fermentation activity of wine yeast. Am. J. Enol. Vitic 36: 170-174.
and
ว า ม
ลังค
ค Ogrydziak, D. M. and S. J. Scharf. 1982. Alkaline extracellular protease produced by
Saccharomycopsis lipolytica CX161-1B. J. General Microbiol 128(6): 1225-1234.

Ota, A. and H. Morishita. 1993. Effect of NaCl on the growth and morphology of
Saccharomycopsis fibuligera. Microbios 73(295): 149-155.

Padt, A. V., J. J. W. Sewalt., S. M. I. Agoston. and K. V. Riet. 1992. Candida rugosa

lipase stability during acylglycerol synthesis. Enzyme Microb. Technol 14: 802-812.
 163

Reed, G. and T. W. Nagodawithana. 1991. Yeast Technology. 2th edition. An AVI Book,
New York.

Ruengruglikit, C. and Y. D. Hang. 2003. L(+)-Lactic acid production from corncobs by

Rhizopus oryzae NRRL-395. Lebensm.-Wiss. U.-Technol 36: 573-575.

Sandhu, D. K., K. S. Vilkhu. and S. K. Soni. 1987. Production of ∝-amylase by

Saccharomycopsis fibuligera (syn. Endomycopsis fibuligera). J. Ferment. Technol
65(4):387-394.

Saono, S., Basyki, T. and Sastraatmadja, D.D. [1977]. Indonesian ragi. Symposium on
Indigenous Fermented Foods, Bangkok, Thailand.

Seitzz, E. W. 1974. Industrial application of microbial lipase : a review. J. Amer. Oil. Chem.
Soc 51(2): 12-16.
ต ร ์
าส
ษตศ
Shimada, A., T. Koda. and I. รNakamura. 1998. Concanavalin A-agarose gel system capable of

ล ย
ั เก
accumulating extracellular glucoamylase produced by Immobilized Saccharomycopsis
า
หวิทยJ. Ferment Bioeng 85(5): 542-542.
fibuligera.
า
ลั ม
Soni,รS.ู้ดิจิทK., I. K. Sandhu., K. S. Bath., U. C. Banerjee. and P. R. Patnaik. 1996.
ว า ม
ง
ั ค Extracellular amylase production by Saccharomycopsis capsularis and its evaluation
ค ล
for starch saccharification. Folia Microbiologica 41(3): 243-248.

Stepanov, A.I., V. P. Afanas-eva., G. V. Zatseva., A. P. Mednikova. and I. B. Lupandina.

1975. Regulation of amylolytic complex enzyme biosynthesis in Endomycopsis
fibuligera strain 20-9. Prikladnaia Biokhimiia I Mikrobiologiia 11(5): 682-685.

Strauss, M. L., N. P. Jolly., M. G. Lambrechts. and P. Rensburg. 2001. Screening for the
production of extracellular hydrolytic enzymes by non-Saccharomyces wine yeasts.
 164

J. App Microbiol 91(1): 182-190.

Sukhumavasi, J. K. Kato. and T. Harada. 1975. Glucoamylase of a strain of Endomycopsis

fibulifera isolated from Mould Bran (Look Pang) of Thailand. J. Ferment. Technol
53(8): 559-565.

Suprianto., R. Ohba., T. Kaga. and S. Ueda. 1989. Liquefaction of glutinous rice and aroma
formation in Tape preparation by Ragi. J. Ferment. Bioeng 67(4): 249-252.

Suzuki, C., Y. Ando. and S. Machida. 2001. Interaction of SMKT, a killer toxin produced by
Pichia farinose, with the yeast cell membranes. Yeast 18(16): 1471-1478.

Tamang, J. P. and P. K. Sarkar. 1995. Microflora of murcha : an amylolytic fermentation

starter. Microbios 81(327): 115-122.

ร์ and biotechnology. West Sussex PO19 IUD, England.

Walker, G. M. 1998. Yeast physiology
ส ต
รศ า
ต ษand V. J. Hodgson. 1995. Interactions between killer yeasts
, A. H. McLeod. เ ก
ย
and pathogenicาลัยfungi. FEMS Microbiol Lett 127(3): 213-222.
ิทาว
ม ห
ัล
ิจิท L. and C. W. Hesseltine. 1970. Sufu and Lao-chao. J. Agr. Food Chem
Wang,รู้ดH.
ว า ม
ังค 18: 572-575.
คล
Wilson, J.J. and W. M. Ingledew. 1982. Isolation and characterization of Schwanniomyces
alluvius amylolytic enzymes. Appl. Environ. Microbiol 44(2): 301-307.

Yamada, T. and D. M. Ogrydziak. 1983. Extracellular acid protease produced by

Saccharomycopsis lipolytica. J. Bacteriol 154(1): 23-31.

Zwietering, M. H., I. Jongenburger., F. M. Rombouts. and K. van’ t Riet. 1990. Modeling of

 165

bacterial growth curve. Appl.Environ. Microbiol 56: 1875–1881.

ต ร ์
าส
ษตรศ
ัย เก
าล
ิาวทย
มห
ิจ ิทัล
า ม รู้ด
คัลงคว
 166

ภาคผนวก

ต ร ์
าส
ษตรศ
ัย เก
าล
ิาวทย
มห
ิจ ิทัล
า ม รู้ด
คัลงคว
 167

ภาคผนวก ก

สูตรและวิธีเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ

1. Starch agar

อาหารผงสําเร็จรูปของ Difco 25.0 กรัมตอลิตร

นึ่งฆาเชื้อที่ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนดตอตารางนิ้ว เปนเวลา 15 นาที

2. 0.1 เปอรเซ็นต peptone water

Peptone 0.1 กรัม

ละลายในน้ํากลั่น 100 มิลลิลิตร และนําไปนึ่งฆาเชื้อที่ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15

ปอนดตอตารางนิ้ว เปนเวลา 15 นาที์
ส ต ร
ต รศา
เกษchloramphenical agar (RBDC)
3. Rose bengal dichloran
ัย
าล
ิาวทย
มห าเร็จรูปของ Merck
อาหารผงสํ 31.6 กรัมตอลิตร
ทิ ัล
ู้ดิจ
ม ร
า นึ่งฆาเชื้อที่ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนดตอตารางนิ้ว เปนเวลา 15 นาที
คว
คลัง
4. Rose bengal dichloran chloramphenical agar (RBDC) ที่มี soluble starch อยู 4 เปอรเซ็นต

RBDC (Merck) 31.6 กรัมตอลิตร

Soluble starch (Merck) 40.0 กรัมตอลิตร

นึ่งฆาเชื้อที่ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนดตอตารางนิ้ว เปนเวลา 15 นาที

 168

5. Yeast extract glucose

Yeast extract (Difco) 0.5 กรัม

Glucose 10.0 กรัม

ละลายในน้ํากลั่น 100 มิลลิลิตร ปรับใหมีคาพีเอชเริ่มตน 3.5 โดยใช HCL ความ

เขมขน 0.1 N และ NaOH ความเขมขน 0.1 N นําไปนึ่งฆาเชื้อที่ 121 องศาเซลเซียส ความดัน
15 ปอนดตอตารางนิ้ว เปนเวลา 15 นาที (Gao and Fleet, 1988)

6. Yeast extract broth

Yeast extract (Difco) 0.5 กรัม

ละลายในน้ํากลั่น 100 มิลลิลิตร ปรับใหมีคาพีเอชเริ่มตน 3.5 โดยใช HCL ความ

เขมขน 0.1 N และ NaOH ความเขมขน 0.1 N นําไปนึ่งฆาเชื้อที่ 121 องศาเซลเซียส ความดัน
์ (Gao and Fleet, 1988)
15 ปอนดตอตารางนิ้ว เปนเวลา 15 รนาที
ต
า ส
ต รศ
เกษ 0.1 เปอรเซ็นต (น้าํ หนักตอปริมาตร)
7. สารละลาย Yeast extract
ัย
าล
ิาวทย
Yeastมหextract (Difco) 0.1 กรัม
ทิ ัล
ู้ดิจ
ม ร
า ละลายในน้ํากลั่น 100 มิลลิลิตร ปรับใหมีคาพีเอชเริ่มตน 3.5 โดยใช HCL ความ
คว
ลัง
ค เขมขน 0.1 N และ NaOH ความเขมขน 0.1 N นําไปนึ่งฆาเชื้อที่ 121 องศาเซลเซียส ความดัน
15 ปอนดตอตารางนิ้ว เปนเวลา 15 นาที (Gao and Fleet, 1988)

8. Malt extract agar

อาหารผงสําเร็จรูปของ Merck 48.0 กรัมตอลิตร

นึ่งฆาเชื้อที่ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนดตอตารางนิ้ว เปนเวลา 10 นาที

 169

9. Tributyrin agar

นําอาหารสําเร็จรูปของ Difco มาใหความรอนจนอาหารละลาย จากนัน้ รอใหอาหารมี

อุณหภูมิประมาณ 45 องศาเซลเซียส นําไปเทลงจานเพาะเชื้อ รอจนอาหารแข็งและแหงเก็บเขา
ตูเย็นไวใชตอไป (Charoenchai et al., 1997)

10. Skim milk agar

Malt extract agar (Merck) 50.0 กรัมตอลิตร

Skim milk (Difco) 100.0 กรัมตอลิตร

ละลาย Skim milk ในน้ํากลัน่ ปริมาตร 1000 มิลลิลิตร ปรับใหมี พีเอช เทากับ 3.5 โดย
ใช 0.1 N HCl จากนัน้ เท Malt extract agar ผสมใหเขากัน นําไปนึ่งฆาเชื้อที่ 100 องศาเซลเซียส
ความดัน 15 ปอนดตอตารางนิ้ว เปนเวลา 10 นาที (Charoenchai et al., 1997)

11. Gelatin agar ประกอบดวย

ต ร ์
าส
รศ
ษต
Malt extract agarเก(Merck) 20.0 กรัมตอลิตร
ย
Gelatin (oxoid) าลัย 15.0 กรัมตอลิตร
า ว ิท
Agarม(หoxoid ) 8.0 กรัมตอลิตร
ท
ิ ัล
รู้ด ิ จ
ว า ม ปรับใหมี พีเอช เทากับ 3.5 โดยใช 0.1 N HCl และนําไปนึ่งฆาเชื้อที่ 100 องศา
ลังค
ค เซลเซียส ความดัน 15 ปอนดตอตารางนิว้ เปนเวลา 10 นาที (Charoenchai et al., 1997)
 170

ภาคผนวก ข

การเตรียมสารและวิธีวิเคราะห

1. สารละลาย NaOH มาตรฐาน

เตรียมโดยชั่ง NaOH 4 กรัม ละลายในน้าํ กลั่นซึ่งตมจนเดือดและทําใหเย็นแลว 1000

มิลลิลิตร

2. การทํา standardization เพื่อหาความเขมขนที่แนนอนของ NaOH

เตรียม standard potassium hydrogen phathalate(KHP) โดยการอบที่อณ ุ หภูมิ 80 องศา

เซลเซียส เปนเวลา 1 คืน นําออกมาทิ้งใหเย็นในโถดูดความชื้น จากนั้นนํามาชั่งใส flask 250
มิลลิลิตร จํานวน 3 ใบ ๆ ละ 0.1 กรัม บันทึกน้ําหนักไว เติมน้ํากลั่น 50 มิลลิลิตร เขยาจน
KHP ละลายหมด หยด phenolphthalein 3 หยด ทําการไตเตรท (titrate) ดวย 0.1 N NaOH ที่
เตรียมไว บันทึกปริมาตรที่ใช นําไปคํ์ านวณหาความเขมขนที่แนนอนของ NaOH ตามสูตร
ส ต ร
ดังตอไปนี้ ศา
ษตร
ัยเก
ล NaOH
ความเขมขนยาของ = น้ําหนักของ KHP ×1000
ิาวท
ห (N) ม mL ของ NaOH × 204.229
ัล
ริู้ดจิท
ม
3.วาสารละลาย phenolphthalein
ค
คลัง
เตรียมโดยชั่ง phenolphthalein 0.5-1 กรัม ละลายในสารละลาย เอธานอล-น้ํา 100
มิลลิลิตร ซึ่งประกอบดวย เอธานอล 60 มิลลิลิตร และน้ํา 40 มิลลิลิตร

4. Lugals′iodine

เตรียมโดยชั่ง iodine 1 กรัม และ potassium iodide 2 กรัม ละลายในน้ํากลั่น 300

มิลลิลิตร เก็บสารละลายไวในขวดสีชา
 171

5. การวิเคราะหหาปริมาณน้าํ ตาลกลูโคสโดย HPLC

5.1 การเตรียมตัวอยาง

นําตัวอยางน้ําขาวหมากที่เก็บไดมากรองผานชุดกรอง โดยกระดาษกรอง Millipore

pore size 0.45 µm กอนจะนําไปฉีดเขาเครื่อง HPLC

5.2 องคประกอบของเครื่อง

5.2.1 Ion chromatograph. Dionex.

5.2.2 GP 50 gradient pump
5.2.3 ED 50 electrochemical detector
5.2.4 Colump CarboPac PA-1(4×250 mm)
5.2.5 Autosample ASI-100

5.3 สภาวะการทดลอง
ต ร ์
าส
ษตรศ
ล ย
ั เก phase
5.3.1 Mobile
า
ิา ทย ก. NaOH 250 mM 50 %
ว
มห ข. H2O 50 %
ิจ ิทัล 5.3.2 Flow rate 1.0 ml/min
า ม รู้ด
คัลงคว 5.3.3 ED 50 electrochemical detector
ก. Reference electrode Ag/AgCl
ข. Working electrode Au
5.3.4 ใชโปรแกรม
ก. Waveform Time = 0.00, Potential = 0.10
ข. Waveform Time = 0.20, Potential = 0.10, Integration = Begin
ค. Waveform Time = 0.40, Potential = 0.10, Integration = End
ง. Waveform Time = 0.41, Potential = -2.00
จ. Waveform Time = 0.42, Potential = -2.00
 172

ฉ. Waveform Time = 0.43, Potential = 0.6

ช. Waveform Time = 0.44, Potential = -0.10
ซ. Waveform Time = 0.50, Potential = -0.10

ต ร ์
าส
ษตรศ
ัย เก
าล
ิาวทย
มห
ิจ ิทัล
า ม รู้ด
คัลงคว