. ReiTipreses Dupticacién de textos y documentos académicos _ Universitario UNIVERS! DEANTIOOUIS. Manual de Laboratorio de Microbiologia General Gustavo Garcia G. Luis Fernando Velasquez V. Guillermo Gomez G. Fabio Pineda G. Yamillé Saldarriaga O. Universidad de Antioquia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Instituto de Biologia Medellinerie Gomez G., Fabio Pineda G. © Gustavo Garcia G., Luis Femando Velasqe? ¥ Yani Saldarrisga O. © Reimpresos, dupicaién de textos y documentos aaémicas de bs Universidad de Antiogtia ISBN: 93840557847 Primera impresin: mayo de 2008 Reimpresdn: marzo de 2008 Sextareimpresion abril de 2015 Impreso y hecho en Colombia Printed and made in Colombia ‘rolubida la reproduccéa wal o parca. por cualquier medio o con euakuier Propénio, sin ls antorzacin escrta de Reimpresor, dupliracn de tex Sealemicos de lx Universita de Antiogtia Reimpresos, duplieacién de textos y documentos académicos “Teletono: (974) 21958.38 Correo electnico.reimpresos@udea.etnco Reimpresos:| Programs solidaia de la Direcciém, de Blenestar “Universitario, aq tiene como objetvo etary distri textos y dacumenton académicos de mayor demand, para Macerlos asequibles a Ta comunidad universizaia en cunplimiento de disposones legals y com ctieson de ceonciia y ledMANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL Edicion revisada por: Gustavo Garcia G. 2004 CONTENIDO. I. Introduccién I Normas generales de conducta en el Laboratorio lil. Precauciones para el uso del microscopio IV. Evaluacion V. Practicas a realizar VI. Plan de trabajo Pagina iv vi vi vil vill| INTRODUCCION Nos proponemos con este manual introducir al estudiante en el conocimiento de las principales técnicas y procedimientos utilizados en Microbiologia experimental, lo cual complementado con los conocimientos teéricos, le servird de herramienta para continuar estudios microbiolégicos avanzados, para la deteccién de problemas y el planteamiento de soluciones a éstos. Las practicas se presentan en forma secuencial buscando interrelacién y coherencia con los conceptos tedrico del curso de Microbiologia, sin que esto se constituya en una camisa de fuerza para el desarrollo del mismo. En el laboratorio, el estudiante tendré la oportunidad de trabajar con microorganismos no patégenos obtenidos de! ambiente, en algunos casos se trabajaré con patégenos, en ambos casos, se le ensefia las técnicas microbiolégicas actuales para manipularlos adecuadamente, garantizando su seguridad personal como la de los demas que laboran con él ivIl. NORMAS DE CONDUCTA EN EL LABORATORIO Aunque tas normas de conducta varian de un laboratorio a otro, en el laboratorio de Microbiologia es fundamental que se tengan en cuenta y se cumplan ya que se trabaja con microorganismos y material estéril, El cumplimiento de estas, garantizaran la seguridad de todos y la confiabilidad de los resultados obtenidos. No se debe comer, fumar, ni beber en el laboratorio. Evite llevar objetos no estériles a la cara, la boca y los ojos Use blusa de laboratorio limpia. Nunca retire los oultivos de microorganismos del lugar de trabajo. ee ens Si quiebra una preparacién en fresco con uno de jos objetivos del microscopio, no la limpie con la mano o pariuelo; informe al profesor. 2 Flamee el asa antes y después de usarla. 7. Cuando tenga el asa bacteriolégica cargada con algtin cultivo de microorganismos, no se desplace de cada parte a otra, pues puede crear aerosoles. Trabaje solo en su puesto. 8. Marque cuidadosamente todos los cultivos y las preparaciones que de ellos se hacen, Incube en el lugar asignado por el profesor. 9. Al terminar el laboratorio, limpie la superficie de la mesa de trabajo. Descarte cuitives y el material que no necesite. Deje todo el material de trabajo en su respectivo puesto. 10. Lave sus manos con agua y jabén al terminar su trabajo.lll. PRECAUCIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO Tenga en cuenta que el microscopio que se le entrega al iniciar el semestre sera una herramienta valiosa para su trabajo en el laboratorio, por ser un instrumento delicado, de precision y costoso, es importante que tenga presente las recomendaciones para su conservacién y buen uso. 1. Evite tocar con los dedos las lentes del microscopio. 2. No olvide retirar el aceite de inmersién del objetivo de 97X 0 100X al finalizar la préctica, Utilice siempre el material adecuado para ello. 3. No deje placas montadas en el microscopio. Prenda la lampara Gnicamente al momento de iniciar sus observaciones. Cunado no lo este usando, baje la intensidad de la ampara. (no la apague). No retire ni afloje los lentes del microscopio. 6. Al iniciar su trabajo en el laboratorio, revise el equipo y el material a utilizar, si observa alguna anormalidad, informe al profesor, al auxiliar o al monitor, Iv, EVALUACION La evaluacién del laboratorio se hara con base en la realizacién de pruebas cortas (quices) y notas de seguimiento, las cuales seran definidas por el profesor al iniciar cada semestre, teniendo en cuenta las normas académicas vigentes.V. PRACTICAS A REALIZAR Laboratorio No. Laboratorio No. Laboratorio No. Laboratorio No. Laboratorio No. Laboratorio No. Laboratorio No. Laboratorio No. Laboratorio No. Laboratorio No. Laboratorio No. Laboratorio No. Laboratorio No. Laboratorio No. Laboratorio No. 4 2 3 4 5 6 7 8 10 1" 12 13 14 15 Distribucién de los microorganismos Observacién de bacterias Coloracién de Gram Coloracién de Zieh! Neelsen Coloracién de esporas Coloracién de cépsula Cultivo y aislamiento de bacterias Metabolismo bacteriano Método para el recuento total de microorganismos, viables en una muestra Hongos Algunos pardsitos de importancia humana Anélisis bacteriolégico de la leche Anélisis bacteriolégico del agua Control de microorganismos Pruebas inmunolégicasVI. PLAN DE TRABAJO 1. Al iniciar cada practica se haré una discusién sobre el laboratorio anterior. Usted debe traer los resultados obtenidos durante la lectura para ser discutidos y complementados con los de sus compafieros. 2. Llegué siempre al laboratorio con un conocimiento completo de la practica que va a realizar. Esto le ahorra tiempo, le permite obtener mejores resultados y una mayor comprensién. 3. Las técnicas de laboratorio correspondientes a la practica que se va a realizar, seran explicadas y demostradas por su profesor. 4. Traiga siempre para cada practica su libreta de anotaciones, el material solicitado y el manual de laboratorio. Anote cuidadosamente todos los resultados obtenidos.LABORATORIO No. 1 DISTRIBUCION DE LOS MICROORGANISMOS Introduccién Los microorganismos se encuentran en muchos ambientes naturales. Pueden ser localizados en suelo, agua, aire, alimentos, tracto intestinal, piel y otros érganos de animales, el hombre y otros seres vivos. Solo unos pocos lugares ‘en la naturaleza como créteres de volcanes actives y tejidos sanos de érganos internos de! hombre y animales estén libres de ellos. ‘Su amplia distribucién puede ser demostrada exponiendo medios estériles al contacto con el medio ambiente y diferentes superficies, En nuestro medio se encuentra una gran variedad de microorganismos suspendidos en el aire 0 sobre superficies, por lo cual, en el laboratorio se deben tomar las precauciones necesarias para evitar la contaminacién de medios de cultivo, soluciones y equipos a utlizar. A. Objetivos 1. Conocer algunas de las técnicas utilizadas para demostrar la existencia de microorganismos en un ambiente determinado. 2, Distinguir las diferentes formas de crecimiento de estos microorganismos en los medios de cultivo. B. Materiales Agar nutritive en tubos Cajas de petri estériles Escobilion de algodén estéril Incubadora Asa metalica MecheroC. Procedimiento Muestras de la poblacién bacteriana ambiental. 1. Funda el agar nutritive (Bafio Maria a 100 °C) y enfrielo hasta 45 °C aproximadamente. Esta temperatura es la que normalmente usted soporta al sostener el tubo con la mano. 2. Vierta el contenido del tubo (15 mI.) del agar nutritivo en la base de cada una de las cajas de petri. 3. Una vez sélido el medio, (después de 5 min.) inocule todas las cajas menos una, con microorganismos obtenidos de las siguientes fuentes: a. Bacterias del aire. Coloque una caja de petri sobre cualquier lugar de! laboratorio, destapela y déjela expuesta al medio ambiente durante 15 minutos, Despugs de este periodo tépela y marquela adecuadamente. Incube dejando la caja invertida a 37 °C de 24 a 48 horas. b. Bacterias en la superficie de la mesa de trabajo. Tome un escobillén y frételo sobre la superficie de la mesa de trabajo, levante la tapa de la caja de petri y aplique el escobillén sobre un extremo de la superficie de agar, haciendo luego estrias con el asa estéril segtin figura No. 1 (No rompa el agar). Tape la caja, inviértala y marquela adecuadamente, incube a 37°C por un tiempo de 24 @ 48 horas. ¢, Microorganismos de mucosas y de piel. Con un escobillén estéril frételo sobre cualquier parte de la superficie del cuerpo 0 insérteselo en la nariz y frote suavemente la mucosa de la misma. Inocule una caja de agar nutritive como |o hizo en el caso anterior. Tape la caja, inviértala adecuadamente, incube a 37 °C por un tiempo de 24 a 48 horas.D. Resultados Después del periodo de incubacién, observe cada una de las cajas inoculadas. Note las diferencias entre las colonias de acuerdo a las siguientes caracteristicas. Color Forma Tamanho REN Cantidad de crecimiento (escaso, moderado, abundante) Registre estos datos en el cuaderno de notas o en el formato de preinforme.A. Colocor a muestra en un extremo del agor. B. Hacer estrias con ef escobillén. Figura 1. Manera de inoculor una caja de petri con agar nutritive.LABORATORIO No. 2 OBSERVACION DE BACTERIAS Introducei6n La observacién al microscopio de las bacterias nos permite diferenciar tres de las formas mas tipicas que son: cocos, bacilos y espirales entre otras. Los cocos son células esféricas que se pueden agrupar en parejas (Diplococos), racimos (Estafilococos), cadenas (Estreptococos), de a cuatro (Tétradas) 0 en cubos (Sarcinas). Estas formas de agrupacién estén determinadas genéticamente. Los bacilos son células en forma de bastén que pueden presentarse individualmente o agrupadas al asar, formando cadenas 0 en palizada. Las espirales son células que presentan forma helicoidal y generalmente no se agrupan. Las anteriores formas bacterianas se pueden observar por medio de los siguientes métodos: - Preparacién no coloreadas: Con este método se observan las bacterias vivas, lo cual hace que podamos detectar con facilidad la movilidad en las que la poseen y su forma. - Preparaciones coloreadas: ‘Como las bacterias son incoloras y tienen el mismo indice de refraccién del agua, es necesario utilizar colorantes para poderlas visualizar mejor. Los métodos para observar bacterias, proporcionan las siguientes ventajas:- Un contraste entre la bacteria y el medio que la rodea, permitiendo diferenciar los tipos morfolégicos bacterianos. - Una visualizacién de ias estructuras internas y externas tales como: esporo, equivalente nuclear, granulos citoplasméticos, pared celular, cépsula y flagelo. Los colorantes mas utilizados para la observacién de bacterias son compuestos organicos los cuales presentan unas caracteristicas moleculares que permiten realizar diferentes técnicas de coloracién. Una de sus caracteristicas es la carga del ion coloreado, el cual puede ser un Anién 9 un Catién, seguin el caso, los colorantes se denominan: Colorante Acido: Anién coloreado Eto- y catién incoloro Na, Ejemplo: Eto Na* osiato de Soxioy Colorante Basico: catién colorado AM+ y anién incoloro Cl-, Ejemplo: Cr AMT (aia de Azle Maton A. Obietivos: 1. Conocer algunos de los métodos de observacién de las bacterias. 2. Diferenciar las formas de accién de los colorantes, sobre la célula, de acuerdo al carécter quimico de estos (Acidos 0 basicos). 3. Diferenciar las caracteristicas morfolégicas y de tincién observadas al microscopio. B. Materiales Cultivos bacterianos Portaobjetos y cubreobjetos Asa metélica Mechero Colorantes (Acido; nigrosina y basico; azul de metileno) Puente de coloracién Frasco lavador Aceite de inmersién Papel absorbente MicroscopioC. Procedimiento 1 Preparaciones no coloreadas. (Preparacién en fresco). a, Cuando la muestra a analizar se encuentra en un medio liquido, proceda asi: Con el asa estéril deposite una gota de cultivo bacteriano en el centro de un portaobjetos limpio. Coloque un cubreobjetos sobre la gota evitando la formacién de burbujas. Observe con objetivos de 10X y 43X. Haga esquemas y describa lo observado. b. Si la muestra a analizar se encuentra en medio sdlido se debe proceder de la siguiente forma: coloque una gota de solucién salina sobre un portaobjetos, toque con el asa una colonia de cultivo y haga con esta muestra una emulsién en la gota. Cubra la preparacién con el cubreobjetos. Observe al microscopio. Haga esquemas y describa lo observado. 2. Preparaciones coloreadas a. Con colorantes basicos. (Coloracién simple o directa) Los colorantes basicos mas empleados son: azul de metileno, cristal Violeta, safranina, fucsina y verde de malaquita. El procedimiento para preparar y fijar las bacterias para la tincién es el siguiente: Antes de tefiir se debe fijar el material que se va a observar. En esta practica se utiliza el calor para adherir las células bacterianas al portaobjetos.4) Coloque la muestra de cultivo en el portaobjetos procediendo de acuerdo con el tipo de muestra que posea (liquida 0 sdlida). (Figura No. 2). 2) Extienda la gota sobre el portaobjetos formando una pelicula fina (casi transparente), 3) Seque la preparacién al aire o pasela répidamente sobre Ia llama de un mechero, (Evite un excesivo calentamiento). 4) Después de este procedimiento las bacterias quedan fijas y listas para la tincién. (Figura No. 3. Pasos A-B). Tincion 1) Coloque los portaobjetos sobre un puente de coloracién. 2) Cubra el extendido con una pequefia cantidad de azul de metileno y déjelo actuar por un minuto. 3) Lave con agua hasta eliminar el exceso de colorante. 4) Seque la preparacion al aire libre 0 al mechero 5) Examine las preparaciones tefiidas al microscopio con el objetivo de inmersién. Haga esquemas y describa lo observado. (Figura No. 4. Pasos AD). b. Con colorantes acidos La nigrosina es uno de los colorantes acidos mas utlizados. En Bacteriologia se utiliza para la tincién negativa o indirecta, la cual no tine directamente la célula sino que se deposita alrededor de ella, facilitando asi su observacién al microscopio. En esta coloraci6n se procede de la siguiente manera: 1) Limpie un portaobjeto con alcohol y gasa para liberarlo de grasa. 2) Coloque una gota de nigrosina sobre el extremo del portaobjeto. 3) Mezcle dos asadas del cultivo con la gota de nigrosina sin extender la muestra.4) Con el borde de otro portaobjeto, extienda la gota suavemente hasta el otro extremo del portaobjetos. (Figura No. 5. Pasos A-B). 5) Deje secar el extendido al aire libre. 6) Observe al microscopio con el objetivo de inmersién. Haga esquemas y describa lo observado.A.Flomee el asa antes y despues de cada indcul colocdndola verticalmente|| 8. Manera de transferir una gota de sobre fa ama. fa muestra de! tubo al portoobjetos. €.Manera de colecar el cubreobjetos para evitar la formacién de burbujas. Figura 2. Preporacion no coloreads. 10A.Toma y extendido de la muestra formando una pelicula delgada, & Fijacién de la muestra pasando la placa por encima de la llama de un mechero. Evite el calor excesivo. Figura 3. Preparacién de un extendido para su tincidn. u€.Lavedo con agua D. Secado de a placa. Figura 4. Tincién directa con colorente bésico. 2A Monera de extender lo preparacién sobre 1a superficie de 1a placa utizando un portaobjetos. B. Forma como queda el extendido. Figura 5. La tincién negative. 1BLABORATORIO No. 3 COLORACION DE GRAM Introduccién El bacteriélogo danés Christian Gram, descubrié en 1884 un método de coloracién e! cual ha dividido a las bacterias en dos grupos: El de las gram positivas y el de las gram negativas. La técnica esta basada en la capacidad de las bacterias para retener el colorante cristal violeta durante la decoloracién con el alcohol acetona Las bacterias gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona, perdiendo el color purpura propio del cristal violeta Las bacterias gram positivas no se decoloran y retienen el color violeta. Después de la decoloracién, se utiliza safranina, que es un colorante de contraste de color rojo, dicho colorante da un color rojo claro a las células decoloradas. Este método de coloracién diferencial constituye una de las técnicas mas importantes en el trabajo bacteriolégico pues la informacién que da, ayuda a la identificacién de la bacteria. A. Obietivos 1. Adquitir destreza en la técnica de coloracién de Gram. 2. Diferenciar con base en la aplicacién de esta técnica las bacterias gram positivas de las gram negativas. 3. Conover los diferentes campos de aplicacién de esta técnica. B. Materiales Cultivos de estreptococes, estafilococos, bacilos gram (+) y gram (-) Portaobjetos 4Papel absorbente Puente de coloracion Mechero Aceite de inmersién Reactivos requeridos para la coloracién de Gram: Cristal violeta, Safranina, lugol y aleohol acetona, Asa Microscopio . Procedimiento 1. Extienda, seque y fie la muestra. (Figura 3. Pasos A-B) 2. Cubra el extendido con cristal violeta. Déjelo actuar durante un minuto 3. Lave el exceso de colorante con agua. 4, Cubra el extendido con solucién yodada de gram (Lugol) durante un minuto. Este acttia como un mordiente. Lave con agua, 6. Decolore con alcohol acetona durante 20 a 30 segundos aproximadamente. Lave con agua. Cubra el extendido con safranina, Déjela actuar durante un minuto, Lave con agua, seque y observe al microscopio con el objetivo de inmersién. 10. Haga esquemas y describa lo observado. (Figura 6. Pasos A-H). 15@.Cubri con tugol D.Lovado con agua. E. Decoloracién con alcohol acetona. | es % 8 F Lavado con ogua. G.Tincién con safranina de Gram. +H. Lavado con agua y secede de fo placa| Figura 6. Procedimiento para la tincién de Gram. 16LABORATORIO No. 4 COLORACION DE ZIEHL NEELSEN Introduecién Algunas bacterias gram positivas poseen una propiedad llamada Acido- resistencia. Dicha propiedad se demuestra con la coloracién de Zielh Nee!sen llamada también Acidorresistente debido a la naturaleza acida del decolorante. El colorante primario utilizado es la fucsina, el cual para que penetre en al célula, requiere un agente intensificador que puede ser el fenol, un detergente © el calor, este procedimiento es necesario debido a que las bacterias acidorresistentes presentan ceras como constituyentes de la pared, dentro de las cuales se destaca el Acido micélico. Este compuesto es dcidorresistente y debido a esta propiedad se cree que el agente decolorante no acttia sobre estas células, Esta técnica es de gran importancia en el diagnéstico de laboratorio debido a que algunos organismos del género Mycobacterium se asocian con infecciones en humanos y animales. A. Qhietivos 1, Adquirir destreza en esta técnica de coloracién, 2. Diferenciar con base en la aplicacién de esta técnica las bacterias acidorresistentes (BAAR) de las no acidorresistentes (no BAAR). 3. Saber aplicar esta técnica en el diagndstico de laboratorio. B. Materiales - Cultivos de Mycobacterium (tipicas y atipicas) - Portaobjetos - Reactivos para Zielh Neelsen (fuesina, azul de metileno, alcohol Acido). - Asas - Mecheros - Frascos con creso ~ Microscopio 7Nota: Las muestras de Mycobacterium se deben colocar en una solucién de albtimina al 1% y luego llevarlas al autoclave para matar las células (sin destruirlas) y evitar asi una posible contaminacién. C. Procedimiento 1. Prepare el extendido y déjelo secar a temperatura ambiente, (No lo caliente a la llama por ningtin motivo). 2. Clibralo con fucsina durante cinco minutos. Durante este tiempo se debe calentar la preparacién en el mechero, sin dejar que hierva, hasta que empiece a desprender vapores, si los bordes del frotis se empiezan a secar, afiada mds colorante. EI colorante como un agente intensificador. Lave con agua. Decolore con alcohol - acido hasta que el extendido no destifia mas. Lave con agua. Cubra el extendido con azul de metileno durante un minuto. Lave con agua y deje secar la preparacién al aire libre. PN OAe SE Observe al microscopio con objetivo de inmersién. (Figura No. 7. Pasos AG). Haga esquemas y describa lo observado. 18B.Utilizacién del.mechero pora ealenter ta preparacién. €.Lavado con agua. ETincidn de contraste con Azul de Metileno. G Lavado con agua. Figura 7. Tincién Acidoresistente o de Zieh! Neelsen.LABORATORIO No. 5 COLORACION DE ESPORAS DE BACTERIAS Introduccion La formacién de espora es una caracteristica conocida principalmente en bacterias en forma de bastén (bacilos), de los géneros Bacillus y Clostridium, sin embargo, se ha encontrado esporulacién en bacterias esféricas (cocos) agrupadas en forma de tétradas, del genero Esporosarcina. Esta estructura posee una mayor resistencia a los agentes fisicos y quimicos que la célula vegetativa. El tamario del diémetro de la espora con respecto al de la célula y Su posicién en ésta, son caracteristicas distintivas de las especies formadoras de dicha estructura, por ejemplo, el género Clostridium presenta una espora con un diémetro mayor al de la célula vegetativa produciendo una deformacién en ésta; el género Bacillus presenta una espora cuyo diémetro es igual o menor al de la célula vegetativa Debido a la dificultad que presenta la espora para ser coloreada por las técnicas normales de coloracién realizadas en las practicas anteriores, es necesaria la aplicacién de una técnica de coloracién especifica. A. Objetivos 1. Adquirir destreza en esta técnica de coloracién. 2. Diferenciar las bacterias esporuladas de las no esporutadas, 3, Conocer el papel de esta técnica en estudios microbiolégicos. B, Materiales - Cultivo de 48 a 72 horas de Bacillus cereus y B. subtilis - Verde malaquita (solucién acuosa al 5%) - Safranina (solucién acuosa al 0.5%) C. Procedimiento A. (Método de Scheaffer - fulton) 20Haga un extendido del cultivo y fijelo. Ctibralo con verde malaquita. Caliente hasta la expulsién de los primeros vapores, retirelo del fuego. Repita la operacién aproximadamente durante 5 minutos. Es importante no dejar secar el colorante. (Figura No. 7. Paso B). Deje que la preparacién se enfrie durante 5 minutos. Lave con agua, Agregue safranina y déjela durante 1 minuto. Noose Lave con agua, seque la preparacién y obsérvela al microscopio con objetivo de inmersion Procedimiento B: (Método Dorner modificado) 1. Adicione a 0.5 mis. de solucién salina una cantidad de la muestra del cultivo a estudiar, hasta que quede una suspensién turbia. 2. Adiciones 0.6 mis. de verde mataquita y caliente al Bafio Marfa durante 10 minutos. Haga un extendido de la preparacién y fijelo. Lave con agua el exceso de colorante. Adicione safranina durante 1 minuto. ook Lave con agua, seque y observe al microscopio con objetivo de inmersion. (Figura 8. Pasos A-H). 7. Haga esquemas y describa lo observado. 21A. Toma Ge muestra det cultive. malaguita ©. Adicién de? colorante verde || D. Calentando ta preparacién al baiio de Maria. [F Extendido y fijado. 1H. Tincién con safranina. i. Lavado con agua. Figure 8. Colorecién de esporas bacterianas. (Frocedimiento 8) 22LABORATORIO No. 6 COLORACION DE CAPSULA Introduccién La capsula bacteriana es una estructura extracelular presente en algunos grupos de bacterias, su composicién es basicamente polisacéridos solubles en agua, por lo cual su tincién se hace mas dificil Al utilizar una de las técnicas normales de coloracién ya realizadas no es posible visualizar la cépsula, por lo tanto es necesario aplicar técnicas especiales, Para la visualizacion de la cépsula se conocen varias técnicas, siendo una de ellas la de Anthony. A. Qbietivos 1. Adquirir destreza en esta técnica de coloracién 2, Conocer los campos de aplicacién de esta técnica de coloracién. B. Materiales - Cullvio de Klebsiella pneumoniae (capsulada) y Staphylococcus aureus (No capsulado) en leche descremada, - Cristal violeta (solucién acuosa al 1%) = Sulfato de cobre (solucién al 20%). C. Procedimiento (Método de Anthony) Tome una asada del cultivo y haga un extendido. Déjelo secar al aire (no se debe calentar) ‘Sumérjala en la caja de coloracién con cristal violeta por 2 minutos. Lave la placa en la caja con solucién de sulfato de cobre al 20%. Saque la placa de la caja y déjela secar en posicién vertical Observe con objetivo de inmersién. (Figura No. 9. Pasos A-C) Noapens Haga esquemas y describa lo observado. 23A. El extendido secado al aire se tifie con cristal violeta. B.Lavado con sulfato de cobre al 20% C. Secodo de lo placa al aire libre y observar con aceite de inmersién. Figura 9. Coloracicn de la cdpsula. 24LABORATORIO No. 7 CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS Introducei6n En la naturaleza, las bacterias estén distribuidas haciendo parte de los diferentes ecosistemas. Estos, como los demas seres vivos, necesitan para sus desarrollos nutrientes apropiados y condiciones ambientales éptimas, tales como pH, presién osmética, oxigeno, temperatura y humedad entre otros. Para el cultivo y aislamiento de bacterias en el laboratorio se utilizan medios adecuados, los cuales segin su consistencia pueden ser sdlidos, semi-sélidos y liquidos; esta consistencia se obtiene por la adicién de un polisacérido denominado agar-agar extraido de algas marinas del género Gollidium, la concentracién depende del tipo de medio asi: 1.5% a 2% si es un medio sélido, 0.5% si es semi-s6lido y sin agar si es un medio liquido. Los medios simples se preparan con agua, extracto de carne, peptona, extracto de levadura, sales inorgénicas y carbohidratos. A algunos medios se les adicionan sustancias como: Liquido ascitico, vitaminas, antibiéticos, colorantes, sales billares, sangre y suero 0 glicerina, obteniéndose de esta forma, medios enriquecidos, de enriquecimiento, diferenciales, selectivos y de transporte. En el aislamiento de bacterias se utilizan varias técnicas, una de las cuales es siembra por estrias en superficie que comprenden varios métodos como el Clasico, el francés y el radial. EI principio basico de estos métodos consiste en agotar la muestra sobre la superficie del medio para obtener colonias separadas y poder observar sus caracteristicas. 25\. Obietivos 1. Conocer los métodos més utilizados para el aisiamiento y cultive de bacterias a partir de diferentes muestras. 2. Conocer la composicién y el uso de los diferentes medios de cultivo utilizados en el laboratorio. 3. Diferenciar las caracteristicas de crecimiento de las bacterias, segun el medio de cuttivo utilizado. Materiales Cepas Gram positivas Staphylococcus epidérmidis Streptococcus pyogenes Bacillus subtilis Cepas Gram negativas Scherichia coli Enterobacter aerégenes Pseudomona aeruginosa Proteus vulgaris Salmonella sp Medios de cultivo ‘Agar nutritive Caldo nutritive Agar EMB (Eosina azul de metileno) Agar SS (Salmonella, Shigella) ‘Agar Manitol sal ‘Agar MacConkey ‘Agar Sangre Mecheros Asas y aguias d Incubadora culacion Cinta de enmascarar 26C. Procedimiento 1. Cultivo en placa de agar: Se utiizan varios métodos de siembra por estrias en superficie entre las cuales tenemos el francés y el clasico, la finalidad de éstos, es obtener colonias separadas. a, Método Francés: 1) Se flamea el asa y se toma la muestra del material a estudiar 2) Coloque el inéculo en uno de los extremos de la caja de petri con el medio de cultivo indicado. 3) Extienda el cultivo haciendo cuatro o cinco estrias paralelas, sin romper el agar. 4) Flamee de nuevo el asa, enfriela y sin tomar mas muestra, haga cuatro © cinco estrias paralelas formando Angulo recto con las anteriores. Este paso se repite hasta cubrir foda el area de la caja. (Figura No. 10. Pasos B-1). b. Método Clasico: 1) Flamee el asa tome muestras del material a estudiar. 2) Coloque el inéculo en uno de los extremos de la caja de petri que contiene uno de los medios a utilizar. 3) Extienda de un extremo a otra formando lineas en zig-zag hasta cubrir toda el area de la caja. (Figura No. 10. Pasos A y B2). Nota: Incube las cajas de petri a 37°C durante 24 a 48 horas, colocandolas en forma invertida para evitar que el agua de condensacién caiga sobre el cultivo. Describa las caracteristicas de las colonias como: Forma, elevacidn, borde, color, consistencia y cardcter éptico. (Figura No. 11), 2. Cultivo en agar inclinado 27a. Rotule el tubo con su nombre, el nombre del germen que va a inocular y la fecha en que se hace el inéculo. Con la mano derecha tome la aguja de inoculacién y flaméela. Sin soltarla, déjela entriar. Sostenga el tubo con el cultivo en la mano izquierda, remueva el tapén con ef meftique de la otra mano y sosténgalo de tal manera que no toque ninguna superficie. Flamee la boca del tubo, Retire con la aguja de inoculacién una porcién de la colonia. Flamee nuevamente la boca del tubo. Tapelo y descartelo. Tome el tubo a inocular, destépelo, flaméelo e inoculelo, haciendo una estria en su superficie en linea recta. Flamee de nuevo la boca del tubo, tépelo y coléquelo en la gradilla (Figura No, 12. Pasos A-H). Antes de descartar la aguja de inoculacién, esterilicela, Incube a 37°C por 24 a 48 horas. Describa las caracteristicas del crecimiento bacteriano en agar inclinado, segtin la figura No. 13. 3. Cultivo en caldo nutritive El crecimiento de las bacterias en medios liquidos se manifiesta por la aparicién de: Turbidez 0 sedimento, velo en la superficie del medio y olor caracteristico. Para la siembra proceda de igual manera que en el caso anterior pero utilizando el asa y agitandola en un medio Iiquido. Incube @ 37°C por 24 a 48 horas; interprete los resultados con base en la figura No. 14. 28B. Método francés y metodo clasico. Figura 10. iétodos para inocular las placas de agar. 29Puntiforme Circular Plana ELEVACION Elevoda * 2 -— = Filamentosa Amiboide Convexa Pulvinado fire Fasforne Unbonode / ~~ entero onde Lotuide Crenado Filamentoso Enrollado Figura i. Guia de términos usados en ta deseripeiéa de colonias. 30A-Rotule ef tubo con agar. C.Quite el topdn del tubo. 0. Flamee la boca del tubo. F Inoculacion det medio. 6 Flamee ta boca de! tubo, y tapeto. HFlomee la aguja antes de descartorta. Figura 12. inoculecion en agar inclinado. 31ESTRIA EN AGAR INCLINADO (eames Fitiforn Equinutada Perlada fi C C \/ Difusa Arborescente Rizoide Figura 13. Diferentes tipos de crecimiento en ager inclinado.CALDO NUTRIVO- SUPERFICIE DE CRECIMIENTO Floculenta Anitlada Peliculada Membranosa Figura 14. Formas de crecimiento en ta superficie de un medio liquide, 33LABORATORIO No. 8 METABOLISMO BACTERIANO Introduce El metabolismo bacteriano se define como el conjunto de reacciones quimicas que desarrolla la célula. Estas reacciones pueden ser catabélicas cuando descomponen un sustrato y anabélicas cuando forman algunos compuestos a partir de elementos més simples. Estas reacciones se realizan gracias a la presencia de enzimas que pueden ser intracelulares 0 extracelulares. EI numero y la clase de enzimas bacterianas son diferentes, debido a que cada enzima esté fabricada bajo un control genético, por lo cual se dan variaciones en la utiizacién de los sustratos. Estas variaciones se utllizan a su vez para ayudar a determinar los diferentes géneros y especies bacterianas. A. Obietivos 1. Diferenciar la actividad bioquimica de las bacterias mediante la utiizacion de diferentes medios de cultivo. 2. Analizar las pruebas bioquimicas utilizadas y con base en los resultados, realizar la determinacién de las bacterias. 3. Conocer ios campos de aplicacién de estas pruebas en estudios microbiolégicos. B. Materiales Cepas de bacilos gram negativos: Escherichia coli Enterobacter aerégenes Klebsiella pneumoniae 34Proteus vulgaris Salmonella typhi Shigella dysenteriae Pseudomona aeruginosa Cepas de bacterias gram positivas: Bacillus subtilis Bacillus cereus staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Medios de cultivo: Agar TSI (Triple azdcar, hierro) 0 Kligler (dos azuicares, hierro). Agar citrato de Simmons Agar SIM (Sulfuro, indol, motilidad) Caldo urea ‘Agar blando Agar sangre Agar almidén Reactivo de Kovacs HzO» (Peréxido de hidrégeno) ‘Suero humano o de conejo Caldo con sacarosa_ Caldo con lactosa Caldo con sucrosa 35Pruebas Bioauimicas de algunas Bacterias Entéricas Gram Negativas - Prueba de carbohidratos Se utiliza el agar Kliger inclinado, en cual contiene dos hidratos de carbono: Lactosa a una concentracién del 1% y glucosa en concentracién de 0.1%, sales de hierro y rojo de fenol como indicador de pH. Es utilizado para diferenciar los bacilos Gram negativos de este grupo por su capacidad para desdoblar los azticares y liberar sulfuros. La fermentacién de los azucares esta Indicada por un cambio de color del rojo inicial al amarillo. En algunos casos hay produccién de gas o de H,S; este ultimo se manifiesta por un ennegrecimiento del medio. - Prueba del citrato Determina si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como fuente de carbono. Se ut el agar citrato de Simmons inclinado, el cual contiene como principal componente citrato de sodio como tinica fuente de carbono y azul de bromotimol como indicador de pH. Las bacterias que lo utilizan alcalinizan el medio, lo cual se manifiesta con un cambio del color verde original, al azul. - Prueba de motilidad Establece la diferencia entre bacterias méviles y no méviles. Se utiliza el agar blando, el cual es un medio semisélido que permite facimente el desplazamiento de las bacterias. La movilidad de los microorganismos se manifiesta por un crecimiento difuso alrededor de la linea de inoculaci6n. - Prueba de hidrdlisis de la urea Sefiala la capacidad de un microorganismo para desdoblar la Urea, por accién de la enzima ureasa y obtiene como resultado la formacién de 36amoniaco. El indicador de pH es rojo de Fenol. Los microorganismos que la utiizan cambian el color amarillo inicial del medio a un rojo rosado. Urea ureasa Amoniaco + COz Prueba de SIM En esta prueba se pueden observar tres reacciones: . Produccién de Acido sulfidrico (HS: ‘Ayuda a diferenciar entre las especies de bacterias capaces de producir Acido sulfidrico, El medio contiene aminodcidos azufrados, que por accién enzimatica de las bacterias producen un gas incoloro (HzS), que al reaccionar con una sal pesada de citrato férrico de amonio produce un precipitado negro insoluble (sulfato ferroso). Cristina —— Cisteina Desulfurasa cisteina. Acido pirtivico + HzS. + NH3 HAS + citrato férrico de amonio————+ Sutfuroferroso_(precipitado negro) Prueba del Indo! Sefiala la capacidad de las bacterias para oxidar el triptéfano. La accion enzimatica de la triptofanasa produce varios metabolitos entre los cuales esté el Indol Triptofano_Triptofanasa, — Indol + Acido pirtivico + Amoniaco. Desaminacién El indol producido se detecta adicionandole al cultivo dos o tres gotas del reactivo de Kovacs. Indo! + (Kovacs) —> anillo (color rojo violaceo) P-Dimetilamino- benzaldehido 373. Prueba de motilidad En este medio se puede detectar la movilidad de las bacterias que la Posen, siempre y cuando no haya produccién de H,S que dificulta la lectura. Cuando esto ocurre la motilidad se observa en el medio Agar blando descrito anteriormente. C. Procedimiento, Para hacer la siembra en una prueba bioquimica proceda de la siguiente manera: Esterilice la aguja de inoculacién Toque una colonia de la muestra a analizar 3. Inocule el TSI 0 Kliger, introduciendo la aguja hasta el fondo, luego saquela y haga una estria en zig-zag en la superficie del bisel. 4. Sin tomar una muestra y sin flamear la aguja, inocule el agar citrato de Simmons haciendo estrias en la superficie del bisel. 5. Luego, sin flamear introduzca la aguja hasta ia mitad del contenido del agar ‘SIM. 6. Inocule el agar biando procediendo como en el literal anterior. 7. Finalmente y sin flamear la aguja, inocule el caldo urea agitandola. 8. Incube todos los tubos de estas pruebas a 37°C por 24 horas Nota: Ademés de estas pruebas, existen actualmente otras sofisticadas y rapidas que permiten una determinacién bastante confiable de las -1D. Para la identificacién de las enterobacteriaceas utilice la Tabla No. 1. diferentes especies de bacterias, ejemplo, el sistema API y 38Otras _Pruebas__Complementarias _para__Bacterias__Grampositivas _y Gramnegativas. - Fermentacién de carbohidratos Una amplia variedad de carbohidratos son fermentacién por bacterias y el patrén de fermentacién es caracteristico de ciertos géneros y especies. Asi el conocimiento de la fermentacién de carbohidratos por un organismos particular ayuda a su determinacién. Esta caracteristica se puede determinar inoculando el organismo dentro de un caldo de carbohidratos. Este medio esté compuesto esencialmente de caldo nutritive adicionado con 0.5% del carbohidrato particular mas un indicador de pH y ademas contiene un tubo de Durham (pequefio tubito invertido dentro del tubo con caldo). Puesto que los productos finales de la fermentacién de los carbohidratos son acidos y gas, el indicador revelerd la produccién de Acido y el tubito invertido atrapara el gas si éste se produce. Para esta prueba proceda de la siguiente manera: 1, Esterilice el asa. 2. Inocule el caldo de carbohidratos con una asada del cultivo a analizar. 3. Rotule bien los tubos e inctibelos a 37°C por 48 horas. Resultado Observe la produccién de dcido por el viraje del indicador a un color amarillo y de gas por la presencia de una burbuja de aire dentro del tubo de Durham. 39Nota: Un tubo del caldo con carbohidratos sin inocular es guardado como control. Hidrélisis de almidon Algunas bacterias producen enzimas capaces de desdoblar las moléculas complejas de polisacaridos. Estas enzimas son extracelulares y realizan la ruptura de los sustratos por medio de la hidrélisis. Asi, la amilasa hidroliza el almidén cuando los organismos que la producen se cultivan en un medio que contiene este polisacarido (Agar almidén). Para esta prueba, proceda de la siguiente manera: Con un lépiz de cera divida una caja de petri en cuatro cuadrantes. 2, Marque un cuadrante con la palabra control y las demés con su respectiva cepa. 3. Esterilice el asa. 4. Inocule el agar en el centro de cada cuadrante con la respectiva bacteria, 5. Incube a 37°C por 24 a 40 horas. 6. Después de la incubacién cubra la superficie del agar con una solucién de lugol, éste en presencia de almidén origina un color azul oscuro. Un halo transparente alrededor de la colonia nos indica que la bacteria hidroliza al almidén, La ausencia de halo significa un resultado negativo. Prueba para la catalasa Diferencia entre especies de bacterias que utiizan el oxigeno. La catalasa es una enzima que esta relacionada con la capacidad de un organismo para utilizar el oxigeno. Esta enzima que cataliza la degradacién del agua oxigenada en agua y oxigeno, no se encuentra en los organismos anaerobios, lo cual produce en éstos la muerte cuando se encuentran en presencia de oxigeno, 40Para esta prueba, proceda de la siguiente manera: 1. Esterilice el asa. 2. Tome varias colonias de un cultive de estafilococos y coléquelas sobre un portaobjetos limpio. 3. Agregue sobre las colonias una gota de H202 al 30%. Observe la produccién de pequefias burbujas, lo que indica la presencia de la catalasa en las bacterias. Repita el proceso con una cepa de estreptococos. - Prueba para la coagulasa Sefiala la capacidad de ciertas bacterias para coagular el plasma por la accién de esta enzima. El plasma humano o de conejo, coagula igual que si fuera sangre entera. Esto se previene si se afiade un poco de citrato de sodio (anticoagulante general) el cual mantiene liquide el plasma. La coagulasa que es una exoenzima elaborada por la mayoria de los Staphylococcus aureus invierte la accién del anticoagulante (en este caso el citrato de sodio). Cuando a este plasma se le inocula la cepa patégena del Staphylococcus aureus, la coagulacién se realiza tal como sino hubiera aftadido citrato. Para esta prueba, proceda asi: 1. Esterilice el asa. 2. Agregue 0.5 mi de plasma citratado a cada tubo de ensayo (2 tubos). 3. Tome una asada de colonias de Staphylococcus aureus (coagulasa positiva) e introduzca en uno de los tubos con plasma. 4, Proceda de igual forma con un Staphylococcus (coagulasa negativa) para usarlo como control. 415. Observe por una o dos horas, revisando cada media hora. Cuando el plasma ya no fluya como al principio, la prueba es positive, en caso contrario es negativa. (Figura No. 15).SUINZLOVEONSINI 30 NOIDVDISILNIG! +1 9101 o112}909019}U9 5° ONGER opopsojes 298 spend — 2 owe1 — 1 osopnp s1@0U0A — A ar 0A — A ouoay — #06 2p 9ju9) uppanpoud uo9 opiny — ¥ a a + + 4 yi s06-apEy — v opey — v ‘Osoubnaneo OuoWOpnesd ‘ossepouowopnesd | ‘s1s06)0a snojoig |e + "punasy 48490903119 x ‘ds oj/u0WIOS. $u9259210u 0401105 vlalels seueboveo 49)2090201U9 + + 7 ds o1e1sqain 3 x] <<] «| <|<|<]<]al« a ds -oja61u5 yoo oyoueyos3 | 1 ‘ShovInaS wanISoua GiVULID | 'S350A 30 OF oan NODA ‘STON ‘OONOs Stawi ator S3V3OVIMSLOVEONSINS vies 43i 6 Pipetee 0.5 mi de plasma en cada tubo. FF” FF Inocule con estofilococos Inocule con estafilococos coagulasa negativa coaguiasa positive | Incube a 37%c une hora | e | Lo mezcia permanece liquide La mezcla se coagula Figura iS. Prueba de Ia coagulasaLABORATORIO No. 9 METODO PARA EL RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS VIABLES EN UNA MUESTRA Introduccién No todas las células de una poblacién bacteriana son viables, se consideran Viables aquellas que pueden formar colonias en un medio sélido 0 bien que pueden formar suspensiones en un medio liquide. El método mas comin para determinar el ntimero de oélulas microbianas en un anélisis de aguas, suelos u otros tipos de muestras, es el recuento en placa recuento de colonias. Este método esta basado en una relacién teérica de que una célula bacteriana da lugar a una colonia y en la presuncién de que el ntimero de colonias que se desarrollan sobre una placa de agar, corresponde al ntimero original de bacterias. Para facilitar el recuento de colonias se utilizan equipos especiales como el contador de colonias. (Figura No. 16). A. Qbjetivos: 41. Conocer algunos de los métodos de recuento de microorganismos. 2. Adquitir destreza en la aplicacién de algunos de estos métodos. 3. Aplicar adecuadamente estos métodos en el analisis microbiolégico de diferentes muestras. B. Materiales ‘Tubos de ensayo con solucién salina peptonada (SSP) para diluciones. Cajas de petri estériles Pipetas estériles de 1 ml. Agar nutritive Muestras a analizar 45Mecheros Procedimiento: 1. Acada estudiante se le entregara cuatro tubos de ensayo, conteniendo cada uno 9 mis. de SSP los cuales se marcaran con los nimeros de 1 al 4. Trabaje con el mechero encendido y flamee la boca del frasco y los tubos antes y después de hacer diluciones. 2. Después de homogenizar la muestra, tome una pipeta estéril y flamee la punta, tome 1 mide muestra y afiédalo al tubo No. 1. Esta es la dilucion 1070 1/10, 3. Con otra pipeta estéril, mezcle y tome 1 ml del tubo No. 1 y afiédalo al tubo No. 2. Esta es la dilucién 10° o 1/100. 4. Con otra pipeta estéril, mezcle la suspensién del tubo No. 2 y afiada 1 mi de ésta al tubo No. 3. Esta es la dilucién 10° 0 1/1000. 5. Con otra pipeta estéril, mezole la suspensién del tubo No. 3, tome 1 ml y paselo al tubo No. 4. Esta es la dilucién 10% 0 1/10000. 6. Con otra pipeta estéril, mezcle la suspensién del tubo No. 3, tome 1 ml y paselo a una caja de petri estéril 7. Con otra pipeta estéril, mezcle la suspensién del tubo No. 4, tome 1 mi, y paselo a una caja de petri estéril 8. Después de agregar el inéculo a la caja de petri, afiada el agar cuenta gérmenes estéril, fundido y enfriado a 45°C, a cada una de las cajas, mezclando con movimientos citculares suaves en la direccién de las agujas del reloj y luego en sentido contrario (tres movimientos en cada direccién). Esto asegura una mezcla adecuada y proporciona buenas separaciones de las colonias. 9. Deje enfriar el agar hasta que se solidifique e inctibelo a 37°C por 24 horas. 410. Cuente las colonias y dé los resultados. (Figura No. 17) Conteo y calculos: ti Seleccione las cajas que contengan entre 30 y 300 colonias. 462. Coloque {a caja de petri en la cuenta colonias. Empiece a contar las colonias desde la parte superior de la caja, utilzando las cuadriculas para separarlos y evite contar la colonia dos veces. 3. Calcule el némero de microorganismos por ml. de muestra, multiplicando el niimero de colonias por el factor de dilucién (RTG=No. de colonias X factor de dilucién). Por ejemplo: Si se conté 250 colonias en la dilucién 1:10.00. Reporte asi’ 250X104 = 250 x 10000= 2500000 microorg./ml Nota: Los resultados se dan en ntimero de microorganismos por ml. Si se toma 0.1 de la muestra se debe multiplicar por 10 el ntimero de microorganismos obtenidos. Si hay cajas con mas de 300 colonias proceda asi 4. Si por cm* hay menos de 10 colonias, cuente 13 cuadros representativos (siete consecutivos horizontales y seis que formen Angulos rectos). Muttiplique la suma de los 13 por 5. 2. Si por cm? hay mas de 10 colonias, cuente 4 cuadros representativos, saque el promedio y multipliquelo por 65 3. Si por cm hay mas de 100 colonias, reportar como mayor que 8.500 veces la dilucién correspondiente. 4, Sino hay colonias informe como menor que, una vez la dilucién menor. Todos los casos deben informarse como "Recuento Estimado Standard”. 7Figura 16. Contador de colonia 48f Agregar agar fundido ZY & Agar cuenta gérmenes liquide 0 45°C + incubar @ 37°C /24 horas. Resultado: Recuento total de gérmenes = rN # de colonias x factor ditucién fhe a” “¢, 35x10.000=350.000 bact/m! Wet Figura 17, Técnica de la cuenta en placa. 49LABORATORIO No. 10 HONGOS Introducci6n Los hongos son organismos eucaridticos, por poseer un verdadero niicleo delimitado y definido. Se encuentran ampliamente distribuidos en el suelo, en el aire y en el agua, como parésitos de plantas, animales y el hombre y como contaminante de alimentos y otras sustancias. Muchas especies de hongos descomponen la materia organica para que pueda ser utilizada por las plantas, otras especies se utllizan en procesos industriales como en la produccién de acidos, alcoholes y antibiéticos, y unos pocos causan enfermedades en los seres vivos, especialmente en las plantas. Los hongos se presentan en dos formas: Como Mohos cuando sus estructuras son de forma filamentosa y crecen en los cultivos en forma algodonosa 0 como Levaduras cuando son unicelulares y su crecimiento en los medios de cultivo es parecido al de las bacterias. Los hongos se clasifican en cuatro clases atendiendo a la forma como se producen, asi: - Zygomicotina, los que poseen esporangiosporas para la reproduccién asexual y zigosporas para la sexual, ~ Ascomicotinas, los que poseen ascosporas para la reproduccién sexual y conidiosporas para la asexual. - Basidiomicotina, los que poseen basidiosporas para la reproduccién sexual y oidiosporas o artrosporas para la asexual - Deuteromicotina, los que solamente se les conoce reproduccién asexual por medio de micro o macroconidias, 50A. Qbietivos: 1. Conocer las principales estructuras de los hongos. 2. Adquirir destreza en el cultivo e identificacién de los hongos aislados de diferentes ambientes. 3. Aplicar dichas técnicas en estudios microbiolgicos de diferentes muestras. B. Materiales Estiletes Cubre y portaobjetos HO destilada estéril Lugot Azul de lactofenol Levadura (Saccharomyces cerevisiae) Mohos (Rhizopus sp, Penecillium sp, Aspergillus sp)- Basidiomycetes (Agaricales, Poliporaceos, Telephoraceos e Hydnaceos). Deuteromycetes (Mycrosporum canis - Trycophyton metagrophytes) etc. Medios (Sabouraud - Mycosel). C. Procedimiento Observacién de levaduras 1. Tome una asada de levaduras suspendidas en solucién salina, coléquelas en un portaobjetos, cuibrala con una laminilla y obsérvelas con 10X, 43x. Haga esquemas. 2. En.un portaobjeto coloque una gota de lugol. Luego tome una asada de la suspensién de levaduras y haga una emulsién con el asa, coloquele un cubreobjeto y observe al microscopio con 10X, 43x. Trate de identificar las siguientes estructuras: Pared celular, cicatriz de yema, nucleo, vacuoles, blastoconidio, etc. Realice esquemas de lo observado. 51Observacién de Mohos 1. Examine las colonies de hongos presentes en las cajas con Agar Sabouraud y/o Mycosel. Describa su color, su contextura, su forma, etc. 2. Prepare una placa tomando con el estilete estéril una muestra del cultivo; depositela en un portaobjeto y adiciénele una gota de azul de lactofenol; luego péngale una laminilla y presione con la yema de los dedos 0 con el borrador del lapiz; observe al microscopio con 10X y 43X. Haga esquemas del tipo de hifa y érganos de reproduccién, Identifique el género del moho observado. 3. Prepare un microcultivo asi: a. Tome un portaobjeto estéril, coloquele una porcién de Agar Sabouraud de aproximadamente un centimetro por cada lado. b. Tome con un estilete estéril una muestra del cultivo de hongos y siémbrelo en el centro del agar rompiendo éste. Cubra el agar con una laminilla presionando un poco. 4. Coloque el portaobjeto en una cémara himeda. Esta consiste en una caja de petri, con un papel de filtro en su interior y una varilla de vidrio en v. e. Humedezea el papel de filtro con 1 mi, de agua. Tape la caja y déjela a temperatura ambiente. Haga observacién cada 24 horas. Una vez obtenido el crecimiento, haga preparaciones para observacién de mohos. (Figura No. 18). 4. Observe la morfologia de los diferentes Basiodiomicetos que se tienen como demostracién; haga esquemas localizando estructuras como: pileo, anillo, estipite, volva, lamela, dientes y poros. 5. Observe las colonias de los Deuteromicetes que se tienen como demostracién. Prepare placas a partir de los cullivos y trate de observar las micro y macroconidias. 52NOTA: Compare todo lo observado en el laboratorio con los esquemas de la figura No. 19. 53Portaobjetos | Agar Sabouraud LS Aso. de inoculecién — Colocar el cubreobjetos Inoculacicn de! medio Montaje en lo cémara himeda. Figura 18 Microcultivo de hongos. 54Hifa_septade Hifas en espiral Levadura 100X Aspergillus Penicillium Figura 19. Estructures generates de los hongos. 55licelio vegetative” Rhizopus Agarical ed Poliporaceo Hydnaceo Figura 19. Continuacién. 56LABORATORIO No. 11 ALGUNOS PARASITOS DE IMPORTANCIA HUMANA Introducciét La incidencia mundial de enfermedades producidas por pardsitos es extraordinariamente elevada, sobre todo en las regiones tropicales. Este hecho obliga a prestarles una atencién proferencial, especialmente porque hay gran cantidad de infectados que ignorando su condicién como tales, pueden llegar @ presentar cuadros patolégicos muy severos, En la lucha contra estas enfermedades y sus agentes causales, la divulgacién de conocimientos sobre morfologia, evolucién y modo de infestacion de los pardsitos humanos tiene vital importancia. Entre los parasitos mas importantes que estudiaremos en esta prdctica tenemos: Algunos protozoos intestinales, helmintos y hemoparasitos. A. Objetivos 1. Conocer las principales caracteristicas morfolégicas de algunos pardsitos de importancia en humanos. 2. Adquirir destreza en el manejo de las técnicas mas utilizadas en el diagnéstico de estos pardsitos. 3. Aplicar adecuadamente dichas técnicas en estudios microbiolégicos. B. Materiales Placas de demostracién Espécimenes conservados en formol Solucién salina Lugot Creso 37Muestra problema (materia fecal y sangre) Portaobjetos y cubreobjetos Observacién de Protozoos Intestinales Entre los protozoos intestinales que revisten importancia patolégica para el hombre tenemos: Entamoeba histolitica, Giardia lamblia y el Balantidium coli En las muestras, lo mismo que en las demostraciones observe las diferencias entre los trofozoitos y los quistes. (Figura No. 20). Procedimiento para un Coprolégico 1. Tome un portaobjeto limpio. 2. Coloque una gota de solucién salina en un extremo y una de lugol en el otro, 3. Con un palillo tome una pequefia porcién de la muestra de material fecal a analizar. 4. Haga emulsién primero en la gota de solucién salina y luego en la de tugol. Coloque el cubreobjeto y observe al microscopio con 10X y 40X. 5, Haga esquemas de lo observado. Observacin de Helmintos Aigunos de los helmintos que revisten importancia patolégica para el hombre son: Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Enterobius vermicularis, Taenia solium, Fasciola hepética y Anoylostoma duodenale. De estos organismos se encontraran placas demostrativas y muestras para observacién en fresco. (Figura No. 21) 58Procedimiento Para la observacién de huevos de Helmintos proceda a hacer un coprolégico segtin lo descrito anteriormente y haga esquemas de fo observado. Observacién de Protozoos Hemopardsitos Es de gran interés patolégico para el hombre el género Plasmodium cuyas especies mas frecuentes en nuestro pais son el PI. vivax y el PI. falciparum. En el laboratorio encontraran placas demostrativas y extendidos, preparaciones de gota gruesa para su tincién con el colorante de Wright. Procedimiento La toma de las muestras debe hacerse preferiblemente en un momento en que el paciente tenga fiebre. Siempre debe hacerse un extendido y una gota gruesa. - Extendido En el extremo de una placa coloque una gota de sangre obtenida de la yema del dedo. Extienda esta gota de modo que quede una capa delgada y pareja, utilizando el borde de un portaobjetos en buen estado. - Gota Gruesa En el centro de una placa coloque una gota de sangre un poco mas grande y con una aguja extiéndala en una superficie de dos cm. aproximadamente. Las preparaciones deben dejarse secar bien, especialmente la gota gruesa, para esto se recomienda la estufa a 37°C por 2 6 3 horas, o temperatura ambiente por 12 horas. - Coloracién con Wright (Gota gruesa) Antes de colorear la gota gruesa se debe deshemogiobinizar. Para esto se cubre con un poco de agua, se deja unos minutos hasta que la gota quede 59blanca y el agua que la cubre haya tomado el color rojizo de la hemoglobin, después de dejarla secar bien se colorea igual que el extendido. Procedimiento 1. Se cubre la placa con el colorante de Wright por 3 minutos. 2. Se le agrega igual volumen de agua destilada o solucién tampén pH 6.7 y se deja por 5 minutos. 3. Se lava con agua corriente y se deja secar. 4, Se observa al microscopio con objetivo de inmersién 5. Haga esquemas de lo observado. Coloracién de Giemsa - Gota Gruesa ‘Sumerja la lamina en azul de metileno fosfatado durante un segundo. 2. Lavar rpidamente sumergiendo la lamina en dos cambios de agua destilada neutralizada (Buffer), para eliminar el exceso de azul. 3. Agregar Giernsa diluida (una gota por cada cc. de solucién tampén) a la lamina hasta cubrir toda la preparacién. Dejar actuar el colorante durante 6 a 10 minutos. 4. Lavar con agua destilada y neutralizada 0 con agua del chorro. Dejar esourtir. 5. Observar al microscopio. 6. Haga esquemas de lo observado. ~ Extendido 4. Sumerja la preparacién en alcohol metilico 1 2 3 minutos, esta fijacién es instantanea. 2. Lavar con agua.. Deje actuar el colorante durante 30 - 40 minutos. El colorante se debe preparar momentos antes de tefiir, afiadiendo 2 gotas de solucién de colorante Giemsa, por cada ce. de agua destilada tampon pH 7.2. Lave rapidamente solo por un instante con agua. Deje secar. 5. Observar al microscopio con objetivo de 40x. 6. Haga esquemas de lo observado. 61Cuerpos cromatoides romating Glucogeno Pored b Entomoeba histolytica. 2. Trofozoito, . Quiste con cuatro adcleos. Membrana_celutar Fiageto J sie a Z Giardia lamblia «a. Trofozoito Bolontidium coli Figura 20. Observacién de protozoos intestinales. 628. Trichuris trichiura. Huevo C Enterobius vermicularis. Huevo Figura 21. Observacién de helmintos. 63Escolex Progiétide _grdvido Fasciola hepética | Anevtostoma duodenale Figura Zl. Esquemas .de olgunos pardsitos del hombre ContinusciénLABORATORIO No. 12 ANALISIS BACTERIOLOGICO DE LA LECHE Introducci6n La leche se ha dicho que es el alimento “casi perfecto" para el hombre. Su valor nutritive se refleja en sus componentes principales como proteinas, carbohidratos, grasas, minerales, vitaminas y agua. Es también un excelente medio para el desarrollo de muchas bacterias. Desde el momento en que es ordefiada, adquiere microorganismos y se sigue contaminando durante su manejo y procesamiento. De estos hechos se deduce la importancia que tiene detectar la presencia de microorganismos en la leche, pues ademés esta puede servir de vehiculo de enfermedades como la tuberculosis, brucelosis y fibre Q._ La informacién sobre su contenido microbiano es usada para juzgar su calidad sanitaria. La Asociacién Americana de Salud Pblica en su publicacién, "Métodos estandares para el examen de la leche y sus derivados" incluye pruebas microbiolégicas y quimicas y sus procedimientos. Las pruebas mas utiizadas en el laboratorio son - Prueba de la reductasa. - Recuento total de bacterias existentes en la leche. - Determinacién cualitativa y cuantitativa de coliformes. PRUEBA DE LA REDUCTASA Esta prueba se basa en la variacién en el potencial éxido - reduccién, la cual depende del ntimero de microorganismos y la clase de metabolismo de éstos. Esta desviacién se puede detectar agregando un indicador adecuado a la 65muestra de leche e incubando en condiciones especificas. El azul de metileno y la resazurina son dos indicadores del potencial de 6xido - reduccién (O/R) Forma oxidada en la leche Forma reducida en la leche Azul de metileno +2H* Leucoazul de metileno (zl) > (Incoloro) Resazurina 42H" » Resorufina (Rosado) (Azul intenso) Dihidroresorufina (incoloro) A. Qbietivo Conocer esta técnica para el andlisis bacteriolégico cualitativo de la leche. B. Materiales Leche cruda y pasteurizada Azul de metileno (1:25.000) 0,04 gr, en un litro de agua Resazurina comercial Tubos de ensayo con tapa de rosca Pipeta de 10 ml, 1 ml Incubadora Bafio Maria Procedimiento Tome un tubo de ensayo y agréguele 10 mi. de la leche a analizar. Adicione 1 mi. de azul de metileno 0 de resazurina. erynso Incube a 35°C 0 Bario Maria y observe a intervals de 15 minutos para detectar los cambios, Not decolorarse, No agite los tubos. Registre el tiempo que le tome a cada tubo el Es importante registrar el tiempo de decoloracién, ya que hay una relacién inversa entre el tiempo y el numero de bacterias por unidad de volumen de leche.Clasificacién de Ia leche segiin el tiempo de decoloracién 4°. Clase excelente, no se decolora en 8 horas 28. Clase buena, se decolora entre 6 y 8 horas. 3. Clase regular, se decolora entre 2 y 6 horas. 4°. Clase mala, se decolora en menos de 2 horas. RECUENTO TOTAL DE BACTERIAS EXISTENTES EN LA LECHE En la leche podemos diferenciar una flora bacteriana normal caracteristica y una flora bacteriana que adquiere durante su manejo y proceso, llamada "flora bacteriana adquirida". A. Obietivos: 1. Adquirir destreza en la utilizacién de las técnicas empleadas para el recuento total de bacterias existentes en una muestra de leches. 2. Capacitar al estudiante en la aplicacién y la interpretacién y de los resultados obtenidos. B. Materiales 6 cajas de petri vacias y estériles, 6 tubos de ensayo cada uno con 15 mis de agar cuenta gérmenes estéril. 6 tubos de ensayo tapa rosea cada uno con 9 ml. de solucién salina peptonada (SSP) estéril 6 pipetas de 1 ml estéril. 1 erlenmeyer con 100 mis de leche 1 inoubadora Contador de colonias. 07C. Procedimiento’ 4. Rotule los tubos que contienen S.S.P, de 10" a 10° y las cajas de petri por duplicado de 10% a 10°. 2. Agite la muestra de leche con el fin de homogenizaria lo mejor posible. (Evite mojar el tapén), 3. Con una pipeta estéril tome 1 ml de leche y agréguelo al tubo 10, sin introducir la punta de la pipeta en la S.S.P. y después de agregar la leche. Descarte la pipeta y agite el tubo varias veces. Repita el mismo procedimiento hasta la dilucién 10°. 5. En la dilucién 10% no descarte la pipeta. Manténgala en la mano. Agite el tubo, destdpalo, flaméelo, saque 1 ml. y depositelo en la caja de petri rotulada10™, luego sin agitar tome 1 mi y depositelo en la segunda caja rotulada 10%. 6. Descarte la pipeta. 7. Continue el mismo procedimiento para las diluciones 10° y 10°. 8. Después de tener listas las cajas de petri (con sus respectivas muestras), doje enfriar el agar cuenta gérmenes hasta 45°C aproximadamente. 9. Cerca al mechero, destape el tubo con el agar, flaméelo y viértalo dentro de la caja de petri, sobre el ml, de muestra; tape la caja y sobre la mesa rétela suavemente en el sentido de las manecillas del reloj y luego en sentido contrario (9 veces en cada caso). 10.Deje solidificar el agar e incube a 37°C por 48 horas haciendo observaciones cada 24 horas. Haga el recuento de las colonias y los célculos respectivos para cada dilucién del numero de bacterias viables en la muestra original, seguin el método ya conocido. (Figura No. 22). DETERMINTACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE COLIFORMES La presencia de coliformes en una muestra de leche nos indica contaminacin fecal. Escherichia coli ha sido considerada como un indicador de dicha