Aplicagées da Genética Molecular PANORAMA Terapia génica melhora a visao de crianga com cegueira congénita ‘A primeira caracteristica diferente que Nancy e Ethan Haas rnotaram em seu flho Corey foi que ele rramente mantinha miedo» Jescobrl- ram que ele tinha um distirbio hereditrio rao conhecido como amaurose congénita de Leber tipo Il. Os médicos disseram aos pais que ele provavelmente estaria cego aos 40 anos €, por i380, Corey comecou a aprender braille preparando-se para a cegueira* ‘corey Haas joganly videvgente ies Ua (eiaple genie que reo rou sua vis8o, Corey tem amaurose congentia de Leber tipo I, um ‘stro hereditaioraro que limita sua Visdo e causaria ceguelra sem a terapia génica Waters R Oriaher 94, 9M Gene Therapy Eves Sight tn Rind Children sith Rave Disorder. wos bloomberg com apps/news?pid= nesatchiveRsid= arwBSNT9QNey. © Uso de tecnologia do DNA recombinante para identificar genes humanos e diagnosticar doencas humanas > Terapia génica humana > Analise do perfil de DNA > Producao de proteinas eucaristicas em bactérias > Animais e vegetais transgénicos » Genética reversa | Anélise de processos, biolégicos por inibicdo da expresso génica 'A amaurose congénita de Leber & causada por mutagbes au- ‘ossémieas recessivas em um de pelo menos 20 genes diferentes. © tipo il, forma mais grave da doenga, é causado por mutagbes no gene RPEG4, expresso em célulasepitelias pigmentares da re- tine (CPR) que produzem o pigments rodopsine pare o3 fotomre- ceptores da parte posterior do olho. Na auséncia do produto do Bene RPE64, hd degeneracao dos fotorreceptores e consequente Esse tipo de cegueira ndo é restrito aos seres humans; tarn- bbém acomete outros mamiferos, principalmente cachorros. Na verdade, «> 1iutayde> na ve cantina Ue PEG 38 CUI Wt aca Briard e causam um tipo muito semelhante de cegueira. Em 2001, cientistas da Univesity of Pennsytvania demonstraram que poderian restaurer partialinente @ visdu Ue caclorius Leyes por iniecdo de cbpias dos genes RFE6A funcionais nas células da retina Esse trabalho abriu caminho para ensaios semelhantes de terapia _génica em seres humienos que tinham o distro heredtao O primeiro desses ensaios de terapia nica em seres humanos foi realizado no Children's Hospital of Philadelphia e no Reino Uni- ddo,em 2008, 0 objetivo desses estudos era testara seguranca do rmétodo de terabia eénica usado. Em todos os casos, um olho era ‘ratado € 0 outro, nfo. Os resultados iniciais mostraram que que- {10 dos seis adultos ovens tratados com genes RPEGA com fungao adequada apresentaram melhora da visdo no olho tratado, No en tanto, com base nos resultados obtidas em cachortos, os pesqui- sadores previram que a resposta a terapia genica sent metnor em riancas porque elas tém mais células retinianas intactas que os440 fundamentos de Genética adultos." Outros nove pacientes foram tratados, inclusive quatro iancas de Ba 11 anos,e os resultados foram impressionantes. As a A Resultados ne A AX & Contoles 12.348 6 7B 9 tori 12iaid 15 161718 19 2021 20 23 2426.26 27 28 29 30 ~ 4B repeticdes CAG mgs ogee ~ 1B repeticdes CAG 1m FIGURA Tez Teste das regioes de epeticao trinucleotsica expandida (A) no gene hurtingtnresponsavels pla doenca de Huntington por CR. Os resultados mostrados em (B)sdo de uma faa venezuelana na qual os pas so heteroigotos para o mesmo alelohuntingtin mutant. ‘Aordem de nascimento des ciancas foi modifcada, eo sexo no 6 indicado para peservaro anonimato. A maixia das pessoas fo submetida 20 teste duas vezes para minimizar eros.Capitulo 16 | Aplicacbes da Genética Molecular 443 Emfoco a © SINDROME DO X FRAGILE REPETICOES. TRINUCLEOTIDICAS EXPANDIDAS secre de igh segunda forme mas com r= A siteesioniac esis casi \drome de Down: ver Capitulo 6). As pessoas com singrome do X tal agesetan canbrometinete mera senda tanbén ped apeertasronraidees sede cra Petco nial eesebnlimarnp resins tse {Tem eala 7000 rads Estados de hedges om (or € conels por Une tla donee tie a com perce nol Cra 20% ds homer agro ¢ son es murs hetero esas A sore ao Xtal toi dss mann ar aca aura reyes recente er sei Dera deFangten Cudos cas moscrom que a sire doX fg est sounds a una nob loge etal cla ce ‘ads nasi emda ede en aroma ura cons pero da creado boo lnge do comoaro Soretarte Go aomosaa [Figure 1A) dl stom comosiro righ rm soguids a andie molecular motrou que eee cromoe- somo contém uma repetio trinuleotiica instvel, (CG), no So ap ess repetiav esa loca rego 5-80 Vale 2ida de um gene designado FMR-1, dongles Frage X mental retar- dation gene 1 (gene do retado mental do X fii 1) (Figura TB). © produto prateico desse gene, designado FMRP, acumulase nos est uli em Bp formadas, a regi8o da repeticlo pode ser muito expandida. Isso » Dn potmerase [ADNA polmerase “deslia” de ‘vote ses trnuceatidos © omega a epicar a mesma rege overnente, 3 TEC EO COC Ee ECC ECeC ECC Oe ETE 7 DNA poimerase explical poe cm meiicnpaiblrhreary sunt aercio para geracso. Deo eT an aps # decoders dt epe kao treo instivel no gee FT, outo dstrbioneurodegeneratv,aatoia rrr espinobubae (também conhecda como doeng de Ken- ned) fi asocada a uma repetca trnucletiiainstve dessa vez (CAG), Desde eno se demonstrou que outros cistirbios eu redapoerior hs eae pocropssee Wace oye ides. O mai bem conhecido a doenca de Hartington. Potato, oo lialagoes aL epee Nin Ace jira pet Um tiga importante ce deeto genético em nossa espéce © Oni polmerserepicando una reoeteso rucetiia C60 2 TUCceec eer eetee 7 A polinerase (0“grampo"é removido por un processo de reparo do UNA. Se GGE6 piLisc ces cececes scecce sceccceccocceC cece Cece GCCoC EC CoCE GE CoCEECEGCEGEL, ‘Repetoao winuceotca expanada 1 FIGURA 2 Um possivel mecanismo de expansio das repeticbes trnuceatidicas. Durante a replicacao da repeticao em série, a DNA polimerase sai do flamento-molde,desiz para trsereiniciaasintese em uma rego jé repicada. O grampo forrnado em vrtude do clicersente 4 fecanhessde coma ar dfs por ie airs deiepere d6/DNA Guetricia poset defepiara, Unis DMA pales {que participa da via de reparo catalisa a sintese de um filamento complementar ao grampo nao dobrado, praduzindo uma regiéo de repeticao de tnnucleotidios expancida,Capitulo 16 | Aplicacbes da Genética Molecular 445 Brenan ‘a Teste de alelos mutantes causadores de retardo mental na sindrome do X fragil PROBLEMA © segundo tipo hereditéio mais comum de retardo mental em se- ‘eshumanes € causa por replies uincletiices CGC expen dias no gene FMR-1 (gene do retard mental do X frig 1). Veja detathes em Em foc Sindrome do X fl erepetiestrinuleot- Leia aresposta do problema ne site ‘ttp:1/gen-io.grupogen.com.br. de DNA contra um acusado de estupro. Depois de um Jillgamento anulado, 0 suspeito fol lbertado. ‘Tres meses depois, ele estava novamente diante do juiz, acusaco de ‘outro estupro, Dessa vez, 0 juiz permitiu que promo- tor apresentasse uma anilise estatistica dos dados com base em estudos populacionais apropriados. A anise mostrou que a probabilidade de que a correspondéncia ‘entre os perfis de DNA preparados a partir de residuos de sémen encontrados na vitima e o perfil de DNA do suspetto fosse obra do acaso era de uma em 10 bilhoes. Dessa vez o suspeito foi condenado. Nao restam diividas sobre o valor dlos perfis de DNA em processos desse tipo ‘quuanily sv ubsidlas boas aniustray de weilos ou cetulas na cena do crime. Quando realizados meticulosamente por cientistas treinados e interpretados de modo con- servador, usando dados populacionais vilides sobre as frequéncias dos polimorfismos implicados, os perfis de DNA podem ser um mstrumento muito necessano e eh iente na Iuta incessante contra o crime. ‘A Figura 16.14 ilustra o tipo de perfis de STR usados ‘em processes judiciais, Para simplificar, sio mostrados os perfis de DNA de apenas 4 dos 13 loci STR do CODIS padronizados. Na pratica, seriam comparados os perfis doe 13 foci O perfil de TNA proparado a partir dn sangue seco na cena do crime corresponde ao perfil de DNA do suspeito 2, mas nao ao perfil do suspeito 1. E claro que cesses perfis de DNA correspondentes nao sio suficientes para comprovar que 0 suspeito 2 cometeu o crime, mas, se combinados a outros perfis de DNA e a outros sinais, constituem forte indicio de que suspeito I esteve na cena do crime. Talvez 0 mais importante seja que esses Sangue na cena do crime Parse niceties: 126 145160185 205-725 245708 (285308320 es Pi ee ees oes Pes eat ete 1.0004 , Un 16 jrescénla ‘elativa: ay 79 13 o4 Loras SW Tan Trae TSFIPD Suspeito 1 Pars dermaletios: 125 146166 185 205, 226 245265 286 305 326, 1.000 -| 10 United Womeredata reise. 500 4 ° Locus STR: wa THOL TPOK sFiPO Suspeito 2 Pores de ucletios: 126 145 165185205225 4G 265286 06325 1.0004 7 United juorescénca ; 10 forests soy | 14) 15 t ‘ ° LocusSTR: WA THOL TPOK csFIPO 1m FICURA 16.14 Pefis de DNA de quatro loc STR preparados a partir de DNA isolado de sangue seco, encontrado no local de um crime, e de sangue coletado de dois suspeitos. Na paticaforense,seriam comparados os pefis de ONA dos 13 faci STR do CODIS.perfis mostram claramente que as células na mancha de sangue no eram do suspeito 1. Assim, os perfis de DNA. ‘mostraram-se inestimaveis para reduzir a frequencia de conviccées erradas, e em varios casos inocentaram pes soas que estavam presas por crimes que nao haviam co- meta. A comparacio dos perfis STR dos 18 loci do CODIS, talvez complementada por dados do DNA mitocondrial, PONTOS ESSENCIAIS Capitulo 16 | Aplicacbes da Genética Molecular 459 praticamente exclui a possibilidade de correspondéncia casual dos perfis de DNA de duas pessoas. Na verdade, a chance de que duas pessoas brancas sem parentesco, de uma populacio nao endogimica, tenham perfis de DNA idénticos nos 18 loci do CODIS € de aproximadamente uma eu 5,75 uilliGes, Nav vesta Uivida de que « audlise do perfil de DNA é um instrumento eficiente em casos de identificacdo pessoal. + Os perfs de DNA detectam e registram polimorfismas nos genomas dos individuos (Os perf de DNA ofeecem fortes indicos de identidade individual, indicis que so cextremamente iteis em procesor de poternidade forenses Produgao de proteinas eucaridticas em bactérias ‘A insulina humana, o horménio de crescimento humano € outras proteinas eucariéticas uteis podem ser produzi- dos de modo econémico em bactérias modificadas por engenharia genética. Durante décadas, os microrganismos foram usados para produzir substncias importantes para os seres humanos. ‘Todos nés estamos cientes do impacto dos antibidticos sobre a saiide humana, mas nem todos conhecem sua im- portancia econdmica. O valor de mercado atacadista de Antibioticos nos EUA € superior a dois bilhoes de dolares anuais. Os micrébios também tém papéis importantes nna producao de muitas outras substincias, por exemplo, farmacos antifingicos, aminoicidos ¢ vitaminas. Toje, gracas a engenharia genética, as bactérias esto sendo usadas na producio de importantes proteinas eucarié- ticas como a insulina humana, horménio do crescimento humano e toda a familia de interferonas humanas, Além disso, microbios modificados por engenharia genética estio sendo usados para sintetizar enzimas titeis € outras moléculas orgénicas e para propiciar mecanismos meta- litus para ¢ desintuaivayay de puluciies © a wuuversau de biomassa em substancias biocombustiveis. HORMONIO DO CRESCIMENTO HUMANO Em 1982, a insulina humana tornouse o primeiro suces s0 comercial das novas tecnologias de recombinagio do DNA na drea farmacéutica. Desde entio, varias outras proteinas humanas com utilidade medicinal foram sin- tetizadas em bactérias. Algumas das primeiras protefnas humanas produzidas em microrganismos foram o fator VHT da coagulayan sat ‘com um tipo de hemofilia), o ativador do plasminogé- nio (uma proteina que dissolve os coagulos sanguineos) ¢ © horménio do crescimento humano (uma proteina deficiente em alguns tipos de nanismo). Analisemos, por ‘exemplo, a sintese de horménio do crescimento humano (hGH) em E. coli. © hGH. necessério para o crescimento normal. € uma cadeia polipeptidica simples de 191 aminodcidos. Ao contrério da insulina, os hormOnios de crescimento suino e bovino so inativos em seres humanos. Somen- te 05 horménios de crescimento humano ou de prima- {a9 préximoa aio atives em serea humanos. Asim, antes de 1985, a principal fonte de horménio do crescimento adequada para tratamento de seres humanos eram os ca- daveres hnmanos. Para obter expressio em F. cali a se- quéncia codificadora do hGH tem de ser controlada por elementos reguladores de £. colt. Portanto, a sequencia codificadora de hGH foi ligada as sequéncias promotoras € de ligacio de ribossomos do 6peron lac de B. coli (um conjunto de genes codificadores de proteinas necessirias para o crescimento na presenga do agiicar lactose; veja 0 Capitulo 18). Para isso, um sitio de clivagem Hadll na trinca de pares de nucleotidies que especifica 0 eéeon 24 do hGH foi usado para fundir uma sequéncia de DNA sintética codificadora dos aminodcidos 1 a 23 a una se- quéncia parcial de CDNA codificadora dos aminoacidos 24a 191. Depois, essa unidade foi inserida em um plas- midio que tinha os sinais reguladores lac ¢ introduzida em E, coli por transformacao, A Figure 16.15 mostra a es- trutura do primeiro plasmidio usado para produzir hGH em E. coli O hGH produzido em E. coli nesses primeiros expe- rimentos continha metionina ma terminagao amino ( metionina especificada pelo oédon iniciador ATG). O hGH nativo tem uma fenilalanina aminoterminal:inicial- mente hé uma metionina, mas que depois é removida por enzimas. A E. coli também remove muitos resfduos ‘metionina aminoterminais apos a traducao. No entanto, a excisio da metionina terminal depende da sequéncia, as células de E. coli nio excisam 0 residuo metionina joerminal do hGH. Todavla, © NGH simedizado em E, coli € totalmente ativo em seres humanos apesar do aminodcido extra. Mais recentemente, uma sequéncia de DNA codificadora de um peptidio sinalizador (a se- quéncia de aminodcidos necessiria para transporte de proteinas através das membranas) foi acrescentada a ima constmucio do gene HGH semelhante a0 mostrado460 Fundamentos de Genética Sequencias promotoras ede lgapao de nbossomos em lade E. cof amor of 1m FIGURA 16:15 Estrtura do primeiro vetor usado para produzir horménio do crescimento humano (HGH) em E. coll © gene amp* provoca resistincia 8 ampicilna: or origem de replica do plasmiio. Os aminoscidos so numerados até 191 a partir da terminacio amino. nna Figura 16.15. Depois do acréscimo da sequéncia sina- lizadora, 0 hGH é secretado ¢ corretamente processado; ou ea do peptidio sinalizador durante o transporte do produto pnimario da traducao através da membrana. Esse produ- 0 € idéntico ao hGH nativo. Em 1985, 0 hGH tornouse © segundo produto farmacéutico de engenharia genéti- ca aproyaily para uso en seres Ihumanus pela Food au Drug Administration norte-americana. A insulina huma- na produzida em E. cali havia sido aprovada para uso por diabéticos em 1982, removide com o restante , © resfduo metionina PROTEINAS COM APLICAGAO INDUSTRIAL Algumas enzimas com importantes aplicagdes indus- dais vou sculy produsidas pus de microrganismos para sintetizé-las. Por exemplo, pro- teases sio produzidas por Bacillus licheniformis e outras bactérias. Fssas proteases sio amplamente empregadas como aditivos de limpeza em detergentes e, em menor quantidade, como amaciantes de carne e como auxilia- res da digestio em rages para animais. As amilases sio ‘usadas em larga eccala para quebrar carboidratos com plexos, como 0 amido, em glicose. Depois, a glicose 6 convertida em trutose pela enzima glicose isomerase, € cessa frutose é usada como adocante de alimentos. As amilases € a glicose isomerase sio produzidas por pro- cessos microbiologicos. ‘A proteina renina é usada na fabricacio de queijos. Antes do advento da engenharia genética, a renina era extraida da quarta cimara do estémago de boi. Atual- mente, bactérias modificadas por engenharia genética sao usadas para a producao comercial de renina, Esses ‘exemplos sio todos de proteinas que tiveram importan- tes aplicacées industriais durante algum tempo. No fu- ary, puesivs espera yur a> vejaut produzidas ¢ usadas em aplicagdes industriais por causa da facilidade de produzir essas proteinas por microrga- nismos recombinantes (ou por vegetais e animais trans sgénicos; ver préxima secao). PONTOS ESSENCIAIS = Protenas sts que s6 ram ixoladas de eucaroto om popuena quamtidade «a um custo ‘elevado agora podem se produidas em grande quantidade em bactris modifcadas por engenarica genitive + Proteinas como a insulina humana ¢ 0 horménio do crescimento humano si férmacos iteis no tratamento do diabetes ¢ do nanismo hipofisari, respectivamente,Capitulo 16 | Aplicacbes da Genética Molecular 461 Animais e vegetais transgénicos Genes sintéticos, modificados ou outros genes exdgenos podem ser introduzidas em animais e vegetais, e os orga- nismos transgenicos resultantes podem ser usados para ectudar as funcfies dos genes, par exempla, por mutagé- nese insercional, para criar novos produtos ou pare servir cde modelos animais para estudos de doencas humanas hereditérias Embora escape a finalidade deste livro a anélise comple- ta dos métodos usados para produzir animais vegetais transgénicos, examinemos alguns procedimentos comuns algumas aplicagées iniciais das tecnologias de recombi- znacio do DNA no melhoramenta de animais e vegetais. ANIMAIS TRANSGENICOS | MICROINJEGAO DE DNA EM OVOS. FERTILIZADOS E TRANSFECCAO DE CELULAS-TRONCO EMBRIONARIAS Muitos animais diferentes foram modificados pela in- trodugio de DNA exégeno. O camundongo, porém, foi ais estudado que qualquer outro vertebrado, € nés li mitaremos a andlise das técnicas usadas para produzir animais transgentcos aquelas usadas em camundongos. Existem dois métodos gerais de inserir transgenes em ‘cromossomos de camundongo. Um requer a injecao de DNA em ovdcitos fertilizados ou embrides ¢ 0 outro, a transfeccéo de células-ronco embrionérias em cultura. s primeiros camundongos transgénicos foram pro- duridas por miceninjogin de TNA em neAcitos fort zados. Na verdade, esse procedimento foi usado quase exclusivamente para produzir porcos, carneiros, bois € ‘outros animais domésticos transgénicos. Antes da mi- croinjecao de DNA, 0s ov6citos s40 removidos cirurgica- mente da mae e fertilizados in vitro. O DNA é mieroinjeta do no promticleo masculino (o micleo haploide oriundo do espermatozoide, antes da fusio nuclear) do ovécito fertilizado através de uma agulha de vidro de ponta mui- to fina (Figura 16.16). Em geral, injetam-se varias cente- jos millares de cOpias do gene de interesse em cada ovécito, € com frequéncia ocorrem miltiplas inte- gracbes. Ao contrario do esperado, quando miltiplas c6- pias ce integram ao genoma, geralmente isso ocorre em arranjos com encadeamento cabeca-cauda em um tinico sitio cromossomico. A integracao das moléculas de DNA. injetadas parece ocorrer em sitios aleat6rios no genoma. Como 0 DNA é injetado no ovcito fertlizado, a in- Weytayau dea mivléculas de DNA inyjciadas yeralineute ocorre no inicio do desenvolvimento embrionério. Logo, algumas células da linhagem germinativa podem ter transgene. Como seria esperado, os animais desenvolvi- dos a partir dos ovécitos injetados — denominados geracio G,~ sa0 quase sempre mosaicos geneticos; algumas ce- lulas somaticas tém o transgene e outras, nio. E preciso © oDNAE inetd 00 rae de um rig. ‘© 0 zigotoinjetaco ¢ lnplaniady en wna fémea de camundongo erie. “6 o punigtads¢ esquisado em cade fihote para identficar ccamundongos transgenicos. 1m FIGURA 16.16 Produgio de camundongos transgenicos por injegdo de DNA em ovécitor, que ao implantados em fEmeas para completar ‘seu desenvolvimento Cruzar os animais transgenicos inciais (G,) € produar a prole G, para obter animais nos quais todas as células te- nham o transgene. Na maioria dos casos em que a heran- 62 foi estudada, os transgenes foram transmitidos para a prole de maneira estavel. outro procedimento atualmente usado em larga es- cala para pradurir cammndangos tranegénions depende da injecdo ou transfeccio de DNA em grandes popula- bes de células cultivadas derivadas de embriges de ca- mundongo muito jovens (Figura 16.17). Essas oflulas-tronco ‘embrionérias (ou CTE) provém da massa celular interna, um grupo de eélulas encontrado no estigio de bldstula de embrides de camundongo. Essas células podem ser cultivadas in vitr, transfectadas ou injetadas com DNA e, depois, introduzidas em outros embrides de camundon- go em desenvolvimento, Algumas das CTE introduzidas podem acidentalmente contribuir para a formagao de tecidos adultos; a0 nascer, o camundongo é constituido de uma mistura de dois tipos de células, suas préprias oé- lulas eas células derivadas das CTE cultivadas (e poszivel mente transfectadas). Esses camundongos sio denomi- nados quimeras. Se as CIE contribuirem para a linhagem germinativa da quimera, hé uma chance de que 0 DNA. estranho introduzido seja transmitido para a proxima gelayay. Porn, a reproduyay endogamics de wun co mundongo quimérico pode criar uma cepa transgénica. ‘Os camundongos trangénicos sio produzidos rotinei- ramente em laboratérios do mundo todo, jé tendo sido criadas milhares de linhagens transgénicas. Eles proven :nstrumentos ute1s para o estudo da expressao genica em mamiferos ¢ um excelente sistemamodelo para testar462. Fundamentos de Genética GF rexssarenio de camndonens x de uma linhagem de pelagem af escra pre tr ens to ‘estigin de Basteisto Massa NS Beet © Cultura de CTE da massa Basocsto( T°) ins celta, “@ transteccao das SS SS... OER mareador(*. & x @ > Ineo das CTE = 5 trenstetadas em um bastoesto de pais de pelagem Ln clare, Hevea « SB ecto co pseudogrvia astocist neta em uma femea de petagem clare para ber pre de plage ‘larayescura (gamer) ‘Camundongo de Quimera ys re pesagem etre “ et x QS “@ Acasalamento da quimera com ‘un canuundong Ue pelagen clara para obter a prole. FON Gbeumaosaaipoae : aes & ‘se contém sequéncias de DNA se eee Sraningn soph CCamundongo de Camurdongo de prlegem cara pelogem esure (no transgénico) (possivelmente transgénico) |B FIGURA 16.17 A produgo de camundongos transgénicos por tec- nologia de clilas-tronco embviondrias (TE) 0s varios vetores de transferéncia de genes € as metodo- logias para possivel uso em seres humanos. Na maioria dos casos, os transgenes apresentam padroes normais de heranga, indicando que foram integrados ao genoma do hospedeiro. Nés apresentamos uma importante aplica- ao dessa tecnologia na seco Mutacdes knockout em ca- ‘mundongo, adiante neste capitulo. ‘Um dos primeiros experimentos com camundongos ramsgénicos mostrou que @ velocidade de crescimento poderia ser aumentada pela expresso de genes de hor ménio do crescimento de ratos, bois ou seres humanos ‘em camundongos (Figura 16. de animais a questionar se a introducao de (1) cépias adi- ionais do gene do horménio do crescimento homélogo (da mesma espécie) ou (2) c6pias de genes heterdlogos do horménio do crescimento de espécies aparentadas puderian estiuular 0 Wescineny dus auiiuiais domes ticos. Assim, os cientistas especializados em animais in- ‘roduziram transgenes do horménio do crescimento em porcos, peixes e galinhas com o objetivo de estimular crescimento, ‘Outro uso possivelmente importante de animais trans- génicos € a producio ea secrecio de protefnas titeis do |. Tazo levou os melhoristas |B FIGURA 16.18 © camundongo transgénico @ esquerda, ue tem um gene quimésco do horménio do crescimento, tem aproximadamente ‘0 dobro do tamanho do camundongo-controle &dreta, leite. Muitas proteinas humanas nativas contém grupos Iaterais de carboidratos ou lipidios que sio acrescentados apdsia tradugao. As bactérias nao comtém as enizimras que catalisam 0 acréscimo dessas poredes as proteinas nas- ccentes. Nesses casos, nao possivel usar bactérias recom- binantee para sintetizar 0 produto final; elas sintetizario © polipeptidio apenas em sua forma nao modificada. Por ‘esse motivo, alguns pesquisadores tém explorado outros ‘métodos de producao de protefnas humanas titeis, sobre- tudo glicoprotefnas e lipoprotefnas. Na verdade, as célu- tay de cammundougy © heemater em culuura S20 Cou usadas para a producio de proteinas humanas com aj cacao medicinal. VEGETAIS TRANSGENICOS | © PLASMIDIO TI DE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ‘Os methoristas de vegetais modificaram as plantas gene- camente durante décadas. Hoje, porém, podem modifi- car diretamente o DNA das plantas ¢ rapidamente acres centar genes de outras espécies aos genomas vegetais por técnicas de recombinagio do DNA. Na verdade, 03 vege tais transgénicos podem ser produzidos por varios proce- dimentos diferentes. Um procedimento usado em larga scala, conhecido como bombardeamento com microprojétes, € feito por disparo de particulas de tungsténio ou de ‘ouro revestidas de DNA para denuo das células vegetals. ‘Outro procedimento, conhecido como eletroporacéo, usa um pulso breve de eletricidade para introduzir 0 DNA ras eélulas. No entanto, o método mais usado para a eria- cao de vegetais transgénicos, ao menos em dicotileds- reas, € a transformagdo mediada por Agrobacterium tumefacens. A.A. tumefaciens € uma bactéria do solo que desenvolveu‘um sistema de engenharia genética natural; contém um segmento de DNA que é transferido da bactéria para as ‘céluias vegetais. Uma caracteristica importante das células vegetais é sua totipoténca — isto é, a capacidade que tem uma tini- ca célula de produzir todas as células diferenciadas do vegetal maduro. Muitas células vegetais diferenciadas sio capazes de sofrer desdiferenciacao até o estado em- brionério e subsequente rediferenciagio em novos tipos celulares. Assim, nao ha separacio entre células da linha- ‘gem germinativa e células sométicas como em animais anperiores Reea totipaténcia das céhulae vegetais & uma importante vantagem para a engenharia genética porque permite a regeneracio de plantas inteiras partir de cé- Tulas somaticas modificadas individuais. A.A. tumefaciens & 0 agente causador da doenca ga- Ihada-coroa de plantas dicotiledéneas. O nome referese as galhas ou tumores que surgem com frequéncia na co- roa (jungao entre a raiz € 0 caule) de vegetais infectados. Como a coroa da planta geralmente est localizada na superficie do solo, esse € 0 local de maior probabilidade de lesdo da planta (p. ex., por abrasdo do solo quando a planta é balancada por um vento forte) e infeccio por ‘uma bactéria do solo como a A. tumefaciens. Ap6s a infec- Gu de uma lesay pus A. (umefaiens, ovotien vis events principais: (1) as células vegetais comecam a proliferar e formar tumores (2) comecam a sintetizar um deriva- do da arginina denominado opina. A opina cintetizada geralmente € a nopalina ou a octopina, dependendo da linhagem de A. tumefaciens, Essas opinas sao catabolisadas ¢ usadas como fontes de enengia pelas bactérias infeccio- sas, As linhagens de A. tumefaciens que induzem a sintese de nopaliana podem crescer em meio com nopalinn, mas ndo com octopina, e vice-versa. E claro que se desen- volveu uma intertelacao interessante entre cepas de A, tumefaciens e 08 vegetais hospedeiros. A A. tumdfacions € capaz de desviar os recursos metabélicos do vegetal hos- pedeiro paraa sintese de opinas, que nao proporcionam heneficin aparente para 0 vegetal, mas propiciam a she sisténcia da bactéria. ‘A capacidade de A. tumefaciens de induzir a galna- -~a-coroa em vegetais é controlada por informacées ge- néticas presentes em um grande plasmidio (cerca de 200,000 pares de nucleotidios) denominado plasmisto Ti ‘em razio de sua capacidade de induzir tumores (do in- glés, tumorinducing). Dois componentes do plasmidio Ti, © DNA e a ragio vir, sio essencizis para a transfor. macio de células vegetais. Durante o processo de trans- formacao, 0 FDNA (do inglés, Transferred DNA, DNA transferido) é excisado do plasmidio Ti, transferido para ‘uma célula vegetal e integrado (inserido de modo cova- Tete) nv DNA de célula vegetal. Oo dads Uinpuuitvein indicam que a integracio do T-DNA ocorre em sitios ‘cromoss6micos aleat6rios; além disso, em alguns casos, ‘ocorrem varios eventos de integracio do TDNA na mes- ‘ma célula. Em plasmidios Ti do tipo nopalina que anali- saremos, 0 LDNA é um segmento com 23,000 pares de nucleotidios e 13 genes conhecidos. Capitulo 16 | Aplicacbes da Genética Molecular 463 A Figura 16.19 mostra a estrutura de um plasmidio Ti nopalina tipico. Alguns genes no segmento de T-DNA do plasmidio Ii codificam enzimas catalisadoras da sintese de fitochorménios (a auxina dcido indoleacético ea cito- cinina isopenteniladenosina). Esses fito-horménios sio respoundveis pur uumuuies Lelulaies na galluedaeeuiva. A regido do TDNA é limitada por repeticdes imperfeitas de 25 pares de nucleotidios, um dos quais tem de estar presente em cis para excisio ¢ transferéncia do TDNA, A delecio da sequéncia da margem direita bloqueia to- talmente a transteréncia de I-DNA para celulas vegetais. A regio vir (de viruléncia) do plasmidio Ti contém (05 genes necessarios para o processo de transferéncia de 'EDNA. Esscs genes codificam as enzimas de process mento do DNA necessérias para excisio, transferéncia ¢ integracio do segmento de T-DNA durante 0 proceso de traneformacin Ok genes wir podem suprir as finches necessirias para transferéncia de T-DNA quando locali- zados em posi¢ao cis ou trans em relacdo 20 T-DNA. Eles sio expressos em niveis muito baixos em células de tumefaciens cultivadas no solo. No entanto, a exposicao das bactérias is eélulas vegetais lesadas ou a exsudatos de células vegetais aumenta os niveis de expressio dos genes vir. Esse processo de inducao é muito lento nas bactérias, levanele 101 15 h até aleancar niveis maximos de expres: io, Substincias fen6licas como acetossiringona sio indu- toras dos genes vir, e com frequéncia ¢ possivel aumentar Repetico terminal deta GOS * ee TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC ACTGTCCTATATAACCGCCCATITG Repety ao tenia! esqucie ‘ Alecia om ‘TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAAC ACCGTCCTATATAACACCACATTTG, egia0 Wr 1m FIGURA 16.19 Estrutura do plasmidio Ti nopalina pTi C58, mostran- 44a campanentesselecionadas. © placmidin Ti tem 710 kh, Os imino los usados sio: or, origem de eplicacao; Tum, genes responsévels pela formog8o de tumor, Nez, genes implicados na biozzinteze de nopalina: 'Noc, genes implicads no catabolism da nopalina ir genes de viru- lencia necessrios para transferencia de T-DNA, As sequencias de pa- res de nucleotidio da esquerda eas repeticées terminals da dreta séo ‘mostradas na parte superior os asteiscos marcam os quatro pares de bases diferentes nas duas sequéncias da margem.