Identificagao de espécies animais pelo DNA Carlos Benigno Vieira de Carvalh Introdugao Embora nao exista uma definicao de espécie universalmente aceita, alguns conceitos sao bastante utilizados, tais como os de espécie fenotipica, espécie bioldgica e espécie filogenética. Enquanto uma es pécie fenotipica pode ser definida como um grupo de individuos que compartilham caracteristicas fisicas distintas de outros grupos, a definicao de uma espécie bioldgica esta baseada no isolamento reprodutivo, defnindo uma espécie como um grupo de populacées que cruzam apenas entre si de forma a produzir prole fértil. O terceiro conceito, 0 de espécie filogenética, considera que as caracteristicas que definem uma determinada espécie, incluindo aspectos do seu DNA, seriam resultantes de um processo de sepa- racao de outros grupos ao longo de sua histéria evolutiva. Tais conceitos se complementam e devem ser Utilizados em conjunto para uma definicao mais completa de espécie. ‘A identificacio de espécies animais é importante por uma série de raz6es, desde a elaboracao de estudos evolutivos e ecologicos, por exemplo, até 0 reconhecimento daquelas que so apropriadas 20 consumo humano ou nocivas a satide. Diversas acdes governamentais de controle sanitario e ambiental, incluindo a entrada ea saida de animais nas fronteiras e a fiscalizacao de alimentos, bem como inumeras investigacdes policiais e processos judiciais, necessitam de informacdes sobre a identidade das espécies envolvidas. Na drea forense, a identificagdo de espécies pode ser utilizada em muitas situa¢ées, incluindo casos em que a interferéncia animal em cadaveres possa ser confundida com ferimentos ante-mortem e na dife- renclacao entre restos mortais humanos e nao humanos em cenas de crime ou acidentes. Além do mais, alguns tipos de crime dependem da identificacéo das espécies evolvidas para a sua caraterizacao, tals Zomo as fraudes em alimentos de origem animal, causadoras de prejuizos econémicos e potenciais danos § catide da populacdo, Varios estudos mostram que a substituicao de peixes e frutos do mar, por exemplo, é bastante comum em varias partes do mundo, inclusive no Brasil. Da mesma forma, crimes como a caga de animais silvestres e 0 comércio ilegal de suas partes ou subprodutos, potenciais causadores de danos sos ecossistemas naturais, também dependem de exames que assegurem o envolvimento de espécies protegidas para a sua tipificacao. Tradicionalmente, a identificagéo de espécies animais é feita com base em sua morfologia. Carac teristicas como tamanho, forma e estruturas presentes nos corpos dos animais podem ser utilizadas para identificar a especie de origem na maior parte dos casos. No entanto, para a realiza¢ao da identificacdo morfolégica sa0 necessérias certas condicdes, entre elas a existéncia de caracteristicas distintivas ineren- tes a especie, a presenca de tais carateristicas no espécime examinado e, algumas vezes, taxonomistas es- pecializados que saibam reconhecé-las. A identificacao de espécies cripticas, individuos imaturos, partes, produtos, além de fluidos ou dejetos de origem animal, muitas vezes, pode nao ser possivel por melo da morfologia Quando a identificacdo morfolégica nao é possivel, existem algumas alternativas que podem ser utilizadas. A analise de proteinas ou reacoes antigeno-anticorpo especificas séo alguns dos métodos de- senvolvidos para a identificacao de espécies, embora, muitas vezes, devido a natureza do material subme tido para exames tals técnicas no possam ser aplicadas. Nesse contexto, métodos moleculares baseados no DNA tém sido desenvolvidos e aprimorados para utilizacéo na identificacao de espécies animais com as mais diversas finalidades,A eV anh eat) Presente em quase todos os seres vivos, o DNA é uma molécula relativamente estavel e resistente, podendo ser recuperado de uma grande variedade de tecidos, até mesmo daqueles bastante danificados Por meio do uso de técnicas adequadas, é possivel fazer uma leitura de pequenos segmentos da molécula de DNA e comparar essas sequéncias com outras de origem conhecida, permitindo chegar a identidade da espécie, Este capitulo tem como principal objetivo detalhar aspectos da técnica mais utilizada nos dias de hoje para a identificacdo genética de espécies animais, sequenciamento de DNA mitocondrial, apre- sentando exemplos de casos e abordando suas limitacoes Caracteristicas e tipos de DNA O DNA, ou acido desoxirribonucleico, é uma molécula que contém as informagées necessarias para 0 funcionamento e a replicacao de todos os seres vivos, com exce¢ao de alguns virus. O DNA possui uma estrutura bastante simples, sendo composto de duas longas cadeias formadas basicamente por quatro unidades nucleotidicas. Cada nucleotideo compreende um acucar, um fosfato e uma das quatro bases a seguir: a) adenina (A); b) timina (1); ©) citosina (©); 4d) guanina (G). As duas cadeias se enrolam ao redor uma da outra, em um processo chamado hibridiza¢ao, ocorren- do sempre o pareamento da adenina coma timina e da citosina com a guanina. As espécies animais apresentam dois tipos basicos de DNA: a) O primeiro deles, o DNA nuclear, é uma molécula extensa que possui cerca de 3 bilhdes de pares de bases na espécie humana e encontra-se organizado na forma de cromossomos no nuicleo das células b) O segundo, o DNA mitocondrial, é uma pequena molécula circular (16.569 pares de bases em humans) localizada no interior das mitoc6ndrias em multiplas cépias. Mitocondrias sao orga- nelas celulares envolvidas na producao de energia localizadas no citoplasma da maior parte das células animais. De forma distinta do DNA nuclear, que é herdado de ambos os pais apos um processo de recombinacao, o DNA mitocondrial é herdado apenas da mae e sem trocas géni- as. Isso significa que, na auséncia de mutagées, todos os membros de uma mesma linhagem materna vo apresentar 0 mesmo tipo de DNA mitocondrial, ou haplétipo. Existem casos em que um individuo apresenta dois ou mais tipos de DNA mitocondrial, condicéo definida como heteroplasmia mas, pelo menos em populacdes humanas, a frequéncia dessa condicao ¢ baixa. Grande parte do DNA de dois individuos que pertencem a mesma espécie ¢ igual, sendo estimado que dois seres humanos compartilhem cerca de 99,8% de seu DNA. Da mesma forma, espécies muito prd- ximas, ou que se diferenciaram mais recentemente, também compartilham grande parte de seu material genético, A variacao genética existente dentro de uma mesma espécie é denominada variacao intraespe- cifica, enquanto a variacao entre espécies diferentes é denominada interespecifica, Marcadores genéticos Marcadores genéticos podem ser definidos como regides do DNA utilizadas para fins de identifi- cacao, Os testes para identificacdo de espécies deve buscar marcadores que apresentem variacao in- terespecifica suficiente para diferencié-las e pouca ou nenhuma variacao intraespecifica. Devido as suas caracteristicas, marcadores de DNA mitocondrial tém sido frequentemente utilizados para a identificacao de espécies animais. vy(0 DE ESPECIES ANIMAIS PELO DNA eat} Os marcadores de DNA mitocondrial ndo tem o mesmo poder de discriminacao apresentado por alguns marcadores de DNA nuclear altamente polimérficos, capazes de diferenciar individuos. Contudo, © DNA mitocondrial apresenta algumas vantagens quando se trabalha com materiais de dificil analise, como algumas amostras forenses, por exemplo. O alto ntimero de cépias do DNA mitocondrial por célula aumenta a sensibilidade do exame e é bastante util quando existe uma pequena quantidade de material ‘ou quando 0 DNA se encontra degradado. Além disso, como resultado de mecanismos de reparo menos eficientes, o DNA mitocondrial apresenta taxas elevadas de mutacao, fazendo com que mesmo espécies muito préximas acumulem diferencas que permitem diferencié-las. Finalmente, muitos marcadores de DNA mitocondrial possuem tamanho pequeno, o que facilita a obtengao das sequéncias, e possuem re- gides flanqueadoras conservadas, o que permite o uso primers universais que amplificam um grande nu- mero de espécies animais. Primers, ou iniciadores especificos, sao oligonucleotideos que se ligam a fita molde nas regides imediatamente anteriores a sequéncia de interesse (flanqueadoras) e servem de ponto de partida para a enzima que efetuard a replicacao do DNA. O uso de primers universais possibilita a anali- se de materiais cuja espécie de origem é desconhecida. Identificagao de espécies animais Embora um grande numero de marcadores de DNA mitocondrial seja utilizado para fins de identi- ficagao de espécies, os mais comuns sao segmentos dos genes citocromo b (Cytb) e da subunidade | da citocromo c oxidase (COI). Os exames de identificacao sao baseados na amplificacao, ou seja, a produgao de muitas cépias da sequéncia de interesse desses marcadores, no sequenciamento {ou “leitura’) des- sas regides e na sua comparacao com sequéncias de identidade conhecida (FIGURA 1). Nos paragrafos seguintes, so apresentadas as diferentes etapas para a realizacao do exame. DNA mitocondrial >Questionada’ CTTATACCTACTCTTCGGAGCATGAGCC. GGTATAGTTGGCACCGCCCTTAGCCT ACTCATCCGTGCAGAACTAGGCCAACC (CGGAACTCTCCTGGGAGACGACCAAAT ‘TTACAACGTAATCGTCACCGCCCATGCC ‘TTICGTAATAATTTICTTCATAGTAATGCC TATCATAATCGGCGGCTTTGGAAACTGA TTAGTCCCCCTTATAATCGGTGCCCCAG ACATAGCATTCCCCCGAATAAACAACAT ‘AAGCTICTGACTCCTACCCCCATCCTIT CTCCTACTACTAGC FIGURA 1 ~ REPRESENTACAO SIMPLIFICADA DE UMA MOLECULA DE DNA MITOCONDRIAL DE MAMIFERO, MOSTRANDO A LOCALIZACAO 'RPROXIMADA DOS DOIS PRINCIPAIS GENES UTILIZADOS PARA FINS DE IDENTIFICACAO ANIMAL (CYTB E COI). COM BASE NA OBTENCAO DE TODA OU PARTE DA SEQUENCIA DE NUCLEOTIDES DESSES GENES, E POSSIVEL A COMPARAGAO COM SEQUENCIAS DE IDENTIDADE ‘CONHECIDAGeO ass ee ae NLS QUILL) Ce TU Coleta e encaminhamento de material para o exame (O exame de identificago pelo DNA mitocondrial inicia-se fora do laboratério, pela coleta, pela pre- servacao e pelo encaminhamento do material a ser examinado. O DNA pode ser obtido de quase todo tecido de origem bioldgica, sendo que itens como carcacas, ovos, penas, dentes e diversos outros s80 comumente encaminhados (FIGURA 2). Entretanto, normalmente, o envio de apenas uma amostra do ma- terial ja é suficiente para a realizacao do exame (1 cm’ de tecido muscular, por exemplo). O material deve ser coletado com auxilio de material descartavel ou descontaminado, evitando-se regides do material que apresentem indicios de degradacao ou que entraram em contato com outros tecidos biolégicos. Além disso, 6 recomendado o uso de mascara e luvas descartaveis pelo responsdvel pela coleta da amostra, evitando-se riscos de contaminacao com o seu proprio DNA. No caso de material imido, como tecidos frescos, por exemplo, apds a coleta o material deve ser acondicionado em recipiente estér'l e preservado ‘em etanol 70% ou congelado (-20") até o envio ao laboratorio. Amostras de material seco devem ser acon- dicionadas em embalagens de papel e protegidas do sol e calor excessivos. Os cuidados na amostragem @ preservacao do material até o encaminhamento ao laboratério aumentam as chances de obtencao de DNA vidvel para exames. FIGURA 2 — EXEMPLOS DE MATERIAIS ENCAMINHADOS PARA IDENTIFICACAO. NO. SENTIDO HORARIO, A PARTIR DA IMAGEM MAIS ACIMA, A ESQUERDA: AVALOS: MARINHOS; CARNE DE CAGA; ‘OVOS; DENTES; MEMBROS DESSECADOS £ OSSO5; E PENAS FONTE: IMAGENS CARLOS BENIGNO VIEIRA DE CARVALHO, POLICIA FEDERAL. 174gH ese Se Ue MOLY UE) Etapas de laboratorio ‘Apés a chegada do material ao laboratério, o DNA deve ser extraido. Existem varios métodos para obtencao do DNA de amostras encaminhadas para exame, sendo que todos eles buscam basicamente romper as membranas das células (lise celular), desnaturar as proteinas presentes ¢ isolar 0 DNA de tais proteinas desnaturadas e outros restos celulares. A escolha do método pode variar de acordo com 2 natureza do material, o tempo e os custos associados ao procedimento. Ossos, dentes e fezes, por exemplo, normalmente so itens mais trabalhosos que podem exigir etapas adicionais ou protocolos especificos, Apesar de muitos laboratérios ja terem incorporado a sua rotina o uso de kits comerciais € (ou) plataformas automatizadas para a extracio de DNA das amostras encaminhadas, na maioria das situacdes, um protocolo simples baseado na extracao por fenol-cloroférmio e purificagao alcéolica, de- nominado extracao organica, é bastante adequado. Apés a extracao, alguns laboratérios submetem 0 produto a uma etapa de quantificacao, que tem por objetivo otimizar a etapa de amplificacao. Entretan- to, tendo em vista a alta sensibilidade da técnica, 0 uso de um volume minimo de produto de extracéo (por exemplo, 1 ul), independentemente de quantificacao, tende a ser suficiente para uma reacao de amplificagao bem-sucedida. Para que o DNA extraido dos itens encaminhados possa ser analisado, deve ser amplificado por meio de uma técnica denominada PCR (Polymerase chain reaction). A PCR é um processo enzimatico que envolve o aquecimento e o resfriamento ciclicos, simulando o processo de replicagao do DNA que ocor- re na célula. Na reacdo de PCR, entre outros reagentes, so adicionados os primers adequados para a regio de interesse, o DNA molde (aquele extraido do material questionado), a enzima DNA polimerase 0s deoxinucleotideos (dNTPs) que serao incorporados durante a extensao das fitas de DNA. O material &colocado em um termociclador com parametros de ciclagem especificos, tais como numero de ciclos a temperatura de anelamento, resultando ao final em inimeras cOpias do fragmento que serd analisado. £ importante a utilizacdo de controles positivo e negativo para a checagem de interferentes e do suces- so da reacdo, O sucesso da reacao de amplificacao pode ser checado por meio de uma eletroforese em gel de agarose. Com a utilizacdo de um corante de DNA, amplificacdes bem-sucedidas so visualizadas gomo bandas nitidas no gel sob luz UV. O produto de amplificacao deve, em seguida, ser tratado enzi- maticamente para a remocao do excesso de alguns reagentes. Posteriormente, o produto de amplificagao deve ser submetido a uma reacao de sequenciamento pelo método de Sanger. Realizada em um termociclador, normalmente com o auxilio de kits comerciais especificos para esse fim, a reacao de sequenciamento contém, entre outros componentes, o DNA ampli- ficado, a DNA polimerase, dNTPs, os primers utilizados na amplificacao e dideoxinucleotideos (ddNTPs), que sao nucleotideos especiais marcados por fluorescéncia que interrompem a extenséo do DNA quan- do incorporados as fitas de DNA. As reacoes sao realizadas separadamente no sentido direto e reverso. {Ao final do processo, os produtos de sequenciamento passam por um novo tratamento enzimético para remocao do excesso de reagentes, seguido por etapas de precipitacao e purificagao. Posteriormente, por meio de eletroforese capilar em um analisador genético (sequenciador), ocorre uma separacao por tama- ho com até uma base de resoluco e uma leitura dos ddNTPs marcados por fluorescéncia, permitindo que um programa de aquisicdo de dados leia e interprete as sequéncias. Por meio de outros programas, apés leituras nos sentidos direto e inverso, sao produzidas as sequéncias consenso e estas tém a sua qua- lidade avaliada, Na avaliacao da qualidade, observam-se parametros baseados na forma e resolucdo dos picos, se a sequéncia possui o tamanho esperado ea ocorréncia de heteroplasmia. £ importante também fazer a traducdo da sequéncia de nucleotideos em proteina e avaliar eventuais divergéncias, principal- mente a ocorréncia de codons de terminacao estranhos. Sequéncias com qualidade suficiente devem ser exportadas pelo software de anélise em um formato semelhante a um arquivo de texto e confrontada com amostras de referéncia.DTH at ae pam OY eta) Comparagao das sequéncias obtidas com aquelas depositadas em bancos de dados Embora em algumas situagdes possam ser utilizadas sequéncias de amostras de referéncia para comparacao, na maioria das vezes, usa-se para confronto as sequencias depositadas em bancos de dados de informacées genéticas de acesso publico. Tais bancos contém sequéncias de identidade conhecida depositadas por diferentes instituicdes e pesquisadores do mundo inteiro com as mais diversas finali- dades, incluindo estudos taxonémicos e filogenéticos. Nesses casos, por meio de ferramentas de busca informatizadas, a sequéncia questionada é confrontada com aquelas existentes no banco, resultando na apresentacao daquelas com maior similaridade. Um dos bancos de dados utilizados para comparagao de sequéncias é 0 GenBank. Trata-se de um grande banco de dados mantido pelo National Center for Biotechnological Information (NCBI) dos Estados Unidos e que possui em seus sistemas milhdes de sequéncias de centenas de milhares de espécies descri- tas. Consultas e depésitos de dados sao permitidos ao publico, em geral, e, sendo assim, embora o volume de informacées existentes seja imenso, algumas vezes existem problemas com rela¢ao a preciso das in- formacées. A comparacao entre uma sequéncia questionada com aquelas depositadas no banco pode ser realizada com a ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), que usa um algoritmo especial para efetuar tal comparacao mais rapidamente e apresentar os melhores resultados. Os resultados incluem, en- tre outras informacées, uma lista de sequéncias com maior similaridade, juntamente com os seus percen- tuais, e 0 e-value, que é um parametro que define a chance de aquele resultado ocorrer por acaso (quanto menor for o valor do parametro, mais significante é o resultado). Um segundo banco de dados disponivel para consultas é o do Barcode of Life Data Systems (BOLD). © banco faz parte de um sistema universal Para catalogar e identificar espécies denominado DNA barcoding criado por iniciativa de um consércio internacional. Para a identificacao de espécies animais, tal sistema utiliza unicamente sequéncias de apro- ximadamente 650 pb da subunidade | do gene mitocondrial citocromo c oxidase (CO!). Embora a consulta a0 banco de dados seja publica, apenas instituicoes cadastradas podem efetuar depdsitos de sequéncias, que devem observar uma série de requisitos de qualidade e ser provenientes de espécimes identificados por taxonomistas. Essas restricoes aos depésitos conferem, em principio, uma maior confianca nos dados la existentes. As buscas sao realizadas com a ferramenta Identification apés a escolha de uma das bibliote- cas de referéncia disponiveis para a identificacao animal. A rotina de busca do BOLD é mista, combinando métodos de similaridade com a construcao de uma arvore filogenética baseada em uma matriz de dis- tancias. O BOLD identifica uma sequéncia até o nivel de espécie com uma probabilidade associada, se a divergéncia entre esta e uma sequéncia depositada no banco for menor do que 1%. Se a divergéncia for maior do que 1%, mas menor do que 3%, a sequéncia é identificada até o género. Apés a obtencao dos resultados do confronto com os bancos de dados, tem-se uma hipdtese de identificagao. Resultados de similaridade muito baixos, normalmente nao tém muito valor, sendo mera- mente ao acaso e resultantes do fato de que grande parte do material genético de todos os animais bastante similar. Resultados elevados de similaridade entre a sequéncia questionada e alguma sequéncia presente no banco, como 100%, por exemplo, em principio, significam sucesso na identificacao. Entre- tanto, antes de qualquer conclusao, em uma abordagem conservadora, é necessaria a realizacao de um levantamento de estudos sobre o status taxondmico e as relacées filogenéticas do grupo identificado, bem como uma avaliacao da representatividade dos bancos de dados consultados. Com base em tais. informacées, deve-se avaliar se o marcador utilizado é adequado para separar as espécies do grupo a que pertencem as sequéncias que apresentaram maior similaridade, uma vez que, em alguns casos, o tempo decorrido entre a separacao das espécies pode nao ter sido suficiente para que estas possam ser diferen- ciadas. Caso as espécies do grupo possam ser diferenciadas com base no marcador escolhido, devem ser avaliadas também se elas se encontram bem representadas no banco de dados utilizado. Se a sequén- cia questionada resultou em uma similaridade de 100% com uma determinada espécie, e as espécies filogeneticamente préximas, que também se encontram representadas no banco, apresentaram valores de similaridade inferiores, pode-se considerar os resultados seguros. Por outro lado, se as espécies maisWa Zab PEIN ROLY eeu E) préximas ndo estiverem representadas no banco consultado, os resultados podem nao ser conclusivos. importa ressaltar que identificacdes positivas podem ser obtidas com valores de similaridade ligeiramen- te inferiores a 100%, uma vez que pequenas variacées nas sequéncias de DNA mitocondrial de individuos da mesma espécie so normais, tais como aqueles provenientes de populacées diferentes. Em algumas situacées, a construcao de arvores filogenéticas pode ser realizada para subsidiar as conclusées. Arvores filogenéticas s4o representacdes graficas das relacées evolutivas de diferentes or- ganismos, apresentando a ordem em que espécies ou individuos se diferenciaram de um ancestral em comum. Trata-se de uma metodologia utilizada, por exemplo, para avaliar se uma sequéncia questiona- da que nao apresentou um resultado alto de similaridade com nenhuma espécie presente no banco de dados, poderia ou nao ser associada ou estar proximamente relacionada a alguma delas. Para se trabalhar com reconstrucées filogenéticas com dados moleculares, devem ser utilizadas sequéncias homélogas, ou seja, que apresentam ancestralidade comum. Com base na literatura cientifica disponivel, podem ser selecionadas sequéncias de outros individuos do mesmo taxon ou de taxons proximos e, quando estas s40 analisadas em conjunto com a sequéncia questionada, sao observados padres de agrupamento (clados ‘ou ramos) que podem auxiliar nas conclusoes. Existem diferentes abordagens para se estimar arvores filogenéticas, mas entendendo-se claramente o funcionamento de cada uma delas, podem ser usados programas de computador que permitem realizar todas as etapas das andlises sem dificuldades. E sempre prudente repetir as andlises com diversos tipos de arvores e modelos, verificando se os resultados per- manecem consistentes entre si e com aqueles resultantes dos confrontos com os bancos de dados (para detalhes das técnicas e programa de analise). Informacées adicionais Uteis para confirmar as identificagoes Informac6es que nao tém origem genética, tais como aquelas baseadas na historia natural e es- tudos biogeogrdficos do grupo identificado, também sao importantes e podem ser uteis para funda- mentar as conclusées. Se, por exemplo, os exames genéticos resultaram em duas possibilidades para a espécie de origem de um determinado material analisado, mas informacées disponiveis na literatura lentifica mostram que uma delas nao ocorre na localidade onde o item foi coletado, é possivel identifi- car o material de forma razoavelmente segura como pertencente a outra espécie. Da mesma forma, em algumas situagées, pode-se eliminar como candidatas espécies muito raras ou consideradas extintas. Exemplos de casos 1. Anélise de uma amostra de sangue de ave envolvida em colisao com aeronave no estado de Sao Paulo. A identificacao da espécie pode ser importante para a realizacao de planos de ma- nejo e adocao de novas medidas de seguranca aeroportuaria visando a prevencao de outros acidentes. Apés a realizacdo das etapas de laboratério, utilizando-se o marcador COI, a sequén- cia obtida foi confrontada com aquelas depositadas no banco de dados do BOLD. A sequéncia apresentou uma similaridade maxima de 99.69% com sequéncias da espécie Coragyps atratus, da familia Catharthidae, popularmente conhecida como “urubu-preto” ou “urubu-de-cabeca -preta", Com base em estudos anteriores, é possivel verificar que o gene COI, de forma geral, ¢ adequado para discriminar espécies de aves. Segundo a classificagao vigente, apoiada em da- dos morfoldgicos e genéticos, a familia Catharthidae possui cinco géneros, sendo eles Cathar- thes, Coragyps, Sarcoramphus, Gymnogyps e Vultur. Com excecao de Cathartes, que possui trés espécies, todos 0s outros géneros sao monotipicos. Todas as espécies da familia encontram-se representadas no banco de dados do BOLD por sequéncias de varios individuos. Como C. atra- tus difere de qualquer uma das outras espécies da familia em pelo menos 9%, a identificagao do material até o nivel de espécie pode ser considerada seguraINA UAe Ua ssate se LSE See 2, Anélise de uma amostra de filé de peixe proveniente do estado de Santa Catarina identificado de forma suspeita como “corvina’, Caso a identificacao da amostra resultasse em outra especie, havie‘a possibilidade de tratar-se de uma fraude ou de crime contra as relacbes de consumo. Fol tllzadb o marcador COI eo resultado do confronto com o banco de dados do BOLD apontou 100% de similaridade com a espécie Micropogonias furnier, da familia Scienidae, popularmertte coohacils como “corvina”, Estudos anteriores mostram que o gene COI é adequado para dife- renciar especies de peixes. O género Micropogonias possui seis espécies, sendo que cinro delas ee eivam representadas no banco de dados consultado. A espécie com maior similaridade depois de M. furnien, é M, undulatus, com menos de 94% de similaridade. Em principio, 2 identi- ficecao do material como M. furnier! seria segura, mas a auséncia de representacao de uma das especies no banco impede a identificacao segura, além do nivel de género baseada apenas nas informacoes genéticas (a espécie ausente, flogeneticamente proxima, poderia, hipoteticamery te, apresentar um valor de similaridade similar ao encontrado para M.furnier), Entretanto, tendo tin vista que é sabido que 0 material é proveniente da costa brasilelra, onde ocorrem apenas as espécies M, furnierie M, undulatus, & possivel concluir de forma razoavelmente segura dvs ° espécie de origem do material é realmente M. furnieri Os resultados mostraram que o produto estava embalado corretamente 3. Andlise de pedaco de carne de caca com suspeita de se tratar de“veado’, proveniente do esta- Go do Parana. A fauna silvestre brasileira é protegida por lel e, caso o material pudesse ser asso" cade 2 uma das espécies que a compdem, o crime ambiental poderia ser comprovado. Foram Ctilizados os marcadores COI e Cytb para realizacao das analises, cujas sequéncias resultaram $m maior similaridade com membros da familia Cervidae. O confronto da sequencia quest hada COl com o banco de dados do BOLD resultou em uma similaridade de 99.81% com una Sequéncia de Mazama sp. € 98.92% com uma de M. americana, embora também tenham sido sea e trades valores de similaridade mais baixos na comparagao com outras sequéncias da cocoa espécie, © confronto da sequéncia questionada Cyt com o GenBank também resuk Tou em uma maior similaridade com a espécie M. americana (99%). Outras sequéncias dessa resma especie apresentaram valores de similaridade mais baixos do que sequéncias de outras quias especies (M. nana e M. bororo), Estudos anteriores mostram que ambos os marcaclores seriam apropriados para a discriminacdo de espécies de mamiferos, incluindo cervideos: Os Generos sul-americanos de Cervidae sao Hippocamelus, Pudu, Blastocerus, Mazama, Odocoileus 2 Ozotocerus, sendo que 0s quatro tltimos ocorrem no Brasil. Todos os seis géneros menciona- dove quase todas as espécies se encontram representadas nos bancos de dados consultados, G que-em principio, permitiria a identificacao do material. Embora restem poucas duvidas de Gue 2 carne examinada seja proveniente do genero Mazama, a identificacao da espécie foi iMonclusiva. A presenca de sequéncias provenientes de individuos nao identificados até o nivel de espécie e a grande variacao intraespecifica observada nas sequéncias de M. americang foram os principais problemas observados. Os resultados refletem 0 fato de que a taxonomia as relacoes filogenéticas do grupo s8o complexas e ainda se encontram em discussao. Espe- Ciftcamente com relacdo ao género Mazama, estudos genéticos sugerem a origem polifilética ci oxistencia de um complexo de espécies cripticas agrupadas em M. americana. Além disso, sc cemelhancas morfologicas entre algumas espécies do género contribuiriam para a existén- eis de sequencias incorretamente identificadas nos bancos de dados. Para que a identifica: Gao genética seja realizada de forma segura, s40 necessérios novos estudos que permitam Sompreender melhor os limites entre as espécies que compdem 0 grupo e a variagao de suas populacdes. Ressalta-se, no entanto, que a identificacao do material até o nivel de género ésu- ficiente para a caracteriza¢ao do crime ambiental, uma vez que todos os Mazama que ocorrem no Brasil sao protegidos pela legislacao vigente.OD aes eee eS ae) eat) Limitagdes da técnica O estgio atual do conhecimento sobre a genética e filogenia de alguns grupos pode representar um empecilho para identificacao de espécies com base no DNA. Sem o conhecimento prévio dos limites de cada espécie, obtido por meio de estudos com diferentes marcadores moleculares e populacoes, nao é possivel identific-las com seguranga. Conforme j mencionado, em algumas situacdes, espécies que se separaram ha pouco tempo po- dem nao ter acumulado diferencas suficientes em suas sequéncias que permitam a sua distingao. Em tais casos, é importante consultar a literatura cientifica disponivel sobre o grupo para verificar se as espécies podem ser separadas com base em outros marcadores ou técnicas diferentes. Bancos de dados incompletos podem representar empecilhos para a identificacao de espécies. Aes- pécie da qual a sequéncia questionada é proveniente pode nao estar representada no banco de dados ou estar subamostrada, havendo apenas uma, ou poucas sequéncias dela. Um numero razoavel de sequén- cias provenientes de diferentes populacées é importante nos casos de grande variacao intraespecifica, © encaminhamento de material contaminado, composto de misturas de mais de um animal, pode impossibilitar os exames, uma vez que o uso de primers universais pode amplificar todos os componentes presentes, Entretanto, se um dos contribuintes estiver presente em uma proporcao muito maior do que PD outro, normalmente os exames serdo bem-sucedidos em identificé-lo. Quando a proporco da mistura éstiver mais equilibrada, causando problemas, podem ser usados primers especificos para um determina- do grupo, mas isso vai depender de informagées prévias sobre a identidade do material. Qutra maneira de Contornar 0 problema seria separar o DNA de diferentes fontes no material com 0 auxilio de protocolos de clonagem. A presenga de pseudogenes, que podem ser amplificados simultaneamente ou de forma preferen- cial, também pode prejudicar os exames. Pseudogenes so segmentos de DNA de origem mitocondrial transportados para o nticleo da célula, onde sofrem recombinagao e séo submetidos a taxas de muta- Gio distintas do segmento de DNA mitocondrial original. Cédons de terminacao estranhos na sequéncia Ga proteina, mutacdes nao sindnimas, insergdes e delegées podem ser usados como indicadores para a ocorréncia desses pseudogenes. Por fim, a heranga materna do DNA mitocondrial representa um problema para a identificacao de individuos hibridos. No caso de um cruzamento entre dois membros de espécies diferentes, a prole resul- tante possuird o mesmo haplotipo de DNA mitocondrial da fémea e, sendo assim, serd identificada como tal. Calcula-se que, na natureza, pelo menos 10% das espécies animais, especialmente as mais recentes, estéo envolvidas com hibridizacao. E importante checar na literatura cientifica disponivel se existem in- formacdes sobre a ocorréncia de hibridizacao na espécie ou grupo identificado geneticamente, devendo esse fato ser levado em consideracao durante as conclusées, 179Tee ease esa aay EE) Referéncias Alacs EA, Georges A, FitzSimmons NN, DNA detective: a review of molecular approaches to wildlife forensics. Forensie Sei Med Pathol. 2010 Sep; 6(3): 180-94. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1; 25 (17): 3389-402, Austerlitz F, David O, Schaeffer B, Bleakley K, Olteanu M, Leblois R, Veuille M, Laredo C, DNA barcode analysis: a comparison of phylogenetic and statistical classification methods. BMC Bioinformatics. 2009; 10 (Suppl 14): $10. Bender K, Schneider PM, Rittner C. Application of mt DNA sequence analysis in forensic casework for the identification of human remains. Forensic Sci int. 2000 Sep 11; 113(1-3): 103-7. Benson DA, Cavanaugh M, Clark K, Karsch-Mizrachi |, Lipman DJ, Ostell J, Sayers EW. GenBank. Nucleic Acids Res. 2013 Jan; 41 (Database issue): D36-42. Borisenko AV, Lim BK, Ivanova NV, Hanner RH, Hebert PON. DNA barcoding in surveys of small mammal communities: field study in Suriname. Mol Ecol Resour. 2008 May; 8 (3):471-9, Butler JM. Fundamentals of Forensic DNA Typing. 1st ed. Burlington, MA: Academic Press; 2010, ly, Zhang L., Wang Y, Liu Q, Shui Q Yue 8, Zhang Z, LiJ. Identification of deer species (Cervidae, Cetartiodactyla) in China using mitochondrial cytochrome ¢ oxidase subunit | (mtDNA CO!). Mitochondrial DNA, 2015 May 12:1-4. Carvalho DC, Oliveira DA, Pompeu OS, Leal CG, Oliveira C, Hanner R. Deep barcode divergence in Brazilian freshwater fishes: the case Of the Sao Francisco River basin. Mitochondrial DNA, 2011 Oct; 22 Suppl 1:80-6, Carvalho DC, Palhares RM, Drummond MG, Frigo TB. DNA Barcoding identification of commercialized seafood in South Brazil: A governmental regulatory forensic program. Food Control. 2015 Apr;50:784-788. DeYoung, RW & Honeycutt, RL. 2005. The molecular toolbox: genetic techniques in wildlife ecology and management. J Wildl Manage. 2005 Oct69(4):1362-1384. Duarte JMB, Gonzalez 5, Maldonado JE. The surprising evolutionary history of South American deer. Mol Phylogenet Evol. 2008 Oct;49(1):17-22, Filonzi L, Chiesa S, Vaghi M, Marzano FN. Molecular barcoding reveals mislabelling of commercial fish products in Italy. Food Res Int. 2010 Jun;43:1 383-1388, Francis CM, Borisenko AY, Ivanova NV, Eger JL, Lim BK, Guillén-Servent A, Kruskop SV, Mackie I, Herbert PDN, The Role of DNA Barcodes in Understanding and conservation of mammal diversity in Southeast Asia. PLoS One, 2010; 5(9):€12575. Freeman 5, Herron JC. Andlise evolutiva. 1a ed. Porto Alegre: Artmed; 2009, Frézal L, Leblois R. Four years of DNA barcoding: Current advances and prospects. Infect Genet Evol. 2008 Sep;8(5):727-36 Froese R, Pauly D. Eds. FishBase (version 01/2016); 2016. Disponivel em: wwwsishbase.org Gilbert C, Ropiquet A, Hassanin A, Mitochondrial and nuclear phylogenies of Cervidae (Mammalia, Ruminantia): Systematics, ‘morphology, and biogeography. Mol Phylogenet Evol, 2006 Jul;40(1):101-17 Gill F, Donsker D. Eds. IOC World Bird List (version 6.3); 2016, Disponivel em: www.worldbirdnames.org Goodwin W, Linacre A, Hadi S. An Introduction to Forensic Genetics. Chichester, West Sussex: Wiley; 2007, Haag-Liautard C, Coffey N, Houle D, Lynch M, Charlesworth 8, Keightley PD. Direct Estimation of the Mitochondrial DNA Mutation Rate in Drosophila melanogaster. PLoS Biol. 2008 Aug 19;6(8):¢204, Hall BG. Phylogenetic Trees Made Easy. Sunderland, MA: Sinauer Associates; 2011 Herbert PDN, Stoeckle MY, Zemlak TS, Francis CM. 2004. Identification of Birds through DNA Barcodes, PLoS Biol. 2004 Oct; 2(10): 312 Hillier ML, Bell LS. Differentiating human bone from animal bone. Areview ofhistological methods. J Forensic Sci.2007 Mar;52(2):249- 63. Holland M, Parsons T. Mitochondrial ONA Sequence Analysis. Validation and Use for Forensic Casework, Forensic Sei Rev. 1999 Junj11(1}:21-50.Massy Nee LY CAPITULO Linacte AMT, Tobe SS. Wildlife DNA Analysis. Applications in Forensic Sciences. 1st ed. Chichester, West Sussex Wiley-Blackwell 2013, Linacre A, Tobe 5S. Species Identification Using DNA Loc. In: Linacre A, editor. Forensic Sciences in Wildlife Investigations Boca Raton, FL: CRC Press; 2009. p. 61-94. Linacre A, Tobe $6. 2011. An overview to the investigative approach to species testing in wildlife forensic scence, Investig Genet. 2011; 2:2, Mallet 3. Hybridization as an invasion of the genome. Trends Ecol Evol. 2005 May:20(5):229-37 Marat BA, Aguila RO, Ventolero MH, Perez SKL, Willette DA, Santos MD. Detection of mislabeled commerci! Fishery by-products in Ar hlpnines using DNA barcodes and it implications to food traceability and safety. Food Control, 2013 Sep:33:119. 125. Ogden R, Danvway N, McEwing R, Wildlife DNA forensics—bridging the gap between conservation genetics and law enforcement. Endang Species Res. 2009 Jan;9: 179,195. Pakendorf 8, Stoneking M. Mitochondrial DNA and human evolution. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2005:6:165-83, pereira Carneiro J, Amorim A. Klntifiation of Species with DNA-Based Technology: Current Progress and Challenges Recent Pat DNA Gene Seq. 2008;2(3):187-99. perera LHG, Hanner R,ForestiF Oliveira C, Can DNA barcoding accurately discriminate megadiverse Neotropical freshwater fish fauna? BMC Genet. 2013 Mar 9:14:20. patnasingham S, Herbert PD. The Barcode of Life Data System (wawibarcodinglif.org), Mol Ecol Notes. 2007 May 1:7(3):355-364. Fiber AO, Calves RA, MariquelaTC, Perera LHG, HannerR Olvera C. DNA barcodes identify marine fishes of So Paulo State, Brazil, Mol Ecol Resour, 2012 Nov;12(6):1012-20. sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989. schulz|, Schneider PM, Olek K, Rothschild MA, Tsokos M. Examination of postmortem animal interference to human remains ving ‘cross-species multiplex PCR, Forensic Sci Med Pathol. 2006 Jun;2(2)95-101 “Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Mol Biol Evol. 2011 Oct:28(10):2731-9. Tavares ES, Goncalves. Miyaki CY, Baker AJ. 2011. DNA Barcode Detects High Genetic Structure within Neotropical Bird Species. PLoS One. 2011;6(12):228543, Tobe $5, Kitchener AC, Linacre AMT. Reconstructing Mammalian Phylogenies: A Detalled Comparison of the Cytochrome band Cytochrome Oxidase Subunit | Mitochondrial Genes. PLoS One, 2010 Nov 305(11)-¢14156 Verma SK, Singh L. Novel universal primers establish identity ofan enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes. 2002 Dec(3): 28-31. Wilson MR, Dizinno JA, Polanskey D, Replogle J, Budowle B, Validation of mitochonerial DNA sequencing for forensic casework analysis. Int J Legal Med. 1995;108(2):68-74. Wong EHK, Hanner RH. DNA barcoding detects market substitution in North American seafood Food Res International. 2008 Oct:41(8):828-837,